CN112513257A

CN112513257A - 产生诱导式少突胶质谱系细胞的方法及使用所述细胞的治疗

Info

Publication number: CN112513257A
Application number: CN201980039972.2A
Authority: CN
Inventors: 吕仁; 黄筱钧; 赖培伦; 吴志昊
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-03-16
Also published as: EP3807402A1; US20210246422A1; TW202016296A; EP3807402A4; WO2019241620A1

Abstract

本发明一般涉及一种产生诱导式少突胶质谱系细胞(oligodendrocyte‑lineage cells,OLGs)并使用所述细胞治疗的方法。该诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)可用于细胞治疗，特别是用于髓鞘脱失病。

Description

产生诱导式少突胶质谱系细胞的方法及使用所述细胞的治疗

相关申请

本申请根据美国专利法第119条(35 U.S.C.§119)主张于2018年6月14日提出申请的美国临时申请第62/684,963号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般涉及产生诱导式少突胶质谱系细胞(induced OLGs)并使用所述细胞治疗的方法。

背景技术

神经系统对于传递信号以控制自愿及非自愿行为极为重要。神经系统控制肌肉活动，协调不同的组织及器官，并接收信息。神经元传输瞬间信号以及快速信号，以感知环境变化并做出反应。脊椎动物的神经系统分为中枢神经系统(central nervous system,CNS)以及周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)。中枢神经系统(CNS)包括脑与脊髓，而周围神经系统(PNS)包括肌肉与腺体¹。中枢神经系统(CNS)整合并协调从身体不同部位接收的所有信息。中枢神经系统可分为灰质及白质，灰质由神经元以及无髓神经纤维组成，而白质由有髓轴突以及少突胶质细胞组成²。视网膜、视神经、嗅神经以及嗅上皮被认为是中枢神经系统(CNS)的一部分，其具有直接连接到大脑的突触。

中枢神经系统(CNS)以及周围神经系统(PNS)具有不同类型的神经元与支持细胞。中枢神经系统主要由神经细胞与神经胶细胞组成。神经胶细胞为中枢神经系统(CNS)中最丰富的细胞类型。由细胞核计算，神经胶细胞的数量约为神经细胞的10倍左右；按体积计算，神经胶细胞与神经细胞都占据约大脑的一半左右。神经细胞被神经胶细胞包围并相互作用。中枢神经系统中的胶质细胞主要包括星形胶质细胞、少突神经胶细胞(少突胶质谱系细胞(oligodendrocyte-lineage cells,OLGs))，以及小神经胶细胞^3,4。而在周围神经系统(PNS)中，神经鞘细胞(Schwann cells)以及卫星细胞起着相同的作用。中枢神经系统(CNS)中的神经胶细胞具有不同的功能^5,6。例如，星形胶质细胞(也称为星状胶质细胞)，是一群星形神经胶细胞，为神经组织提供生化支持与营养，并维持细胞外离子平衡。至于小胶质细胞，常驻巨噬细胞，其可活化免疫功能，以清除斑块、感染因子，以及不必要的神经元³。其他细胞类型，如少突胶质细胞，对髓鞘形成极为重要。

少突胶质细胞前体/先驱细胞(oligodendrocyte precursor/progenitorscells,OPCs)在神经源性/胶质细胞转换后分化为少突胶质细胞³。少突胶质细胞(也称为少突神经胶细胞)为一种神经胶细胞，其功能主要是通过为神经轴突提供支撑与绝缘。少突胶质细胞产生髓鞘以包裹轴突以进行绝缘并增加电传导，少突胶质细胞在周围神经系统(PNS)中表现出与神经鞘细胞相同的功能³。关于髓鞘形成，一个少突胶质细胞可包裹约50个轴突，但它只能形成一个髓鞘到每个轴突的区段。相较于无髓鞘神经元，神经冲动在有髓鞘轴突中的移动快了100倍⁷。此外，少突胶质谱系细胞通过提供营养及适当的环境来帮助神经再生。髓鞘形成过程的主要参与者包括髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)，以及蛋白脂质蛋白(proteolipid protein,PLP)的蛋白质。此外，表面抗原O4、转录因子Olig2与Nkx2.2在少突胶质谱系细胞(OLGs)中表现⁸。

中枢神经系统疾病为影响脊髓或大脑的疾病。根据受损区域，大脑或脊髓损伤会导致不同的残疾。由结构缺陷引起的中枢神经系统(CNS)损伤起源于中风、感染、变性，以及自体免疫疾病。其中，一种自体免疫性疾病为由体内自体蛋白质的耐受性丧失所引起的，其导致免疫系统攻击并破坏人体组织。在中枢神经系统(CNS)不同部位的神经元损伤或神经支持细胞功能丧失会导致不同的疾病。髓鞘脱失病的病因可分为五类：病毒、免疫、遗传、中毒，以及受伤。髓鞘脱失病由神经系统中的髓鞘损伤所引起，并且发生在中枢神经系统(CNS)及周围神经系统(PNS)中。髓鞘丢失或功能障碍影响全世界2至250万人。它造成大量的发病率及死亡率⁹。数种疾病属于在中枢神经系统(CNS)中的发炎性髓鞘脱失病：多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)、急性出血性脑白质炎(acute hemorrhagicleukoencephalitis,AHL)，以及急性播散性脑脊髓炎(acute-disseminatedencephalomyelitis,ADEM)，脑桥中央髓鞘溶解、进行性多处脑白质病、脑性麻痹、先天性脑白质营养不良^10,11。在这些疾病中，多发性硬化症(MS)为一种常见的自体免疫性疾病，其中免疫系统攻击髓鞘或少突胶质谱系细胞(OLGs)缺失并导致系统性髓鞘脱失^12-14。多发性硬化症(MS)的症状，取决于损伤区域，可导致视力、膀胱、记忆/思考、疼痛、痉挛、言语问题以及吞咽症状。此外，多发性硬化症(MS)在严重情况下也可导致中风、肌无力或死亡¹⁵。多发性硬化症(MS)在减轻病征后会持续发生复发及缓解的过程。复发及缓解过程之间的潜伏期是不可预测的，可能需要很多年¹⁶。其他神经元疾病也涉及髓鞘脱失，例如杭丁顿氏症以及精神分裂症。杭丁顿氏症是由于杭丁顿氏蛋白中CAG重复(聚麸酰胺区)增加所引起。它是一种体染色体显性遗传性神经退化性疾病¹⁷。一些记载提到，在杭丁顿氏症患者的大脑中，神经胶细胞退化，并观察到病理表型^18-22。杭丁顿氏症患者的前兆症状为髓鞘分解与损伤^20,22,23。此外，许多杭丁顿氏症小鼠模型中已被记载具有髓鞘脱失^24-26。此外，放射线疗法还在人类及小鼠模型中产生髓鞘脱失病^27-29，并且可以少突胶质细胞先驱细胞治疗³⁰。

细胞疗法为髓鞘脱失病的潜在且有希望的治疗策略^12-14。目前，大约有115项临床试验正在研究神经胶细胞相关疗法的疗效(www.clinicaltrials.gov)。一些研究将正常的少突胶质谱系细胞(OLGs)注入受损区域以包裹髓鞘脱失区域而具有良好的结果^31-33。然而，很难获得足够用于细胞疗法的人类原代少突胶质谱系细胞(OLGs)^31-33。因此，提供足够数量的少突胶质谱系细胞(OLGs)是需要解决的主要障碍。现今，人类胚胎干细胞(humanembryonic stem cells,hESCs)以及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stemcells,iPSCs)为转录因子的异位表现或可溶性因子的逐步分化提供了获得功能性少突胶质谱系细胞(OLGs)的平台^34-36。目前，人类胚胎干细胞(hESCs)衍生的神经干细胞(Neuralstem cells,NSCs)或间质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)衍生的少突胶质谱系细胞(OLGs)已经可以改善动物实验中多发性硬化症(MS)的症状^37,38。然而，人类胚胎干细胞(hESCs)以及诱导性多能干细胞(iPSCs)具有例如畸胎瘤风险的缺点³⁹。此外，分化过程耗费人力，成本高，并且需要45天。另一方面，只有小鼠或大鼠的少突胶质谱系细胞(OLGs)而非人类的细胞可以从具有转录因子病毒转导的纤维母细胞中获得，其具有插入诱变的风险^40,41。此外，囓齿动物细胞中的转录因子碱基重新编程仅达到9.2％或15.6％细胞表现O4标记的效率。

发明内容

于本发明中，首次公开了通过将皮肤细胞，例如纤维母细胞，暴露于化学诱导剂，可以成功地产生诱导式少突胶质谱系细胞(induced OLGs)，该化学诱导剂包括Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase,ROCK)抑制剂以及一种或多种选自由下列所组成的群组的辅助剂：组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制剂、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂，以及环腺苷单磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)活化剂。根据本发明，皮肤细胞例如纤维母细胞经过这样的治疗之后可以重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)，其可用于细胞治疗，特别是用于髓鞘脱失病。

因此，于一实施例，本发明特别提供了产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的方法，包括在允许部分皮肤细胞重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的条件下培养所述皮肤细胞，其中该条件包括培养基，该培养基包含化学诱导剂，该化学诱导剂包括Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂，其中所述皮肤细胞亦以选自由下列所组成的群组的辅助剂处理：组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂、环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，以及其任何组合。

于一些具体实施例中，所述皮肤细胞为纤维母细胞。

于一些具体实施例中，该辅助剂包括该细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。

于一些具体实施例中，该辅助剂包括该组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂以及该环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，可视需要地连同该细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。

于一些具体实施例中，该化学诱导剂以及辅助剂同时或依次添加至培养基。于某些实例中，在该化学诱导剂之前将该辅助剂添加至该培养基中。于某些实例中，在该Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂之前将该组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂添加至该培养基中。

于一些具体实施例中，该化学诱导剂及/或该辅助剂为小分子。

于一些具体实施例中，该化学诱导剂包括Y27632。于一些具体实施例中，该辅助剂包括毛喉素(forskolin,FSK)、SU9516、VPA，及/或G06983。

于一些具体实施例中，该诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)表现一选自由下列所组成的群组的细胞标记：血小板衍生的生长因子受体(platelet-derived growth factorreceptor,PDGFR)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、少突胶质细胞转录因子(oligodendrocyte transcription factor,Oligo2)、SOX10、蛋白脂质蛋白(proteolipidprotein,PLP)1、A2B5、O4，以及其任何组合。

于一些具体实施例中，本发明的方法还包括从该细胞培养物中分离该诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)以获得分离的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)群。

于另一实施例，本发明提供如本文所述的分离的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)群。

于又一实施例，本发明提供治疗疾病或病症的方法，包括给予有需要这种治疗的受试者治疗有效量的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。具体而言，该诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)通过以包括Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的化学诱导剂处理而衍生自皮肤细胞，其中该皮肤细胞以一种或多种选自由下列所组成的群组的辅助剂进一步处理：组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂，以及环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂。于一些具体实施例中，该辅助剂包括该细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。于一些实例中，该(复数个)辅助剂包括该组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂以及该环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，可视需要地具有该细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。还提供如本文所述的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)于制备用于治疗疾病或病症的药物的用途。

于一些具体实施例中，该疾病或病症与少突胶质细胞功能障碍有关。

于一些具体实施例中，该疾病或病症为髓鞘脱失病。

于一些具体实施例中，该诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)以有效促进该受试者中神经元髓鞘形成的量施用。

于一些具体实施例中，该疾病或病症选自由下列所组成的群组：多发性硬化症(MS)、急性出血性炎症性疾病(AHL)、脑性麻痹、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、脑桥中央髓鞘溶解、进行性多处脑白质病、先天性脑白质营养不良、帕金森氏症、杭丁顿氏症、精神分裂症，以及放射线治疗引起的髓鞘脱失病。

还提供了一种医药组合物，包含治疗有效量的如本文所述的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)以及药学上可接受的载剂。

还提供了一种包含皮肤细胞以及培养基的培养物，该培养基包含化学诱导剂以及一种或多种如本文所述的辅助剂。特别是，该培养物还包含衍生自该皮肤细胞的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。

于以下的描述中阐述了本发明的一个或多个具体实施例的细节。由以下对数种实施例的实施方式以及亦从所附的申请专利范围中，本发明的其他特征或优点将显而易见。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明以下的实施方式。出于说明本发明的目的，于图式中显示出目前较佳的实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于所示的精确配置及手段。

于图式中：

图1A-1B所示为SU9516与Y27632诱导人类原代皮肤纤维母细胞的形态变化。SU9516诱导出圆顶状形态(图1A)，而Y27632引发了树突状形态的变化(图1B)。

图2A及2B所示为Y27632与SU9516将该纤维母细胞重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。图2A所示为Y27632(Y)与SU9516(S)将纤维母细胞转化成具有树突形态的少突胶质谱系细胞(OLGs)。图2B所示为荧光染色显示在该诱导的细胞上少突胶质细胞特异性标记(O4)的表现。DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)用于染色细胞核。

图3所示为Go6983、Y27632，以及SU9516增强了诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的重新编程。以由Y27632(Y)、Go6983(G)，以及SU9516(S)组成的不同组合处理，结果显示这些因子中的每一个都可促进少突胶质谱系细胞(OLGs)状形态、树突生长，以及圆顶状的形成。Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983。

图4A-4B所示为通过用VPA预处理有效地增强重新编程的效率。图4A所示为以VPA预处理2天可以提高转化效率的效率。图4B所示为通过对该诱导的细胞的荧光染色检测少突胶质细胞特异性标记O4。DAPI用于染色细胞核。V：VPA，Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983。

图5所示为毛喉素(FSK)促进诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的形态变化。在以VPA预处理后，测试了22种化学物质并筛选促进YSG重新编程的药物。数据显示，毛喉素(FSK)可以维持圆顶状细胞并诱导具有更多树突状结构的细胞。V：VPA，Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983。

图6A所示为在以五种化学物质处理的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)上多种少突胶质细胞标记的表现。通过化学混合物(VYSGF)诱导的细胞表现PDGFRα(少突胶质细胞标记)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、Olig2与O4(少突胶质细胞特异性标记)。Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983，F：毛喉素，V：丙戊酸。

图6B所示为qPCR显示少突胶质细胞特异性基因的增加。mRNA表现显示，相较于纤维母细胞，诱导的细胞中的转录因子SOX10、髓鞘碱性蛋白(MBP)，以及PLP1表现增加。

图7所示为Go6983对于转化过程是不必要的。以不同的组合化学物处理细胞，包括VPA、Y27632、FSK、Go6983或SU9516。结果显示，VPA、Y27632、FSK，以及SU9516诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)状形态，Go6983对于转化过程则为不必要的。

图8所示为低剂量的4C化学混合物(10μM的Y27632、FSK，以及SU9516，3mM的VPA)足以用于转化过程。在4C化学混合物中以不同浓度的Y27632、FSK，以及SU9516处理细胞。结果显示，10μM的这些化学物质可诱导该少突胶质谱系细胞(OLGs)。

图9A所示为以四种化学物质处理的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的标记表现。以小分子(VYSF)诱导细胞表现少突胶质谱系细胞(OLGs)标记Olig2、O4，以及PDGFRa。Y：Y27632，S：SU9516，F：毛喉素，V：丙戊酸。

图9B所示为相较于纤维母细胞，iOLGs表现少突胶质细胞标记。通过化学混合物(4C，VYSF)诱导细胞。数据显示iOLGs表现少突胶质细胞特异性标记GalC、GPR17、髓鞘碱性蛋白(MBP)，以及O1。

图9C所示为qPCR显示不同少突胶质细胞特异性基因Sox10、髓鞘碱性蛋白(MBP)，以及PLP1的增加。mRNA表现显示，相较于纤维母细胞，转录因子SOX10、髓鞘形成蛋白髓鞘碱性蛋白(MBP)以及PLP1在iOLGs(4C，VYSF)中表现增加。

图10所示为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)将神经元髓鞘化。以小鼠DRG共培养诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)显示，少突胶质细胞特异性标记髓鞘碱性蛋白(MBP)与神经标记神经丝(neurofilament,NF)共定位，显示诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)具有髓鞘形成能力。

图11所示为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)具有增殖能力。免疫荧光染色显示O4阳性细胞也表现增殖指标Ki67。

图12A、12B以及12C所示为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)表现少突胶质细胞先驱细胞标记A2B5以及O4。图12A所示为相较于纤维母细胞，诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)中A2B5表现增加。图12B所示为相较于纤维母细胞，诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)中O4表现增加。图12C所示为以流式细胞仪分析A2B5与O4表现的定量结果。

图13A-13B所示为VPA可被其他组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂替代以产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。图13A所示为莫汀司他以及帕新司他可替代VPA并诱导纤维母细胞重新编程为更成熟的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)形态。图13B所示为免疫荧光染色结果，其显示以莫汀司他与帕新司他诱导的细胞具有更强的少突胶质细胞标记O4以及髓鞘碱性蛋白(MBP)的表现。

图14A与14B所示为3C(三种化合物)诱导式iOLGs表现少突胶质细胞先驱细胞标记A2B5。图14A所示为少突胶质细胞标记A2B5通过流式细胞仪分析定量。相较于纤维母细胞，以3C(VPA、毛喉素、Y27632)处理的细胞增加A2B5的表现。以4C(VPA、毛喉素、Y27632、SU9516)处理的细胞则作为阳性对照。图14B所示为免疫荧光染色，其显示以3C处理的细胞的少突胶质谱系细胞(OLGs)转录因子Olig2表现增加。以4C处理的细胞作为阳性对照。

图15所示为来自人类皮肤纤维母细胞的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的化学转化过程的总结。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

1.定义

如本文所用，单数形式“一”、“一个”，以及“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种组成分”包括多种这样的组成分及本领域技术人员已知的其等同物。

术语“包含(comprise)”或“包含(comprising)”通常以包含/包括的含义使用，其代表允许存在一种或多种特征、成分或组成分。术语“包含(comprise)”或“包含(comprising)”包括术语“由......组成(consists of)”或“由......组成(consistingof)”。

如本文所用，术语“少突胶质谱系细胞(OLGs)”可包括少突胶质细胞、促少突胶质细胞，以及少突胶质细胞前体/先驱细胞(OPCs)。中枢神经系统(CNS)中的少突胶质细胞产生髓鞘，其包裹神经轴突以进行绝缘并增加电传导，并且对于轴突完整性以及存活也是重要的。

如本文所用，术语“诱导式少突胶质谱系细胞(induced OLGs)”是指少突胶质谱系细胞(OLGs)状细胞(亦即，具有少突胶质谱系细胞(OLGs)状特征的细胞)，其从其他细胞类型，如皮肤细胞，产生(或重新编程)。

如本文所用，“皮肤细胞”是指在皮肤中发现的细胞，例如上皮细胞或纤维母细胞。

如本文所用，术语“重新编程”是指将细胞转化为具有一些不同特性或生物学功能的不同细胞类型的过程。

如本文所用，术语“培养物”是指以一培养基培养的细胞群，较佳维持该细胞存活或使该细胞生长。

本文所用的术语“小分子”是指在自然界中合成或发现的有机或无机分子，通常分子量小于10,000克/莫耳，特别是小于5,000克/莫耳，特别是小于2,000克/莫耳，特别是少于1,000克/莫耳。于一些具体实施例中，一小分子是指一非聚合物，例如非蛋白质或核酸类的化学分子。

本文所用的术语“约”是指其使用数量的数值的加或减10％。因此，约1％代表在0.9％至1.1％的范围内。

如本文所用，Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂可指下调、降低或抑制Rho相关蛋白激酶的量及/或活性的试剂。本文所述的Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的实例包括，但不限于，Y-27632、AS 1892802、GSK 269962、GSK 429286、H 1152二盐酸盐、HA 1100盐酸盐、OXA 06二盐酸盐、RKI 1447二盐酸盐、SB 772077B二盐酸盐等。

如本文所述，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂可指下调、降低或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的量及/或活性的试剂。如本文所述的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的实例包括，但不限于，SU9516、PD-0332991、罗斯维汀(Roscovitine)、SNS-032、狄纳昔布(Dinaciclib)、夫拉平度(Flavopiridol)、AT7519、夫拉平度(Flavopiridol)、JNJ-7706621、AZD5438、MK-8776、PHA-793887、BS-181、帕泊昔布(Palbociclib(PD0332991))羟乙基磺酸钠、A-674563、博马昔布(abemaciclib)、BMS-265246、PHA-767491、密西尼(Milciclib)、R547、NU6027、P276-00、MSC2530818、塞内辛(Senexin)A、LY2857785、LDC4297、ON123300、肯包隆(Kenpaullone)、K03861、THZ1 2HCl、AT7519 HCl、普瓦兰诺(Purvalanol)A、Ro-3306、XL413、LDC000067、ML167、TG003、利泊昔布(Ribociclib)、沃贡宁(Wogonin)、BIO、AZD1080、1-Azakenpullone，及其他。

如本文所述，环状腺苷单磷酸(cAMP)活化剂可指，相较于不存在该试剂时的背景生理细胞内含量，一种可增加环腺苷单磷酸(cAMP)的细胞内含量的试剂。环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂的实例包括，但不限于，毛喉素、咯利普兰(rolipram)、NKH477、PACAP1-27、PACAP1-38，及其他。

如本文所述，蛋白激酶C(PKC)抑制剂可指下调、降低或抑制PKC激酶的量及/或活性的试剂。如本文所述的PKC抑制剂的实例包括，但不限于，Go6976、Go66850、Go6983、粗糠柴毒素、双吲哚基马来酰亚胺II、C-1、钙感光蛋白C、蜂毒、GF 109203X、二氢鞘氨醇、白屈菜红碱、氯化物、CGP 53353、CID 2858522、二氢鞘氨醇、GF 109203X、Go 6976、Go 6983、[Ala107]-MBP(104-118)、Ala¹¹³]-MBP(104-118)、(±)-棕榈酰肉碱氯化物、PKC(19-36)(假基质胜肽；PKC抑制剂)、PKC 412、PKC假基质、Ro 32-0432盐酸、粗糠柴毒素、D-赤型-神经鞘氨醇(合成)、ZIP、RO 31-8220甲磺酸，及其他。

如本文所述，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂可以指下调、降低或抑制组蛋白脱乙酰酶的量及/或活性以从组蛋白上的离胺酸残基去除乙酰基的一试剂。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂的实例包括，但不限于，丙戊酸(VPA，2-丙基戊酸)、阿匹西定(Apicidin)、CI 994、FK 228、LMK 235、M 344、MC 1568、MC 1742、MI 192、NCH 51、NSC 3852、PCI 34051、4-苯基丁酸钠、派若沙米德(Pyroxamide)、SAHA、SBHA、司力泰(Scriptaid)、丁酸钠、TC-H106、TCS HDAC6 20b、曲古霉素A、土巴辛(Tubacin)、UF 010、莫汀司他、帕新司他，及其他。

如本文所述，术语“分离的或纯化的细胞群”或“分离的或纯化的细胞”是指已经与该细胞相关的其他细胞组成分或其他细胞分离的细胞制剂。例如，分离的细胞可能已经从其天然环境或细胞群中移除，或者可能是由已从细胞群中移除的细胞的繁殖所产生的。当细胞被描述为“分离的”或“纯化的”时，应理解为不是绝对地分离或纯化，而是相对地分离或纯化。例如，包含分离的细胞的制剂可包含0.5％或更多，10％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，或100％该制剂中总细胞数的量的细胞。于一些特定具体实施例中，包含分离的细胞的制剂可包含50％或更多，60％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，或100％该制剂中总细胞数的量的细胞。

如本文所用，本文所用的术语“受试者”包括人类与非人类动物，例如伴侣动物(如狗、猫等)、农场动物(如牛、羊、猪、马等)，或实验动物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

如本文所述，当涉及治疗性治疗时，术语“治疗(treating)”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用于患有疾病、该疾病的病征或症状，或该疾病的恶化的受试者，目的为治疗、治愈、缓解、减缓、改变、补救、改善、增进，或影响该疾病、该疾病的该病征或症状，由该疾病引起的残疾或该疾病的恶化。另一方面，术语“处理(treating)”可指与治疗性处理疾病无关的应用或过程，例如施用一种或多种成分或试剂以接触细胞以改变其命运，例如，恢复为其他细胞类型。

如本文所述，本文所用的术语“治疗有效量”是指在被治疗的受试者中赋予治疗效果的活性成分的量。该治疗有效量可根据各种原因而改变，例如给药途径及频率、体重以及接受该药物的个体的种类，以及给药目的。如本文所用，当提及与治疗性处理疾病无关的应用或过程时，术语“有效量”可指用于实现预期目的的成分或药剂的量，例如，施用于接触的细胞，例如纤维母细胞，的成分或试剂的量以用于重新编程的目的。

2.使用化学试剂以产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)

本发明基于意外的发现，即皮肤细胞，例如纤维母细胞，可以通过与化学诱导剂以及一种或多种辅助剂一起培养，而重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)，而不需要通过转录因子的转导进行基因修饰。

根据本发明，皮肤细胞可在含有化学诱导剂的培养基中培养，该化学诱导剂包括Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂以及选自由下列所组成的群组的辅助剂：组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂、环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，以及其任意组合，以有效诱导重新编程的量，使得该皮肤细胞转化为少突胶质谱系细胞(OLGs)。于一些具体实施例中，该辅助剂包括该细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。于一些具体实施例中，该辅助剂包括该组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂以及该环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，可视需要地含有该细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。该化学诱导剂以及该(复数个)辅助剂可同时或依次加入该培养基中。例如，首先将辅助剂添加至该培养基中用于预处理(预培养)，然后再添加化学诱导剂用于随后的培养。于一些具体实施例中，在该Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(例如，Y27632)之前将该组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(例如，VPA)加入该培养基中。预处理(预培养)的时间约为总培养期间的十分之一(1/10)、五分之一(1/5)、四分之一(1/4)、三分之一(1/3)或更长一段时间。于一实例中，该预处理(预培养)的时间为总培养期间的约三分之二(2/3)。

适用于培养根据本发明的皮肤细胞的培养基可在本领域中获得，例如DMEM、MEM、DMEM/F12、剔除DMEM，或IMEM培养基。培养可在一正常条件下进行，例如37℃、1-10％CO₂。具体而言，该培养基可为无血清培养基。

于一些具体实施例中，用于转化的培养基(转化培养基)含有剔除DMEM、AlbuMAXI、N2补充物，非必需胺基酸(nonessential amino acids,NEAA)。

于一些具体实施例中，该培养进行至少1天或更长时间(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更长时间)，由此，该皮肤细胞的一部分转化为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。于一特定的实例中，该培养进行3天或更长时间，包括以一辅助剂预处理约2天(总培养期间的三分之二)以及以一化学诱导剂与任选的(复数个)辅助剂再培养1天(总培养期间的三分之一)。

于一些具体实施例中，该培养基可包含一种或多种生长因子及/或培养补充物，有利于少突胶质细胞的分化。生长因子的实例包括，但不限于，血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)，以及神经营养蛋白-3(neurotrophin-3,NT3)。培养补充剂的实例包括，但不限于，N2与B27。

表A说明了本文所用的化学诱导剂的一些实例。

根据本发明，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的皮肤细胞在该培养中重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。于一些具体实施例中，约20％或更多，例如30％至90％(例如，40％至80％、50％至75％)的皮肤细胞在该培养中被重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。

于特定的具体实施例中，该皮肤细胞首先以一组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(例如VPA)处理，然后以一Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(例如Y27632)以及一环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂(FSK)处理，并可视需要地进一步以一细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂(SU9516)处理。

于特定的具体实施例中，该皮肤细胞以一Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(例如，Y27632)以及一细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂(SU9516)处理。

3.用于重新编程的皮肤细胞

皮肤细胞例如纤维母细胞可用于本文中以产生本发明的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。本文用于重新编程的纤维母细胞可从新生儿或成年供体获得。

可以通过皮肤穿刺或包皮环切从适当的自体或同种异体供体获得皮肤活体组织切片，并可从该皮肤活体组织切片长出皮肤纤维母细胞。通常，约4mm的皮肤活体组织切片可产生15-20百万个纤维母细胞。于一些具体实施例中，可商业购得纤维母细胞。较佳地，如本文所用的用于转化为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的纤维母细胞为哺乳动物来源的，最佳为人类来源的。

4.诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)

根据本发明，所生成的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)具有少突胶质谱系细胞(OLGs)状的特征。具体而言，诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)具有少突胶质谱系细胞(OLGs)状的形态(细胞体为圆顶形以及固体、双极或多极分支)。更具体而言，所生成的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)可以表现典型的少突胶质谱系细胞(OLGs)标记。

于一些具体实施例中，该少突胶质谱系细胞(OLGs)标记选自由以下所组成的群组：血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、少突胶质细胞转录因子(OLIG2)、SOX10、蛋白脂质蛋白(PLP)1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Ki67、A2B5、O4，以及其任何组合。

于一些具体实施例培养后，为了进一步富集诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)，可以一种或多种少突胶质谱系细胞(OLGs)标记对细胞进行分选。细胞分选可以通过本领域已知的各种技术实现。细胞分选技术的实例包括荧光活化细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)、免疫亲和管柱分离，或免疫磁分离(immunomagneticseparation,MACS)或任何技术，其能够基于物理特征(密度)或结构特征(特别是特定抗原)获得一种特定细胞类型的富集。

5.使用诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的应用

根据我们的研究结果，可从可接触的皮肤活体组织切片产生自体或同种异体诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)，这可在临床中容易地获得。该过程不需要手术或任何其他痛苦的过程。

诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)能有效促进神经元的髓鞘形成，因此可用于治疗，特别是用于治疗髓鞘脱失病或与少突胶质细胞功能障碍有关的疾病或病症。

此类疾病或病症的实例包括，但不限于，多发性硬化症(MS)、急性出血性炎症性疾病(AHL)、脑性麻痹、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、脑桥中央髓鞘溶解、进行性多处脑白质病、先天性脑白质营养不良、帕金森氏症、杭丁顿氏症、精神分裂症，以及放射线治疗引起的髓鞘脱失病。

诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的治疗用途包括将该诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)移植到一有需要的受试者中。可将该细胞以有效促进神经元髓鞘形成的量注射或移植到中枢神经系统(CNS)，例如胼胝体或小脑。

总而言之，本发明提供了一种生成诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的新技术，包括如下特征及优点：

(i)第一种从人类分化的体细胞产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的方法。

(ii)第一种能够将体细胞重新编程/转分化为少突胶质谱系细胞(OLGs)的化学混合物。没有先前的技术可以通过化学物质从任何其他的体细胞类型中产生少突胶质谱系细胞(OLGs)。

(iii)诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)为在3天内以少量化学物质(有生长因子或没有生长因子)产生。

(iv)从皮肤纤维母细胞产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的转化率很高。平均效率超过30％。

(v)诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)是可扩展的，类似于天然的细胞。

(vi)用于产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的混合物的组成分都是明确定义的而且不含动物血清，适合临床应用并具有高再现性。

(vii)诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)表现神经胶细胞以及少突胶质细胞的特异性标记。

(viii)这是一种化学重新编程过程，没有反转录病毒/慢病毒/质体感染过程，避免了插入突变或其他生物安全的问题。

本发明可提供如下的各种应用：

(i)用于产生诱导式少突胶质谱系细胞的商业试剂盒。由于这是从体细胞产生少突胶质谱系细胞(OLGs)的第一种也是唯一的方法，因此可以将其作为用于产生用于基础研究以及细胞疗法的少突胶质谱系细胞的试剂盒。

(ii)用于疾病治疗的诱导式少突胶质谱系细胞的生产。根据我们的研究结果，有可能从可触及的体细胞如皮肤活体组织切片中产生自体或同种异体少突胶质谱系细胞(OLGs)，这可以在临床上轻松获得。该过程不需要手术或任何其他痛苦的过程。然后患者可以获得自体诱导式少突胶质谱系细胞，不需要服用免疫抑制药物。或者，相较于通过手术获得形成中枢神经系统(CNS)的少突胶质谱系细胞(OLGs)，更容易找到愿意捐献皮肤细胞用于诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)生产的健康供体。有鉴于神经胶细胞具有髓鞘再生以及神经支持的能力，诱发的少突胶质谱系细胞(OLGs)可以治疗疾病，包括髓鞘脱失病以及神经退化性疾病[多发性硬化症(MS)以及急性出血性脑炎(AHL)、脑性麻痹、帕金森氏症、精神分裂症，以及放射线治疗引起的髓鞘脱失病]。我们还可以利用本发明的药物配方将体细胞直接转化为体内功能性少突胶质谱系细胞(OLGs)以促进神经组织的修复。

(iii)组织工程与再生医学中的少突胶质谱系细胞。诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)可以支持神经细胞的生长及分化，并且可以帮助修复神经疾病治疗中的神经损伤。转换方法可与适当的生物医学材料结合使用，以支持神经生长，例如在组织工程以及再生医学中构建神经管束。

(iv)个人化治疗平台。我们可以使用诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)进行药物筛选，为不同患者寻找合适的药物标靶。患者可以使用他们自己的体细胞或纤维母细胞来产生可诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)，以建立针对神经胶细胞株相关疾病的最佳个人化治疗。

具体而言，本发明提供了一种包含皮肤细胞以及培养基的培养物，该培养基包含化学诱导剂以及一种或多种如本文所述的辅助剂。特别而言，该培养物进一步包含衍生自皮肤细胞的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。

根据本发明，如本文所述的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)或其培养物可用于作为治疗有需要的受试者的疾病的活性成分。于一些具体实施例中，治疗有效量的活性成分可与药学上可接受的载剂配制成适当形式的医药组合物，用于递送及吸收的目的。取决于给药方式，本发明的医药组合物较佳包含约0.1％重量至约100％重量的活性成分，其中该重量百分比为基于整个组合物的重量来计算。该组合物可以直接作为植入物或进一步修饰为适合移植的形式。

如本文所用，“药学上可接受的”是指该载剂与该组合物中的活性成分兼容，并且较佳地可以稳定该活性成分并且对接受治疗的个体而言是安全的。一药学上可接受的载剂的实例包括常规缓冲剂(磷酸、柠檬酸，其他有机酸等)、生理盐水、消毒水、抗氧化剂(抗坏血酸等)、等渗剂，以及防腐剂。

于一些具体实施例中，将根据本发明的组合物配制成适于注射的剂型，其中细胞悬浮在一药学上可接受的载剂中，例如，灭菌水或生理盐水或在使用前冷冻储存。于一些具体实施例中，该组合物可进一步包含可生物降解的聚合物，其可在局部注射到缺陷部位后用于稳定、支持以及固定细胞簇。根据本发明的组合物可以配制成单位剂型或掺入多剂量容器中。该剂型可为油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳液，或粉末、颗粒、片剂或胶囊。本发明的组合物可通过生理学上可接受的途径递送，通常通过注射递送。

通过以下实例进一步说明本发明，提供这些实施例是为了说明而非为了限制的目的。根据本发明的公开内容，本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可以对所公开的特定具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实例

许多髓鞘脱失病与少突胶质细胞功能障碍有关，例如多发性硬化症(MS)以及急性出血性炎症性疾病(AHL)。一些髓鞘脱失病是由放射线疗法所引起的。此外，一些神经退化性疾病如脑性麻痹、帕金森氏症、杭丁顿氏症，以及精神分裂症也是少突胶质细胞疾病。因此，神经胶细胞很可能可以治疗神经退化性疾病以及髓鞘脱失病。目前，大约115项临床试验正在研究胶质细胞相关治疗的疗效(www.clinicaltrials.gov)。迄今为止，已知少突胶质谱系细胞(OLGs)可以源自胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)或诱导式多能干细胞(induced pluripotent stemcells,iPSCs)。然而，分化过程需要超过45天，这不仅消耗劳力且成本过高。此外，胚胎干细胞或诱导式多能干细胞(iPSCs)具有畸胎瘤的风险。只有小鼠或大鼠的少突胶质谱系细胞(OLGs)，而非人类的细胞，可以从具有转录因子诱导的纤维母细胞中获得。到目前为止，还没有使用化学混合物输出任何少突胶质谱系细胞(OLGs)的计划。我们的计划提供了第一种使用化学物质从真皮纤维母细胞产生人类诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的方法。该方法不但高效且避免插入病毒基因。最重要的是，这是迄今为止最快的重新编程方法，只需要3天。这一发现可能有益于干细胞生物学、细胞疗法，以及再生医学。

1.材料与方法

1.1产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)

将细胞(1×10⁴)种植于一24孔盘的每个孔上。于补充有10％胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)(Hyclone公司)的HG-DMEM培养基(Life technologies公司)中培养2天，以补充有1％N2补充剂、1％Albumax、1％非必需胺基酸(NEAA)的剔除培养基(处理培养基，所有试剂皆来自Life technologies公司)或以具有1％N2、1％B27、20ng/mL PDGF-AA、EGF、bFGF，以及10ng/mL NT3的DMEM/F12培养基，并添加不同的处理化学混合物替换。最终条件为3mM丙戊酸培养2天，10μM Y27632、10μM SU9516、10μM毛喉素(FSK)(Tocris公司)培养1天；或10μM莫汀司他或帕新司他培养2天，10μM Y27632、10μM SU9516、10μM毛喉素(FSK)(Tocris公司)培养1天。

1.2定量实时聚合酶连锁反应(Quantitative real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)。

根据制造商的说明，使用RNeasy Micro(Qiagen公司，希尔登，德国)或

LS试剂(Thermo Fisher Scientific公司)分离总RNA。以DNA酶I处理RNA以除去污染的DNA(Promega公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)，并使用Superscript III反转录。将得到的cDNA(80ng/样品)作为定量实时反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)的模板，其使用SYBR GREEN2X master mix(KAPA Biosystems公司，威尔明顿，麻州，美国)进行。使用ABI 7900实时PCR系统(Applied Biosystems公司，卡尔斯巴市，加州，美国)测量并定量相对cDNA量。以相对于甘油醛-3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase,GADPH)的RNA含量对目标基因的相对量进行标准化。

1.3免疫荧光分析

诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)在室温下以4％甲醛固定15分钟。以1×PBS洗涤后，以0.03％Triton X-100透化细胞5分钟。以1×PBS洗涤细胞两次，然后与一级抗体作用[抗Olig2抗体(1:100；Merck millipore公司)、Nkx2.2(1:100；Stanta Cruz公司)、O4抗体(1:100；Merck millipore公司)、髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体(1:100；Proteintech公司)、PDGFRα抗体(1:100；R&D systems公司)]以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1:1500；Life technologies公司)在阻隔缓冲液(含有0.02％BSA的PBS)中于4℃培养隔夜。将细胞于1×PBS中洗涤两次，然后以CF555山羊抗兔二级抗体(1:200；Life technologies公司)、CF488山羊抗兔二级抗体(1:200；Biotium公司)、CF555山羊抗小鼠二级抗体(1:200；Lifetechnologies公司)、CF488山羊抗小鼠二级抗体(1:200；Biotium公司)、CF555山羊抗大鼠二级抗体(1:200；Life technologies公司)在阻隔缓冲液中于室温下避光作用1小时。将细胞以1×PBS洗涤两次，并将细胞保持在1×PBS中。通过使用荧光显微镜分析荧光。通过图像分析软件(Image-Pro plus4.5软件，马里兰州，美国)分析每个图像的荧光强度。每个免疫荧光图像定量超过300个细胞/场。

1.4流式细胞仪分析

将细胞依次与一级抗体以及二级抗体一起作用。然后通过FACSCanto(BectonDickinson公司，法兰克林湖，纽泽西州，美国)分析细胞。通过FACSDiva软件(BDBiosciences公司)进一步定量数据。

1.5髓鞘共培养试验

从小鼠中分离纯化的背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron,DRGN)培养物。将细胞维持在成熟培养基(DMEM-F12，补充有N1、0.01％胎牛血清白蛋白，以及B27补充剂(Invitrogen公司)，10ng/mL碱性纤维母细胞因子(basic fibroblast factor,bFGF)，以及2nmol/L三碘甲状腺原氨酸(T3)、10ng/mL血小板衍生生长因子(PDGF)-AA、12.5ng/mL神经生长因子(nerve growth factors,NGF))，持续3周。细胞形成神经元网络。将少突胶质谱系细胞(0.7×10⁵个细胞/cm²)悬浮在限定培养基中的背根神经节神经元(DRGN)培养物中。确定的培养基由补充有N1(Sigma-Aldrich公司)、0.01％胎牛血清白蛋白、1％青霉素-链霉素，以及B27补充剂(Invitrogen公司)，10ng/mL血小板衍生生长因子(PDGF)-AA、10ng/mL碱性纤维母细胞因子(bFGF)，以及2nmol/L三碘甲腺原氨酸(T3)(Sigma-Aldrich公司)(称为DM+GF)的DMEM-F12培养基所组成。在共培养2周后分析细胞分化程度以及髓鞘形成。

2.结果

2.1五种化学药剂的混合物组成分的优化

为了优化皮肤纤维母细胞中诱导的少突胶质谱系细胞(OLGs)的诱导方法，我们首先测量了Y27632以及SU9516。结果显示SU9516与圆顶状形成有关(图1A)，Y27632导致树突状形态变化(图1B)。Y27632以及SU9516的组合有效地将大多数纤维母细胞转化为少突胶质谱系细胞(OLGs)状细胞(图2A)。结果显示，诱导细胞的形态在两天内迅速变化，O4显著表现(图2B)。此外，我们加入了PKC抑制剂Go6983，据记载它可以改善少突胶质细胞的形成⁴²。Go6983与Y27632促进树枝状的形成，SU9516则具有维持圆顶状的功能(图3)。在先前的研究之后，我们通过预处理丙戊酸(VPA)2天来抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)并成功地提高重新编程的效率(图4A、4B)。接下来，我们筛选基于混合物的药物筛选的支持因子。在22种药物中，我们发现毛喉素(FSK)显著促进转化作用(图5)。总体而言，优化方案以VPA、Y27632、Go6983、FSK，以及SU9516处理细胞以指导重新编程(图6A、6B)。优化的混合物可以将皮肤纤维母细胞转分化成为具有相应细胞形态以及标记表现的少突胶质谱系细胞(OLGs)状细胞。在我们的例子中，该五种化学物质可以在三天内有效地转化细胞(图6A、6B)。

2.2在由五种化学物质产生的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)上表现多种少突胶质细胞特异性标记

根据初步数据，我们设计了含有五种化学物质的混合物，以诱导纤维母细胞产生少突胶质谱系细胞(OLGs)。于此，我们通过免疫荧光以及QRT-qPCR检查被诱导的细胞上的各种少突胶质细胞特异性标记(图6A以及6B)。标记染色结果显示，PDGFR[少突胶质细胞前体/先驱细胞(OPCs)标记]、髓鞘碱性蛋白(MBP)(成熟髓鞘化少突胶质细胞标记)，以及Olig2(在少突胶质细胞前体/先驱细胞(OPCs)中组成型表现的转录因子)的表现程度在诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)中增加(图6A)。此外，我们通过RT-qPCR检查了SOX10(与少突胶质细胞前体/先驱细胞(OPCs)分化相关的转录因子)、PLP1(在成熟少突胶质细胞上表现的髓鞘蛋白)的表现程度(图6B)。结果显示，SOX10、PLP1具有高表现量。总之，这些数据显示出分子特征与形态变化的一致性。

2.3低剂量的四种化学物质足以用于诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的转化作用

此外，我们发现Go6983对于转换过程是不必要的(图7)。此外，低剂量的Y27632、SU9516，以及FSK(10μM)混合物足以获得与高剂量(50μM)相似的结果(图8)。结果显示，10μM足以触发重新编程，具有更好的转换效率。少突胶质细胞的特异性标记oligo2、O4、PDGFRα、GlaC、GRP17、髓鞘碱性蛋白(MBP)、O1(图9A和9B)通过免疫荧光测定法大量表现。通过qRT-PCR分析，显示Sox10、髓鞘碱性蛋白(MBP)，以及PLP1显著增加超过3倍(图9C)。

2.4通过共培养实验证实诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)可以髓鞘化神经元。

为了详细阐述体外髓鞘形成能力，我们对诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)(通过用四种化合物4C(VYSF)处理从皮肤细胞产生的)与小鼠神经元(背根神经节细胞，mDRGs)进行了共培养测定。为了分析，我们将来自小鼠神经元(mDRGs)的诱导的细胞与人类核(HuNu)的染色区分开来。结果证明神经丝(neurofilament,NF)以及髓鞘碱性蛋白(MBP)在小鼠神经元(mDRG)以及诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)上的共定位(图10)。这表示神经元可被诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)髓鞘化。

还研究了诱导式少突胶质谱系细胞的增殖能力。为了确定我们以化学物质处理后诱导式细胞是否仍然具有足够的增殖能力，我们对有丝分裂标记进行染色并检测到O4-阳性诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)(通过以四种化合物4C(VYSF)处理而从皮肤细胞所产生)上Ki67的表现。我们的发现显示这些诱导式细胞表现Ki67并具有一定的增殖能力(图11)。此外，通过流式细胞仪分析，我们计划使用A2B5(少突胶质细胞先驱细胞标记)在早期发育阶段分离少突胶质细胞。这些A2B5阳性细胞达到78％的活细胞并且能够扩增并表现O4标记高达56.4％(图12A、12B、12C)。结果显示，A2B5-阳性细胞表现出少突胶质细胞谱系特征，且转化效率高。

2.5使用莫汀司他以及帕新司他代替VPA以产生诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。

特别是，如同VPA，莫汀司他以及帕新司他为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。我们尝试在第一步诱导时以莫汀司他以及帕新司他替换VPA。实验结果显示，相较于原始混合物，这两种组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂可以促进纤维母细胞分化成更成熟的少突胶质细胞形态，具有更多的分支与复杂的结构(图13A)。免疫荧光染色结果显示，以这两种组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂处理的细胞表现少突胶质细胞特异性标记O4以及髓鞘碱性蛋白(MBP)(图13B)。

2.6三种化学物质(3C)足以将纤维母细胞转化为少突胶质谱系细胞(OLGs)。

为了了解哪些化学物质为少突胶质谱系细胞(OLGs)转换的关键因子，我们尝试测试并减少一、两种因子。实验结果显示，含有VPA、Y27632以及FSK的三种化学物质可以导致少突胶质谱系细胞(OLGs)特异性标记A2B5(图14A)、O4(图14B)，以及髓鞘碱性蛋白(MBP)(图14B)的表现增加。这表示3C可以形成具有较低功效的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)。

3.总结

总之，于此我们展示了化学物质Y27632(一种Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂)与VPA(一种组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂)，以及Forskolin(一种环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂)的组合，可视需要地进一步与SU9516(一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂)或Y27632(一种Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂)的组合，而且SU9516(一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂)可以将纤维母细胞重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)，具有多种少突胶质细胞标记的表现。其转换效率很高。少突胶质谱系细胞(OLGs)标记O4阳性率为56.4％，而A2B5为73.9％。这些表现多种少突胶质谱系细胞(OLGs)谱系标记的诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)在髓鞘化神经元中具有功能性且为有效的，因此可用于细胞治疗，特别是用于髓鞘脱失病。

参考文献

1.O'Rahilly,R.&

F.Basic human anatomy:a regional study of humanstructure.(Saunders,Philadelphia；1983).

2.Purves,D.&Williams,S.M.Neuroscience,Edn.2nd.(Sinauer Associates,Sunderland,Mass.；2001).

3.Allen,N.J.&Barres,B.A.Neuroscience:Glia-more than just brainglue.Nature 457,675-677(2009).

4.Burns,T.C.,Verfaillie,C.M.&Low,W.C.Stem cells for ischemic braininjury:a critical review.J Comp Neurol 515,125-144(2009).

5.Thoma,E.C.et al.Chemical conversion of human fibroblasts intofunctional Schwann cells.Stem Cell Reports 3,539-547(2014).

6.Ohara,P.T.et al.Gliopathic pain:when satellite glial cells gobad.Neuroscientist15,450-463(2009).

7.Kier,L.B.&Tombes,R.M.Proton hopping:a proposed mechanism formyelinated axon nerve impulses.Chem Biodivers 10,596-599(2013).

8.Bradl,M.&Lassmann,H.Oligodendrocytes:biology and pathology.ActaNeuropathol 119,37-53(2010).

9.Inglese,M.Multiple sclerosis:new insights and trends.AJNR Am JNeuroradiol27,954-957(2006).

10.Love,S.Demyelinating diseases.J Clin Pathol 59,1151-1159(2006).

11.Lepeta,K.et al.Synaptopathies:synaptic dysfunction in neurologicaldisorders.J Neurochem(2016).

12.Najm,F.J.et al.Drug-based modulation of endogenous stem cellspromotes functional remyelination in vivo.Nature 522,216-220(2015).

13.Imani,A.&Golestani,M.Cost-utility analysis of disease-modifyingdrugs in relapsing-remitting multiple sclerosis in Iran.Iran J Neurol 11,87-90(2012).

14.Gallo,P.,Van Wijmeersch,B.&Paradig,M.S.G.Overview of themanagement of relapsing-remitting multiple sclerosis and practicalrecommendations.Eur J Neurol 22Suppl 2,14-21(2015).

15.Compston,A.&Coles,A.Multiple sclerosis.Lancet 372,1502-1517(2008).

16.Grigoriadis,N.,van Pesch,V.&Paradig,M.S.G.A basic overview ofmultiple sclerosis immunopathology.Eur J Neurol 22Suppl 2,3-13(2015).

17.Zoghbi,H.Y.&Orr,H.T.Glutamine repeats and neurodegeneration.AnnuRev Neurosci 23,217-247(2000).

18.Rosas,H.D.et al.Evidence for more widespread cerebral pathology inearly HD-An MRI-based morphometric analysis.Neurology 60,1615-1620(2003).

19.Fennema-Notestine,C.et al.In vivo evidence of cerebellar atrophyand cerebral white matter loss in Huntington disease.Neurology 63,989-995(2004).

20.Bartzokis,G.et al.Myelin breakdown and iron changes in Huntington's disease:Pathogenesis and treatment implications.Neurochem Res 32,1655-1664(2007).21.Di Paola,M.et al.Multimodal MRI Analysis of the Corpus CallosumReveals White Matter Differences in Presymptomatic and Early Huntington'sDisease.Cereb Cortex 22,2858-2866(2012).

22.Di Paola,M.et al.MRI measures of corpus callosum iron and myelinin early Huntington's disease.Hum Brain Mapp 35,3143-3151(2014).

23.Phillips,O.et al.Deep White Matter in Huntington's Disease.PlosOne 9(2014).

24.Wade,A.,Jacobs,P.&Morton,A.J.Atrophy and degeneration in sciaticnerve of presymptomatic mice carrying the Huntington's disease mutation.BrainRes1188,61-68(2008).

25.Xiang,Z.M.et al.Peroxisome-Proliferator-Activated Receptor GammaCo活化剂1alpha Contributes to Dysmyelination in Experimental Models ofHuntington's Disease.J Neurosci 31,9544-9553(2011).

26.Huang,B.et al.Mutant huntingtin downregulates myelin regulatoryfactor-mediated myelin gene expression and affects matureoligodendrocytes.Neuron 85,1212-1226(2015).

27.Kurita,H.et al.Radiation-induced apoptosis of oligodendrocytes inthe adult rat brain.Neurol Res 23,869-874(2001).

28.Oi,S.et al.Brain tumors diagnosed in the first year of life infive Far-Eastern countries.Statistical analysis of 307cases.Childs Nerv Syst6,79-85(1990).

29.Panagiotakos,G.et al.Long-term impact of radiation on the stemcell and oligodendrocyte precursors in the brain.PLoS One 2,e588(2007).

30.Piao,J.et al.Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyteprogenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits followingradiation.Cell Stem Cell 16,198-210(2015).

31.Kawabata,S.et al.Grafted Human iPS Cell-Derived OligodendrocytePrecursor Cells Contribute to Robust Remyelination of Demyelinated Axonsafter Spinal Cord Injury.Stem Cell Reports 6,1-8(2016).

32.Tontsch,U.,Archer,D.R.,Dubois-Dalcq,M.&Duncan,I.D.Transplantationof an oligodendrocyte cell line leading to extensive myelination.Proc NatlAcad Sci U S A 91,11616-11620(1994).

33.Groves,A.K.et al.Repair of demyelinated lesions by transplantationof purified O-2A progenitor cells.Nature 362,453-455(1993).

34.Guarino,A.T.&McKinnon,R.D.Reprogramming cells for brainrepair.Brain Sci 3,1215-1228(2013).

35.Ogawa,S.,Tokumoto,Y.,Miyake,J.&Nagamune,T.Immunopanning selectionof A2B5-positive cells increased the differentiation efficiency of inducedpluripotent stem cells into oligodendrocytes.Neurosci Lett 489,79-83(2011).

36.Biswas,D.&Jiang,P.Chemically Induced Reprogramming of SomaticCells to Pluripotent Stem Cells and Neural Cells.Int J Mol Sci 17,226(2016).

37.Aharonowiz,M.et al.Neuroprotective effect of transplanted humanembryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiplesclerosis.PLoS One 3,e3145(2008).

38.Mikaeili Agah,E.,Parivar,K.&Joghataei,M.T.Therapeutic effect oftransplanted human Wharton's jelly stem cell-derived oligodendrocyteprogenitor cells(hWJ-MSC-derived OPCs)in an animal model of multiplesclerosis.Mol Neurobiol 49,625-632(2014).

39.Bulic-Jakus,F.,Katusic Bojanac,A.,Juric-Lekic,G.,Vlahovic,M.&Sincic,N.Teratoma:from spontaneous tumors to the pluripotency/malignancyassay.Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 5,186-209(2016).

40.Najm,F.J.et al.Transcription factor-mediated reprogramming offibroblasts to expandable,myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.NatBiotechnol 31,426-433(2013).

41.Yang,N.et al.Generation of oligodendroglial cells by directlineage conversion.Nat Biotechnol 31,434-439(2013).

42.Baer,A.S.et al.Myelin-mediated inhibition of oligodendrocyteprecursor differentiation can be overcome by pharmacological modulation ofFyn-RhoA and protein kinase C signalling.Brain 132,465-481(2009).

Claims

1.一种产生诱导式少突胶质谱系细胞(induced oligodendrocyte-lineage cells,OLGs)的方法，包括在允许部分皮肤细胞重新编程为诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)的条件下培养所述皮肤细胞，其中该条件包括培养基，该培养基包含化学诱导剂，该化学诱导剂包括Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase,ROCK)抑制剂，其中所述皮肤细胞以选自由下列所组成的群组的辅助剂处理：组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制剂、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂、环腺苷单磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)活化剂，以及其任何组合。

2.如权利要求1所述的方法，其中该皮肤细胞为纤维母细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其中该辅助剂包括CDK抑制剂。

4.如权利要求1所述的方法，其中该辅助剂包括HDAC抑制剂以及cAMP活化剂，可视需要地连同CDK抑制剂。

5.如权利要求1所述的方法，其中该辅助剂以及该化学诱导剂同时或依次添加至该培养基中。

6.如权利要求1所述的方法，其中该辅助剂在该化学诱导剂之前被添加至该培养基中。

7.如权利要求1所述的方法，其中该化学诱导剂为小分子。

8.如权利要求1所述的方法，其中该辅助剂为小分子。

9.如权利要求1所述的方法，其中该化学诱导剂包括Y27632。

10.如权利要求1所述的方法，其中该HDAC抑制剂是选自由下列所组成的群组：VPA、莫汀司他(Mocetinostat)、帕新司他(Pracinostat)及其任何组合；该环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂包括毛喉素(forskolin,FSK)；该CDK抑制剂包括SU9516；及/或该PKC抑制剂包括G06983。

11.如权利要求4所述的方法，其中该HDAC抑制剂在该ROCK抑制剂之前被加入该培养基中。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述皮肤细胞为人类细胞。

13.如权利要求1所述的方法，其中该诱导式少突胶质谱系细胞(OLGs)表现选自由下列所组成的群组的细胞标记：血小板衍生的生长因子受体(platelet-derived growthfactor receptor,PDGFR)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、少突胶质细胞转录因子(oligodendrocyte transcription factor,OLIG2)、SOX10、蛋白脂质蛋白(proteolipid protein,PLP)1、Ki67、A2B5、O4，以及其任何组合。

14.如权利要求1所述的方法，进一步包括从该细胞培养物中分离该诱导式OLGs以获得分离的诱导式OLGs群。

15.一种治疗疾病或病症的方法，包括给予有需要这种治疗的受试者治疗有效量的诱导式OLGs，其中该诱导式OLGs通过以包括Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的化学诱导剂处理而衍生自皮肤细胞，其中所述皮肤细胞以选自由下列所组成的群组的辅助剂处理：组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂、环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，以及其任何组合。

16.如权利要求15所述的方法，其中该辅助剂包括CDK抑制剂。

17.如权利要求15所述的方法，其中该辅助剂包括HDAC抑制剂以及cAMP活化剂，可视需要地连同CDK抑制剂。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述皮肤细胞在以该ROCK抑制剂处理之前先以该HDAC抑制剂处理。

19.如权利要求15所述的方法，其中该疾病或病症与少突胶质细胞功能障碍有关。

20.如权利要求15所述的方法，其中该疾病或病症为髓鞘脱失病。

21.如权利要求15所述的方法，其中该诱导式OLGs有效促进该受试者中神经元的髓鞘形成。

22.如权利要求15所述的方法，其中该疾病或病症选自由下列所组成的群组：多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)、急性出血性炎症性疾病(acute hemorrhagicinflammatory disease,AHL)、脑性麻痹、急性播散性脑脊髓炎(acute-disseminatedencephalomyelitis,ADEM)、脑桥中央髓鞘溶解、进行性多处脑白质病、先天性脑白质营养不良、帕金森氏症、杭丁顿氏症、精神分裂症，以及放射线治疗引起的髓鞘脱失病。

23.一种医药组合物，包含治疗有效量的诱导式OLGs以及药学上可接受的载剂，其中该诱导式OLGs通过以包括Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的化学诱导剂处理而衍生自皮肤细胞，其中所述皮肤细胞以选自由下列所组成的群组的辅助剂处理：组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂、环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，以及其任何组合。

24.如权利要求23所述的医药组合物，其中该辅助剂包括该CDK抑制剂。

25.如权利要求23所述的医药组合物，其中该辅助剂包括HDAC抑制剂以及cAMP活化剂，可视需要地连同CDK抑制剂。

26.如权利要求25所述的医药组合物，其中所述皮肤细胞在以该ROCK抑制剂处理之前先以该HDAC抑制剂处理。

27.一种培养物，包含皮肤细胞以及包含化学诱导剂的培养基，该化学诱导剂包含Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂，结合选自由下列所组成的群组的辅助剂：组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂、环腺苷单磷酸(cAMP)活化剂，以及其任何组合。

28.如权利要求27所述的培养物，进一步包含衍生自所述皮肤细胞的诱导式OLGs。