WO2016186346A1 - Oct4가 도입된 인간체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통한 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법 - Google Patents

Oct4가 도입된 인간체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통한 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법 Download PDF

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WO2016186346A1
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WO
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human somatic
somatic cells
oligodendrocyte progenitor
progenitor cells
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유승권
윤원진
박민지
박지용
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고려대학교산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing oligodendrocyte progenitor cells through direct reprogramming from human somatic cells into which a nucleic acid molecule encoding Oct4 protein is introduced or human somatic cells treated with Oct4 protein.
  • oligodendrocyte procursor cells which can differentiate into oligodendrocytes capable of forming myelin sheath, has emerged as a major treatment method. Research into embryonic stem cells and adult stem cells to obtain.
  • Embryonic Stem Cells unlike somatic cells, are pluripotentcy cells that can differentiate into any cell in the body that has the ability to divide indefinitely.
  • Adult stem cells are multipotency cells that can be extracted from a patient.
  • neural stem cells NSC
  • Neural stem cells which are adult stem cells, have gained the spotlight as cell therapy products because they have the advantage of overcoming the immune rejection problem when treating neurological diseases, but their ability to differentiate into oligodendrocytes is remarkably low, and the patient's own brain tissue Because of the limited number of cells that can be obtained from the situation is not very effective.
  • Embryonic stem cells also have disadvantages that must be overcome for clinical use. First of all, embryonic stem cells have ethical problems because they need to destroy fertilized embryos to obtain embryonic stem cells. There is a problem that rejection occurs.
  • dedifferentiation from differentiated cells to undifferentiated cells has been in the spotlight, and dedifferentiation is using pluripotent stem cells such as embryonic stem cells using differentiated cells.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells using differentiated cells.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • An alternative method of stem cell differentiation is a direct reprogramming method, which is a method of introducing genes that are specifically expressed in cells and grows with a combination of derivatization inducers and low molecular weight substances. It can be seen as two techniques to induce desired cells without obtaining pluripotency through signal regulation. This method is highly regarded for removing many of the factors that inhibit clinical application while having the advantages of several stem cells.
  • the present inventors have made intensive efforts to induce rare oligodendrocyte progenitor cells through direct reprogramming from human somatic cells.
  • the present inventors introduced Oct4 into human somatic cells and treated several low molecular materials involved in oligodendrocyte formation. It was confirmed that induction into progenitor glial progenitor cells was completed, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is oligodendrocyte progenitor cells from human somatic cells through direct reprogramming, comprising culturing human somatic cells into which a nucleic acid molecule encoding Oct4 protein is introduced in a medium containing a specific low molecular weight material.
  • Another object of the present invention is direct reprogramming comprising culturing human somatic cells in a medium containing a specific low molecular weight material, wherein the human somatic cells are treated with Oct4 protein before, simultaneously with, or after culturing.
  • the present invention provides a method for inducing oligodendrocyte progenitor cells from human somatic cells.
  • Another object of the present invention is to provide a oligodendrocyte precursor through direct reprogramming from human somatic cells treated with Oct4 protein or introduced with a nucleic acid molecule encoding Oct4 protein, which contains a specific low molecular weight substance as an active ingredient. It is to provide a composition for cell induction.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for differentiating oligodendrocyte progenitor cells prepared by the above method into oligodendrocytes.
  • the present invention provides a human somatic cell into which a nucleic acid molecule encoding Oct4 protein is introduced (i) a TGF- ⁇ type I receptor inhibitor; (ii) Inhibitor of Rho-associated kinase; (iii) Histone deacetylase inhibitors; And (iv) culturing the oligodendrocyte progenitor cells from human somatic cells through direct reprogramming comprising culturing in a medium containing a Shh agent (Sonic hedgehog agonist).
  • the present invention also relates to human somatic cells comprising (i) a TGF- ⁇ type I receptor inhibitor; (ii) Inhibitor of Rho-associated kinase; (iii) Histone deacetylase inhibitors; And (iv) culturing in a medium containing Shh agonist (Sonic hedgehog agonist), wherein the human somatic cells are treated via direct reprogramming, which comprises the step of treating Oct4 protein before, simultaneously with or after culturing.
  • Shh agonist Sonic hedgehog agonist
  • the invention also relates to (i) TGF- ⁇ type I receptor inhibitors; (ii) Inhibitor of Rho-associated kinase; (iii) Histone deacetylase inhibitors; And (iv) oligodendum through direct reprogramming from human somatic cells into which a nucleic acid molecule encoding Oct4 protein is introduced or human somatic cells treated with Oct4 protein, comprising a Shh agent (Sonic hedgehog agonist) as an active ingredient.
  • a composition for inducing glial progenitor cells is provided.
  • the present invention also provides a step of culturing the oligodendrocyte progenitor cells prepared by the above method in a medium containing a ROCK inhibitor (Inhibitor of Rho-associated kinase), a calcium channel agonist and a Leukemia Inhibitory Factor (LIF). It provides a method for differentiating oligodendrocyte progenitor cells comprising oligodendrocytes.
  • ROCK inhibitor Inhibitor of Rho-associated kinase
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • iOPCs are induced by introducing Oct4 into Fibroblasts differentiated from Sox10 :: eGFP hESCs.
  • Figure 2 shows the introduction of Oct4 into Sox10 :: eGFP fibroblasts and incubated in Reprogramming Media (RM) for 7 days, followed by incubation in Inducing Media (IM) to form small molecules required to establish oligodendrocyte progenitor cells (iOPCs). It shows the process of screening sex material.
  • RM Reprogramming Media
  • IM Inducing Media
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • FIG. 6 compares Sox10 expression in a medium in which low molecular weight substances were removed one by one and in a medium containing all of them.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • MMET epithelial to epithelial transition
  • 11 is a result of comparing the mRNA expression of OPC marker genes in iOPC by real-time PCR.
  • oligodendrocyte oligodendrocytes
  • oligodendrocyte in the form of a typical branch when the established iOPC cultured for 40 to 60 days in the growth conditions excluding differentiation conditions, real-time PCR and immunochemical staining method It is a result confirming the increased expression of MBP and MAG markers of oligodendrocytes.
  • FIG. 13 shows that iOPC expressing GFP is co-cultured with neurons of mice to differentiate into oligodendrocytes, and neurons and myelin myelination are achieved.
  • FIG. 14 confirms that myelin is observed similarly to normal mice by implanting iOPC into multiple sclerosis animal models in order to verify the efficacy of differentiation and treatment in vivo.
  • FIG. 16 shows the proliferation after removing iFCs and PDGF-AA, which are growth factors of OPCs, from the culture medium to prove that iOPCs are iOPCs that proliferate in response to growth factors without passing through neural stem cells.
  • iOPCs are iOPCs that proliferate in response to growth factors without passing through neural stem cells.
  • Expression of OPC markers PDGFRa, A2B5 in the growth factor dependent proliferating cells was confirmed by FACS analysis.
  • FIG. 17 shows the results of overexpressing Oct4 in hair follicle cells (Hair-follicle Dermal Papilla) and culturing in IM, and analyzing the expression of OPC markers by FACS analysis, real-time PCR, and immunochemical staining.
  • FIG. 18 shows the results of overexpressing Oct4 in amniotic stem cells, adipose derived stem cells and skin cells of various ages, and culturing in IM, followed by real-time PCR or FACS analysis of OPC marker expression.
  • 19 is a schematic diagram showing the overall contents of the present invention and the difference from the existing technology.
  • oligodendrocyte progenitor cells induction into oligodendrocyte progenitor cells through the introduction and control of culture conditions of the Oct4 gene overexpressing Oct4 in human somatic cells and treating various low molecular materials involved in the formation of oligodendrocytes.
  • OPC marker gene expression, epigenetics and myelin formation ability in vitro were confirmed.
  • the oligodendrocyte progenitor cells thus induced showed differentiation efficacy as a cell therapeutic agent.
  • the present invention relates to the development of patient-specific cell therapy using a direct reprogramming method.
  • the low molecular weight material KR 10-1357402
  • the present inventors have discovered a combination of new substances and a combination with genes. Through this, oligodendrocyte progenitor cells were established without passing neural stem cells from human somatic cells.
  • oligodendrocytes after introducing Oct4 gene into the foreskin fibroblasts, which are human somatic cells, oligodendrocytes by culturing in a medium containing A83-01, thiazobibin, effervescent acid (VPA), permophamine and forskolin Progenitor marker expression was confirmed and induction of oligodendrocyte progenitor cells from human somatic cells was confirmed.
  • the present invention provides a human somatic cell into which a nucleic acid molecule encoding Oct4 protein is introduced at an integrated point (i) a TGF- ⁇ type I receptor inhibitor; (ii) Inhibitor of Rho-associated kinase; (iii) Histone deacetylase inhibitors; And (iv) culturing the oligodendrocyte progenitor cells from human somatic cells through direct reprogramming comprising culturing in a medium containing a Shh agent (Sonic hedgehog agonist).
  • the gene of the nucleic acid form encoding Oct4 protein was introduced into the foreskin fibroblasts, which are human somatic cells, but Oct4 was overexpressed. It can also be used by treating directly to somatic cells. Oct4 protein may be treated before, simultaneously with or after culturing somatic cells in a medium containing low molecular weight material.
  • the present invention provides human somatic cells comprising (i) a TGF- ⁇ type I receptor inhibitor; (ii) Inhibitor of Rho-associated kinase; (iii) Histone deacetylase inhibitors; And (iv) culturing in a medium containing Shh agonist (Sonic hedgehog agonist), wherein the human somatic cells are treated via direct reprogramming, which comprises the step of treating Oct4 protein before, simultaneously with or after culturing.
  • Shh agonist Sonic hedgehog agonist
  • the medium preferably further contains a calcium channel agonist, and also RG108, BIX01294, SP600125, Lysophosphatidic acid, Bayk8644, Forskolin, and dexamethasone.
  • a calcium channel agonist preferably further contains any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the TGF- ⁇ type I receptor inhibitor is A83-01
  • the ROCK inhibitor is thiazovivin
  • the histone deacetylase inhibitor is Valproic Acid
  • the Shh agonist is Permorphamine (Purmorphamine).
  • the calcium channel agonist is, but is not limited to, Forskolin.
  • TGF- ⁇ type I Transforming growth factor- ⁇ type I
  • TGF- ⁇ type I Transforming growth factor- ⁇ type I
  • TGF- ⁇ type I is a multifunctional peptide that has various functions on cell proliferation, differentiation and various cell types. It is known to play a pivotal role in the growth and differentiation of various tissues such as cell differentiation and to inhibit the proliferation of neural stem cells.
  • TGF- ⁇ type I receptor inhibitor A83-01 In addition to the TGF- ⁇ type I receptor inhibitor A83-01, all TGF- ⁇ type I receptor inhibitors including SB432542 may be used, and the low molecular weight TGF- ⁇ type I receptor inhibitor A83-01 may be purchased or used on the market. Can be used to promote neural stem cell proliferation by the inhibitor treatment.
  • the TGF- ⁇ type I receptor inhibitor A83-01 is treated in the medium to be included in an effective concentration. Effective concentrations may be affected by factors well known in the art, such as media type and culture method.
  • Thiazovivin N-benzyl-2- (pyrimidin-4-ylamino) thiazole-4-carboxamide
  • Rho / ROCK Rho / ROCK signal inducing apoptosis of neurons and neural stem cells and neural stem cells. It is known to block PTEN signaling, which inhibits the proliferation of cells, and is expected to inhibit neural stem cell apoptosis, increase self-renewal and self-proliferation (Matthias Groszer, et al., Science 294: 2186, 2001) .
  • the thiazovivin is a substance that selectively inhibits ROCK (Rho-associated kinase) as an inhibitor of Rho-associated kinase (ROCK), and Y-27632 may be used in addition to thiazovivin. . Treating the thiazobibin in the medium to be included in an effective concentration, the effective concentration may be affected depending on factors well known in the art, such as the type and culture method of the medium.
  • VPN valproic acid, 2-propylpentanoic acid
  • valproic acid valproic acid, 2-propylpentanoic acid
  • chromatin a substance that inhibits histone deacetylase, and makes chromatin into a high acetylation state, and expression of genes necessary for cell proliferation inhibitors and differentiation. Promotes differentiation of cells (cancer cells), inhibits angiogenesis, and locks the cell cycle to the G1 state to induce apoptosis of cancer cells, resulting in strong cytostatic anti-cancer It is known to exhibit activity.
  • Histone deacetylase inhibits gene transcription via pRB / E2F, and the destruction of histone acetylation is associated with a number of cancer developments, and HDAC is associated with hypoxia, mortgage ( Iii) HDAC is known to be recognized as an important regulator of cell carcinogenesis and differentiation by inhibiting the expression of cell proliferation factor and expressing it under severe environmental conditions such as cell carcinogenesis.
  • the VPA is known to cause inositol reduction, inhibit GSK-3 ⁇ , activate the ERK pathway, and stimulate PPAR activity.
  • HDAC inhibitor histone deacetylase inhibitor
  • VPA valproic acid, 2-propylpentanoic acid
  • TSA trachostatin
  • the derivative may be variously pharmaceutically acceptable.
  • Inorganic or organic salts If the treatment concentration is too low, it will be difficult to see the effect. If the concentration is too high, it will be toxic, so it is necessary to check the appropriate concentration according to the cell type.
  • purmorphamine is a purine compound, and is known to be involved in the Shh signaling system.
  • the permopamine is not particularly limited as long as it can induce the Shh signal, and various derivatives may be used.
  • 2- (1-Naphthoxy) -6- (4-morpholinoanilino) -9-cyclohexylpurin) can be purchased commercially.
  • the permophamine may be treated with a medium commonly used to induce differentiation into neural stem cell-like cells. This treatment of Shh analogs, permophamine, there is an advantage that does not need to introduce a gene to produce neural stem cells from human fibroblasts.
  • the permophamine is included in the medium at an effective concentration. Effective concentrations of permopamine may be affected by factors well known in the art, such as media type and culture method.
  • phospholine acts to directly activate the catalytic subunit of dadenylate cyclase to increase the concentration of cAMP in the cell
  • trimenypromine is an enzyme that normally degrades norepinephrine at the nerve endings. It acts to inhibit phosphorus monoamine oxidase (MAO).
  • the culture medium includes all media commonly used for culturing neural stem cells, and the medium used for culturing generally includes a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component.
  • the medium of the present invention is DMEM including N2, B27, penicillin / streptomycin, non-essential amino acid, bFGF, PDGF and ascorbic acid, but is not limited thereto.
  • the medium for induced cell culture of the present invention can be used without limitation, basal medium known in the art.
  • the basal medium may be prepared by artificially synthesizing, or a commercially prepared medium may be used.
  • commercially prepared media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal). essential medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), and Isocove's Modified Dulbecco's Medium, but are not limited thereto.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F-12
  • ⁇ -MEM ⁇ -Minimal
  • essential medium G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium)
  • the human somatic cells are foreskin fibroblasts, hair follicle dermal papilla, IMR90 pulmonary fibroblasts or dermal fibroblasts, but is not limited thereto. .
  • induction of oligodendrocyte precursor cells from amniotic stem cells (Amniotic derived Stem Cells) or Adipose-derived Stem Cells (Aldipose-derived Stem Cells) is also possible.
  • Oct4 of the present invention is preferably provided in the form of a protein or nucleic acid encoding a protein thereof, the Oct4 protein of the present invention includes a variant of the Oct4 protein as well as a protein having its wild type amino acid sequence.
  • the variant of Oct4 protein refers to a protein in which the native amino acid sequence of Oct4 and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • the variant may be a functional equivalent that exhibits the same biological activity as a natural protein, or may be a variant in which the physicochemical properties of the protein are modified as necessary to increase structural stability to a physical and chemical environment or to increase physiological activity.
  • nucleic acid having a nucleotide sequence encoding Oct4 protein wherein the nucleotide sequence encoding Oct4 is a nucleotide sequence encoding a wild type or Oct4 protein of the variant form, wherein one or more bases are substituted or deleted. It can be mutated by insertion, insertion, or a combination thereof and can be isolated from nature or prepared using chemical synthesis. Nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the Oct4 protein may be a single or double chain, DNA molecules (genome, cDNA) or RNA molecules.
  • the nucleic acid encoding the Oct4 protein can be introduced into cells in a manner known in the art, for example, as naked DNA in the form of a vector (Wolff et al. Science , 1990: Wolffet al. J Cell Sci . 103: 1249-59, 1992), liposomes, cationic polymers (Cationic polymer) and the like can be introduced into the cell.
  • Liposomes are phospholipid membranes prepared by mixing cationic phospholipids such as DOTMA or DOTAP for gene introduction. When liposomes and anionic nucleic acids are mixed in a proportion, a nucleic acid-liposomal complex is formed.
  • vector refers to a gene construct, which is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and which contains essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • operably linked refers to a functional linkage of a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest to perform a general function. Operative linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes commonly known in the art and the like.
  • Vectors of the present invention include signal or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, enhancers, and can be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable expression vector, a replication origin. Vectors can self replicate or integrate into host DNA.
  • Vectors include plasmid vectors, cosmid vectors, viral vectors, and the like. Preferably, it is a viral vector.
  • Viral vectors are retroviruses such as Human immunodeficiency virus (HIV), Murineleukemia virus (MLV), Avian sarcoma / leukosis (ASLV), Spleen necrosis virus (SNV), Rus sarcoma virus (RSV), and Mouse (MMTV).
  • mammary tumor virus such as, but not limited to, adenovirus (Adenovirus), adeno-associated virus (Adenoassociated virus), herpes simplex virus (Herpes simplex virus) and the like.
  • the rare oligodendrocyte progenitor cells may be characterized by expressing any one or more markers selected from the group consisting of PDGFRa, A2B5, Olig2, Sox10, S100b and ZFP536, Sox1, Sox2 and Pax6 markers It may be characterized by not expressing.
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a TGF- ⁇ type I receptor inhibitor; (ii) Inhibitor of Rho-associated kinase; (iii) Histone deacetylase inhibitors; And (iv) oligodendum through direct reprogramming from human somatic cells into which a nucleic acid molecule encoding Oct4 protein is introduced or human somatic cells treated with Oct4 protein, comprising a Shh agent (Sonic hedgehog agonist) as an active ingredient. It relates to a composition for inducing glial progenitor cells.
  • a calcium channel agonist RG108, BIX01294, SP600125, Lysophosphatidic acid (Lysophosphatidic acid), Bayk8644, Forskolin (Forskolin) It may be characterized by further containing any one selected from the group consisting of, dexamethasone (Dexamethasone), EX527 and Rolipram (Rolipram).
  • the TGF- ⁇ type I receptor inhibitor is A83-01
  • the ROCK inhibitor is thiazovivin
  • the histone deacetylase inhibitor is Valproic Acid
  • the Shh agonist is Permorphamine (Purmorphamine).
  • the calcium channel agonist is, but is not limited to, Forskolin.
  • the oligodendrocyte progenitor cells may be characterized in that they do not express Sox1, Sox2 and Pax6 markers.
  • the growth factor and the specific low molecular weight material were removed from the conventional induction culture, and the T3 (triiodo-l-thyronine), induced by using a differentiation medium added with triazobibin, foscholine, and LIF It was confirmed that oligodendrocyte progenitor cells differentiate into oligodendrocytes.
  • the present invention provides a rare oligodendrocyte progenitor cell prepared by the above method in which the ROCK inhibitor (Inhibitor of Rho-associated kinase), Calcium channel agonist and LIF (Leukemia Inhibitory Factor) are included. It relates to a method of differentiating oligodendrocyte progenitor cells into oligodendrocytes comprising culturing in a medium.
  • ROCK inhibitor Inhibitor of Rho-associated kinase
  • Calcium channel agonist and LIF (Leukemia Inhibitory Factor
  • the medium is preferably, but not limited to, DMEM containing N2, B27, penicillin / streptomycin, non-essential amino acid, ascorbic acid and T3 (triiodo-l-thyronine).
  • the rare oligodendrocyte progenitor cells of the present invention are known to have extremely small amounts in the cerebrum and are known to have low differentiation rate in neural stem cells constituting the cerebrum, thereby establishing many oligodendrocyte progenitor cells from higher stem cells. There is difficulty. Therefore, in the prior art, many studies have been conducted to efficiently establish oligodendrocyte progenitor cells, but there is a problem in that oligodendrocyte progenitor cells can be established through long-term differentiation of at least 70 days.
  • the present invention can solve these problems with high efficiency cell conversion rate in a short period of time because the oligodendrocyte progenitor cells can be established through a relatively short-term culture of 1 to 2 weeks through direct reprogramming without neural stem cells. .
  • the low molecular material of the present invention is used to treat the nervous system It is expected to play an important role in.
  • Demyelination disease is a refractory neurological disease caused by the absence of oligodendrocytes.
  • the conventional technique is mostly to establish and treat oligodendrocyte progenitor cells from embryonic stem cells.
  • embryonic stem cells have limitations due to immunorejection reactions and have ethical problems, making it difficult to establish them as therapeutic agents.
  • the method for establishing oligodendrocyte progenitor cells through direct reprogramming from somatic cells according to the present invention not only solves ethical problems, but can greatly contribute to establishing a patient-specific cell therapeutic agent because there is no immune rejection reaction.
  • the present inventors have established conditions for inducing neural stem cells from mouse cells with only low molecular weight materials without gene introduction (KR 10-1357402). Therefore, the Sox10 reporter system, a gene known to be important for the development of oligodendrocytes, was established to establish new conditions for inducing human somatic cells into oligodendrocyte progenitor cells based on the low molecular weight material established in previous studies. :: eGFP) was used to select low molecular weight material (FIG. 1).
  • RM Reprogramming Media
  • DMEM High Glucose + 5% Knock out Serum Replacement (KSR) + 1% Penicillin / Streptomycin + 1% Non-Essential Amino Acid + basic FGF (bFGF) 20ng / ml + Human Recombinant
  • KSR Knock out Serum Replacement
  • bFGF basic FGF
  • PDGF Platelet Derived Growth Factor
  • MET Mesenchymal to Epithelial Transition
  • the cells are passaged in a Matrigel coated dish, followed by A83-01, a combination of low-molecular substances that can induce neural stem cells, Thiazovivin, Valproic Acid and Permo.
  • Cultures containing Purmorphamine DMEM High glucose + 1X N2 + 1X B27 (without vitamin A) + 1% penicillin / streptomycin + 1% non-essential amino acid + basic FGF (bFGF) 20ng / ml + Human Recombinant Platelet Derived Epigenetic modulator (20) Growth Factor (PDGF) 20 ng / ml + Ascorbic Acid 50 ⁇ g / ml +0.5 ⁇ M A83-01 +0.5 ⁇ M Tazobibin +0.1 mM effervescent acid (VPA) +0.5 ⁇ M permophamine) ) And low molecular weight substances that affect the development of the nervous system.
  • the following shows the combination conditions of the low molecular weight materials.
  • ATVP 0.5 ⁇ M A83-01 + 0.5 ⁇ M thiazobibin + 0.1 mM effervescent acid (VPA) + 0.5 ⁇ M permophamine, RG108: 0.5 ⁇ M RG108, BIX01294: 0.25 ⁇ M BIX01294, SP600125: 2 ⁇ M SP600125, LPA: 2 ⁇ M lisophospha Lysophosphatidic acid, Bayk: 2 ⁇ M Bayk8644, Fsk: 10 ⁇ M Forskolin, Dex: 1 ⁇ M Dexamethasone, EX527: 5 ⁇ M EX527, Rolipram: 2 ⁇ M Rolipram
  • KSR Knockout Serum Replacement contained in Reprogramming Media (RM) of Example 1-1 has been reported to be converted to neural stem cells when used with overexpression of Oct4.
  • oligodendrocyte progenitor cells were induced under conditions other than KSR, and it was confirmed that the appearance of oligodendrocyte progenitor cells appeared.
  • the low molecular weight material was removed and processed one by one under the induction conditions of Example 1-1, and the highest Sox10 expression was confirmed in the medium containing all the low molecular weight material. 6).
  • Sox10 used as reporter cell lines of Example 1-1 are cells obtained through differentiation from ES cells, and thus, stem cells other than fibroblasts cannot be completely excluded. It is not a direct reprogramming from somatic cells.
  • the US Shengding team and Mickie Bhatia team used a culture solution containing Knock Out Serum Replacement (KSR) in the process of establishing neural stem cells after overexpressing Oct4 in human body cells.
  • KSR Knock Out Serum Replacement
  • Reprogramming Media (RM) containing KSR was not used to induce direct reprogramming from human somatic cells without passing neural stem cells, the upper stem cells of oligodendrocyte progenitor cells (FIG. 7).
  • the Oct4 gene was introduced into BJ cells, followed by subculture in a Matrigel coated dish, and cultured for 4 days under induction conditions (IM) of the oligodendrocyte progenitor cells established in Examples 1-2.
  • IM induction conditions
  • MET epithelial-mesenchymal transition
  • induced oligodendrocyte progenitor cells induced OPC: iOPC
  • Example 3 Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells into oligodendrocytes
  • the oligodendrocyte progenitor cells induced in Example 2 were implanted into an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis mouse model (EAE mouse model).
  • induced oligodendrocyte progenitor cells induced OPC: iOPC were differentiated in vivo to show the efficacy as a cell therapy.
  • Example 4 Induction of oligodendrocyte progenitor cells via direct reprogramming
  • the gene expression change during the 7 days of induction was performed by real-time PCR to verify that iOPC was established by direct reprogramming rather than differentiated from neural stem cells induced after Oct4 overexpression. It was confirmed through.
  • iOPC could prove that oligodendrocyte progenitor cells are established through direct reprogramming without neural stem cells for 7 days after induction.
  • Example 5 Induction of oligodendrocyte progenitor cells from various human somatic cells
  • oligodendrocyte precursor cells Five different cells (Hair-follicle dermal papilla, Amniotic stem cells) were used to determine whether induction of oligodendrocyte precursor cells is possible not only in Foreskin fibroblast but also in other human somatic cells.
  • Stem Cells Stem Cells
  • IMR90 pulmonary fibroblasts Dermal Fibroblasts
  • Adipose-derived Stem Cells were overexpressed in Oct4 and induced into oligodendrocyte progenitor cells.
  • PDGFR ⁇ , A2B5 and Olig2 which are representative markers of oligodendrocyte progenitor cells as well as forskin fibroblasts, were confirmed by RT-PCR, immunochemical staining and FACS analysis (FIGS. 17 and 18).
  • Oct4 and the low molecular weight combination proved to be an induction method that can be applied to various human somatic cells, not the induction method limited to BJ cells.
  • the method of inducing rare oligodendrocyte progenitor cells by treating a low molecular material to Oct4-overexpressed human cells can establish oligodendrocyte progenitor cells with high efficiency for a short period of time through direct reprogramming without neural stem cells. It is useful as a cell therapy for intractable demyelinating diseases.

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Abstract

본 발명은 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질이 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통해 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Oct4가 과발현된 인간체세포에 저분자성 물질을 처리하여 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법은 신경줄기세포를 거치지 않는 직접적 리프로그래밍을 통하여 단기간 동안 고효율로 희소돌기아교 전구세포를 확립할 수 있어, 난치성 탈수초성 질환의 세포치료제로 유용하다.

Description

Oct4가 도입된 인간체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통한 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법
본 발명은 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질이 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통해 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
고령화 사회가 되면서 건강한 노후와 질병 없는 건강한 삶을 위한 개인 맞춤형 세포치료제는 삶의 질 향상을 위한 필수적인 의약품이다. 중추신경계 질환으로 알려져 있는 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)은 정확한 원인이 밝혀지지 않는 탈수초성 질환으로 심한 경우 감각 및 운동장애가 수반되지만, 증상완화 약물치료가 시행될 뿐 근본적인 치료법이 없는 실정이다. 이에, 마이엘린 수초(Myelin Sheath) 형성이 가능한 희소돌기아교세포(Oligodendrocyte)로 분화할 수 있는 희소돌기아교 전구세포(Oligodendrocyte Precursor Cell; OPC) 이식이 주요 치료법으로 대두되고 있으며, 이식에 사용될 세포를 얻고자 배아줄기세포, 성체줄기세포를 통한 연구가 진행되고 있다.
배아줄기세포(Embryonic Stem Cells)는 체세포와 다르게 무한히 분열할 수 있는 능력을 가지는 인체 내 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화성(Pluripotentcy) 세포이다. 성체줄기세포는 환자로부터 추출할 수 있는 다분화성(Multipotency) 세포로 대표적으로는 신경줄기세포(Neural Stem Cell; NSC)가 잘 알려져 있다. 성체줄기세포인 신경줄기세포는 신경계 질환 치료시 면역 거부반응 문제점을 극복할 수 있는 장점이 있어 세포치료제로 각광을 받고 있지만, 희소돌기아교 세포로 분화할 수 있는 능력이 현저히 낮고, 환자 본인의 뇌 조직에서 얻어야 하기 때문에 얻을 수 있는 세포의 수가 제한되어있어 큰 효과가 없는 실정이다. 배아줄기세포 역시 임상이용을 위해 극복해야하는 단점들이 존재하는데 우선, 배아줄기세포를 얻기 위해서는 수정된 배아를 파괴해야 하므로 윤리적인 문제점을 가지고 있으며, 배아줄기세포에서 분화된 세포를 환자에 이식했을 경우 면역 거부반응이 일어난다는 문제점이 있다.
이러한 문제점들을 극복하기 위해 시도된 여러 방법 중, 분화된 세포에서 미분화된 세포로의 역분화(dedifferentiation) 방법이 각광을 받았으며, 역분화는 분화된 세포를 이용하여 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포를 만들어내는 것을 총칭한다. 2006년 일본의 신야 야마나카 교수가 유전자 도입을 통한 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell;iPS cell)를 개발한 이후, 치료제에 적용하기 위한 수많은 연구가 진행되고 있다.
마우스 또는 인간의 체세포에 4개의 유전자(역분화 유도인자; Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입한 후 배아줄기세포 배양조건에서 장기간 배양하면 배아줄기세포와 유사한 특성의 줄기세포가 확립된다는 보고(Cell 126:663-676, 2006; Science 318:1917-1920, 2007) 이후, 이를 임상적으로 이용하기 위해 유전자를 대체할 수 있는 여러 가지 방법이 연구되고 있다. 하지만, 아직까지 인간 체세포에 대한 연구결과는 미흡하고 역분화 유도 기작을 규명하기 어려운 점 및 양성종양(teratoma) 형성의 위험 등 때문에 역분화 줄기세포를 임상적용 하는데 어려움이 있다. 이러한 역분화 줄기세포의 대안으로 최근 제시되고 있는 방법이 ‘직접적 리프로그래밍 (Direct reprogramming)’방법으로, 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 도입 기술 및 역분화 유도인자와 저분자성 물질의 조합으로 성장신호 조절을 통한 만능성 획득 없이 원하는 세포로 유도하는 기술 2가지로 볼 수 있다. 이 방법은 여러 줄기세포의 장점만을 가지면서 임상적용을 저해하는 요소들을 상당부분 제거했다는 점에서 높이 평가받고 있다.
최근 미국의 Marius Wernig 연구팀은 3개의 유전자(Olig2, Sox10, Zfp536)를, Paul J Tesar 연구팀도 3개의 유전자(Olig2, Sox10, NKX6.2)를 이용하여 마우스 희소돌기아교 전구세포의 확립이 가능함을 보여주어, 마우스 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포로 직접적 리프로그래밍에 성공하였음을 보고하였다. 그러나, 아직까지 인간의 체세포를 이용한 보고는 없다. 또한, 미국의 Shengding 연구팀과 Mickie Bhatia 연구팀은 인간의 체세포에 Oct4 유전자를 도입하여 직접적 리프로그래밍을 통한 신경줄기세포의 확립을 보여주어, Oct4 유전자가 세포내에서 신경계 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있다는 새로운 패러다임을 제시하였다.
이에, 본 발명자들은 인간의 체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통한 희소돌기아교 전구세포를 유도하기 위해 예의 노력한 결과, 인간 체세포에 Oct4를 도입시키고 희소돌기아교세포 형성에 관여하는 여러 저분자성 물질을 처리하여 희소돌기아교 전구세포로의 유도가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포를 특정 저분자성 물질을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인간 체세포를 특정 저분자성 물질을 함유하는 배지에서 배양하되, 상기 인간 체세포는 배양 전, 배양과 동시에 또는 배양 후에 Oct4 단백질로 처리하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 특정 저분자성 물질을 유효성분으로 포함하는, Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입되거나 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포를 (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 인간 체세포를 (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 함유하는 배지에서 배양하되, 상기 인간 체세포는 배양 전, 배양과 동시에 또는 배양 후에 Oct4 단백질을 처리하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 유효성분으로 포함하는, Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 희소돌기아교 전구세포를 ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase), 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist) 및 LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
도 1은 Sox10::eGFP hESCs로부터 분화시킨 Fibroblasts에 Oct4를 도입하여 iOPCs가 유도되는 것을 보여주는 것이다.
도 2는 Sox10::eGFP fibroblasts에 Oct4를 도입하여 Reprogramming Media(RM)에서 7일간 배양 후, Inducing Media(IM)에서 배양을 통하여 희소돌기아교 전구세포(induced OPCs, iOPCs)를 확립하는 데 필요한 저분자성 물질을 선별하는 과정을 보여주는 것이다.
도 3은 Oct4가 도입된 Sox10::eGFP Fibroblasts에 저분자성 물질를 처리 후, GFP+ 분포를 FACS 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 4는 Oct4가 도입된 Sox10::eGFP Fibroblasts에 저분자성 물질를 처리 후, Sox10 이외에 희소돌기아교 전구세포의 마커로 알려져 있는 Olig2, NKX2.2 및 ZFP536의 mRNA 수준을 실시간 PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 5는 KSR(Knockout Serum Replacement)를 사용하지 않고, 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포의 모양이 나타나는 것을 보여주는 것이며, Olig2, Sox10 및 ZFP536 마커가 발현되는 것을 확인한 결과이다.
도 6은 저분자성 물질이 하나씩 제거된 배지와 모두 함유된 배지에서의 Sox10 발현을 비교하였다.
도 7은 KSR(Knockout Serum Replacement)를 사용하지 않고, 인간 체세포로부터 iOPCs를 유도하는 것을 보여주는 것이다.
도 8은 유도배지(IM)에서 배양한 3일 후에 상피-중간엽 이행(MMET: esenchymal to Epithelial Transition) 과정을 거친 세포를 확인하고, 배양 7일 후에 OPC와 유사한 모양의 세포를 확인한 결과이다.
도 9는 FACS 분석를 통해 iOPC에서 OPC 마커인 PDGFRa, A2B5의 발현을 확인한 결과이다.
도 10은 면역화학염색법을 통해 iOPC에서 발현되는 PDGFRa, A2B5의 발현을 세포막에서 확인한 결과이다.
도 11은 실시간 PCR을 통해 iOPC에서 OPC 마커 유전자들의 mRNA 발현을 비교분석한 결과이다.
도 12는 확립된 iOPC를 성장인자가 배제된 분화조건에서 40일~60일 배양하였을 때 나타나는 전형적인 Branch 유형의 형태로 희소돌기아교세포(Oligodendrocyte)의 분화를 확인한 결과이며, 실시간 PCR과 면역화학염색법을 통해 희소돌기아교세포의 마커인 MBP와 MAG의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 13은 GFP를 발현하는 iOPC를 쥐의 뉴런(Neuron)과 공배양하여 희소돌기아교세포로 분화하고, 뉴런과 마이엘린 수초형성(myelination)을 이루고 있는 것을 확인한 결과이다.
도 14는 생체내 분화 및 치료제로서의 효능을 검증하기 위해, 다발성 경화증 동물모델에 iOPC를 이식하여 myelin이 정상쥐와 유사하게 관찰이 되는 것을 확인하였다.
도 15는 iOPCs의 유도과정이 Oct4 과발현 후에 신경줄기세포를 거쳐 분화를 한 것이 아니라는 것을 증명하기 위해, 유도기간 중 신경줄기세포 마커인 Sox1, Sox2, Pax6 유전자의 발현을 실시간 PCR을 통해 확인을 한 결과이다.
도 16은 iOPCs의 유도과정이 신경줄기세포를 거치지 않고, 성장인자에 반응하여 증식하는 iOPC 임을 증명하기 위해, 유도과정 중 OPCs의 성장인자인 bFGF, PDGF-AA를 배양액에서 제거한 후 증식을 확인하였으며, 상기 성장인자 의존 증식 세포에서 OPC 마커인 PDGFRa, A2B5의 발현을 FACS 분석으로 확인하였다.
도 17은 모낭세포(Hair-follicle Dermal Papilla)에서 Oct4를 과발현시켜 IM에서 배양한 후, OPC 마커의 발현을 FACS 분석 및 실시간 PCR, 면역화학염색법으로 분석한 결과이다.
도 18은 양수줄기세포, 다양한 연령대의 지방유래 줄기세포 및 피부세포에서 Oct4를 과발시켜 IM에서 배양한 후, OPC마커의 발현을 실시간 PCR 또는 FACS 분석을 통해 보여준 결과인다.
도 19는 본 발명의 전체적인 내용 및 기존 기술과의 차이점을 나타낸 도식도이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 인간 체세포에 Oct4를 과발현시키고 희소돌기아교세포 형성에 관여하는 여러 저분자성 물질을 함께 처리하는 Oct4 유전자의 도입과 배양 조건 조절을 통해 희소돌기아교 전구세포로의 유도가 가능함을 확인하고, OPC 마커 유전자의 발현, 후성학적 특성(epigenetics) 및 in vitro에서의 마이엘린(Myelin) 형성 능력 등을 확인하였다. 또한, 이렇게 유도된 희소돌기아교 전구세포가 분화하여 세포치료제로서의 효능을 나타냄을 확인하였다.
본 발명은 직접적 리프로그래밍 방법을 활용한 환자 맞춤형 세포치료제 개발에 관한 것으로, 본 발명자들은 이전에 확립한 저분자성 물질(KR 10-1357402)을 바탕으로 새로운 물질의 조합을 발굴하고 유전자와의 조합을 통하여 인간 체세포로부터 신경줄기세포를 거치지 않고 희소돌기아교 전구세포를 확립하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 체세포인 포피 섬유아세포에 Oct4 유전자를 도입한 뒤, A83-01, 티아조비빈, 발포릭산(VPA), 퍼모파민 및 포스콜린을 함유하는 배지에서 배양하여 희소돌기아교 전구세포 마커 발현을 확인하고, 인간 체세포에서 희소돌기아교 전구세포로의 유도를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포를 (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 체세포인 포피 섬유아세포에 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산 형태의 유전자를 도입하여 Oct4를 과발현시켰으나, 희소돌기아교 전구세포 유도를 위해서는 체세포에 Oct4 유전자를 도입하는 방법 이외에도 Oct4 단백질을 직접 체세포에 처리하여 사용할 수도 있다. Oct4 단백질은 체세포를 저분자성 물질을 함유하는 배지에서 배양하기 전, 배양과 동시에 또는 배양 후에 처리할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 인간 체세포를 (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 함유하는 배지에서 배양하되, 상기 인간 체세포는 배양 전, 배양과 동시에 또는 배양 후에 Oct4 단백질을 처리하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 배지는 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist)를 추가로 함유하는 것이 바람직하며, 또한 RG108, BIX01294, SP600125, 리소포스파디드산(Lysophosphatidic acid), Bayk8644, 포스콜린(Forskolin), 덱사메타손(Dexamethasone), EX527 및 로리프램(Rolipram) 로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 추가로 함유하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, TGF-β 타입 I 수용체 억제제는 A83-01, ROCK 억제제는 티아조비빈 (Thiazovivin), 히스톤 탈아세틸효소 억제제는 발포릭산 (Valproic Acid) 또는 Shh 작용제는 퍼모파민 (Purmorphamine)인 것이 바람직하며, 칼슘 통로 작용제는 포스콜린 (Forskolin)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "A83-01"은 TGF-β 타입 I 리셉터 억제제(TGF-β type I receptor inhibitor)로 TGF-β 타입 I 리셉터에 결합하여 TGF-β 타입 I의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미한다(Tojo M et al., Cancer Sci. 96: 791-800, 2005). TGF-β 타입 I (Transforming growth factor-β type I)은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드로서, 이러한 다기능성은 지방세포형성, 근세포형성, 골세포형성, 상피세포 분화 등 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 하며, 신경줄기세포의 증식을 억제한다고 알려져 있다. 상기 TGF-β 타입 I 리셉터 억제제 A83-01 외에도 SB432542을 포함한 모든 TGF-β 타입 I 리셉터 억제제가 사용될 수 있으며, 상기 저분자성 물질 TGF-β 타입 I 리셉터 억제제 A83-01는 시중에서 구입하여 사용하거나 제조하여 사용할 수 있으며 상기 억제제 처리에 의해 신경줄기세포증식이 촉진된다. 상기 TGF-β 타입 I 리셉터 억제제 A83-01는 배지에 처리하여 유효 농도로 포함되도록 한다. 배지의 종류 및 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 유효농도는 영향을 받을 수 있다.
본 발명에서 "티아조비빈(Thiazovivin: N-benzyl-2-(pyrimidin-4-ylamino)thiazole-4-carboxamide)"은 신경세포와 신경줄기세포의 세포사멸을 유도하는 Rho/ROCK 신호를 막고 신경줄기세포의 증식을 억제하는 PTEN 신호를 막는다고 알려져 있어, 신경줄기세포의 세포사멸 억제와 자가재생능력과 자가증식능력을 증가시킬 수 있을 것으로 예상된다(Matthias Groszer, et al., Science 294: 2186, 2001). 상기 티아조비빈(Thiazovivin)은 ROCK 억제제 (inhibitor of Rho-associated kinase: ROCK)로 ROCK(Rho-associated kinase)을 선택적으로 억제하는 역할을 하는 물질로 티아조비빈 외에 Y-27632 등을 사용할 수 있다. 상기 티아조비빈을 배지에 처리하여 유효 농도로 포함되도록 하며, 배지의 종류 및 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 유효농도는 영향을 받을 수 있다.
본 발명에서 "VPA (valproic acid, 2-프로필펜타노익산)"은 히스톤 디아세틸라아제를 억제하는 물질이며, 크로마틴을 고아세틸화 상태로 만들어 세포증식억제인자 및 분화유도에 필수적인 유전자들의 발현을 촉진하여 세포 (암세포)의 분화를 유도하고 혈관신생 (angiogenesis)을 억제하며, 세포주기를 G1상태로 고정시켜 암세포 (cancer cell)의 아폽토시스 (apoptosis)를 유발하여 강한 세포증식억제 (cytostatic) 항암활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC)는 pRB/E2F를 매개로 유전자 전사 (gene transcription)을 억제하며, 히스톤 아세틸레이션 (histone acetylation)의 파괴가 여러 가지 암 발생과 관련되어 있고, HDAC는 저산소증, 저당 (低糖), 세포암화 등 열악한 환경조건에서 고발현되어 세포증식억제인자의 발현을 저해하여 세포증식을 촉진시키는 역할을 하여, HDAC는 세포암화 및 분화조절에 중요조절인자로 인식되고 있다고 알려져 있다. 특히, 상기 VPA는 이노시톨 감소를 유발하고, GSK-3β를 저해하고 ERK pathway를 활성화시키고, PPAR 활성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 상기 히스톤 디아세틸라아제 억제제 (HDAC inhibitor) VPA (valproic acid, 2-프로필펜타노익산) 외에도 트라코스타틴 (trichostatin, TSA) 또는 그 유도체 등을 사용할 수 있으며, 상기 유도체는 약제학적으로 허용가능한 각종 무기염 또는 유기염을 포함한다. 처리 농도는 너무 낮으면 효과를 보기 어렵고, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 세포의 종류에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다.
본 발명에서 "퍼모파민 (purmorphamine)"은 퓨린화합물 (purine compound)로서, Shh 신호체계에 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 퍼모파민은 Shh 시그널을 유도할 수 있다면 특별한 제한이 있는 것은 아니며 다양한 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어 2-(1-Naphthoxy)-6-(4-morpholinoanilino)-9-cyclohexylpurin) 등을 시중에서 구입하여 사용할 수 있다. 상기 퍼모파민은 신경줄기세포 유사세포로 역분화를 유도하기 위하여 통상적으로 사용되는 배지에 처리하면 된다. 이렇게 Shh 유사체인 퍼모파민을 처리하면 인간 섬유아세포로부터 신경줄기세포를 제조하기 위해 유전자를 도입할 필요가 없는 이점이 있다. 상기 퍼모파민은 상기 배지에 유효 농도로 포함되도록 한다. 배지의 종류와 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 퍼모파민의 유효 농도는 영향을 받을 수 있다.
본 발명에서 “포스콜린”은 다데닐산고리화효소의 촉매소단위를 직접 활성화하여 세포내 cAMP의 농도를 상승시키는 작용을 하며, “트라닐시프로민”은 신경말단에서 정상적으로 노르에피네프린을 분해하는 효소인 모노아민산화효소 (MAO)를 억제하는 작용을 한다.
본 발명에 있어서, 배양 배지는 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함하며, 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 본 발명의 배지는 N2, B27, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수아미노산, bFGF, PDGF 및 아스코브산이 포함된 DMEM인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유도된 세포 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 DMEM 배지일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM 배지에 배양시켰다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 체세포는 포피 섬유아세포 (Foreskin fibroblast), 모낭 모유두세포 (Hair-follicle dermal papilla), IMR90 폐섬유아세포 또는 피부 섬유아세포 (Dermal Fibroblasts)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간 체세포 외에 양막 줄기세포 (Amniotic derived Stem Cells) 또는 지방 줄기세포 (Adipose-derived Stem Cells)로부터 희소돌기아교 전구세포의 유도 또한 가능하다.
본 발명의 Oct4는 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 제공되는 것이 바람직하며, 본 발명의 Oct4 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 Oct4 단백질의 변이체를 포함한다.
상기 Oct4 단백질의 변이체란 Oct4의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형되어 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
더욱 바람직하게는, Oct4 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산의 형태인 것이며, 상기 Oct4을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기 변이체 형태의 Oct4 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 Oct4 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.
상기 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 도입하거나(Wolff et al. Science, 1990: Wolffet al. J Cell Sci . 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer) 등을 이용하여 세포내로 도입될 수 있다. 리포좀은 유전자 도입을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adenoassociatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 희소돌기아교 전구세포는 PDGFRa, A2B5, Olig2, Sox10, S100b 및 ZFP536로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있으며, Sox1, Sox2 및 Pax6 마커를 발현하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 유효성분으로 포함하는, Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한, RG108, BIX01294, SP600125, 리소포스파디드산(Lysophosphatidic acid), Bayk8644, 포스콜린(Forskolin), 덱사메타손(Dexamethasone), EX527 및 로리프램(Rolipram) 로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, TGF-β 타입 I 수용체 억제제는 A83-01, ROCK 억제제는 티아조비빈 (Thiazovivin), 히스톤 탈아세틸효소 억제제는 발포릭산 (Valproic Acid) 또는 Shh 작용제는 퍼모파민 (Purmorphamine)인 것이 바람직하며, 칼슘 통로 작용제는 포스콜린 (Forskolin)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 희소돌기아교 전구세포는 Sox1, Sox2 및 Pax6 마커를 발현하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 기존의 유도 배양액에서 성장인자 및 특정 저분자성 물질을 제거하고, T3 (triiodo-l-thyronine), 티아조비빈, 폴스콜린 및 LIF를 첨가한 분화 배양액을 이용하여 유도된 희소돌기아교 전구세포가 희소돌기아교세포로 분화되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 희소돌기아교 전구세포를 ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase), 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist) 및 LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 배지는 N2, B27, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수아미노산, 아스코브산 및 T3 (triiodo-l-thyronine)가 포함된 DMEM인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 희소돌기아교 전구세포의 경우, 대뇌에서도 극히 소량 존재하는 세포로 알려져 있을 뿐 아니라 대뇌를 구성하는 신경줄기세포에서도 분화율이 낮다고 알려져 있어, 상위 줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 확립하는데 많은 어려움이 있다. 따라서, 종래 기술의 경우, 희소돌기아교 전구세포를 효율적으로 확립하려는 연구가 많이 진행되고 있지만, 최소 70일이라는 장기간의 분화를 통하여 희소돌기아교 전구세포를 확립할 수 있는 문제점이 있다.
본 발명은 신경줄기세포를 거치지 않고 직접적 리프로그래밍을 통해 희소돌기아교 전구세포를 1주~2주 정도의 상대적으로 짧은 기간 배양을 통해 확립할 수 있으므로 단기간에 고효율의 세포 전환율로 이러한 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 아직까지 인간체세포를 이용한 직접적 리프로그래밍을 이용한 희소돌기아교 전구세포의 확립에 대한 보고가 없으므로, 향후 세포치료제 시장에서 탈 수초성 질환 관련 치료제로 유용하며, 본 발명의 저분자성 물질이 신경계 치료에 있어 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
탈 수초성 질환(demyelination disease)은 희소돌기아교세포의 부재로 일어나는 난치성 신경계 질환으로, 종래의 기술은 배아줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 확립하여 치료하는 연구가 대부분이다. 그러나, 배아줄기세포는 면역거부반응으로 인해 한계가 있을 뿐 아니라 윤리적인 문제가 있어 치료제로 확립하는데 어려움이 있다. 이에, 본 발명에 따른 체세포로부터 직접적 리프로그래밍을 통해 희소돌기아교 전구세포를 확립하는 방법은 윤리적인 문제를 해결할 뿐 아니라, 면역거부반응이 없어 환자 맞춤형 세포 치료제를 확립하는데 크게 기여할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 저분자성 물질의 선별 및 유도조건 확립
1-1: Sox10 리포터 시스템을 이용한 저분자성 물질의 선별
본 발명자들은 유전자 도입 없이 저분자성 물질만으로 마우스 세포로부터 신경줄기세포를 유도할 수 있는 조건을 확립한바 있다(KR 10-1357402). 따라서, 이전 연구에서 확립된 저분자성 물질을 토대로 인간 체세포를 희소돌기아교 전구세포로 유도할 수 있는 새로운 조건을 확립하기 위해, 희소돌기아교세포의 발달에 중요하다고 알려져 있는 유전자인 Sox10 리포터 시스템(Sox10::eGFP)을 이용하여 저분자성 물질을 선별하였다(도 1).
Oct4 유전자가 도입된 세포를 Reprogramming Media(RM: DMEM High Glucose +5% Knock out Serum Replacement(KSR) +1% 페니실린/스트렙토마이신 +1% 비필수아미노산 +basic FGF(bFGF) 20ng/ml +Human Recombinant Platelet Derived Growth Factor (PDGF) 20ng/ml +아스코브산 50㎍/ml)에서 배양하였을 때, 유도 1주일 후 상피-중간엽 이행(Mesenchymal to Epithelial Transition: MET) 과정을 통하여 세포의 길이가 짧아지고 크기가 작아져 상피 유사 콜로니(Epithelial like Colony)를 형성하는 것을 확인하였다. 이 세포를 마트리젤 코팅 디쉬(Matrigel coated dish)에 계대배양을 한 후, 신경줄기세포를 유도할 수 있는 저분자성 물질 조합인 A83-01, 티아조비빈(Thiazovivin), 발포릭산(Valproic Acid), 퍼모파민(Purmorphamine)이 포함된 배양액 (DMEM High glucose +1X N2 +1X B27(without vitamin A) +1% 페니실린/스트렙토마이신 +1% 비필수아미노산 +basic FGF(bFGF) 20ng/ml +Human Recombinant Platelet Derived Growth Factor (PDGF) 20ng/ml +아스코브산 50㎍/ml +0.5μM A83-01 +0.5μM 티아조비빈 +0.1mM 발포릭산(VPA) +0.5μM 퍼모파민)에 후성적 조절인자(epigenetic modulator) 및 신경계 발달에 영향을 미치는 저분자성 물질 등을 추가적으로 조합하여 선별하였다.
다음은 저분자성 물질의 조합 조건을 나타낸다.
ATVP: 0.5μM A83-01 + 0.5μM 티아조비빈 + 0.1mM 발포릭산(VPA) + 0.5μM 퍼모파민, RG108: 0.5μM RG108, BIX01294: 0.25μM BIX01294, SP600125: 2μM SP600125, LPA: 2μM 리소포스파디드산(Lysophosphatidic acid), Bayk: 2μM Bayk8644, Fsk: 10μM 폴스콜린(Forskolin), Dex: 1μM 덱사메타손(Dexamethasone), EX527: 5μM EX527, Rolipram: 2μM 로리프램(Rolipram)
그 결과, 10μM 포스콜린(Forskolin)을 첨가한 조건에서 Sox10::eGFP의 발현이 가장 높은(3.31%) 것을 FACS 분석을 통하여 확인하였으며(도 3), 실시간 PCR을 통하여 Sox10 이외에 희소돌기아교 전구세포의 마커로 알려져 있는 Olig2, NKX2.2 및 ZFP536의 mRNA발현 또한 상기 조건에서 가장 높은 것을 확인하였다(도 4).
1-2: KSR을 배제한 유도조건 확립
실시예 1-1의 Reprogramming Media(RM)에 함유된 Knockout Serum Replacement(KSR)의 경우 Oct4의 과발현과 함께 이용될 경우, 신경줄기세포로의 전환이 가능하다는 보고가 있다.
이에, 리프로그래밍이 아닌 분화로 유도된 희소돌기아교 전구세포를 배제하기 위해, KSR을 제외한 조건에서 희소돌기아교 전구세포를 유도한 결과, 희소돌기아교 전구세포의 모양이 나타나는 것을 확인하였고, 희소돌기아교 전구세포의 마커인 Olig2, Sox10 및 ZFP536의 발현을 PCR을 통해 검증하였다(도 5).
또한, 최적의 저분자성 물질 조합을 선별하기 위해 실시예 1-1의 유도 조건에서 저분자성 물질을 하나씩 제거하여 처리해본 결과, 저분자성 물질이 모두 함유된 배지에서 가장 높은 Sox10의 발현을 확인하였다(도 6).
따라서, 상기 확립된 조건(IM: DMEM High glucose +1X N2 +1X B27(without vitamin A) +1% 페니실린/스트렙토마이신 +1% 비필수아미노산 +basic FGF(bFGF) 20ng/ml +Human Recombinant Platelet Derived Growth Factor (PDGF) 20ng/ml +아스코브산 50㎍/ml +0.5μM A83-01 +0.5μM 티아조비빈 +250μM 발포릭산(VPA) +0.5μM 퍼모파민 +10μM 포스콜린)을 희소돌기아교 전구세포의 유도조건으로 확립하였다(도 2).
실시예 2: 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포 유도 및 검증
실시예 1-1의 리포터 세포주로 사용된 Sox10::eGFP 섬유아세포(fibroblasts)의 경우 배아줄기세포(ES cell)로부터 분화를 통해 얻어진 세포이기 때문에 섬유아세포가 아닌 다른 줄기세포들을 완벽히 배제할 수 없어 체세포로부터의 직접적 리프로그래밍이라 볼 수 없다. 또한, 미국의 Shengding 연구팀과 Mickie Bhatia 연구팀이 인간체세포에 Oct4를 과발현 후 신경줄기세포를 확립하는 과정에서 KSR(Knock out Serum Replacement)이 들어간 배양액을 사용하였으므로, 본 실시예에서는 배아(Embryo) 유래가 아닌 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포의 상위 줄기세포인 신경줄기세포를 거치지 않고 직접적 리프로그래밍을 유도하기 위하여 KSR이 들어간 RM(Reprogramming Media)를 사용하지 않았다(도 7).
즉, BJ 세포에 Oct4 유전자를 도입한 뒤 마트리젤 코팅 디쉬(Matrigel coated dish)에 계대배양하고, 상기 실시예 1-2에서 확립된 희소돌기아교 전구세포의 유도조건(IM)에서 4일간 배양한 결과, 상피-중간엽 이행(MET) 과정을 거친 세포들이 관찰이 되었으며, 배양 7일 후 희소돌기아교 세포처럼 보이는 세포들이 관찰되었다(도 8).
또한, 배양 7일 후의 세포들이 희소돌기아교 전구세포인지 확인하기 위하여 FACS 분석(도 9) 및 면역화학염색법(도 10)을 통하여, 약 10% 세포들이 희소돌기아교 전구세포의 대표적인 마커인 PDGFRa 및 A2B5이 각각 발현되는 것을 확인하였으며, 실시간 PCR을 통하여 유도된 희소돌기아교 전구세포에서 역분화 줄기세포로부터 유래된 희소돌기아교 전구세포에서 발현되는 마커인 Olig2, Sox10, S100b 및 ZFP536이 발현되는 것을 확인하였다(도 11).
상기 결과를 토대로, 확립된 세포를 유도된 희소돌기아교 전구세포 (induced OPC: iOPC)라 명명하였다.
실시예 3: 희소돌기아교 전구세포의 희소돌기아교 세포로의 분화
3-1: 희소돌기아교 세포로의 분화
실시예 2에서 유도된 희소돌기아교 전구세포의 희소돌기아교세포로의 분화능력을 확인하기 위해, 기존 배양액에서 성장인자를 제거하고 분화 배양액 (DMEM High glucose + 1X N2 + 1X B27 (without vitamin A) + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 비필수아미노산 + 50㎍/ml 아스코브산 + 40ng/ml T3 (triiodo-l-thyronine) + 0.5μM 티아조비빈 + 10μM 폴스콜린 + 10ng/ml Human Leukemia Inhibitor Factor(LIF))으로 바꾸어 주었다.
그 결과, 희소돌기아교세포의 전형적인 Branch 유형의 형태(morphology)를 나타내었고, 실시간 PCR을 통하여 MBP 및 MAG의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 12).
또한, 분화된 희소돌기아교세포의 in vitro 마이엘린 수초형성(myelination)을 확인하기 위해 Rat의 해마(Hippocampus)로부터 얻은 뉴런과 공배양을 진행한 결과, 분화된 희소돌기아교세포가 뉴런과의 수초형성(myelination)을 이루는 것을 확인하였다(도 13).
3-2: 생체내 분화 및 치료능 검증
희소돌기아교 전구세포의 생체내 분화능 및 세포치료제로서의 치료능을 검증하기 위하여 다발성 경화증 동물모델(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis mouse model, EAE mouse model)에 실시예 2에서 유도된 희소돌기아교 전구세포를 이식하였다.
그 결과, PBS를 주입한 대조군에서는 myelin이 전혀 관찰되지 않았으나, iOPC가 이식된 군에서는 myelin이 정상 쥐와 유사하게 관찰이 되는 것을 확인하였다(도 14). 즉, 유도된 희소돌기아교 전구세포 (induced OPC: iOPC)는 생체내에서 분화되어 세포치료제로의 효능을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: 직접적 리프로그래밍을 통한 희소돌기아교 전구세포의 유도
본 실시예에서는 iOPC를 확립하는 과정에서, iOPC가 Oct4 과발현 후에 유도된 신경줄기세포로부터 분화된 것이 아니라 직접적 리프로그래밍을 통해 확립이 되었다는 것을 검증하기 위하여, 유도 7일 동안의 유전자 발현 변화를 실시간 PCR을 통해 확인하였다.
그 결과, 신경줄기세포의 마커로 알려진 Sox1, Sox2 및 Pax6 모두 7일 동안 발현이 되지 않음을 확인하였다(도 15).
또한, 유도 7일 동안 OPC의 성장인자로 알려진 FGF2 및 PDGF-AA에 의해 세포가 증식하는 것을 관찰하였으며, 증식된 세포들은 PDGFRa 및 A2B5를 나타내는 세포임을 FACS 분석을 통해 알 수 있었다(도 16).
따라서, 상기 결과를 바탕으로 iOPC는 유도 7일 동안 신경줄기세포를 거치지 않고 직접적 리프로그래밍을 통해 희소돌기아교 전구세포를 확립한다는 것을 증명할 수 있었다.
실시예 5: 다양한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포의 유도
희소돌기아교 전구세포로의 유도가 포피 섬유아세포(Foreskin fibroblast) 뿐 아니라 다른 인간 체세포에서도 가능한 것인지 확인하기 위하여 서로 다른 5종 세포 (모낭 모유두세포(Hair-follicle dermal papilla), 양막 줄기세포(Amniotic derived Stem Cells), IMR90 폐섬유아세포, 피부 섬유아세포(Dermal Fibroblasts) 및 지방 줄기세포(Adipose-derived Stem Cells))에 Oct4를 과발현 시킨 후, 희소돌기아교 전구세포로 유도하였다.
그 결과, 포피 섬유아세포(Forskin Fibroblasts)와 마찬가지로 희소돌기아교전구세포의 대표적인 마커인 PDGFRα, A2B5 및 Olig2의 발현을 RT-PCR, 면역화학염색법 및 FACS 분석을 통해 확인하였다(도 17 및 18).
따라서 Oct4와 저분자성 물질 조합은 BJ 세포에 국한된 유도방법이 아니라 다양한 인간 체세포에 적용될 수 있는 유도 방법임을 증명하였다.
본 발명에 따른 Oct4가 과발현된 인간체세포에 저분자성 물질을 처리하여 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법은 신경줄기세포를 거치지 않는 직접적 리프로그래밍을 통하여 단기간 동안 고효율로 희소돌기아교 전구세포를 확립할 수 있어, 난치성 탈수초성 질환의 세포치료제로 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

  1. Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포를 (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  3. 인간 체세포를 (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 함유하는 배지에서 배양하되, 상기 인간 체세포는 배양 전, 배양과 동시에 또는 배양 후에 Oct4 단백질을 처리하는 단계를 포함하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배지는 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 RG108, BIX01294, SP600125, 리소포스파디드산(Lysophosphatidic acid), Bayk8644, 포스콜린(Forskolin), 덱사메타손(Dexamethasone), EX527 및 로리프램(Rolipram)으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, TGF-β 타입 I 수용체 억제제는 A83-01이고, ROCK 억제제는 티아조비빈 (Thiazovivin)이며, 히스톤 탈아세틸효소 억제제는 발포릭산 (Valproic Acid)이고, Shh 작용제는 퍼모파민 (Purmorphamine)인 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  7. 제2항 또는 제4항에 있어서, 칼슘 통로 작용제는 포스콜린 (Forskolin)인 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 배지는 N2, B27, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수아미노산, bFGF, PDGF 및 아스코브산이 포함된 DMEM인 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  9. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 인간 체세포는 포피 섬유아세포 (Foreskin fibroblast), 모낭 모유두세포 (Hair-follicle dermal papilla), IMR90 폐섬유아세포 및 피부 섬유아세포 (Dermal Fibroblasts)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 희소돌기아교 전구세포는 PDGFRa, A2B5, Olig2, Sox10, S100b 및 ZFP536로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  11. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 희소돌기아교 전구세포는 Sox1, Sox2 및 Pax6 마커를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 인간 체세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 유도하는 방법.
  12. (i) TGF-β 타입 I 수용체 억제제 (TGF-β type I receptor inhibitor); (ii) ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase); (iii) 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (Histone deacetylase inhibitor); 및 (iv) Shh 작용제 (Sonic hedgehog agonist)를 유효성분으로 포함하는, Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, RG108, BIX01294, SP600125, 리소포스파디드산(Lysophosphatidic acid), Bayk8644, 포스콜린(Forskolin), 덱사메타손(Dexamethasone), EX527 및 로리프램(Rolipram)으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물.
  15. 제12항에 있어서, TGF-β 타입 I 수용체 억제제는 A83-01이고, ROCK 억제제는 티아조비빈 (Thiazovivin)이며, 히스톤 탈아세틸효소 억제제는 발포릭산 (Valproic Acid)이고, Shh 작용제는 퍼모파민 (Purmorphamine)인 것을 특징으로 하는 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 칼슘 통로 작용제는 포스콜린 (Forskolin)인 것을 특징으로 하는 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 상기 희소돌기아교 전구세포는 Sox1, Sox2 및 Pax6 마커를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 Oct4 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입된 인간 체세포 또는 Oct4 단백질로 처리된 인간 체세포로부터 직접적 리프로그래밍 (direct reprogramming)을 통한 희소돌기아교 전구세포 유도용 조성물.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 희소돌기아교 전구세포를 ROCK 억제제 (Inhibitor of Rho-associated kinase), 칼슘 통로 작용제 (Calcium channel agonist) 및 LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 배지는 N2, B27, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수아미노산, 아스코브산 및 T3 (triiodo-l-thyronine)가 포함된 DMEM인 것을 특징으로 하는 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법.
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