TWI833764B - 產生誘導式少突膠質譜系細胞之方法及使用該等細胞的治療 - Google Patents
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Abstract
本發明一般涉及一種產生誘導式少突膠質譜系細胞(oligodendrocyte-lineage cells, OLGs)並使用該等細胞治療之方法。該誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)可用於細胞治療，特別是用於髓鞘脫失病。
Description
相關申請案
本申請案根據美國專利法第119條(35 U.S.C. §119) 主張於2018年6月14日提出申請的美國臨時申請案第62/684,963號之權益，其全部內容透過引用併入本文。
本發明一般涉及產生誘導式少突膠質譜系細胞(induced OLGs)並使用該等細胞治療的方法。
神經系統對於傳遞訊號以控制自願及非自願行為極為重要。神經系統控制肌肉活動，協調不同的組織及器官，並接收資訊。神經元傳輸瞬間訊號以及快速訊號，以感知環境變化並做出反應。脊椎動物的神經系統分為中樞神經系統(central nervous system, CNS)以及周圍神經系統(peripheral nervous system, PNS)。中樞神經系統(CNS)包括腦與脊髓，而周圍神經系統(PNS)包括肌肉與腺體1
。中樞神經系統(CNS)整合並協調從身體不同部位接收的所有資訊。中樞神經系統可分為灰質及白質，灰質由神經元以及無髓神經纖維組成，而白質由有髓軸突以及少突膠質細胞組成2
。視網膜、視神經、嗅神經以及嗅上皮被認為是中樞神經系統(CNS)的一部分，其具有直接連接到大腦的突觸。
中樞神經系統(CNS)以及周圍神經系統(PNS)具有不同類型的神經元與支持細胞。中樞神經系統主要由神經細胞與神經膠細胞組成。神經膠細胞為中樞神經系統(CNS)中最豐富的細胞類型。由細胞核計算，神經膠細胞的數量約為神經細胞的10倍左右；按體積計算，神經膠細胞與神經細胞都佔據約大腦的一半左右。神經細胞被神經膠細胞包圍並相互作用。中樞神經系統中的膠質細胞主要包括星形膠質細胞、少突神經膠細胞(少突膠質譜系細胞(oligodendrocyte-lineage cells, OLGs))，以及小神經膠細胞3,4
。而在周圍神經系統(PNS)中，神經鞘細胞(Schwann cells)以及衛星細胞起著相同的作用。中樞神經系統(CNS)中的神經膠細胞具有不同的功能5,6
。例如，星形膠質細胞(也稱為星狀膠質細胞)，是一群星形神經膠細胞，為神經組織提供生化支持與營養，並維持細胞外離子平衡。至於小膠質細胞，常駐巨噬細胞，其可活化免疫功能，以清除斑塊、感染因子，以及不必要的神經元3
。其他細胞類型，如少突膠質細胞，對髓鞘形成極為重要。
少突膠質細胞前體/先驅細胞(oligodendrocyte precursor/progenitors cells, OPCs)在神經源性/膠質細胞轉換後分化為少突膠質細胞3
。少突膠質細胞(也稱為少突神經膠細胞)為一種神經膠細胞，其功能主要是透過為神經軸突提供支撐與絕緣。少突膠質細胞產生髓鞘以包裹軸突以進行絕緣並增加電傳導，少突膠質細胞在周圍神經系統(PNS)中表現出與神經鞘細胞相同的功能3
。關於髓鞘形成，一個少突膠質細胞可包裹約50個軸突，但它只能形成一個髓鞘到每個軸突的區段。相較於無髓鞘神經元，神經衝動在有髓鞘軸突中的移動快了100倍7
。此外，少突膠質譜系細胞透過提供營養及適當的環境來幫助神經再生。髓鞘形成過程的主要參與者包括髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein, MBP)、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)，以及蛋白脂質蛋白(proteolipid protein, PLP)的蛋白質。此外，表面抗原O4、轉錄因子Olig2與Nkx2.2在少突膠質譜系細胞(OLGs)中表現8
。
中樞神經系統疾病為影響脊髓或大腦的疾病。根據受損區域，大腦或脊髓損傷會導致不同的殘疾。由結構缺陷引起的中樞神經系統(CNS)損傷起源於中風、感染、變性，以及自體免疫疾病。其中，一種自體免疫性疾病為由體內自體蛋白質的耐受性喪失所引起的，其導致免疫系統攻擊並破壞人體組織。在中樞神經系統(CNS)不同部位的神經元損傷或神經支持細胞功能喪失會導致不同的疾病。髓鞘脫失病的病因可分為五類：病毒、免疫、遺傳、中毒，以及受傷。髓鞘脫失病由神經系統中的髓鞘損傷所引起，並且發生在中樞神經系統(CNS)及周圍神經系統(PNS)中。髓鞘丟失或功能障礙影響全世界2至250萬人。它造成大量的發病率及死亡率9
。數種疾病屬於在中樞神經系統(CNS)中的發炎性髓鞘脫失病：多發性硬化症(multiple sclerosis, MS)、急性出血性腦白質炎(acute hemorrhagic leukoencephalitis, AHL)，以及急性播散性腦脊髓炎(acute‐disseminated encephalomyelitis, ADEM)，腦橋中央髓鞘溶解、進行性多處腦白質病、腦性麻痺、先天性腦白質營養不良10,11
。在這些疾病中，多發性硬化症(MS)為一種常見的自體免疫性疾病，其中免疫系統攻擊髓鞘或少突膠質譜系細胞(OLGs)缺失並導致系統性髓鞘脫失12-14
。多發性硬化症(MS)的症狀，取決於損傷區域，可導致視力、膀胱、記憶/思考、疼痛、痙攣、言語問題以及吞嚥症狀。此外，多發性硬化症(MS)在嚴重情況下也可導致中風、肌無力或死亡15
。多發性硬化症(MS)在減輕病徵後會持續發生復發及緩解的過程。復發及緩解過程之間的潛伏期是不可預測的，可能需要很多年16
。其他神經元疾病也涉及髓鞘脫失，例如杭丁頓氏症以及精神分裂症。杭丁頓氏症是由於杭丁頓氏蛋白中CAG重複(聚麩醯胺區)增加所引起。它是一種體染色體顯性遺傳性神經退化性疾病17
。一些記載提到，在杭丁頓氏症患者的大腦中，神經膠細胞退化，並觀察到病理表型18-22
。杭丁頓氏症患者的前兆症狀為髓鞘分解與損傷20,22,23
。此外，許多杭丁頓氏症小鼠模型中已被記載具有髓鞘脫失24-26
。此外，放射線療法還在人類及小鼠模型中產生髓鞘脫失病27-29
，並且可以少突膠質細胞先驅細胞治療30
。
細胞療法為髓鞘脫失病的潛在且有希望的治療策略12-14
。目前，大約有115項臨床試驗正在研究神經膠細胞相關療法的療效(www.clinicaltrials.gov)。一些研究將正常的少突膠質譜系細胞(OLGs)注入受損區域以包裹髓鞘脫失區域而具有良好的結果31-33
。然而，很難獲得足夠用於細胞療法的人類原代少突膠質譜系細胞(OLGs)31-33
。因此，提供足夠數量的少突膠質譜系細胞(OLGs)是需要解決的主要障礙。現今，人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cells, hESCs)以及誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)為轉錄因子的異位表現或可溶性因子的逐步分化提供了獲得功能性少突膠質譜系細胞(OLGs)的平台34-36
。目前，人類胚胎幹細胞(hESCs)衍生的神經幹細胞(Neural stem cells, NSCs)或間質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)衍生的少突膠質譜系細胞(OLGs)已經可以改善動物實驗中多發性硬化症(MS)的症狀37,38
。然而，人類胚胎幹細胞(hESCs)以及誘導性多能幹細胞(iPSCs)具有例如畸胎瘤風險的缺點39
。此外，分化過程耗費人力，成本高，並且需要45天。另一方面，只有小鼠或大鼠的少突膠質譜系細胞(OLGs)而非人類的細胞可以從具有轉錄因子病毒轉導的纖維母細胞中獲得，其具有插入誘變的風險40,41
。此外，囓齒動物細胞中的轉錄因子鹼基重新編程僅達到9.2%或15.6%細胞表現O4標記的效率。
於本發明中，首次公開了透過將皮膚細胞，例如纖維母細胞，暴露於化學誘導劑，可以成功地產生誘導式少突膠質譜系細胞(induced OLGs)，該化學誘導劑包括Rho相關蛋白激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK)抑制劑以及一種或多種選自由下列所組成之群組的輔助劑：組蛋白去乙醯化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)抑制劑、蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制劑，以及環腺苷單磷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)活化劑。根據本發明，皮膚細胞例如纖維母細胞經過這樣的治療之後可以重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)，其可用於細胞治療，特別是用於髓鞘脫失病。
因此，於一態樣，本發明特別提供了產生誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)之方法，包括在允許部分皮膚細胞重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的條件下培養該些皮膚細胞，其中該條件包括培養基，該培養基包含化學誘導劑，該化學誘導劑包括Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑，其中該些皮膚細胞亦以選自由下列所組成之群組的輔助劑處理：組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑、蛋白激酶C (PKC)抑制劑、環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑，以及其任何組合。
於一些具體實施例中，該些皮膚細胞為纖維母細胞。
於一些具體實施例中，該輔助劑包括該細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。
於一些具體實施例中，該輔助劑包括該組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑以及該環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑，可視需要地連同該細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。
於一些具體實施例中，該化學誘導劑以及輔助劑同時或依次添加至培養基。於某些實例中，在該化學誘導劑之前將該輔助劑添加至該培養基中。於某些實例中，在該Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑之前將該組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑添加至該培養基中。
於一些具體實施例中，該化學誘導劑及/或該輔助劑為小分子。
於一些具體實施例中，該化學誘導劑包括Y27632。於一些具體實施例中，該輔助劑包括毛喉素(forskolin, FSK)、SU9516、VPA，及/或G06983。
於一些具體實施例中，該誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)表現一選自由下列所組成之群組的細胞標記：血小板衍生的生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)、髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein, MBP)、少突膠質細胞轉錄因子(oligodendrocyte transcription factor, Oligo2)、SOX10、蛋白脂質蛋白(proteolipid protein, PLP) 1、A2B5、O4，以及其任何組合。
於一些具體實施例中，本發明之方法還包括從該細胞培養物中分離該誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)以獲得分離的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)群。
於另一態樣，本發明提供如本文所述之分離的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)群。
於又一態樣，本發明提供治療疾病或病症之方法，包括給予有需要這種治療的受試者治療有效量的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。具體而言，該誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)透過以包括Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑的化學誘導劑處理而衍生自皮膚細胞，其中該皮膚細胞以一種或多種選自由下列所組成之群組的輔助劑進一步處理：組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑、蛋白激酶C (PKC)抑制劑，以及環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑。於一些具體實施例中，該輔助劑包括該細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。於一些實例中，該(複數個)輔助劑包括該組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑以及該環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑，可視需要地具有該細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。還提供如本文所述之誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)於製備用於治療疾病或病症的藥物之用途。
於一些具體實施例中，該疾病或病症與少突膠質細胞功能障礙有關。
於一些具體實施例中，該疾病或病症為髓鞘脫失病。
於一些具體實施例中，該誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)以有效促進該受試者中神經元髓鞘形成的量施用。
於一些具體實施例中，該疾病或病症選自由下列所組成之群組：多發性硬化症(MS)、急性出血性炎症性疾病(AHL)、腦性麻痺、急性播散性腦脊髓炎(ADEM)、腦橋中央髓鞘溶解、進行性多處腦白質病、先天性腦白質營養不良、帕金森氏症、杭丁頓氏症、精神分裂症，以及放射線治療引起的髓鞘脫失病。
還提供了一種藥物組合物，包含治療有效量的如本文所述之誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)以及藥學上可接受之載劑。
還提供了一種包含皮膚細胞以及培養基之培養物，該培養基包含化學誘導劑以及一種或多種如本文所述之輔助劑。特別是，該培養物還包含衍生自該皮膚細胞的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。
於以下之描述中闡述了本發明的一個或多個具體實施例之細節。由以下對數種實施例的實施方式以及亦從所附之申請專利範圍中，本發明的其他特徵或優點將顯而易見。
除非另外定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的含義相同之含義。
1.
定義
如本文所用，單數形式「一」、「一個」，以及「該」包括複數指示物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一種組成分」包括多種這樣的組成分及本領域技術人員已知的其等同物。
術語「包含(comprise)」或「包含(comprising)」通常以包含/包括的含義使用，其代表允許存在一種或多種特徵、成分或組成分。術語「包含(comprise)」或「包含(comprising)」包括術語「由......組成(consists of)」或「由......組成(consisting of)」。
如本文所用，術語「少突膠質譜系細胞(OLGs)」可包括少突膠質細胞、促少突膠質細胞，以及少突膠質細胞前體/先驅細胞(OPCs)。中樞神經系統(CNS)中的少突膠質細胞產生髓鞘，其包裹神經軸突以進行絕緣並增加電傳導，並且對於軸突完整性以及存活也是重要的。
如本文所用，術語「誘導式少突膠質譜系細胞(induced OLGs)」係指少突膠質譜系細胞(OLGs)狀細胞(亦即，具有少突膠質譜系細胞(OLGs)狀特徵的細胞)，其從其他細胞類型，如皮膚細胞，產生(或重新編程)。
如本文所用，「皮膚細胞」係指在皮膚中發現的細胞，例如上皮細胞或纖維母細胞。
如本文所用，術語「重新編程」係指將細胞轉化為具有一些不同特性或生物學功能的不同細胞類型之過程。
如本文所用，術語「培養物」係指以一培養基培養的細胞群，較佳維持該細胞存活或使該細胞生長。
本文所用之術語「小分子」係指在自然界中合成或發現的有機或無機分子，通常分子量小於10,000 克/莫耳，特別是小於5,000 克/莫耳，特別是小於2,000 克/莫耳， 特別是少於1,000 克/莫耳。於一些具體實施例中，一小分子係指一非聚合物，例如非蛋白質或核酸類的化學分子。
本文所用之術語「約」係指其使用數量的數值的加或減10%。因此，約1%代表在0.9%至1.1%的範圍內。
如本文所用，Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑可指下調、降低或抑制Rho相關蛋白激酶的量及/或活性的試劑。本文所述之Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑的實例包括，但不限於，Y-27632、AS 1892802、GSK 269962、GSK 429286、H 1152二鹽酸鹽、HA 1100鹽酸鹽、OXA 06二鹽酸鹽、RKI 1447二鹽酸鹽、SB 772077B二鹽酸鹽等。
如本文所述，細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑可指下調、降低或抑制細胞週期蛋白依賴性激酶的量及/或活性的試劑。如本文所述之細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑的實例包括，但不限於，SU9516、PD-0332991、羅斯維汀(Roscovitine)、SNS-032、狄納昔布(Dinaciclib)、夫拉平度(Flavopiridol)、AT7519、夫拉平度(Flavopiridol)、JNJ-7706621、AZD5438、MK-8776、PHA-793887、BS-181、帕泊昔布(Palbociclib (PD0332991) )羥乙基磺酸鈉、A-674563、博馬昔布(abemaciclib)、BMS-265246、PHA-767491、密西尼(Milciclib)、R547、NU6027、P276-00、MSC2530818、塞內辛(Senexin) A、LY2857785、LDC4297、ON123300、肯包隆(Kenpaullone)、K03861、THZ1 2HCl、AT7519 HCl、普瓦蘭諾(Purvalanol) A、Ro-3306、XL413、LDC000067、ML167、TG003、利泊昔布(Ribociclib)、沃貢寧(Wogonin)、BIO、AZD1080、1-Azakenpullone，及其他。
如本文所述，環狀腺苷單磷酸(cAMP)活化劑可指，相較於不存在該試劑時的背景生理細胞內含量，一種可增加環腺苷單磷酸(cAMP)的細胞內含量的試劑。環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑的實例包括，但不限於，毛喉素、咯利普蘭(rolipram)、NKH477、PACAP1-27、PACAP1-38，及其他。
如本文所述，蛋白激酶C (PKC)抑制劑可指下調、降低或抑制PKC激酶的量及/或活性的一試劑。如本文所述之PKC抑制劑的實例包括，但不限於，Go6976、Go66850、Go6983、粗糠柴毒素、雙吲哚基馬來醯亞胺 II、C-1、鈣感光蛋白C、蜂毒、GF 109203X、二氫鞘氨醇、白屈菜紅鹼、氯化物、CGP 53353、CID 2858522、二氫鞘氨醇、GF 109203X、Go 6976、Go 6983、[Ala107]-MBP (104-118)、Ala113
]-MBP (104-118)、(±)- 棕櫚醯肉鹼氯化物、PKC (19-36)(假基質胜肽；PKC抑制劑)、PKC 412、PKC假基質、Ro 32-0432 鹽酸、粗糠柴毒素、D-赤型-神經鞘氨醇(合成)、ZIP、RO 31-8220甲磺酸，及其他。
如本文所述，組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑可以指下調、降低或抑制組蛋白脫乙醯酶的量及/或活性以從組蛋白上的離胺酸殘基去除乙醯基的一試劑。組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑的實例包括，但不限於，丙戊酸(VPA，2-丙基戊酸)、阿匹西定(Apicidin)、CI 994、FK 228、LMK 235、M 344、MC 1568、MC 1742、MI 192、NCH 51、NSC 3852、PCI 34051、4-苯基丁酸鈉、派若沙米德(Pyroxamide)、SAHA、SBHA、司力泰(Scriptaid)、丁酸鈉、TC-H 106、TCS HDAC6 20b、曲古黴素A、土巴辛(Tubacin)、UF 010、莫汀司他、帕新司他，及其他。
如本文所述，術語「分離的或純化的細胞群」或「分離的或純化的細胞」係指已經與該細胞相關的其他細胞組成分或其他細胞分離的細胞製劑。例如，分離的細胞可能已經從其天然環境或細胞群中移除，或者可能是由已從細胞群中移除的細胞的繁殖所產生的。當細胞被描述為「分離的」或「純化的」時，應理解為不是絕對地分離或純化，而是相對地分離或純化。例如，包含分離的細胞之製劑可包含0.5%或更多，10%或更多，20%或更多，30%或更多，40%或更多，50%或更多，60%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，或100%該製劑中總細胞數的量之細胞。於一些特定具體實施例中，包含分離的細胞之製劑可包含50%或更多，60%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，或100%該製劑中總細胞數的量之細胞。
如本文所用，本文所用之術語「受試者」包括人類與非人類動物，例如伴侶動物(如狗、貓等)、農場動物(如牛、羊、豬、馬等)，或實驗動物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。
如本文所述，當涉及治療性治療時，術語「治療(treating)」係指將包含一種或多種活性劑的組合物應用或施用於患有疾病、該疾病的病徵或症狀，或該疾病的惡化的受試者，目的為治療、治癒、緩解、減緩、改變、補救、改善、增進，或影響該疾病、該疾病的該病徵或症狀，由該疾病引起的殘疾或該疾病的惡化。另一方面，術語「處理(treating)」可指與治療性處理疾病無關的應用或過程，例如施用一種或多種成分或試劑以接觸細胞以改變其命運，例如，恢復為其他細胞類型。
如本文所述，本文所用之術語「治療有效量」係指在被治療的受試者中賦予治療效果的活性成分的量。該治療有效量可根據各種原因而改變，例如給藥途徑及頻率、體重以及接受該藥物之個體的種類，以及給藥目的。如本文所用，當提及與治療性處理疾病無關的應用或過程時，術語「有效量」可指用於實現預期目的之成分或藥劑的量，例如，施用於接觸的細胞，例如纖維母細胞，的成分或試劑的量以用於重新編程之目的。
2.
使用化學試劑以產生誘導式少突膠質譜系細胞
(OLGs)
本發明基於意外之發現，即皮膚細胞，例如纖維母細胞，可以透過與化學誘導劑以及一種或多種輔助劑一起培養，而重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)，而不需要透過轉錄因子的轉導進行基因修飾。
根據本發明，皮膚細胞可在含有化學誘導劑的培養基中培養，該化學誘導劑包括Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑以及選自由下列所組成之群組的輔助劑：組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑、蛋白激酶C (PKC)抑制劑、環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑，以及其任意組合，以有效誘導重新編程的量，使得該皮膚細胞轉化為少突膠質譜系細胞(OLGs)。於一些具體實施例中，該輔助劑包括該細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。於一些具體實施例中，該輔助劑包括該組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑以及該環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑，可視需要地含有該細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。該化學誘導劑以及該(複數個)輔助劑可同時或依次加入該培養基中。例如，首先將輔助劑添加至該培養基中用於預處理(預培養)，然後再添加化學誘導劑用於隨後的培養。於一些具體實施例中，在該Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑(例如，Y27632)之前將該組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑(例如，VPA)加入該培養基中。預處理(預培養)的時間約為總培養期間的十分之一(1/10)、五分之一(1/5)、四分之一(1/4)、三分之一(1/3)或更長一段時間。於一實例中，該預處理(預培養)的時間為總培養期間的約三分之二(2/3)。
適用於培養根據本發明之皮膚細胞的培養基可在本領域中獲得，例如DMEM、MEM、DMEM/F12、剔除DMEM，或IMEM培養基。培養可在一正常條件下進行，例如37o
C、1-10% CO2
。具體而言，該培養基可為無血清培養基。
於一些具體實施例中，用於轉化的培養基(轉化培養基)含有剔除DMEM、AlbuMAX I、N2補充物，非必需胺基酸(nonessential amino acids, NEAA)。
於一些具體實施例中，該培養進行至少1天或更長時間(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更長時間)，由此，該皮膚細胞的一部分轉化為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。於一特定的實例中，該培養進行3天或更長時間，包括以一輔助劑預處理約2天(總培養期間的三分之二)以及以一化學誘導劑與任選的(複數個)輔助劑再培養1天(總培養期間的三分之一)。
於一些具體實施例中，該培養基可包含一種或多種生長因子及/或培養補充物，有利於少突膠質細胞之分化。生長因子的實例包括，但不限於，血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)，以及神經營養蛋白-3 (neurotrophin-3, NT3)。培養補充劑之實例包括，但不限於，N2與B27。
表A說明了本文所用之化學誘導劑的一些實例。
根據本發明，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或更多的皮膚細胞在該培養中重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。於一些具體實施例中， 約20%或更多，例如30%至90% (例如，40%至80%、50%至75%)的皮膚細胞在該培養中被重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。
於特定的具體實施例中，該皮膚細胞首先以一組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑(例如VPA)處理，然後以一Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑(例如Y27632)以及一環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑(FSK)處理，並可視需要地進一步以一細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑(SU9516)處理。
於特定的具體實施例中，該皮膚細胞以一Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑(例如，Y27632)以及一細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑(SU9516)處理。
3.
用於重新編程的皮膚細胞
皮膚細胞例如纖維母細胞可用於本文中以產生本發明的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。本文用於重新編程的纖維母細胞可從新生兒或成年供體獲得。
可以透過皮膚穿刺或包皮環切從適當的自體或同種異體供體獲得皮膚活體組織切片，並可從該皮膚活體組織切片長出皮膚纖維母細胞。通常，約4 mm的皮膚活體組織切片可產生15-20百萬個纖維母細胞。於一些具體實施例中，可商業購得纖維母細胞。較佳地，如本文所用之用於轉化為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的纖維母細胞為哺乳動物來源的，最佳為人類來源的。
4.
誘導式少突膠質譜系細胞
(OLGs)
根據本發明，所生成的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)具有少突膠質譜系細胞(OLGs)狀的特徵。具體而言，誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)具有少突膠質譜系細胞(OLGs)狀的形態(細胞體為圓頂形以及固體、雙極或多極分支)。更具體而言，所生成的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)可以表現典型的少突膠質譜系細胞(OLGs)標記。
於一些具體實施例中，該少突膠質譜系細胞(OLGs)標記選自由以下所組成之群組：血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、髓鞘鹼性蛋白(MBP)、少突膠質細胞轉錄因子(OLIG2)、SOX10、蛋白脂質蛋白(PLP) 1、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、Ki67、A2B5、O4，以及其任何組合。
於一些具體實施例培養後，為了進一步富集誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)，可以一種或多種少突膠質譜系細胞(OLGs)標記對細胞進行分選。細胞分選可以透過本領域已知的各種技術實現。細胞分選技術的實例包括螢光活化細胞分選術(fluorescence-activated cell sorting, FACS)、免疫親和管柱分離，或免疫磁分離(immunomagnetic separation, MACS)或任何技術，其能夠基於物理特徵(密度)或結構特徵(特別是特定抗原)獲得一種特定細胞類型的富集。
5.
使用誘導式少突膠質譜系細胞
(OLGs)
之應用
根據我們的研究結果，可從可接觸的皮膚活體組織切片產生自體或同種異體誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)，這可在臨床中容易地獲得。該過程不需要手術或任何其他痛苦的過程。
誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)能有效促進神經元的髓鞘形成，因此可用於治療，特別是用於治療髓鞘脫失病或與少突膠質細胞功能障礙有關的疾病或病症。
此類疾病或病症的實例包括，但不限於，多發性硬化症(MS)、急性出血性炎症性疾病(AHL)、腦性麻痺、急性播散性腦脊髓炎(ADEM)、腦橋中央髓鞘溶解、進行性多處腦白質病、先天性腦白質營養不良、帕金森氏症、杭丁頓氏症、精神分裂症，以及放射線治療引起的髓鞘脫失病。
誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的治療用途包括將該誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)移植到一有需要的受試者中。可將該細胞以有效促進神經元髓鞘形成的量注射或移植到中樞神經系統(CNS)，例如胼胝體或小腦。
總而言之，本發明提供了一種生成誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的新技術，包括如下特徵及優點：
(i) 第一種從人類分化的體細胞產生誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)之方法。
(ii) 第一種能夠將體細胞重新編程/轉分化為少突膠質譜系細胞(OLGs)的化學混合物。沒有先前的技術可以透過化學物質從任何其他的體細胞類型中產生少突膠質譜系細胞(OLGs)。
(iii) 誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)為在3天內以少量化學物質(有生長因子或沒有生長因子)所產生的。
(iv) 從皮膚纖維母細胞產生誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的轉化率很高。平均效率超過30%。
(v) 誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)是可擴展的，類似於天然的細胞。
(vi) 用於產生誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的混合物的組成分都是明確定義的而且不含動物血清，適合臨床應用並具有高再現性。
(vii)誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)表現神經膠細胞以及少突膠質細胞的特異性標記。
(viii) 這是一種化學重新編程過程，沒有反轉錄病毒/慢病毒/質體感染過程，避免了插入突變或其他生物安全的問題。
本發明可提供如下之各種應用：
(i) 用於產生誘導式少突膠質譜系細胞的商業套組。由於這是從體細胞產生少突膠質譜系細胞(OLGs)的第一種也是唯一的方法，因此可以將其作為用於產生用於基礎研究以及細胞療法的少突膠質譜系細胞之套組。
(ii) 用於疾病治療的誘導式少突膠質譜系細胞的生產。根據我們的研究結果，有可能從可觸及的體細胞如皮膚活體組織切片中產生自體或同種異體少突膠質譜系細胞(OLGs)，這可以在臨床上輕鬆獲得。該過程不需要手術或任何其他痛苦的過程。然後患者可以獲得自體誘導式少突膠質譜系細胞，不需要服用免疫抑制藥物。或者，相較於透過手術獲得形成中樞神經系統(CNS)的少突膠質譜系細胞(OLGs)，更容易找到願意捐獻皮膚細胞用於誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)生產的健康供體。有鑑於神經膠細胞具有髓鞘再生以及神經支持的能力，誘發的少突膠質譜系細胞(OLGs)可以治療疾病，包括髓鞘脫失病以及神經退化性疾病[多發性硬化症(MS)以及急性出血性腦炎(AHL)、腦性麻痺、帕金森氏症、精神分裂症，以及放射線治療引起的髓鞘脫失病]。我們還可以利用本發明的藥物配方將體細胞直接轉化為體內功能性少突膠質譜系細胞(OLGs)以促進神經組織的修復。
(iii) 組織工程與再生醫學中的少突膠質譜系細胞。誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)可以支持神經細胞的生長及分化，並且可以幫助修復神經疾病治療中的神經損傷。轉換方法可與適當的生物醫學材料結合使用，以支持神經生長，例如在組織工程以及再生醫學中構建神經管束。
(iv) 個人化治療平台。我們可以使用誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)進行藥物篩選，為不同患者尋找合適的藥物標靶。患者可以使用他們自己的體細胞或纖維母細胞來產生可誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)，以建立針對神經膠細胞株相關疾病的最佳個人化治療。
具體而言，本發明提供了一種包含皮膚細胞以及一培養基的培養物，該培養基包含一化學誘導劑以及一種或多種如本文所述之輔助劑。特別而言，該培養物進一步包含衍生自皮膚細胞的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。
根據本發明，如本文所述之誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)或其培養物可用於作為治療一有需要的受試者的疾病之活性成分。於一些具體實施例中，一治療有效量的活性成分可與一藥學上可接受之載劑配製成一適當形式之藥物組合物，用於遞送及吸收之目的。取決於給藥方式，本發明之藥物組合物較佳包含約0.1%重量至約100%重量的活性成分，其中該重量百分比為基於整個組合物的重量來計算。該組合物可以直接作為植入物或進一步修飾為適合移植的形式。
如本文所用，「藥學上可接受的」係指該載劑與該組合物中的活性成分相容，並且較佳地可以穩定該活性成分並且對接受治療的個體而言是安全的。一藥學上可接受的載劑之實例包括常規緩衝劑(磷酸、檸檬酸，其他有機酸等)、生理鹽水、消毒水、抗氧化劑(抗壞血酸等)、等滲劑，以及防腐劑。
於一些具體實施例中，將根據本發明之組合物配製成適於注射的劑型，其中細胞懸浮在一藥學上可接受的載劑中，例如，滅菌水或生理鹽水或在使用前冷凍儲存。於一些具體實施例中，該組合物可進一步包含可生物降解的聚合物，其可在局部注射到缺陷部位後用於穩定、支持以及固定細胞簇。根據本發明之組合物可以配製成單位劑型或摻入多劑量容器中。該劑型可為油性或水性介質中的懸浮液、溶液或乳液，或粉末、顆粒、片劑或膠囊。本發明之組合物可透過生理學上可接受的途徑遞送，通常透過注射遞送。
透過以下實例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了說明而非為了限制之目的。根據本發明之公開內容，本領域技術人員應當理解的是，在不脫離本發明之精神及範圍的情況下，可以對所公開的特定具體實施例進行許多改變並仍然獲得相同或相似之結果。
實例
許多髓鞘脫失病與少突膠質細胞功能障礙有關，例如多發性硬化症(MS)以及急性出血性炎症性疾病(AHL)。一些髓鞘脫失病是由放射線療法所引起的。此外，一些神經退化性疾病如腦性麻痺、帕金森氏症、杭丁頓氏症，以及精神分裂症也是少突膠質細胞疾病。因此，神經膠細胞很可能可以治療神經退化性疾病以及髓鞘脫失病。目前，大約115項臨床試驗正在研究膠質細胞相關治療的療效(www.clinicaltrials.gov)。迄今為止，已知少突膠質譜系細胞(OLGs)可以源自胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)或誘導式多能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。然而，分化過程需要超過45天，這不僅消耗勞力且成本過高。此外，胚胎幹細胞或誘導式多能幹細胞(iPSCs)具有畸胎瘤的風險。只有小鼠或大鼠的少突膠質譜系細胞(OLGs)，而非人類的細胞，可以從具有轉錄因子誘導的纖維母細胞中獲得。到目前為止，還沒有使用化學混合物輸出任何少突膠質譜系細胞(OLGs)的計劃。我們的計畫提供了第一種使用化學物質從真皮纖維母細胞產生人類誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)之方法。該方法不但高效且避免插入病毒基因。最重要的是，這是迄今為止最快的重新編程方法，只需要3天。這一發現可能有益於幹細胞生物學、細胞療法，以及再生醫學。
1.
材料與方法
1.1
產生誘導式少突膠質譜系細胞
(OLGs)
將細胞(1×104
)種植於一24孔盤的每個孔上。於補充有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Hyclone公司)的HG-DMEM培養基(Life technologies公司)中培養2天，以補充有1% N2補充劑、1% Albumax、1% 非必需胺基酸(NEAA)的剔除培養基(處理培養基，所有試劑皆來自Life technologies公司)或以具有1% N2、1% B27、20 ng/mL PDGF-AA、EGF、bFGF，以及10 ng/mL NT3的DMEM/F12培養基，並添加不同的處理化學混合物替換。最終條件為3 mM丙戊酸培養2天，10 μM Y27632、10 μM SU9516、10 μM毛喉素(FSK)(Tocris公司)培養1天；或10 μM 莫汀司他或帕新司他培養2天，10 μM Y27632、10 μM SU9516、10 μM毛喉素(FSK)(Tocris公司)培養1天。
1.2
定量即時聚合酶連鎖反應
(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)
。
根據製造商的說明，使用RNeasy Micro (Qiagen公司，希爾登，德國)或TRIzol® LS試劑(Thermo Fisher Scientific公司)分離總RNA。以DNA酶I處理RNA以除去污染的DNA (Promega公司，麥迪遜，威斯康辛州，美國)，並使用Superscript III反轉錄。將得到的cDNA (80 ng/樣品)作為定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)的模板，其使用SYBR GREEN 2X master mix (KAPA Biosystems公司，威爾明頓，麻州，美國)進行。使用ABI 7900即時PCR系統(Applied Biosystems公司，卡爾斯巴市，加州，美國)測量並定量相對cDNA量。以相對於甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GADPH)的RNA含量對目標基因的相對量進行標準化。
1.3
免疫螢光分析
誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)在室溫下以4%甲醛固定15分鐘。以1×PBS洗滌後，以0.03% Triton X-100透化細胞5分鐘。以1×PBS洗滌細胞兩次，然後與一級抗體作用[抗Olig2抗體(1:100；Merck millipore公司)、Nkx2.2 (1:100；Stanta Cruz公司)、O4抗體(1:100；Merck millipore公司)、髓鞘鹼性蛋白(MBP)抗體(1:100；Proteintech公司)、PDGFRα抗體(1:100；R&D systems公司)]以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1:1500；Life technologies公司)在阻隔緩衝液(含有0.02% BSA的PBS)中於4o
C培養隔夜。將細胞於1×PBS中洗滌兩次，然後以CF555山羊抗兔二級抗體(1:200；Life technologies公司)、CF488山羊抗兔二級抗體(1:200；Biotium公司)、CF555山羊抗小鼠二級抗體(1:200；Life technologies公司)、CF488山羊抗小鼠二級抗體(1:200；Biotium公司)、CF555山羊抗大鼠二級抗體(1:200；Life technologies公司)在阻隔緩衝液中於室溫下避光作用1小時。將細胞以1×PBS洗滌兩次，並將細胞保持在1×PBS中。透過使用螢光顯微鏡分析螢光。透過圖像分析軟體(Image-Pro plus 4.5軟體，馬里蘭州，美國)分析每個圖像的螢光強度。每個免疫螢光圖像定量超過300個細胞/場。
1.4
流式細胞儀分析
將細胞依次與一級抗體以及二級抗體一起作用。然後透過FACSCanto (Becton Dickinson公司，法蘭克林湖，紐澤西州，美國)分析細胞。透過FACSDiva軟體(BD Biosciences公司)進一步定量數據。
1.5
髓鞘共培養試驗
從小鼠中分離純化的背根神經節神經元(dorsal root ganglion neuron, DRGN)培養物。將細胞維持在成熟培養基(DMEM-F12，補充有N1、0.01%胎牛血清白蛋白，以及B27補充劑(Invitrogen公司)，10 ng/mL鹼性纖維母細胞因子(basic fibroblast factor, bFGF)，以及2 nmol/L三碘甲狀腺原氨酸(T3)、10 ng/mL血小板衍生生長因子(PDGF)-AA、12.5 ng/mL神經生長因子(nerve growth factors, NGF))，持續3週。細胞形成神經元網路。將少突膠質譜系細胞(0.7×105
個細胞/cm2
)懸浮在限定培養基中的背根神經節神經元(DRGN)培養物中。確定的培養基由補充有N1 (Sigma-Aldrich公司)、0.01%胎牛血清白蛋白、1%青黴素-鏈黴素，以及B27補充劑(Invitrogen公司)，10 ng/mL血小板衍生生長因子(PDGF)-AA、10 ng/mL鹼性纖維母細胞因子(bFGF)，以及2 nmol/L三碘甲腺原氨酸(T3)(Sigma-Aldrich公司)(稱為DM+GF)的DMEM-F12培養基所組成。在共培養2週後分析細胞分化程度以及髓鞘形成。
2.
結果
2.1
五種化學藥劑的混合物組成分之最佳化
為了最佳化皮膚纖維母細胞中誘導的少突膠質譜系細胞(OLGs)之誘導方法，我們首先測量了Y27632以及SU9516。結果顯示SU9516與圓頂狀形成有關(圖1A)，Y27632導致樹突狀形態變化(圖1B)。Y27632以及SU9516的組合有效地將大多數纖維母細胞轉化為少突膠質譜系細胞(OLGs)狀細胞(圖2A)。結果顯示，誘導細胞的形態在兩天內迅速變化，O4顯著表現(圖2B)。此外，我們加入了PKC抑制劑Go6983，據記載它可以改善少突膠質細胞的形成42
。Go6983與Y27632促進樹枝狀的形成，SU9516則具有維持圓頂狀的功能(圖3)。在先前的研究之後，我們透過預處理丙戊酸(VPA) 2天來抑制組蛋白去乙醯化酶(HDAC)並成功地提高重新編程的效率(圖4A、4B)。接下來，我們篩選基於混合物的藥物篩選的支持因子。在22種藥物中，我們發現毛喉素(FSK)顯著促進轉化作用(圖5)。總體而言，最佳化方案以VPA、Y27632、Go6983、FSK，以及SU9516處理細胞以指導重新編程(圖6A、6B)。最佳化的混合物可以將皮膚纖維母細胞轉分化成為具有相應細胞形態以及標記表現的少突膠質譜系細胞(OLGs)狀細胞。在我們的例子中，該五種化學物質可以在三天內有效地轉化細胞(圖6A、6B)。
2.2
在由五種化學物質產生的誘導式少突膠質譜系細胞
(OLGs)
上表現多種少突膠質細胞特異性標記
根據初步數據，我們設計了含有五種化學物質的混合物，以誘導纖維母細胞產生少突膠質譜系細胞(OLGs)。於此，我們透過免疫螢光以及QRT-qPCR檢查被誘導的細胞上的各種少突膠質細胞特異性標記(圖6A以及6B)。標記染色結果顯示，PDGFR [少突膠質細胞前體/先驅細胞(OPCs)標記]、髓鞘鹼性蛋白(MBP) (成熟髓鞘化少突膠質細胞標記)，以及Olig2 (在少突膠質細胞前體/先驅細胞(OPCs)中組成型表現的轉錄因子)的表現程度在誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)中增加(圖6A)。此外，我們透過RT-qPCR檢查了SOX10 (與少突膠質細胞前體/先驅細胞(OPCs)分化相關的轉錄因子)、PLP1 (在成熟少突膠質細胞上表現的髓鞘蛋白)的表現程度(圖6B)。結果顯示，SOX10、PLP1具有高表現量。總之，這些數據顯示出分子特徵與形態變化的一致性。
2.3 低劑量的四種化學物質足以用於誘導式少突
膠質譜系細胞 (OLGs) 的轉化作用
此外，我們發現Go6983對於轉換過程是不必要的(圖7)。此外，低劑量的Y27632、SU9516，以及FSK (10 μM)混合物足以獲得與高劑量(50 μM)相似的結果(圖8)。結果顯示，10 μM足以觸發重新編程，具有更好的轉換效率。少突膠質細胞的特異性標記oligo2、O4、PDGFRα、GlaC、GRP17、髓鞘鹼性蛋白(MBP)、O1 (圖9A和9B)透過免疫螢光測定法大量表現。透過qRT-PCR分析，顯示Sox10、髓鞘鹼性蛋白(MBP)，以及PLP1顯著增加超過3倍(圖9C)。
2.4
透過共培養實驗證實誘導式少突膠質譜系細胞
(OLGs)
可以髓鞘化神經元。
為了詳細闡述體外髓鞘形成能力，我們對誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)(透過用四種化合物4C (VYSF)處理從皮膚細胞產生的)與小鼠神經元(背根神經節細胞，mDRGs)進行了共培養測定。為了分析，我們將來自小鼠神經元(mDRGs)的誘導的細胞與人類核(HuNu)的染色區分開來。結果證明神經絲(neurofilament, NF)以及髓鞘鹼性蛋白(MBP)在小鼠神經元(mDRG)以及誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)上的共定位(圖10)。這表示神經元可被誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)髓鞘化。
還研究了誘導式少突膠質譜系細胞的增殖能力。為了確定我們以化學物質處理後誘導式細胞是否仍然具有足夠的增殖能力，我們對有絲分裂標記進行染色並檢測到O4-陽性誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)(透過以四種化合物4C (VYSF)處理而從皮膚細胞所產生)上Ki67的表現。我們的發現顯示這些誘導式細胞表現Ki67並具有一定的增殖能力(圖11)。此外，透過流式細胞儀分析，我們計劃使用A2B5 (少突膠質細胞先驅細胞標記)在早期發育階段分離少突膠質細胞。這些A2B5陽性細胞達到78%的活細胞並且能夠擴增並表現O4標記高達56.4% (圖12A、12B、12C)。結果顯示，A2B5-陽性細胞表現出少突膠質細胞譜系特徵，且轉化效率高。
2.5
使用莫汀司他以及帕新司他代替
VPA
以產生誘導式少突膠質譜系細胞
(OLGs)
。
特別是，如同VPA，莫汀司他以及帕新司他為組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑。我們嘗試在第一步誘導時以莫汀司他以及帕新司他替換VPA。實驗結果顯示，相較於原始混合物，這兩種組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑可以促進纖維母細胞分化成更成熟的少突膠質細胞形態，具有更多的分支與複雜的結構(圖13A)。免疫螢光染色結果顯示，以這兩種組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑處理的細胞表現少突膠質細胞特異性標記O4以及髓鞘鹼性蛋白(MBP) (圖13B)。
2.6 三種化學物質 (3C) 足以將纖維母
細胞轉化為少突膠質譜系細胞 (OLGs) 。
為了瞭解哪些化學物質為少突膠質譜系細胞(OLGs)轉換的關鍵因子，我們嘗試測試並減少一、兩種因子。實驗結果顯示，含有VPA、Y27632以及FSK的三種化學物質可以導致少突膠質譜系細胞(OLGs)特異性標記A2B5 (圖14A)、O4 (圖14B)，以及髓鞘鹼性蛋白(MBP)(圖14B)的表現增加。這表示3C可以形成具有較低功效的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。
3.
總結
總之，於此我們展示了化學物質Y27632 (一種Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑)與VPA (一種組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑)，以及Forskolin (一種環腺苷單磷酸(cAMP)活化劑)的組合，可視需要地進一步與SU9516 (一種細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑)或Y27632 (一種Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑)的組合，而且SU9516 (一種細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑)可以將纖維母細胞重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)，具有多種少突膠質細胞標記的表現。其轉換效率很高。少突膠質譜系細胞(OLGs)標記O4陽性率為56.4%，而A2B5為73.9%。這些表現多種少突膠質譜系細胞(OLGs)譜系標記的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)在髓鞘化神經元中具有功能性且為有效的，因此可用於細胞治療，特別是用於髓鞘脫失病。參考文獻
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無
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及本發明以下之實施方式。出於說明本發明之目的，於圖式中顯示出目前較佳的實施例。然而，應該理解的是，本發明不限於所示之精確配置及手段。
於圖式中：
圖1A-1B所示為SU9516與Y27632誘導人類原代皮膚纖維母細胞的形態變化。SU9516誘導出圓頂狀形態(圖1A)，而Y27632引發了樹突狀形態的變化(圖1B)。
圖2A及2B所示為Y27632與SU9516將該纖維母細胞重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。圖2A所示為Y27632 (Y)與SU9516 (S)將纖維母細胞轉化成具有樹突形態的少突膠質譜系細胞(OLGs)。圖2B所示為螢光染色顯示在該誘導的細胞上少突膠質細胞特異性標記(O4)的表現。DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)用於染色細胞核。
圖3所示為Go6983、Y27632，以及SU9516增強了誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的重新編程。以由Y27632 (Y)、Go6983 (G)，以及SU9516 (S)組成的不同組合處理，結果顯示這些因子中的每一個都可促進少突膠質譜系細胞(OLGs)狀形態、樹突生長，以及圓頂狀的形成。 Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983。
圖4A-4B所示為透過用VPA預處理有效地增強重新編程的效率。圖4A所示為以VPA預處理2天可以提高轉化效率之效率。圖4B所示為透過對該誘導的細胞的螢光染色檢測少突膠質細胞特異性標記O4。DAPI用於染色細胞核。 V：VPA，Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983。
圖5所示為毛喉素(FSK)促進誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的形態變化。在以VPA預處理後，測試了22種化學物質並篩選促進YSG重新編程的藥物。數據顯示，毛喉素(FSK)可以維持圓頂狀細胞並誘導具有更多樹突狀結構的細胞。 V：VPA，Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983。
圖6A所示為在以五種化學物質處理的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)上多種少突膠質細胞標記的表現。透過化學混合物(VYSGF)誘導的細胞表現PDGFRα (少突膠質細胞標記)、髓鞘鹼性蛋白(MBP)、Olig2與O4(少突膠質細胞特異性標記)。 Y：Y27632，S：SU9516，G：Go6983，F：毛喉素，V：丙戊酸。
圖6B所示為qPCR顯示少突膠質細胞特異性基因的增加。mRNA表現顯示，相較於纖維母細胞，誘導的細胞中的轉錄因子SOX10、髓鞘鹼性蛋白(MBP)，以及PLP1表現增加。
圖7所示為Go6983對於轉化過程是不必要的。以不同的組合化學物處理細胞，包括VPA、Y27632、FSK、Go6983或SU9516。結果顯示，VPA、Y27632、FSK，以及SU9516誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)狀形態，Go6983對於轉化過程則為不必要的。
圖8所示為低劑量的4C化學混合物(10 μM的Y27632、FSK，以及SU9516，3 mM的VPA)足以用於轉化過程。在4C化學混合物中以不同濃度的Y27632、FSK，以及SU9516處理細胞。結果顯示，10 μM的這些化學物質可誘導該少突膠質譜系細胞(OLGs)。
圖9A所示為以四種化學物質處理的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的標記表現。以小分子(VYSF)誘導細胞表現少突膠質譜系細胞(OLGs)標記Olig2、O4，以及PDGFRa。Y：Y27632，S：SU9516，F：毛喉素，V：丙戊酸。
圖9B所示為相較於纖維母細胞，iOLGs表現少突膠質細胞標記。透過化學混合物(4C，VYSF)誘導細胞。數據顯示iOLGs表現少突膠質細胞特異性標記GalC、GPR17、髓鞘鹼性蛋白(MBP)，以及O1。
圖9C所示為qPCR顯示不同少突膠質細胞特異性基因Sox10、髓鞘鹼性蛋白(MBP)，以及PLP1的增加。mRNA表現顯示，相較於纖維母細胞，轉錄因子SOX10、髓鞘形成蛋白髓鞘鹼性蛋白(MBP)以及PLP1在iOLGs (4C，VYSF)中表現增加。
圖10所示為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)將神經元髓鞘化。以小鼠DRG共培養誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)顯示，少突膠質細胞特異性標記髓鞘鹼性蛋白(MBP)與神經標記神經絲(neurofilament, NF)共定位，顯示誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)具有髓鞘形成能力。
圖11所示為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)具有增殖能力。免疫螢光染色顯示O4陽性細胞也表現增殖指標Ki67。
圖12A、12B以及12C所示為誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)表現少突膠質細胞先驅細胞標記A2B5以及O4。圖12A所示為相較於纖維母細胞，誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)中A2B5表現增加。圖12B所示為相較於纖維母細胞，誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)中O4表現增加。圖12C所示為以流式細胞儀分析A2B5與O4表現的定量結果。
圖13A-13B所示為VPA可被其他組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑替代以產生誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)。圖13A所示為莫汀司他以及帕新司他可替代VPA並誘導纖維母細胞重新編程為更成熟的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)形態。圖13B所示為免疫螢光染色結果，其顯示以莫汀司他與帕新司他誘導的細胞具有更強的少突膠質細胞標記O4以及髓鞘鹼性蛋白(MBP)的表現。
圖14A與14B所示為3C (三種化合物)誘導式iOLGs表現少突膠質細胞先驅細胞標記A2B5。圖14A所示為少突膠質細胞標記A2B5透過流式細胞儀分析定量。相較於纖維母細胞，以3C (VPA、毛喉素、Y27632)處理的細胞增加A2B5的表現。以4C (VPA、毛喉素、Y27632、SU9516)處理的細胞則作為陽性對照。圖14B所示為免疫螢光染色，其顯示以3C處理的細胞的少突膠質譜系細胞(OLGs)轉錄因子Olig2表現增加。以4C處理的細胞作為陽性對照。
圖15所示為來自人類皮膚纖維母細胞的誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)的化學轉化過程之總結。
無
Claims (17)
- 一種產生誘導式少突膠質譜系細胞(induced oligodendrocyte-lineage cells,OLGs)之方法，包括將皮膚纖維母細胞培養於含有0.2-20mM之丙戊酸、0.1-10μM之莫汀司他或0.1-10μM之帕新司他之培養基1天，再培養於含有0.5-50μM之Y27632、0.5-50μM之SU9516以及5-500μM之毛喉素之培養基2天，使該皮膚纖維母細胞重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞。
- 如請求項1之方法，其中丙戊酸之濃度為3mM、莫汀司他之濃度為5-10μM以及帕新司他之濃度為5-10μM。
- 如請求項1之方法，其中Y27632、SU9516及毛喉素之濃度各自為10μM。
- 如請求項2之方法，其中該Y27632、SU9516及毛喉素之濃度各自為10μM。
- 如請求項1之方法，包括將皮膚纖維母細胞培養於含有0.2-20mM之丙戊酸之培養基1天，再培養於含有0.5-50μM之Y27632、0.5-50μM之SU9516以及5-500μM之毛喉素之培養基2天，使該皮膚纖維母細胞重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞。
- 如請求項5之方法，其中丙戊酸之濃度為3mM，Y27632、SU9516以及毛喉素之濃度各自為10μM。
- 如請求項1之方法，包括將皮膚纖維母細胞培養於含有0.1-10μM之莫汀司他之培養基1天，再培養於含有0.5-50μM之Y27632、0.5-50μM之 SU9516及5-500μM之毛喉素之培養基2天，使該皮膚纖維母細胞重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞。
- 如請求項7之方法，其中莫汀司他之濃度為5-10μM，Y27632、SU9516及毛喉素之濃度各自為10μM。
- 如請求項1之方法，包括將皮膚纖維母細胞培養於含有0.1-10μM帕新司他之培養基1天，再培養於含有0.5-50μM之Y27632、0.5-50μM之SU9516、5-500μM之毛喉素之培養基2天，使該皮膚纖維母細胞重新編程為誘導式少突膠質譜系細胞。
- 如請求項9之方法，其中帕新司他之濃度為5-10μM，Y27632、SU9516以及毛喉素之濃度各自為10μM。
- 如請求項1至10中任一項之方法，其中該培養基不包括Go6983。
- 如請求項1至10中任一項之方法，其中該皮膚纖維母細胞為人類皮膚纖維母細胞。
- 如請求項1至10中任一項之方法，其中該誘導式少突膠質譜系細胞(OLGs)表現選自由下列所組成之群組的細胞標記：血小板衍生的生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)、髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein,MBP)、少突膠質細胞轉錄因子(oligodendrocyte transcription factor,OLIG2)、SOX10、蛋白脂質蛋白(proteolipid protein,PLP)1、Ki67、A2B5、O4，以及其任何組合。
- 如請求項1至10中任一項之方法，進一步包括從該細胞培養物中分離該誘導式OLGs以獲得分離的誘導式OLGs群。
- 一種誘導式OLGs用於製備供促進神經元之髓鞘形成之藥物之用途，其中該誘導式OLGs係由如請求項1至14任一項之方法製備而得。
- 如請求項15之用途，其中該藥物可用於治療髓鞘脫失病。
- 如請求項15之用途，其中該藥物可用於治療選自由下列所組成之群組之疾病或病症：多發性硬化症(multiple sclerosis,MS)、急性出血性炎症性疾病(acute hemorrhagic inflammatory disease,AHL)、腦性麻痺、急性播散性腦脊髓炎(acute-disseminated encephalomyelitis,ADEM)、腦橋中央髓鞘溶解、進行性多處腦白質病、先天性腦白質營養不良、帕金森氏症、杭丁頓氏症、精神分裂症，以及放射線治療引起的髓鞘脫失病。
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