CN104582729B - 新细胞组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明的提供一种名为AMP‑N细胞的新细胞组合物。具体来说,本发明提供新的AMP‑N细胞组合物以及由所述AMP‑N细胞衍生的新组合物。所述由AMP‑N细胞衍生的新组合物包括但不限于由所述细胞获得的新条件培养基(ACCS‑N)。本发明还提供用于制备所述新AMP‑N细胞和新ACCS‑N组合物的方法以及这些组合物的用途。

Description

新细胞组合物及其制备方法和用途

联邦政府资助研究或研发的相关声明

本发明部分由美国政府资助，并荣获以下机构的资助：日内瓦基金会，子合同编号S-1153-01，主合同编号W81XWH-08-2-0127。美国对本发明或拥有一定的权利。

相关申请

本申请要求以2012年8月16日提交的美国临时专利申请号61/683,896及2013年3月11日提交的美国临时专利申请号61/776,031为优先权基础，所述专利申请的所有内容都以引用方式被纳入本申请中。

技术领域

本发明的领域涉及一种名为AMP-N细胞的新细胞组合物。本发明的领域特别涉及一种新AMP-N细胞组合物以及由所述AMP-N细胞衍生的新组合物。所述由AMP-N细胞衍生的新组合物包括但不限于由所述细胞获得的新条件培养基(在本发明中称为ACCS-N)。本发明的领域还涉及用于制备所述新AMP-N细胞组合物和新组合物ACCS-N的方法以及这些组合物的用途。

背景技术

Uchida S,et al.(2000)J Neurosci Res 62:585-590描述源自人羊膜上皮细胞的条件培养基对神经生长的作用。Sheng,JG.,et al.(1993)Exp Neurol 123(2):192-203报告患有半帕金森病的大鼠在移植羊膜细胞后其多巴胺神经元发芽和行为恢复的情况。Lindvall,O.and Kokaia,Z.,(2006)Nature 441:1094-1096描述了使用干细胞治疗神经系统疾病的进展。Kakishita,K.,et al.,(2000)Exp Neurol 165:27-34报告移植到患有帕金森病的大鼠模型的纹状体内的人羊膜上皮细胞能够制造多巴胺和存活。Okawa,H.,et al.,(2001)Neuroreport 12(18):4003-7报告羊膜上皮细胞在缺血性脑内转化成神经元样细胞。Kakishita,K.,et al.,(2003)Brain Res 980(1):48-56描述在患有6-羟基多巴胺损伤的大鼠移植人羊膜上皮细胞可防止黑质多巴胺神经元的退化。Meng,XT,et al.,(2007)Cell Biol Int 31(7):691-8报告与羊膜上皮细胞共同培养的神经干细胞,其神经分化和神经突生长被增强。Sankar,V.et al.,(Neuroscience 2003,Letter to Neuroscience,118(1):11-7)研究人羊膜上皮细胞移植在修复横断性脊髓损伤上的作用，并报道人羊膜上皮细胞在猴子的横断脊髓能够存活，其中移植者的轴突可穿过该细胞移植物并且其横断病变部位没有发现胶质疤痕。Wu,Z-Y.,et al(Chinese Med Jour 2006,119(24):2101-07)报道移植人羊膜上皮细胞可以改善脊髓有损伤的大鼠的后肢功能。

发明内容

本发明的目的为提供一种具有独特的表型和功能的新细胞组合物。所述新细胞(在本发明中称为AMP-N细胞)是由于使用新颖的培养条件培养AMP细胞,使得AMP细胞改变并展现出一种独特的表型,所述独特表型经细胞表面和细胞内标记分析评估及确认。具体而言，本发明証明AMP-N细胞表达一个含有不同标记的独特组合，其中某些标记出现于神经元细胞，某些则出现于神经胶质细胞及AMP细胞(如下文所描述)。这些AMP-N细胞为首个能够在一种细胞内展现所述独特标记组合的细胞。本发明的另一目的为提供从AMP-N细胞衍生的新组合物，特别是从AMP-N细胞衍生的条件培养基(在本发明中称为N-条件培养基或ACCS-N)。这种新条件培养基是一个含有不同分泌蛋白因子的独特组合。本发明另一目的为单独或结合使用AMP-N细胞或ACCS-N，和/或与其他试剂结合使用AMP-N细胞和/或ACCS-N，所述试剂包括活性和/或无活性试剂，以治疗患有神经系统的疾病﹑毛病或损伤(随后在本说明书中详述)的患者，使得患者从所述神经系统疾病﹑毛病或损伤中有所改善或复原。

因此，本发明的第一个方面为包含AMP-N细胞的组合物。

在一个实施例中，AMP-N细胞表达高水平的SSEA-4、GFAP、α-S100和低水平的β-微管蛋白III(β-tubulin III)、MAP2、PSA-NCAM和NFM。

本发明的另一个实施例为一种含有AMP-N细胞的药物组合物。在另一个实施例中，含有AMP-N细胞的药物组合物被包装在生产制品中，所述生产制品包括药物组合物、包装材料，以及使用该药物组合物的说明书。

本发明的第二方面为一种含有ACCS-N的组合物。

本发明的一个实施例为一种包含ACCS-N的药物组合物。

在本发明的另一个实施例中,含有ACCS-N的药物组合物被包装在生产制品中，所述生产制品包括药物组合物、包装材料，以及使用该药物组合物的说明书以治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤。

在另一实施例中，ACCS-N被配制成持续释放。

在另一个实施例中,所述ACCS-N为合并的ACCS-N。

本发明的第三方面是治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤的方法，所述方法包括给予患者一种或多种组合物的治疗有效量，所述组合物选自：AMP-N细胞，ACCS-N和合并的ACCS-N。

本发明的其它特征和优点，将显示在随后的描述﹑实施例和权利要求中。本申请把所有被引用的参考文献，审查中的专利申请和已授权的专利的全部内容纳入本申请内。在有矛盾的情况下，以本说明书和当中的定义为准。

定义

本文所用的术语“一(a)”或“一种(an)”是指一种或多种；至少一种。

本文所用的术语“附加的”是指共同地、一起、另外地、相结合地等。

本文所定义的“分离的”是指将物质从其原来的环境中提取出来，因此是＂人为地＂从其天然状态改变而来的。

本文所定义的“基因”为参与生产多肽链的DNA段，包括编码区前面和后面的区域，以及在各个编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。

本文所用的术语“蛋白质标记”，是指细胞或细胞群的任何蛋白质分子特征。蛋白质标志可以位于细胞的质膜上，或在某些情况下为一个分泌蛋白或存在于细胞内的蛋白。

本文所用的“富集的”，是指通过从混合物中消除不需要的物质或选择并分离所需的物质，选择性地浓缩或增加一种或多种物质的量，例如从一异质细胞群中分离出具有特定细胞标记的细胞。

本文所用的术语“高度纯化的”是指就一个特定的标记或标记组合而言，细胞群是基本上同质的。基本上同质是指该特定的标记或标记组合为至少90％，或95％的细胞所表达。

本文所用的术语“胎盘”是指早产胎盘或足月胎盘。

本文所用的术语“多能干细胞”(multipotent stem cell)是真正的干细胞，但只能分化成有限数量的细胞类型。例如，骨髓中的多能干细胞，可变成血液中所有的血细胞，但未必能分化成其他的细胞类型。

本文所用的术语“胚外组织”是指位于胚体外涉及胚胎的保护﹑营养﹑清除废物等的组织。胚外组织为在胚胎出生时被丢弃的组织。胚外组织包括但不限于羊膜﹑绒毛膜(包含脐带和血管的滋养层和胚外中胚层)﹑卵黄囊﹑尿囊和羊水(包括其中含有的所有物质)。胚外组织和由此得的细胞与发育中的胚胎具有相同基因型。

本文所用的术语“源自羊膜的多能祖细胞”或“AMP细胞”(amnion-derivedmultipotent progenitor cell)是指一群从羊膜获得的上皮细胞。AMP的细胞具有以下特征：它们并未曾在存有源自动物的物质下的情况下被培养，因此这些细胞及其产物并没有被非人物质污染，适合于人的临床应用。AMP细胞在添有人血清白蛋白的基础培养基中培养。在一实施例中，AMP细胞分泌细胞因子VEGF﹑血管生成素﹑PDGF和TGFβ2及MMP抑制剂TIMP-1和/或TIMP-2。这些细胞因子或其组合具有以下的生理浓度范围：VEGF约为5-16ng/mL，血管生成素约为3.5-4.5ng/mL，PDGF约为100-165pg/mL，TGFβ2约为2.5-2.7ng/mL，TIMP-1约为0.68μg/mL和TIMP-2约为1.04μg/mL。AMP细胞不需要饲养层细胞亦可生长，不表达蛋白端粒酶和非致瘤性。AMP细胞不表达造血干细胞的蛋白标记CD34。一个细胞群缺乏CD34阳性细胞，表示该分离的细胞群并没有受造血干细胞如脐带血或胚胎成纤维细胞的污染。几乎100％的细胞都与低分子量角蛋白抗体产生反应，确认其上皮性质。从羊膜新鲜分离的细胞不会与干细胞或祖细胞标记c-kit(CD117)和Thy-1(CD90)的抗体发生反应，并可从这些细胞分离出AMP细胞。从足月或早产胎盘获取细胞的多种方法在本领域中是已知的(参见，如US 2004/0110287；Anker et al.,2005,Stem Cells 22:1338-1345；Ramkumar etal.,1995,Am.J.Ob.Gyn.172:493-500)。然而，本文中所採用的方法可提供改良及新的组合物和细胞群。

本文所用的术语“AMP-N细胞”为一种新的细胞类型,该细胞展示一个含有不同标记的独特组合,所述标记包括神经元﹑神经胶质细胞﹑AMP细胞和干细胞的标记。

本文就某些组合物﹑生长条件﹑培养基等所用的术语“无动物的”，是指在制备﹑生长﹑培养﹑增殖﹑储存或配方该些组合物或方法时，没有使用来自非人类动物的物质，如牛的血清﹑蛋白质﹑脂质﹑碳水化合物﹑核酸﹑维生素等。“无非人类动物的物质”所指的物质从未置于或接触非人类动物的身体或物质，因此并没有被非人类物质污染。当制备﹑生长﹑培养﹑增殖﹑储存和/或配方该些组合物或方法时，只使用达至临床标准的物质，如重组产生的人类蛋白质。

本文就指定组合物﹑生长条件﹑培养基等所用的术语“不含血清”，是指不含任何动物来源的血清，包括人类来源的血清，用在制备﹑生长﹑培养﹑扩展﹑存储或制剂的组合物或方法。

本文所用的术语“传代”是具有以下步骤的细胞培养技术：把在组织培养容器中生长达到汇合或将达到汇合的细胞从培养容器中取出，用新鲜的培养基稀释(即以1：5稀释)，并放置到一个新的组织培养容器使其继续生长和存活。例如，从羊膜分离的细胞为原代细胞。这些细胞通过在本文所描述的生长培养基中培养而被扩增。当将这样的原代细胞作传代培养时，每一轮的传代培养被称为一个世代。本文所用的“原代培养物”是指新鲜分离的细胞群。

本文所用的术语“合并的”是指已被合并的多种组合物，这些组合物已被合并以形成一种具有比非合并的组合物更加恒定或更加一致的特征的新组合物。

本文所用的术语“分化”是指细胞逐渐变得更特化的一个过程。

本文所用的术语“分化效率”是指一个细胞群中正在分化的或能分化的细胞百分比。

本文所用的术语“一种细胞产物”或“多种细胞产物”是指由细胞制备并分泌的任何物质和全部物质，包括但不限于蛋白因子(即生长因子、分化因子、移植因子、细胞因子、形态素)、蛋白酶(即以促进内源细胞分层)、蛋白酶抑制剂、细胞基质组分(即纤连蛋白等)。

本文所用的术语“条件培养基”是指特定细胞或细胞群已在其中培养、随后被除去的培养基。将细胞培养在培养基中时，它们可分泌对其他细胞提供支持或者影响其他细胞行为的细胞因子。这种因子包括但不限于激素、细胞因子、胞外基质(ECM)、蛋白质、小泡、抗体、趋化因子、受体、抑制剂和颗粒。条件培养基为含细胞因子的培养基。

本文所用的术语“源自羊膜的细胞因子溶液-N”或“ACCS(amnion-derivedcellular cytokine solution)-N”，并包括“合并ACCS-N”，是指源自AMP-N细胞的条件培养基。ACCS-N含有不同分泌蛋白质因子的独特组合，并可以用于治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤。

本文所用的术语“生理水平”是指物质在生命体系中存在的、并且与正确发挥生化过程和/或生物过程的功能有关的水平。

本文所用的术语“治疗有效量”是指达到所需生理效应(即治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤)需要的治疗剂量。

本文所用的术语“裂解产物”是指裂解细胞如AMP-N细胞并可选择地除去细胞碎片(如细胞膜)时得到的组合物。裂解细胞可通过机械方式、冻融、超声、使用洗涤剂例如EDTA、或者使用例如透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶的酶消化。在某些情况下，裂解细胞需保留细胞碎片并除去剩馀部份。在其他情况下，则需要保留细胞碎片和剩馀部份。

本文所用的术语“可药用的”是指除治疗剂外构成制剂的组分适合给予本发明的待治疗患者。

本文所用的术语“组织”是指一个由相似地分化的细胞组成的聚集体，这些细胞联合行使特定的功能。

本文所用的术语“治疗性蛋白”包括多种生物活性蛋白，包括但不限于生长因子、酶、激素、细胞因子、细胞因子抑制剂、凝血因子、肽生长因子和分化因子。

本文所用的术语“移植”是指给予人或其它动物一种由细胞组成的组合物,该组合物包括细胞悬液或处于基质或组织中的细胞,这些细胞可以是未分化﹑部分地分化或已完全分化。

本文所用的术语“试剂”是指活性试剂或无活性试剂。术语“活性试剂”是指一种能够给予受试者具有生理效果的试剂。活性试剂包括，但不限于生长因子、细胞因子、抗体、细胞、细胞的条件培养基等。术语“无活性试剂”是指一种不能够给予受试者生理效果的试剂。这样的试剂可以称为“药学上可接受的辅料”。无活性试剂包括，但不限于延时释放胶囊等。

本文使用的术语“共同给予”可包括同时或按次序给予两种或多种试剂。所述两种或更多种试剂不必通过相同的途径给药。

本文所用的术语“疗法”、“治疗”或“进行治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病或病征的任何治疗，包括：(a)防止易患所述疾病或病征但尚未确诊的受试者罹患所述疾病或病症；(b)抑制所述疾病或病征，即阻止其发展；(c)减轻和/或改善所述疾病或病征，即消退所述疾病或病征；或者(d)治愈所述疾病或病征，即终止其发展或进展。本发明方法所治疗的受试群包括患病的受试者，以及有罹患所述病征或疾病的风险的受试者。

本文所用的术语“肠胃外给药”和“肠胃外给予”是本领域公认的，并指非肠内给药和局部给药的给药方式，通常是但不一定需要通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、脑内和胸骨内注射或注入。其他给药途径包括鼻内和粘膜。

本文所用的术语“持续释放”、“延长释放”、“延时释放”、“控制释放”或“连续释放”是指通常为治疗剂或药物的制剂，被配制成可随时间释放。

本文所用的术语“可生物侵蚀的”或“生物侵蚀”是指导致物质崩解的物理过程(即解体)和化学过程(即化学键断裂)的结合。

本文所用的术语“可生物降解的”或“生物降解”是指生物剂(即酶、微生物或细胞)可造成物质崩解。

本文所用的术语“可生物再吸收的”或“可生物吸收的”通过细胞活性(即吞噬作用)除去崩解产物。

本文所用的术语“纳米颗粒”是指直径小于100纳米的粒子，表现出与材料相同但较大尺度的颗粒显著新的或增强的独特性能。

本文中的“神经元”﹑“神经元细胞”和“神经细胞”(包括神经祖细胞和神经干细胞)指神经细胞并可互换使用，即负责从身体的一个部分传导神经脉冲到另一部分的细胞。大多数的神经元由三个不同的部分组成：包含细胞核的细胞体，以及两种不同类型的胞质突出物：树突(dendrite)和轴突(axons)。树突是神经元的接收部分，通常是从细胞体扩展出来﹑高度支化并呈厚身的部分。轴突通常是一条细长的突出物，用以从细胞体传导神经脉冲到另一个神经元或其他肌肉或腺体组织。轴突可具有称为“轴突侧支”(axon collaterals)的分支。轴突侧支和轴突的末梢部分会形成许多称为“终端树突”(telodendria)的细长丝状物。终端树突的远端被称为突触端球茎或轴突终端，这些突触端球茎或轴突终端包含储存有神经传导物的突触囊泡。轴突被称为髓鞘(myelin sheath)的覆盖物包围,所述覆盖物是多层和白色的,以磷脂组成并被分割成段，髓鞘由周边神经系统的许旺氏细胞(Schwanncells)和中枢神经系统的寡树突神经胶质细胞(oligodendrocytes)所形成。被覆盖物包围的轴突称为“有髓鞘的”。神经元包括感觉(传入)神经元，把神经脉冲从身体周边的受体传送到大脑和脊髓，和把神经脉冲从较低中枢神经系统传送到较高的中枢神经系统。神经元亦可以是运动(传出)神经元，把神经脉冲从脑和脊髓传达到身体周边的受应体，和把神经脉冲从较高的中枢神经系统传送到较低的中枢神经系统。其他神经元为联络(连接或中介)神经元，把神经脉冲从感觉神经元传送到运动神经元，联络神经元位于中枢神经系统内。传入神经元和传出神经元的突出物排列成捆状物,所述捆状物位于中枢神经系统内时被称为“神经”，位于中枢神经系统外则被称为纤维束。

“神经组织”是指包括任何包含神经细胞或神经的组织。除了神经元外，“神经组织”还包括一个或多个的寡树突神经胶质细胞(oligodendrocytes)、星状细胞(astrocytes)、室管膜细胞(ependymal cells)、小神经胶质细胞(microglial cells)或许旺氏细胞(Schwann cells)。

本文所用的术语“神经系统”是指所有组成脑、脊髓和周边神经的细胞和组织。术语“中枢神经系统”或“CNS”是指脑和/或脊髓，而术语“周边神经系统”或“PNS”則指所有组成周边神经的细胞和组织。

本文所用的术语“神经系统疾病或病症”是指任何會引起或导致中央和/或周边神经系统的功能上和/或物理上不足的狀况。本文所用的术语“中枢神经系统疾病或病症”或“CNS疾病或病症”是指任何會引起或导致脑和/或脊髓的功能上和/或物理上不足的狀况。“周边神经系统疾病或病症”或“PNS疾病或病症”是指任何會引起或导致组成周边神经的细胞和组织其功能上和/或物理上不足的狀况。

本文所用的术语“脑损伤”是指任何和所有与大脑有关的伤害，脑损伤可以由以下的的情况引起:颅骨断裂或穿透(即交通意外、跌倒、枪伤)、神经毒素、感染、肿瘤、代谢异常或闭合性颅脑损伤，如头部急促的加速或减速(即摇晃婴儿综合症、爆炸)，钝伤、脑震荡和脑震荡综合征。

本文所用的术语“星状细胞”(astrocytes)和“星状胶质细胞”(astroglialcells)是指一种在病理状况下或在脑和视网膜移植后变得活跃的神经胶质细胞，这些细胞的中间丝状蛋白(intermediate filament,IF)如胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白(VIM)的表达水平有所上调。“GFAP”是指“胶质纤维酸性蛋白”(glial fibrillary acidprotein)，是成熟星状细胞内其中一种主要的中间丝状蛋白。它常被用作标记，以在发育过程期间从其他胶质细胞区分出星状细胞。

本文所用的术语“轴突性生长”或“轴突生长”指的是神经细胞其轴突的延长或伸展。轴突可以伸展至微米到米的长度。轴突的延长或伸展亦可被称为神经细胞轴突的“再生”，并可能重新建立神经细胞之间的连接性。

本文所用的术语“脊髓损伤”是指脊髓的轴突或神经纤维被中断，损伤一般由机械力所造成。

本文所用的术语“脊髓结痂”是指神经胶质细胞在脊髓损伤部位的集合和增生。在此部位密集的细胞(主要是活跃的星状细胞)及其分泌物会形成称为胶质疤痕的密集细胞斑块。这疤痕可以防止轴突延伸,因而防止轴突再生和恢复功能时受到干扰。

本文所用的术语“神经保护”是指以抑制和/或逆转神经退化的过程。本文所用的“神经退化”是指神经元的渐进性损失。这包括但不限于神经元的即时损失，以及随后所述神经元其连接或邻近的神经元的损失。

附图说明

图1是定量RT-PCR的结果,当中比较了AMP-N细胞和未分化的AMP细胞其中28个基因的表达水平。

图2是定量RT-PCR的结果,当中比较了AMP-N细胞和人神经元细胞其中28个基因的表达水平。

具体实施方式

根据本发明，本领域技术人员可能採用常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整解释。参见，例如Sambrook et al,2001,"MolecularCloning:A Laboratory Manual"；Ausubel,ed.,1994,"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III；Celis,ed.,1994,"Cell Biology:A Laboratory Handbook"Volumes I-III；Coligan,ed.,1994,"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III；Gait ed.,1984,"Oligonucleotide Synthesis"；Hames&Higgins eds.,1985,"Nucleic Acid Hybridization"；Hames&Higgins,eds.,1984,"Transcription AndTranslation"；Freshney,ed.,1986,"Animal Cell Culture"；IRL Press,1986,"Immobilized Cells And Enzymes"；Perbal,1984,"A Practical Guide To MolecularCloning."

本文提供的数值范围应理解为在所述范围的上限和下限之间的每个中间值(除非文中另外明确指出，这些中间值的间隔为下限单位的十分之一)，以及所述范围中任何其他另作说明的值或中间值，都包括在本发明中。这些较小范围的上下限可以独立地被包含于所述较小范围中，并涵盖在本发明中，这些上下限受制于所述范围内任何特定的排除限值。如果所述范围包含一个或两个限值，则排除任何一个限值的范围都包括在本发明中。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。尽管任何与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于实施或检验本发明，以下描述的为优选的方法和材料。

应注意，在本文中和随附的权利要求中，除非文中明示，否则单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复形式的指定对象。

获取和培养细胞

AMP细胞的组合物使用以下步骤进行制备：a)从胎盘收集羊膜，b)使用蛋白酶从所述羊膜离解羊膜上皮细胞，c)在添加有天然来源的或重组产生的人蛋白(即人血清白蛋白)并不含有非人类动物蛋白的基础培养基中培养所述上皮细胞；d)从上述上皮细胞培养物中选取AMP细胞，以及可选择地e)使用另外的添加剂和/或生长因子进一步增殖所述细胞(即重组人类表皮生长因子,EGF)。详情描述于美国专利申请公布文件2006-0222634-A1中，该公布文件通过引用的方式纳入本文。

AMP细胞的培养-AMP细胞培养于基础培养基中。这种培养基包括但不限于上皮细胞培养基(Cascade Biologicals)、OPTI-PRO^TM不含血清培养基、VP-SFM不含血清培养基、IMDM高度富集基础培养基、KNOCKOUT^TMDMEM低渗透压培养基、293 SFM II设定并不含血清培养基(均由Gibco；Invitrogen生产)、HPGM造血细胞生长培养基、Pro 293S-CDM不含血清培养基、Pro293A-CDM不含血清培养基、UltraMDCK^TM不含血清培养基(均由Cambrex生产)、T-细胞增殖培养基和II造血细胞增殖培养基(均由Sigma-Aldrich生产)、DMEM培养基、DMEM/F-12营养混合物培养基(均由Gibco生产)、Ham’sF-12营养混合物培养基、M199基础培养基(均由Sigma-Aldrich生产)和其他等同的基础培养基。这种培养基可选择地包含或者添加有人蛋白。本文使用的“人蛋白”是天然产生的蛋白或使用重组技术产生的蛋白，例如人血清白蛋白。在一些实施例中，所述基础培养基为IMDM高度富集基础培养基T-细胞增殖培养基或II造血细胞增殖培养基、OPTI-PRO^TM不含血清培养基或由以上所组合的培养基，当中的人蛋白为至少添加0.5％及最多10％的人血清白蛋白。在一些实施例中，人血清白蛋白约0.5％-2％。在一具体实施例中，人血清白蛋白为0.5％。人血清白蛋白可以从液体或固体(粉末)而来，包括但不限于重组人血清白蛋白、正常人血清白蛋白及人血分离成分(均由Talecris Biotherapeutics生产)。

在一个实施例中，细胞在无动物产物的体系中培养以避免被非人物质污染。在该实施例中，培养基为IMDM高度富集基础培养基、T-细胞增殖培养基或II造血细胞增殖培养基、OPTI-PRO^TM不含血清培养基、或DMEM培养基，当中可添加最多10％人血清白蛋白(正常人血清白蛋白)。

本发明还考虑使用任何上述的基础培养基，当中来自动物的蛋白以重组人蛋白替代，来自动物的血清如牛血清白蛋白则以人血清白蛋白替代。在一实施例中，所述培养基除了是无动物的之外，还是无血清的。

可选择地使用其他因子。在一个实施例中，人类表皮生长因子(EGF)的浓度为0-1μg/mL。在一个实施例中，所述EGF浓度为大约10-20 ng/mL。所用的添加剂均达临床标准.

从AMP细胞生产新的AMP-N细胞

根据本发明所述的专有及多步骤的方法处理AMP细胞，使其表型改变为具有神经元、神经胶质和干细胞特征的表型。

从AMP-N细胞生产条件培养基(ACCS-N)

本发明的AMP-N细胞可用于生产ACCS-N。在一个实施例中，如本文所述生产AMP-N细胞,以1×10⁶个细胞/mL接种至装有5-30mL培养基、优选10-25mL培养基并且最优选约10-15mL培养基的T75培养瓶中。将所述细胞培养，在培养大約28天后收集ACCS-N。

鉴定AMP-N细胞和ACCS-N

可使用任何本领域技术人员熟知的测定法，以评估AMP-N细胞和ACCS-N的表型和治疗潜力。此类测定法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)抗体阵列、基因阵列、酶联免疫吸附法(ELISA)、质谱、基于细胞的活性测定法、流式细胞分析仪、动物模型等。

制剂、剂量和给药

本发明的组合物可根据其拟定用途以不同方式制备。例如，可以实现本发明的组合物可以是包含本发明的药剂即AMP-N细胞的和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的液体，所述液体为溶液﹑悬液或两者兼有(溶液/悬液)。术语“溶液/悬液”是指液体组合物中的活性药剂，第一部分存在于溶液中，而第二部分以颗粒形式存在于具有液体基质的悬浮物中。液体组合物还包括凝胶。所述液体组合物可以是水性的，或者是软膏、油膏、乳膏或类似的形式。

可以实现本发明的水性悬液或溶液/悬液可包含一种或多种作为助悬剂的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物如纤维素聚合物以及不溶于水的聚合物如交联的含羧基聚合物。本发明的水性悬液或溶液/悬液优选地是粘稠的或粘附性的，甚至更优选地是粘稠的和粘附性的。

可将包含AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的组合物给予一名受试者以提供多种细胞上或组织上的作用，例如治療神经系统的疾病﹑毛病或损伤。本文使用的“受试者”可以指人或非人动物。

所述组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体(任选地包含赋形剂和辅剂)以任何常规的方式配制。合适的配制取决于所选择的给药途径。所述组合物可以与说明其用途(即治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤，或恢复对治疗重要的代谢作用)的书面使用说明一同包装。所述组合物还可在一种或多种生理上可接受的载体中给予接受者。用于AMP-N细胞的载体可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)或含生理浓度的盐混合物的乳酸盐林格溶液﹑基础培养基等。

在一个实施例中，液体组合物为水性的。或者，该组合物可採取软膏的形式。在一个实施例中，该组合物为原位可凝胶化的水性组合物。所述组合物可以包括一浓度的胶凝剂，该胶凝剂能与身体接触时有效地促进胶凝作用。合适的胶凝剂非限制性地包括热固性聚合物如以四取代乙烯二胺的环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物(如泊洛沙胺poloxamine1307)；聚卡波非(polycarbophil)；以及多醣如结兰胶(gellan)﹑角菜胶(carrageena,如kappa-角菜胶和iota-角菜胶)﹑壳聚醣(chitosan)和褐藻胶(alginate gums)。词语“原位可凝胶化”不仅包括具低粘度并可以形成凝胶的液体，还包括具更高粘度﹑在给药时能显着增加粘度或凝胶硬度的液体如半流质和摇变性凝胶。

本发明的水性组合物具有生理性的pH和渗透压。优选地这些组合物运用方法例如在无菌条件下进行制备和包装和/或包含有效劑量的抗微生物防腐剂以抑制微生物的生长。合适的防腐剂非限制性地包括含汞的物质如苯汞盐(例如醋酸苯汞，硼酸苯汞和硝酸苯汞)和硫柳汞；稳定化二氧化氯；四级氨化合物例如苯扎氯铵﹑十六烷基三甲基溴化铵和西吡氯铵；咪唑烷基脲；苯甲酸酯类如对羟基苯甲酸甲酯,对羟基苯甲酸乙酯,对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，以及它们的盐；苯氧基乙醇；氨苯氧基乙醇；苯氧基丙醇；氯丁醇；氯甲酚；苯乙醇；乙二胺四乙酸二钠；山梨酸及它们的盐。

所述组合物可包括一个包含活性試剂的贮藏式制剂以供给药。该贮藏式制剂包含本发明的组合物(即AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N)。包含所述组合物的微粒可以嵌入在生物相容﹑药学上可接受的聚合物或脂质中。贮藏式制剂可设计成在一段较长的时间内释放全部或几乎全部的活性物质。聚合物或脂质基质可在释放全部或几乎全部的活性物质后被充分降解以便从给药部位运走。贮藏式制剂可以是包含药学上可接受的聚合物和已溶解或已分散活性剂的液体制剂。注射后，聚合物透过方法如凝胶化或沉淀在注射部位形成一个贮藏体。

所述组合物可包含植入或插入在合适的疾病或损伤部位中，并在该位置释放活性试剂的固体物品。释放位置优选为通常与所述固体物品紧密接触的神经系统。适合植入或插入的固体物品通常包含可生物侵蚀的或非生物可侵蚀的聚合物。用于制备载有本发明组合物的植入体﹑可生物侵蚀的聚合物非限制性地包括脂族聚酯如聚乙交酯﹑聚丙交酯﹑聚ε-己内酯﹑聚羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯﹑聚氨基酸﹑聚原酸酯﹑聚酐﹑脂族聚碳酸酯和聚醚乳糖。硅弹性体为合适的非生物可侵蚀聚合物的例子。

所述AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N可整合或植入支持基质,所述支持基质包括与接受者相容的，并且可降解成对所述接受者无害的产物的基质。

基质可以是天然的和/或合成的可生物降解基质。天然可生物降解的基质包括血浆凝块(例如来自哺乳动物)、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白基质。合适的合成基质材料必须是生物相容的，以排除免疫并发症。它还必须是可再吸收的。所述基质应能够被制成多种不同形状，并应具有足够强度以防止在植入时坍塌。最近的研究表明，由聚乙醇酸制成的可生物降解的聚酯聚合物符合所有上述标准(Vacanti，etal.J.Ped.Surg.23：3-9(1988)；Cima,et al.Biotechnol.Bioeng.38：145(1991)；Vacanti,et al.Plast.Reconstr.Surg.88:753_9(1991))。其他合成的可生物降解的支持性基质包括合成的聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。其他合成聚合物以及将组合物整合或植入基质的方法在现有技术中是已知的。参见，例如美国专利4,298,002和5,308,701。

生物可降解的聚合物基质的一个优点是，可将AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N直接整合至所述支持基质中，使得組合物可在体内随着所述支持基质降解而缓慢释放。除所述AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N外，还可以将包括以下物质整合至所述基质中或者与所述基质结合提供：营养素、生长因子、诱导分化或去分化(即使已分化的细胞失去分化特征并获得诸如增殖和更一般性功能的特征)的诱导剂、分泌产物、免疫调节剂、炎症抑制剂、消退因子、增强或允许淋巴网络或神经纤维向内生长的生物活性化合物、透明质酸、购自提供商诸如Co11aborative Research SigmaChemical Co.的药物(其为本领域技术人员已知的并且是市售的，同时带有关于多少量构成有效量的说明书)、生长因子如表皮生长因子(EGF)以及肝素结合的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。类似地，可合成制造含肽例如连接肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合物，用于形成基质(参见，例如美国专利4,988,621,4,792,525,5,965,997,4,879,237和4,789,734)。

在另一个实施例中，可将所述AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N整合至凝胶基质(例如来自Upjohn Company的Gel foam)中。多种包封技术已被开发(例如Lacy etal.，Science 254：1782-84(1991)；Sullivan et al.,Science252：718-712(1991)；WO 91/10470；WO 91/10425；美国专利5,837,234；美国专利5,011,472；美国专利4,892,538)。在涉及直接物理触及病态或损坏组织的开放式手术过程中，所述AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N递送制品的全部所述形式都是可选的。可间断地重复给予这些组合物，直至达到所需的治疗效果。

本发明使用的三维基质为结构化基质,以提供支架以引导组织的愈合和形成过程。支架可采取的形式包括纤维、凝胶、织物、海绵状片层和使用复杂的固体自由成型建造(SFFF)方法建造复杂的3-D结构,当中包括孔洞和通道。本文使用的术语“支架”是指三维(3D)结构(基底和/或基质)。它可由生物组分、合成组分或上述两者的结合构成。此外，它可天然地由细胞构建或者是人工构建的。另外，所述支架可包含在适当条件下有生物活性的组分。所述支架的结构可包括网状物、海绵，或者由水凝胶形成。

支架的设计和构建以形成三维基质是很重要的。所述基质应该是易弯曲的、无毒的、具有多孔并可被注入的模板，以容许血管向内生长。基质的孔应允许血管向内生长。通常这些孔为约100-300微米﹑相互联接的孔，即孔与孔之间具有100-300微米的间质空间，亦可使用具有更大开口的孔。所述基质的形状应使表面积最大化，以使营养物、气体和生长因子充足地扩散。现时，多数优选使用较能对抗压缩的多孔结构，虽然已经有人证明即使基质其六面中有一面或两面被压缩，基质仍能有效地使组织生长。

所述聚合物基质可被制成易弯曲的或坚硬的，取决于所需的最终形式、结构和功能。例如，为了修复缺损，可将易弯曲的纤维垫切割成与整个缺损大小相若的大小，然后根据需要将之放到由外科手术形成的缺损处。使用纤维基质的一个优点是，在植入时更容易将基质结构重新定形或重新排列。

本发明还提供了AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N与上述支持基质的任一种以及源自羊膜的膜的结合递送。所述膜可以是本发明所述用于回收AMP细胞的方法的副产物，或者通过例如以下文献描述的其他方法得到：美国专利6,326,019，其中描述一种用于制备、保存和使用来自人羊膜的外科移植物的方法；US 2003/0235580，描述重建的和重组的羊膜用于向宿主某部位持续递送治疗分子、蛋白或代谢产物；U.S.2004/0181240，描述覆盖组织表面的羊膜，所述羊膜可防止粘附、排除细菌或抑制细菌活性，或者促进愈合或组织生长；以及美国专利4,361,552，它涉及交联羊膜的制备以及所述羊膜在治疗烧伤和伤口的方法中的用途。根据本发明，AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N可整合至这些膜之中。

本领域技术人员可容易地确定按目的確定AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的合适浓度或剂量。本领域技术人员应了解，优选的剂量为对有需要患者产生治疗效果(如治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤)的剂量。当然，所述AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的合适剂量需要在使用时根据经验并基于多个可变因素确定，所述可变因素包括但不限于被治疗的疾病、损伤、毛病或状况的严重度和类型；患者的年龄、体重、性别、健康状态；所述患者正接受的其他药剂和治疗等等。本领域技术人员还应了解，给药的剂量数目(剂量方案)还需要根据经验基于例如被治疗的疾病、损伤、毛病或状况的严重度和类型来确定。在一实施例中，给予一个剂量是充分的。另一些实施例则考虑2个、3个、4个或更多个剂量。

本发明提供一个透过给予治疗有效量的AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N以治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤的方法。“治疗有效量”指一个能充分引发一治疗效果的AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的剂量。因此，在跟本发明相符的给药剂量单位中，AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的浓度对治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤是有效的。

作为非限制性实施例，AMP-N细胞的浓度约为1×10⁷–1×10⁸细胞/mL、优选约2.5×10⁷–7.5×10⁷细胞/mL并且最优选约5×10⁷细胞/mL。细胞混合物的容量将取决于几个不同的情况，并且只能由主治医师的诊断来判定。当然，所述AMP-N细胞的合适剂量需要在使用时根据经验并基于多个可变因素确定，所述可变因素包括但不限于被治疗的疾病、损伤、毛病或状况的严重程度和类型；患者的年龄、体重、性别、健康状态；所述患者正接受的药剂和治疗等等。

此外，本领域技术人员可按目的容易地确定ACCS-N和/或合并的ACCS-N的合适浓度或剂量。一个优选的剂量范围是每平方厘米施用面积使用约0.1至1000微克。其他优选的剂量范围为每平方厘米施用面积使用1.0至50微克。在一实施例中，预计较少量的ACCS-N和/或合并的ACCS-N就有治疗效用。本领域技术人员还应了解，给药的剂量数目(剂量方案)还需要根据经验基于例如被治疗的疾病、损伤、毛病或状况的严重度和类型来确定。在一实施例中，给予一个剂量是充分的。另一些实施例则考虑2个、3个、4个或更多个剂量。

在一实施例中，可共同给予AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N和其他试剂(包括活性或无活性的试剂)以治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤。活性试剂包括，但不限于细胞因子、趋化因子、抗体、酶抑制剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、免疫抑剂，以及其他的细胞类型等。无活性试剂包括载体、稀释剂、稳定剂、胶凝剂、运载工具、ECM(天然和合成的)、支架、基质、纳米颗粒等。当共同给予AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N和其他有药学活性的试剂时，或需要较少的AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N以对治疗有效。

可以透过递送装置将AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N注射至受试者的目标位置以给药，例如可通过管﹑导管﹑针筒﹑针头﹑喷雾器﹑喷散器等将所述AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N导入至受试者中的所需位置。

给药途径包括并指非肠内、局部、鼻內、对跨、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、脑内和胸骨内的给药方式。给药的合适途径取决于疾病﹑毛病﹑损伤和给药的部位。

给予AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的时间取决于被治疗的神经系统的疾病﹑毛病或损伤的类型和严重度。在一个实施例中，在神经系统的疾病﹑毛病或损伤确诊后尽快地给予患者AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N。在另一实施例中，在确诊后给予患者多于一次的AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N。

持续释放组合物

所述AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N可配制成持续释放的组合物。本领域技术人员应当熟知制备治疗剂(包括以蛋白为基础的治疗剂如AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N)的持续释放组合物的方法。

持续释放组合物可由本文中所述的任一方法制备。例如，多泡脂质体制剂技术可用于蛋白和肽治疗剂的持续释放。Qui，J.等人(ACTA Pharmacol Sin，2005，26(11)：1395-401)描述了以上述方法配制持续释放的干扰素α-2b。Vyas，S.P.等人(Drug Dev IndPharm，2006，32(6)：699-707)描述了在多泡脂质体中包封聚乙二醇化干扰素α。AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N适合用于多泡脂质体持续释放的制剂中。

纳米颗粒技术也可用于制备持续释放组合物。例如，Packhaeuser，C.B.等人(JControl Release，2007，123(2)：131-40)描述了以装载了胰岛素的二烷基氨基烷基-胺-聚乙烯醇-g-聚(丙交酯共乙交酯)纳米颗粒为基础的可生物降解﹑肠胃外贮藏系统，并结论出以纳米颗粒为基础的贮藏体适合用于设计针对生物活性大分子(即蛋白)的控制释放装置。Dailey，L.A.等人(Pharm Res 2003，20(12)：2011-20)描述了以支化聚合物DEAPA-PVAL-g-PLGA为基础的无表面活性剂并可生物降解﹑用于气溶胶疗法的纳米颗粒，并结论出DEAPA-PVAL-g-PLGA为多功能性的药物递送系统。AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N适合用于基于纳米颗粒的持续释放制剂。

基于聚合物的持续释放制剂也是非常有用的。Chan，Y.P.等人(Expert Opin DrugDeliv，2007，4(4)：441-51)提供了Medusa系统(Flamel Technologies)的综述，所述Medusa系统用于持续释放的蛋白和肽疗法。迄今为止，Medusa系统已在动物模型(大鼠、狗、猴子)中以及在肾癌(IL-2)和丙型肝炎(IFN-α(2b))患者的临床试验中被应用以皮下注射IL-2和IFN-α(2b)。Chavanpatil，M.D.等人(PharmRes，2007，24(4)：803-10)描述了表面活性剂聚合物纳米颗粒，作为用于水溶性分子的持续且增强细胞递送的新平台。Takeuchi，H.等人(AdvDrug Deliv Res，2001，47(l)：39-54)描述了用于递送肽药物的粘附性纳米颗粒系统，该系统包含脂质体和聚合物纳米颗粒。Wong，H.L.等人(Pharm Res，2006，23(7)：1574-85)描述了一个新的聚合物-脂质杂合系统，该系统已被证明可提高阿霉素对多抗药性乳癌细胞的细胞毒性。AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N适合用于上述持续释放的制剂方法中。

另外，本领域技术人员熟悉的但未在本文中具体地描述的其他持续释放方法，也适合使用于AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N。

药物组合物-本发明提供了AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N及可药用载体的药物组合物。术语“可药用”是指由美国联邦政府或州政府的管理机构批准或者在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍公认的药典中列出可用于动物、尤其是用于人。术语“载体”是指与所述组合物一同给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、麵粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、乾脱脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。根据需要，所述组合物还可含有少量的湿润剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、持续释放制剂等的形式。合适的药物载体的实例记载于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中，有些则是本领域技术人员所熟悉的。

可以实现本发明某些实施例的药物组合物包括有疗效量的活性剂和药学上可接受的载体。这种药物组合物可以是液体﹑凝胶﹑软膏﹑油膏﹑缓释制剂或其他适用在治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤。所述药物组合物包含本发明(即AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N)和可选地至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。

本发明的药物组合物可配制成中性形式或盐形式。可药用的盐包括那些用游离氨基形成的盐，例如盐酸盐、磷酸盐、醋酸盐、草酸盐、酒石酸盐等，以及那些用游离羧基形成的盐，例如钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、氢氧化铁盐、异丙胺盐、三乙胺盐、2-乙氨基乙醇的盐、组氨酸盐、普鲁卡因盐等。

治疗试剂盒-本发明还提供了一种生产制品，包括包装材料和包含在所述包装材料中的本发明的药物组合物，其中所述药物组合物包含AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N。所述包装材料包含一个标签或药物说明书，以说明内含的AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N可用于治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤。

使用AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的模范性治疗

本文所用的术语“脑损伤”是指任何和大脑有关的所有伤害，脑损伤可以由以下的的情况引起:颅骨骨折或穿透、其他疾病的发展过程、毒素或感染、或闭合性脑损伤(如头部急促的加速或减速)。

闭合性脑损伤或穿透性头部损伤可以导致创伤性脑损伤(TBI)。当头部突然受到外物的猛烈撞击但头骨未被时穿透时,会导致闭合性脑损伤。当外物穿透头骨并进入脑组织时，会导致穿透性头部损伤。头骨裂开或断裂会引致颅骨骨折。当断裂的头骨的碎片压着大脑组织，会引致凹陷性颅骨骨折。物件如子弹刺穿颅骨时，会在脑组织留下一个明显和局部的损伤,并引致穿透性颅骨骨折。颅骨骨折可引起大脑挫伤。

缺氧是另一个可能导致大脑损伤的原因。即使有足够的血液流向器官组织，但组织缺乏氧气供应，亦会导致缺氧。低氧是指氧气供应减少，而不是完全缺乏氧气。局部性缺血是指血液供应不足，如脑肿胀的情况。在任何情况下，如果没有足够的氧气，会引发一个称为缺血性串联反应的生化串联反应，大脑细胞可以在几分钟内死亡。这种类型的损伤常见于濒临溺死的人士﹑心脏病发作的患者，或因遭受了其他伤害后显着失血并减少血液流向大脑的人士。

所有上述的结果会导致神经退化,即逐渐捐失大脑中的神经元。创伤性脑损伤后,会发生多个生理事件并导致脑组织的神经退化。这些事件的例子包括：脑水肿、血管完整性受破坏、免疫和炎症反应的增加、髓鞘脱落和脂质过氧化。因此，本发明的方法有用于减少和/或预防由上述生理事件导致的神经退化。具体而言，本发明的方法可以减少或消除中枢神经系统受创伤性脑损伤后出现的神经元细胞死亡(直接或间接)、水肿、局部缺血，以及增强组织的生存力。

脊髓损伤-脊髓损伤的常见原因包括椎骨骨折(椎骨碎片或会移位并导致损伤,脊髓或因相关震荡而受损)、血管损坏或新生神经根挫伤。椎骨脱位也会造成脊髓损伤；椎间盘破裂一般会使椎骨脱位，甚至部分或完全地切断脊髓。穿透性损伤亦可能部分或完全地切断脊髓。硬脑膜外出血和硬脊膜下血肿会使脊髓受压并导致渐进性的下肢瘫痪。间接脊髓损伤包括因头部受击或脚部受掷引致的损伤。

髓内损伤可由下列原因造成:脊髓直接受压或通过脊髓传递的压力、骨骼引致的脊髓撕裂、血管因脊髓传递的压力破裂并失血至脊髓。弱化血管破裂亦会引致髓内出血和形成血肿。脊髓前动脉受压、吻合血管受压或主要血管受损后或会导致缺血性损害(Gilroy,in Basic Neurology,McGraw-Hill,Inc.New York,N.Y.(1990)。

脊髓损伤可分为两大类，完全性损伤和不完全损伤。损伤的分类或在复原期间有所改变。完全性脊髓损伤的特征通常包括失去感觉和运动能力，并通常与脊髓瘀伤、失血至脊髓或脊髓受压造成的脊髓损伤有关。脊髓很少会被切割并切断。一般来说，完全性脊髓损伤会导致损伤部位以下的感觉和运动能力完全丧失。

不完全性脊髓损伤通常不会导致损伤部位以下会完全失去感觉和运动能力。用以介定不完全性脊髓损伤的模式包括:1)由于脊髓前区内运动和感觉传导路径损坏而导致的前脊髓综合症。其影响包括丧失活动能力和整体的感觉，虽然仍可透过完整的传导路径获得部分感觉；2)因脊髓的颈部区域的中心受损而导致的中央脊髓综合症。这种损害会影响负责大脑之间传递信号至脊髓以控制活动的皮质脊髓。中央脊髓综合征的患者的胳膊会感无力或瘫痪,并失去部分感官功能。腿部力量和感觉功能的丧失会较胳膊少。许多中央脊髓综合征患者会自然地恢复运动功能，某些患者会在损伤后首六周获得相当程度的复原；3)因脊髓的右或左侧受损而导致脊髓半切综合症(Brown-Sequard syndrome)。对应脊髓受损一侧的身体，其损伤部位以下会完全失去感觉和运动能力。另一侧的身体则由于脊髓的交叉路径受损而丧失感受温度和疼痛的功能；4)个别神经细胞受损，因而使受伤的神经根对应的身体区域失去感觉和运动功能。因此，这些损伤的症状取决于受影响的神经根的位置和功能；5)脊髓挫伤,即脊髓损伤最常见的类型。其中,脊髓出现瘀伤而不是被切断，但在损伤区域附近的血管可能出现炎症和出血。脊椎挫伤可能会导致暂时(通常是一到两天)的不完全或完全性脊髓衰弱，或较长期的不完全或完全性脊髓衰弱(包括永久的不完全或完全性脊髓衰弱)。

治疗脊髓损伤的目标包括促进运动功能的恢复。另一个目标是促进感觉的恢复。各种方式曾被试用以恢复运动和感觉功能，但大多数只取得有限的成功。这些研究包括在损伤部位应用各种生长因子和细胞因子、以及移植脑衍生的干细胞或健康脊髓组织至损伤部位。干细胞移植疗法是目前最有前景的治疗方法之一(例如，Cummings,B.J.,et al.,Neurol Res 200628(5):474-81；Pallini,R.,et al.,Neurosurgery 200557(5):1014-25；Cummings,B.J.,et al.,PNAS USA 2005102(39):14069-74；Sankar,V.et al.,Neuroscience 2003118(1):11-7)。

神经系统退行性疾病

阿兹海默氏症-阿兹海默氏症(Alzheimer's disease,AD)为痴呆症最常见的类型，是一种神经退化疾病，其特征为渐进性认知衰退、日常生活活动能力下降和出现神经精神症状或行为变化。最明显的早期症状是丧失短期记忆，患者通常先出现轻微的健忘并续渐变得更加明显，但较旧的记忆会得以保存。随着病情的发展，认知障碍延伸至语言、技巧性动作、识别、以及决策和规划能力。病理过程主要因位于颞皮质和额叶皮质的神经元损失或萎缩，以及因淀粉样蛋白斑(amyloid plaques)沉积和神经原纤维缠结而引起的炎性反应。

虽然导致AD的最终原因仍未确定，但已知遗传因素是重要的并已在少量家族性及早发性的AD病例中鉴定出三个不同的基因显性突变。就较普遍的迟发性AD而言，载脂蛋白E(ApoE)是唯一被重复确定为AD的易感基因。

进行尸检时，淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结在显微镜下清晰可见。在解剖的层面，AD可根据脑部的弥漫性萎缩，以及大脑皮层和皮层下的某些地区的神经元、神经元突出物和突触损失而确认。这会导致受影响的区域的重大萎缩。

当前治疗包括乙酰胆碱酯酶的抑制剂(例如多奈哌齐donepezil(Aricept)、加兰他敏galantamine(Razadyne)和利凡斯的明rivastigmine(Exelon))、天然银杏叶提取物、NMDA拮抗剂(例如美金刚memantine(Akatinol、Axura、Ebixa和Namenda))，以及心理社会疗法(如咨询、心理治疗、回忆治疗、现实导向、行为增援和认知康复训练)。本发明的组合物和方法可有效地治疗AD。

额颞叶痴呆症(Frontotemporal dementia,FTD)-是与大脑额叶和颞前叶萎缩(以前版称作匹克氏病Pick’s disease)相关的临床综合症。现时的分类方法将原发性渐进失语症(primary progressive aphasia)、语义痴呆症(semantic dementia)及匹克氏病组合在一起并统称为额颞叶痴呆症(FTD)。有些医生亦建议增加皮质基底退化(corticobasaldegeneration)和渐进核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)至FTD，并统称为匹克氏综合症(Pick Complex)。在当今的定义，FTD的症状可分为两项临床症状模式:(1)行为改变及(2)语言障碍。行为改变模式其行为特征可以是冲动型(不受抑制)或闷郁及没精打采(萎靡)。语言障碍模式的主要病征是功能语言紊乱，包括在作出及了解对话时出现困难，并通常与行为改变模式的症状结合出现。空间认知技能和记忆则不受影响。FTD是有强烈遗传因素并经常在家族间发生。本发明的组合物和方法可有效地治疗FTD。

帕金森病(Parkinson’s Disease)是由于大脑中被称为黑质的区域的神经元逐渐损坏或退化所引起。当正常运作时，这些神经元会产生重要的大脑化学物质多巴胺。多巴胺为神经传导物的一种，负责黑质和大脑的另一个区域纹状体之间的通信,以协调肌肉活动的顺畅和平衡。缺乏多巴胺会导致神经功能异常，因而丧失控制身体动作的能力。

帕金森病目前主要使用药物治疗，或在某些情况下进行外科手术。两种常用于治疗帕金森病并配合药物治疗的方法包括:1)减缓多巴胺在脑中的损失和2)改善帕金森病的症状。大多数帕金森病的患者在得到适当的药物治疗后，其症状得以减轻。如果药物疗效不足，也可采用新的、具高疗效和安全的手术治疗。目前可用于治疗帕金森病的药物包括息宁(Sinemet)(左旋多巴/卡比多巴levodopa/carbidopa)左旋多巴(Levodopa)(也称为L-多巴L-dopa)，这是最常用和最有效的处方药物，用于控制帕金森病的症状；金刚烷胺(Symmetrel)可能对于患有轻度帕金森病的患者有帮助，但它常常引起显着的副作用，包括溷乱和记忆力下降的问题；抗胆碱能药(安坦，Cogentin)通过降低乙酰胆碱的量，以恢复多巴胺和乙酰胆碱两个脑化学物质之间的平衡。但上述药物可损害记忆和思维，尤其是对老年人。因此，现时已很少人使用上述药物；帕定平锭剂(Eldepryl)和丙炔苯丙胺(Deprenyl)是相同药物的两个不同名称。这种药物有助通过防止多巴胺被破坏以保持可用的多巴胺的数量。某些引起争议的证据显示，这种药物可以减缓帕金森病，特别是在该疾病的早期。尽管有争议性，由于大多数患者对这种药物的耐受性良好，很多专家都会建议使用。答是托卡朋(Tasmar)和柯丹(Comtan)均为COMT的抑制剂。当COMT被抑制，多巴胺可以得以保留和更有效地被使用，从而减少帕金森氏病的症状。COMT抑制剂也可以提高左旋多巴的药效。

现时选用的手术包括脑部深层刺激手术以灭活引起帕金森病和与其相关的症状的脑部分，而不破坏大脑。在脑部深层刺激时，电极放置在苍白球内。这些电极通过电线连接到植入至胸部皮肤下的起搏器(即脉冲产生器，或IPG)。被启动后，起搏器会发送连续电脉冲至大脑的目标区域，以阻断导致震颤的脉冲。这手术能达到切除丘脑手术和苍白球切除手术的相同效果，但不会真正破坏脑部。患者可以使用手持式磁铁或接入控制装置以开启或关闭所述刺激。本发明的组合物和方法可有效地治疗帕金森病。

亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease,HD)是由大脑某些区域的神经元的基因编程退化而引起。这退化导致动作不受控制、智力损失以及情绪困扰。HD是一种家族性疾病，患有HD的父母的正常基因发生突变,并将之传给孩子。每个孩子有50％的机会从患有HD的父母获得HD基因。如没有获得HD基因，孩子就不会发病，并且不会把HD基因传给后代。拥有HD基因的人士迟早会患上HD。HD的一些早期症状包括情绪波动、抑郁、烦躁、学习新事物、记住事实或者作出决定。随着病情的发展，集中智力工作变得越来越困难和患者或有自我进食和吞咽的困难。疾病进展的变化速度和发病年龄因人而异。

当前HD的治疗方法主要是解决症状，而不是引病原因。例如，镇静剂如氯硝西泮(克诺平,Klonopin)和抗精神病药如氟哌啶醇(哈泊度,Haldol)和氯氮平(可致律锭,Clozaril)是用来帮助控制动作、猛烈的情绪爆发和幻觉。其他药物如氟西汀(百忧解，Sarafem)、舍曲林(左洛复,Zoloft)和去甲替林(Aventyl，Pamelor)，用于帮助控制抑郁症和一些常出现于HD患者的强迫行为。药物如锂(Eskalith，Lithobid)可以帮助控制极端情绪和情绪波动。用于治疗HD症状的药物副作用包括过度兴奋﹑疲劳和躁动。在一些情况下，抗精神病药可能会引起与帕金森病征状相似的副作用，包括脸部和身体不自主地抽搐(迟发性运动障碍)。由于HD可以削弱言语能力，患者往往需要接受语言治疗。本发明的组合物和方法可有效地治疗HD。

运动神经元疾病

肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)-有时也被称为葛雷克氏症(Lou Gehrig's disease)，是由运动神经元退化引起的渐进性和致命的神经退化疾病。ALS的特征为中枢神经系统中负责控制随意肌肉运动的神经元的逐渐退化。这种疾病会导致整个身体的肌肉无力和萎缩。上位运动神经元和下位运动神经元会退化或死亡，并停止发送信息到肌肉。在无法运作的情况下，肌肉会逐渐变弱和萎缩。最后，大脑完全失去引起和控制随意运动的能力。此疾病不一定如阿兹海默氏症或其它神经疾病令病人的智力运作变得衰弱。相反，晚期病者患可保持与发病前相同的记忆、性格和智力。

当前用作治疗ALS的方法非常有限。利鲁唑主要处方给有吞咽因难的患者，此药通过减少运动神经元受损害，以延长患者数月的寿命。另一种药物加巴喷丁是治疗癫痫发作的药物，被认为可减少谷氨酸的制造。它对某些ALS患者可能有作用。本发明的组合物和方法可有效地治疗ALS。

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是遗传性的脊髓运动神经元疾病,此病由运动神经元退化而引起。这种疾病会导致随意肌肉无力和消瘦。腿部肌肉无力通常比在胳膊更严重。全部儿童时期病发的SMA都是染色体隐性基因疾病。即是,此病会在家族间发生，兄弟姐妹或同一代的表亲或会发生多于一个的病症。SMA有许多类型，较常见的有：SMA一型，也被称为韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)，可在出生前或出生后的数月内确诊。在怀孕的最后几个月胎动有可能减少。症状包括四肢和躯干软弱无力、手臂和腿部动作微弱、吞咽和进食困难以及呼吸障碍。受影响的儿童从无法坐或站立，并通常在两岁前死亡。SMA二型症状一般在出生后3至15个月之间出现。孩子可能有呼吸困难、四肢软弱、减少或缺乏深部肌腱反射和手臂、腿或舌头的肌肉抽搐。这些孩子可以学习坐，但永远无法站立或行走。患者的预期寿命因人而异。SMA三型(Kugelberg-Welander病)的症状在2和17岁之间出现，包括行走方式异常；跑步、上台阶或从椅子上站起有困难以及手指轻微震颤。肯尼迪氏综合征(Kennedy syndrome)或渐进性脊髓延髓肌萎缩(spinobulbarmuscular atrophy)可能在15至60岁之间出现。SMA三型的特征可以包括舌头和面部的肌肉虚弱、吞咽困难、语言障碍，并使男性乳腺过度发育。该疾病的发展通常是缓慢的。伴随有关节挛缩(即关节持续地挛缩,并且肢体姿势持续异常)的先天性SMA是一种罕见的疾病。症状包括严重挛缩、脊柱弯曲、胸部畸形、呼吸困难、下巴异常地小及上眼睑下垂。

虽然现时没有药物用于治疗SMA，但医学上可以做很多事情以控制病情，特别在呼吸管理、营养和康复护理方面。目前正在研究的药物包括丁酸盐、丙戊酸、羟基脲和利鲁唑。本发明的组合物和方法可有效地治疗SMA。

渐进性延髓麻痹(Progressive bulbar palsy)是一种负责控制咀嚼、吞咽和说话的肌肉的神经受影响而引起的疾病，因而使上述功能越来越困难。由于吞咽困难，食物或唾液常常被吸入(抽入)肺部，引起窒息或作呕和增加肺炎的风险。死亡一般在病发一至三年后发生,并通常由肺炎引起。大多数治疗用于管理症状。利鲁唑或对部分病人有效。本发明的组合物和方法可有效地治疗渐进性延髓麻痹。

原发性侧索硬化症(Primary Lateral Sclerosis)和渐进性假延髓麻痹(Progressive Pseudobulbar Palsy)是肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateralsclerosis)的变异病种,两者都是罕见和缓慢渐进的。原发性侧索硬化症主要影响胳膊和腿部，而渐进性假延髓麻痹主要影响面部﹑下颌和咽喉的肌肉。患者情绪可能会变得不稳定。不适当的情绪爆发是常见的。这两种疾病会引起严重的肌肉僵硬和无力。患者通常在数年后渐渐变得完全残障。大多数治疗用于管理症状。利鲁唑或对部分病人有效。本发明的组合物和方法可有效地治疗原发性侧索硬化症和渐进假性延髓麻痹。

小儿麻痹症后期综合症-小儿麻痹症的康复者的肌肉可能在大概十五年或以后感到疲惫、疼痛和无力。如肌肉组织会日益消瘦，表示小儿麻痹症有可能复发。现时没有药物用于治疗小儿麻痹症后期综合症。大多数治疗用于管理症状。药物主要用于治疗三个症状，包括:肌肉无力、疲劳(个别肌肉疲乏和全身疲乏)、和痛楚(即小儿麻痹症后的疼痛、因过度使用而引起的疼痛、生物力学疼痛及骨痛)。本发明的组合物和方法可有效地治疗小儿麻痹症后期综合症。

脱髓鞘疾病(Demyelinating Diseases)

A.后天性

多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)-是一个未能预知的中枢神经系统疾病，随着脑和身体其它部分之间的通信中断，其病情可以是较是温和至近乎残障。许多研究者认为多发性硬化症是一种由于神经绝缘性的髓鞘被攻击而引起的自身免疫性疾病。大多数人在20至40岁之间首次经历多发性硬化症，初时症状大多是视力模煳或复视，红、绿颜色扭曲，甚至一只眼睛失明。大多数患者出现四肢的肌肉无力及协调和平衡困难。症状可能会严重至影响行走甚至站立，并且在最坏的情况下变得部分或完全瘫痪。大多数多发性硬化症患者也表现出感觉异常。其他常见症状包括言语上的障碍、震颤、头晕，亦有部分患者出现听力下降。大约有一半多发性硬化症患者有认知障碍，如集中力﹑注意力﹑记忆力和判断力变差，但这些症状通常是轻微的。多发性硬化症有多种形式，包括良性的多发性硬化症﹑复发和缓解型多发性硬化症(最常见的形式)﹑继发和渐进的多发性硬化症﹑原发和渐进的多发性硬化症﹑恶性的多发性硬化症(即马尔堡变种Marburg variant)和慢性的多发性硬化症。

几种可用于治疗多发性硬化症的药物，包括干扰素β-1b干扰素β-1a高剂量/频率干扰素β-1a格拉默(glatiramer,)，米托蒽醌(mitoxantrone,)和皮质类固醇(corticosteroids)。本发明的组合物和方法可有效地治疗多发性硬化症。

同心圆性硬化症(Balo’s concentric sclerosis,Balo疾病)-是一种罕见和渐进性的多发性硬化症变异病种。它通常在成年期第一次出现，但亦曾有儿童的病例。多发性硬化症一般慢慢由好转坏，但同心圆性硬化症往往进展得十分迅速。症状包括头痛﹑抽搐﹑逐渐瘫痪﹑不随意肌痉挛和认知损失。该疾病的特征在于完整髓鞘(负责保护和包围神经纤维的脂肪物质)在脑部各部分和脑干内交替出现失去髓鞘的环带(脱髓鞘)。症状可进展迅速至数周或缓慢至两到三年。用于治疗多发性硬化症药品亦对同心圆性硬化症有效。本发明的组合物和方法可有效地治疗同心圆性硬化症。

急性散播性脑脊髓炎(Acute disseminating encephalomyelitis,ADEM)-是在脑和脊髓中短暂但强烈的炎症，会使髓鞘损伤。此症通常在病毒感染后发作，或在较少机会下在接种麻疹、腮腺炎或风疹的疫苗后发作。ADEM的症状迅速出现，开始时有与脑炎相似的症状如发热、乏力、头痛、恶心和呕吐，在严重的情况下会出现癫痫和昏迷。此症也可能会损坏白质，因而导致神经症状如单眼或两眼的视力丧失，虚弱甚至瘫痪，并且难以协调随意肌的运动。ADEM有时会被误诊为首次发生并严重的多发性硬化症。然而，ADEM通常具有脑炎的症状(如发热或昏迷)，以及髓鞘损伤的症状(视力丧失，麻痹)。此外，ADEM通常是发作一次，而多发性硬化症在一段时期内可发作多次。儿童比成年人更容易患有ADEM。本发明的组合物和方法可有效地治疗急性散播性脑脊髓炎。

视神经脊髓炎(Neuromyelitis Optic,Devic’s Disease)-是中枢神经系统的炎性疾病，其中髓鞘发炎和受损,并大多数仅影响视觉神经和脊髓。此症通常会导致单眼或两眼暂时失明，但偶尔会导致永久失明。此症亦可能由于脊髓损伤，导致腿或手臂有不同程度的无力或麻痹、感觉丧失和/或膀胱和肠功能障碍。本发明的组合物和方法可有效地治疗视神经脊髓炎。

横贯性脊髓炎(Transverse myelitis,TM)-是脊髓发炎引致的神经性综合征。横贯性脊髓炎不常见但亦非罕见。术语脊髓炎是脊髓炎症的普遍性术语；横贯性则指该症涉及脊髓某一横贯的节段。此症可发生在成人和儿童。本发明的组合物和方法可有效地治疗横贯性脊髓炎。

B.遗传性

脑白质营养不良(Leukodystrophie)是指由于脑的白质逐步退化而引致的一组毛病。此症由髓鞘生长底发育不良引起。髓鞘是由至少十个不同的分子组成的复合物。每种类型的脑白质营养不良都是由基因缺陷引致的，所述基因负责控制组成髓鞘的某一个分子的代谢或生产。不同类型的脑白质营养不良包括:肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、克拉伯病(Krabbe disease)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、卡纳万病(Canavan disease)、儿童中的失调(ataxia)及中枢神经髓鞘形成不良(centralhypomyelination)(或CACH或白质消失疾病)、亚历山大症(Alexander disease)、雷夫叙姆病(Refsum disease)和脑腱黄瘤病(cerebrotendineous xanthomatosis)。本发明的组合物和方法可有效地治疗脑白质营养不良。

周边神经疾病

最常见的周边神经病变其症状包括手和脚部疼痛和麻木。疼痛通常被描述为刺痛或烧灼，而丧失知觉就如穿着薄长袜或手套般的感觉程度。导致周边神经病变的成因包括:创伤性损伤(即切断远端的背根神经节)或手术切口、神经压迫(即三叉神经痛)、疱疹后感染(即带状疱疹感染)、艾滋病病毒感染、代谢问题(即糖尿病)、遗传性感觉和自主神经病变、接触有毒物质(即由神经毒性化疗引起的周边神经病变)以及药物(即抗逆转录病毒药物)。在很多情况下，周边神经病变的症状可随时间改善，尤其是当引起症状的成因获解决或至少受控。最初用于治疗其它病症的药物，例如用以治疗癫痫和抑郁症的药物，通常可用于降低周边神经病变的疼痛症状。但可选用的治疗仍然是有限的。本发明的组合物和方法可有效地治疗周边神经病变。

本文所用的术语“神经系统损伤”是指对神经组织的任何损伤并包括由以下引起的损伤:骨折或颅骨或椎骨穿透(如交通意外、跌倒、枪伤而导致脑部或脊髓受损)、疾病(神经毒素、感染、肿瘤、代谢异常、基因异常或神经退化疾病等)、使大脑损伤的闭合性脑损伤(如头部急促的加速或减速，即摇晃婴儿综合症)、或影响周边神经的损伤或疾病。这些损伤可能对身体和心理机能造成破坏性的终身影响。

熟练的技术人员将认识到，任何的标准方法和方式在临床实践和临床开发一种治疗神经系统疾病、病症或损伤的和当前的所有都适合实践本发明的方法。施用路线、制剂、与其他试剂共同施用(如果合适的话)等在本文其它地方亦有详细的讨论。

实施例

给出下列实施例是为了为本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，非旨在限制本发明人所认为的本发明的范围。本发明已努力确保所使用的数字(如份量、温度等)的精确度，但是还是应该考虑到某些实验错误和误差。除非另外指明，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或约为大气压。

实施例1：制备源自羊膜的多能祖细胞(AMP)

使用离解剂PXXIII从羊膜离解羊膜上皮细胞。羊膜的平均重量为18-27g。从每克羊膜回收细胞数目约为10-15×10⁶个。

选择AMP细胞的方法：将从羊膜分离的细胞立即铺板。在培养基中培养约2天后，除去非附着细胞并保留附着细胞。利用细胞是否附着塑料组织培养容器为挑选方法以获得所需AMP细胞群。附着和非附着AMP细胞似乎具有相似的细胞表面标记表达图谱，但附着细胞具有更大的存活力，为本发明所需的细胞群。在添加人血清白蛋白的基础培养液培养附着的AMP细胞，直至它们达到约120,000-150,000细胞/cm²。在这时，细胞培养物是汇合的。合适的细胞培养物将在约5-14天达到该细胞数目。符合该细胞数目标准是AMP细胞具有增殖能力的指示，不符合该标准的细胞不会被选择作进一步的分析和使用。一旦AMP细胞达到约120,000-150,000细胞/cm²，它们将被收集并冷藏保存。该收集时间点被称为p0。

实施例2：生成AMP-N细胞

以上所述的AMP细胞，根据专有的及多步骤的培养方法生成出称为AMP-N细胞的新细胞类型。对所述AMP-N细胞进行了如下的分析。

实施例3：分析AMP-N细胞的细胞表面标记

透过专有的及多步骤的培养方法获得的AMP-N细胞，表现出含有不同细胞标记的独特组合,而该细胞标记的组合从未在其他细胞中出现过。所述AMP-N细胞展现神经元相关的标记，以接近神经元的表达水平表达β微管蛋白-III和MAP2。相比之下，没有经过所述培养方法所得的AMP细胞，展现出非常低水平的或不表达这些神经元的标记。重要的是，由于AMP-N细胞没有表达其他神经元的标记，因此与神经元不同。具体而言，神经元表达高水平的表面标记如PSA-NCAM和NFM，而AMP-N细胞和AMP细胞则呈低表达水平。AMP-N细胞(和AMP细胞)也表达出高水平的胶质细胞标记GFAP和a-S100，而神经元则表达非常低水平的GFAP和a-S100。最后，对干细胞标记SSEA-4在AMP-N细胞和AMP细胞的表达进行了分析。如预期，此标记在AMP细胞呈阳性表达，但在AMP-N细胞其表达水平则下降，这表明AMP-N细胞在所述专有的及多步骤的培养生产过程中失去“干细胞的特性”。由于神经元是最终分化的细胞，并不表达干细胞标记物，即不表达SSEA-4。

因此，申请人创造出新的细胞类型,该细胞呈现出由含有不同细胞标记的独特组合，包括某些神经元标记(即β-微管蛋白-III和MAP2)但不包括其他神经元标记(即PSA-NCAM和NFM)、某些神经胶质标记(即GFAP和α-S100)以及某些AMP细胞标记(即SSEA-4)。

实施例4：比较AMP-N细胞及未分化AMP细胞的基因表达

定量RT-PCR用于比较AMP-N细胞和未分化的AMP细胞中的28个基因的表达。在该实验中，相对表达指数1(由图1中虚线表示)表示该基因在两种细胞类型有相同的表达水平。当基因表达水平在AMP-N细胞高于AMP细胞时，其相对表达指数会大于1；当基因表达水平在AMP-N细胞相对较低时，其相对表达指数会少于1。基因表达水平相差有大于三倍被视为有显着差异(p<0.05)并以星号表示(图1)。表达结果和统计分析通过REST2009软件的随机分析获得，并代表每种细胞类型三次重复实验所得的平均值(M.W.Pfaffl et al.NucleicAcids Research 2002May 1；30(9):E36)。误差棒代表95％的信赖区间。18S RNA的表达被用作每个样品的参考。两种细胞类型都观察不到FGF4、GFAP、IL-10、NeuroDl、S100B、SHH、Sox2或Sox10的表达。

实施例5：比较AMP-N细胞及神經元细胞的基因表达

定量RT-PCR用于比较AMP-N细胞和神经元细胞(Sciencell#1520-10)中的28个基因的表达。在该实验中，相对表达指数1(由图2中虚线表示)表示该基因在两种细胞类型有相同的表达水平。当基因表达水平在AMP-N细胞高于神经元细胞时，其相对表达指数会大于1；当基因表达水平在AMP-N细胞相对较低时，其相对表达指数会少于1。基因表达水平相差有大于三倍被视为有显着差异(p<0.05)并以星号表示(图2)。FGF4、GFAP、NRCAM,S100B及Sox2在AMP-N细胞的表达水平十分低,因此不能在图2观察到其表达水平的平均值。表达结果和统计分析通过REST2009软件的随机分析获得，并代表每种细胞类型三次重复实验所得的平均值(M.W.Pfaffl et al.Nucleic Acids Research 2002May 1；30(9):E36)。误差棒代表95％的信赖区间。18S RNA的表达被用作每个样品的参考。两种细胞类型都观察不到FGF4IL-10，Sox10,或SHH的表达。

实施例6：從AMP-N细胞獲得ACCS-N

本发明的AMP-N细胞可用于制备含有不同分泌蛋白因子的独特组合的条件培养基，该条件培养基有用于治疗神经系统的疾病﹑毛病或损伤。根据上述方法培养AMP-N细胞,并收集其条件培养基。在某些实施例中,可以收集多个条件培养基并将其合并,从而获得分泌蛋白因子水平更一致的条件培养基。

实施例7：分析ACCS-N

使用标准酶联免疫吸附法(ELISA)﹑抗体阵列和质谱方法分析ACCS-N中的分泌蛋白因子。

实施例8：制备持续释放的组合物

包含AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的持续释放组合物是通过以下方式产生：将包含AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的组合物与本文所述的(参见以上)或本领域技术人员熟知的任何持续释放制剂技术相结合。

实施例9：AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N在患有神经系统疾病或毛病的动物模型中的效用

阿兹海默氏症-Wenk,G.L.(Behav Brain Res 199357(2):117-22)描述阿兹海默氏症的模型。该文献假设注射一种神经毒素如鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid)可以破坏基底前脑的碱能神经元,并能引起与阿兹海默氏症相关的认知损伤。可使用所述阿兹海默氏症模型测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的效用。

帕金森病-Arai,N.,et al.(Brain Res 1990515(1-2):57-63)描述经MPTP处理的C57黑色小鼠的帕金森病模型。该文献的作者认为该模型有用于研究帕金森病。可使用所述帕金森病模型测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的效用。

亨廷顿舞蹈症-Reddy,P.H.,et al.,(Nat Genet 199820(2):198-202)描述一个亨廷顿舞蹈症的实验模型的建立。该模型为广泛地展现与亨廷顿舞蹈症相关的全段人类cDNA的转基因小鼠,所述cDNA带有16、48或89个CAG重复序列。带有48或89个CAG重复序列的小鼠其行为和运动功能表现出渐进的失调,并在其纹状体﹑大脑皮层﹑丘脑和海马体出现神经元的损失和神经胶质变性。该文献的作者认为该模型与亨廷顿舞蹈症的发病机理有临床相关性。可使用所述亨廷顿舞蹈症模型测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的效用。

肌萎缩侧索硬化症(ALS)-Pioro,E.P.and Mitsumoto,H.(Clin Neurosci 1995-19963(6):375-85)描述四个ALS动物模型。可使用所述ALS模型测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的效用。

脊髓性肌萎缩症-Monani,U.R.,et al.,Hum Mol Genet 20009(16):2451-2457)描述患有脊髓性肌萎缩症的动物模型。可使用所述脊髓性肌萎缩症模型测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的效用。

多发性硬化症-Peiris,M.,et al.,(J Neurosci Methods 2007Mar 30epub)描述C57BL/6小鼠的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)实验模型以研究针对多发性硬化症的干预性治疗的效用。可使用所述模型测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的效用。

周边神经病变-Fricker,et al,(Neurodegen Dis 2008,5:72-108)广泛地综述了实验性的周边神经病变,包括全面地概述多个有用于研究一切周边神经病变类型的动物模型。例如，遗传性病变动物模型(HNPP﹑CMT1A﹑CMT1B﹑DSS﹑CMT1X﹑CMT4B1)，感染性病变(麻风病，HIV)﹑免疫性(GBS)﹑糖尿病性(I型﹑II型)﹑损伤性(暂时性神经损碎﹑慢性缩窄损伤﹑局部神经结扎﹑脊神经结扎﹑部分神经损伤)﹑化疗诱导的(即cisplatin)神经病变。可使用所述模型测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N的效用。

实施例10：AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N在患有神经系统损伤的动物模型中的效用

创伤性脑损伤(TBI)-在穿透性弹道式脑损伤的大鼠模型(PBBI)(Williams,A.J.,2005,“Characterization of a New Rat Model of Penetrating Ballistic BrainInjury”,J Neurotrauma 22；3:313-331)测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N其保护神经的潜力。在大鼠完成右额叶PBBI或假PBBI手术后立即在同一侧的脑室下以注射AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N。PBBI对照组则被注射生理盐水﹑对照培养基或条件培养基。

脊髓损伤(SCI)-在脊髓损伤的小鼠模型中测试AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N。在挫伤后九天(参见，例如，Constantini,S.,and Young,W.(1994),J.Neurosurg.80,97-111；Anderson,A.J.,et al.,Journal of Neurotrauma 21(12),1831-1846for animal models),在两个不同的地方,即损伤的中部或相邻的神经实质组织,给予AMP-N细胞和/或ACCS-N和/或合并的ACCS-N。

分析-在脊髓损伤的领域中,旷场运动行为测试(Open field locomotortesting)是标准的测试方法,因为它允许研究者全面地评估恢复情况:从完全麻痹(BBB或BMS为零)到完全正常运动(BBB为21及BMS为9)。然而，这些评估级别是非线性的(定序性)。它并非用于直接比较相关评估级别数值上的改变，而是利用评估级别表示运动行为功能的恢复。在这些测试中，动物可在圆形区域内自由移动四分钟，两名不知动物属于哪个实验组的调查员观察动物并基于各评估级别的具体标准将动物排名。在“恢复程度”这项评估中,调查员主要基于动物能否做出一致的踏步和完成方位协调的“关卡”以进行排名。其中,每个完整不断开﹑大于三个身体长度的动作被定为一个“关卡”。正常动物可以为每个前肢步作出一个后肢步；如动物错过踏步其评估级别的分数会被扣。

在不背离本发明的主旨和基本属性的前提下，本发明可以由其他具体方式实施。任何同等或类似的实施例均被涵盖于本发明的范围内。基于本文的显示和描述，本领域的技术人员可显而易见的对本发明作多样的修改。这些修改也落在随附权利要求的范围内。

在说明书全文中引用了多篇出版物。每篇出版物均以引用的方式全文纳入本说明书。

Claims (10)

1.一种包含源自羊膜的多能祖-N(AMP-N)细胞的组合物,其特征在于,所述AMP-N细胞展现如下细胞表面标记的表型:

i)相比源自羊膜的多能祖(AMP)细胞表达低水平的表面标记SSEA-4；

ii)相比源自羊膜的多能祖(AMP)细胞表达高水平的表面标记β-微管蛋白III和MAP2；

iii)相比神经细胞表达高水平的表面标记α-S100；及

iv)相比神经细胞表达低水平的表面标记PSA-NCAM和NFM。

2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述AMP-N细胞进一步展现如下的基因表达图谱:

i)FGF2,GDF15,GDNF,Notch2,NRCAM,NRG1,NTF4,TGFB2和TUBB3的基因表达水平高于AMP细胞；

ii)CNTF,FGF18,FGFR3,GUSB,Nestin,NGF,NGFR,NOG,NTF3,S100A6和TGFβ1的基因表达水平低于AMP细胞；

iii)GDF15,GDNF,Noggin,NTF4,S100A6和TGFβ2的基因表达水平高于神经细胞；

iv)ARTN,CNTF,FGF18,FGFR3,Nestin,NeuroD1,NGFR和NRG1的基因表达水平低于神经细胞；及

v)相比神经细胞没有表达基因FGF2,GFAP,NRCAM,S100B和Sox2。

3.一种包含权利要求1或2所述的组合物的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物被包装在生产制品中，所述生产制品进一步包括包装材料以及使用该药物组合物的说明书。

5.一种包含源自羊膜的细胞因子溶液-N(ACCS-N)的组合物,其特征在于,所述ACCS-N为条件培养基并以如下步骤制备:

a)在培养液培养权利要求1所述的源自羊膜的多能祖-N(AMP-N)细胞；及

b)收集所得的条件培养基成为源自羊膜的细胞因子溶液-N(ACCS-N)。

6.根据权利要求5所述的组合物,其特征在于,所述条件培养基为合并的ACCS-N,该合并ACCS-N经多次重复步骤a)及b),并合并所有步骤b)所得的条件培养基来取得。

7.一种包含权利要求5或6所述的组合物的药物组合物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物被包装在生产制品中，所述生产制品进一步包括包装材料以及使用该药物组合物的说明书。

9.根据权利要求5或6所述的组合物,其特征在于,所述组合物被配制成持续释放。

10.一种组合物制备治疗神经系统疾病﹑毛病或损伤的药物的应用,所述组合物包含治疗有效量选自权利要求1,2,5或6所述的组合物。