CN107810268A - 通过直接重编程由引入Oct4的人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞的方法 - Google Patents

通过直接重编程由引入Oct4的人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种通过直接重编程由其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的人体细胞或用Oct4蛋白处理的人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞的方法。用低分子量物质处理Oct4过表达人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞的方法可以通过不经由神经干细胞而直接重编程在短时间内高效地建立少突胶质细胞前体细胞，因此少突胶质细胞前体细胞作为治疗难治性脱髓鞘疾病的细胞治疗剂是有用的。

Description

通过直接重编程由引入Oct4的人体细胞诱导少突胶质细胞前 体细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种通过直接重编程由其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的人体细胞或Oct4蛋白处理的人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞(OPC)的方法。
背景技术
由于老龄化社会的发展，用于更健康老化和无疾病健康生活的个性化细胞治疗剂是改善生活质量所必需的药物。被认为是中枢神经系统疾病的多发性硬化症是原因不明的脱髓鞘疾病，并且在严重情况下伴有感觉和运动损伤。然而，除了用药物治疗减轻症状外，没有基本的治疗方法。因此，能够分化为能产生髓鞘的少突胶质细胞的OPC的移植已经作为主要治疗方法受到了关注，对使用胚胎干细胞和成体干细胞获得将用于移植的细胞的研究正在进行。
胚胎干细胞是多能细胞，与体细胞不同，其能够分化成具有无限分裂能力的所有类型的人类细胞。成体干细胞是能够从患者中提取的多能细胞，作为代表性实例，神经干细胞(NSC)是众所周知的。作为成体干细胞的NSC可以克服神经疾病治疗中的免疫排斥反应，因此作为细胞治疗剂受到关注。然而，由于NSC分化成少突胶质细胞的能力相当低因此是低效的，并且由于它们应该从患者自身的脑组织获得因此在细胞数量方面受到限制。胚胎干细胞在临床应用上也有缺点需要克服。首先，存在道德问题，因为需要破坏受精胚胎以获得胚胎干细胞，并且当将从胚胎干细胞分化的细胞移植到患者中时，发生免疫排斥。
在试图克服这些问题的各种方法中，从分化细胞去分化为未分化细胞的方法已受到关注，并且去分化包括使用分化细胞产生多能干细胞如胚胎干细胞。2006年，日本ShinyaYamanaka教授通过基因引入研发了诱导性多能干细胞(iPS细胞)后，将这些细胞应用于治疗剂的各种研究正在进行。
在当将四种基因(去分化诱导因子；Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4)引入小鼠或人体细胞中然后在胚胎干细胞培养条件下长时间培养时(Cell126:663-676,2006；Science 318:1917-1920,2007)建立了与胚胎干细胞具有相似特性的干细胞的报道被提出之后，各种能够用于临床应用的替代基因的方法已被研究。然而，由于对人体细胞研究结果仍然不足，难以确定去分化诱导机制以及形成畸胎瘤的风险，因此将iPS细胞应用于临床试验是困难的。直接重编程方法是最近已经提出作为这样的iPS细胞的替代方法，并且包括两种类型的技术，通过生长信号的调节由去分化诱导因子和低分子量物质的组合在非多能性阶段用于引入在细胞中特异性表达的基因并将细胞诱导为所需的细胞。这种方法被高度赞赏，因为它仅具有各种干细胞的优点，并消除了许多抑制临床应用的因素。
近年来，美国的Marius Wernig研究小组使用三种基因(Olig2、Sox10、Zfp536)和Paul J Tesar研究小组使用三种基因(Olig2、Sox10、NKX6.2)显示了建立小鼠OPC的可能性，并且据报道，他们成功地从小鼠体细胞直接重编程到OPC。然而，目前还没有使用人体细胞的报道。另外，美国的Shengding和Mickie Bhatia研究小组通过将Oct4基因引入人体细胞直接重编程来证明了神经干细胞的建立，因此提出了Oct4基因可以调控神经系统相关基因在细胞中的表达的新范例。
因此，本发明人通过直接重编程来集中尝试由人体细胞诱导OPC，从而通过将Oct4引入人体细胞并处理涉及形成少突胶质细胞的几种低分子量物质来确认诱导OPC的可能性，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明涉及提供一种通过直接重编程由人体细胞诱导OPC的方法，其包括将其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的人体细胞在含有特定低分子量物质的培养基中培养。
本发明还涉及提供一种通过直接重编程由人体细胞诱导OPC的方法，其包括在含有特定低分子量物质的培养基中培养人体细胞，其中在培养之前、期间或之后用Oct4蛋白处理人体细胞。
本发明还涉及提供一种用于通过直接重编程由其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子或用Oct4蛋白处理的人体细胞诱导OPC的组合物，所述组合物包括特定低分子量物质作为有效成分。
本发明还涉及提供一种将由上述方法制备的OPC分化成少突胶质细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种通过直接重编程由人体细胞诱导OPC的方法，该方法包括：在含有以下物质的培养基中培养其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的人体细胞：(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)Rho相关激酶抑制剂(ROCK抑制剂)；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)音猬因子激动剂(Shh激动剂)。
本发明还提供了一种通过直接重编程由人体细胞诱导OPC的方法，其包括在含有以下物质的培养基中培养人体细胞：(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)ROCK抑制剂；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)Shh激动剂，其中在培养之前、期间或之后用Oct4蛋白处理人体细胞。
本发明还提供了一种用于通过直接重编程由其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子或用Oct4蛋白处理的人体细胞诱导OPC的组合物，所述组合物包括(i)TGF-β1型受体抑制剂；(ii)ROCK抑制剂；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)Shh激动剂作为活性成分。
本发明还提供了一种将OPC分化成少突胶质细胞的方法，所述方法包括：在含有ROCK抑制剂、钙通道激动剂和白血病抑制因子(LIF)的培养基中培养通过上述方法制备的OPC。
附图说明
图1显示了通过将Oct4引入到由Sox10::eGFP hESC分化的成纤维细胞中来诱导iOPC。
图2显示了在重编程培养基(RM)中培养引入Oct4的Sox10::eGFP成纤维细胞7天后通过在诱导培养基(IM)中培养来选择建立诱导OPC(iOPC)所必需的低分子量物质的过程。
图3显示了用低分子量物质处理引入Oct4的Sox10::eGFP成纤维细胞后的GFP+分布的FACS分析结果。
图4显示了引入Oct4的Sox10::eGFP成纤维细胞用低分子量物质处理后已知为OPC的标志物的Olig2、NKX2.2和ZFP536(除Sox10之外)的mRNA水平的实时PCR结果。
图5显示了Olig2，Sox10和ZFP536标志物的表达，以及不使用敲除血清替代物(knockout serum replacement，KSR)由人体细胞诱导的OPC的形态。
图6显示了在逐步除去低分子量物质的培养基中和在含有所有低分子量物质的培养基中Sox10表达的比较。
图7显示了不使用KSR由人体细胞诱导iOPC。
图8显示了在诱导培养基(IM)中培养之后三天经历间充质至上皮转化(MMET)的细胞，以及培养之后7天与OPC具有类似形态的细胞。
图9显示了通过FACS分析PDGFRα和A2B5(它们是iPOC中的OPC标志物)的表达。
图10显示了通过免疫组织化学染色鉴定的细胞膜中，iPOC中PDGFRα和A2B5的表达。
图11显示了通过实时PCR比较分析iPOC中OPC标志物基因的mRNA表达。
图12显示了当在排除生长因子的分化条件下将建立的iOPC培养40至60天时显示的典型分支类型中少突胶质细胞的分化，并通过实时PCR和免疫组织化学染色确认了少突胶质细胞标志物(例如MBP和MAG)表达增加。
图13显示了将表达GFP的iOPC与小鼠神经元共培养并分化成少突胶质细胞，然后用神经元髓鞘化。
图14显示了将iOPC移植到多发性硬化症动物模型中后获得的髓磷脂作为治疗剂进行体内分化和功效的测试与正常大鼠类似。
图15显示了诱导期间神经干细胞标志物(例如Sox1、Sox2和Pax6基因)的表达通过实时PCR确认以证明Oct4过表达后通过神经干细胞分化不能实现iOPC诱导。
图16显示了在诱导期间从培养液中除去OPC的生长因子(例如bFGF和PDGF-AA)后的增殖证明了通过神经干细胞不能实现iOPC诱导，并且通过与生长因子的反应使iOPC增殖，以及在生长因子依赖的增殖细胞中OPC标志物(例如PDGFRα和A2B5)的表达由FACS分析确认。
图17显示了通过FACS分析、实时PCR和免疫组织化学染色分析在IM中培养过表达Oct4的毛囊真皮乳头后的OPC标志物的表达。
图18显示了通过实时PCR或FACS分析在羊水干细胞、各种年龄范围的脂肪来源的干细胞和真皮细胞中过表达Oct4并在IM中培养后的OPC标志物的表达。
图19是显示本发明的完整细节和与现有技术的不同点的图。
具体实施方式
除非另外定义，否则说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，这里使用的术语在本领域是公知的并且通常使用。
在本发明中，确认了在人体细胞中过表达Oct4后通过用涉及少突胶质细胞产生的各种低分子量物质处理的Oct4基因的引入以及培养条件的调节可能实施OPC的诱导，并且也确认了OPC标志物基因的表达、表观遗传学特征，体外髓鞘化的能力也得到了确认。另外，确认了由其诱导的OPC是分化的，因此显示出作为细胞治疗剂的功效。
本发明涉及使用直接重编程方法开发个性化细胞治疗剂，并且本发明人发现了基于先前建立的低分子量物质(KR10-1357402)的新型物质组合，并建立了通过与基因组合而不经由神经干细胞的来自人体细胞的OPC。
在本发明的一种示例性实施方式中，在将Oct4基因引入到人体细胞包皮成纤维细胞后，将细胞在含有A83-01、噻唑维林(thiazovivin)、丙戊酸(VPA)、2,6,9-三元取代嘌呤(purmorphamine)和毛喉素的培养基中培养以确认OPC标志物的表达，然后确认来自人体细胞的OPC的诱导。
因此，在一个方面中，本发明涉及通过直接重编程由人体细胞诱导OPC的方法，所述方法包括：在含有以下物质的培养基中培养其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的人体细胞：(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)ROCK抑制剂；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)Shh激动剂。
在本发明的一种示例性实施方式中，尽管将编码Oct4蛋白的核酸型基因引入到人体细胞包皮成纤维细胞中以过表达Oct4，但是为了诱导OPC以及将Oct4基因引入到体细胞，可以使用Oct4蛋白直接处理体细胞。可以在将人体细胞在含有低分子量物质的培养基中培养之前、期间或之后对Oct4蛋白质进行处理。
因此，在另一方面中，本发明涉及通过直接重编程由人体细胞诱导OPC的方法，所述方法包括：在含有以下物质的培养基中培养人体细胞：(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)ROCK抑制剂；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)Shh激动剂，其中，在培养之前、期间或之后用Oct4蛋白处理人体细胞。
在本发明中，培养基可进一步含有钙通道激动剂，或可进一步含有选自由RG108、BIX01294、SP600125、溶血磷脂酸、Bayk8644、毛喉素、地塞米松、EX527和咯利普兰组成的组中的任一种，但是本发明并不限于此。
在本发明中，TGF-βI型受体抑制剂可以是A83-01，ROCK抑制剂可以是噻唑维林，组蛋白脱乙酰酶抑制剂可以是丙戊酸，Shh激动剂可以是2,6,9-三元取代嘌呤，以及钙通道激动剂可以是毛喉素，但是本发明并不限于此。
在本发明中，“A83-01”是转化生长因子-βI型(TGF-βI型)受体抑制剂，其是与TGF-βI型受体结合以干扰TGF-βI型的正常信号传导过程的物质(Tojo M et al.,CancerSci.96:791-800,2005)。TGF-βI型是在细胞增殖和各种类型的细胞中发挥各种作用的多功能肽，并且已知这种多功能性在各种组织的生长和分化中起关键作用(例如脂肪生成、肌生成、骨细胞形成、上皮细胞分化)并抑制神经干细胞的增殖。除了TGF-βI型受体抑制剂A83-01之外，可以使用包括SB432542的所有TGF-βI型受体抑制剂，并且TGF-βI型受体抑制剂A83-01可以商购或作为低分子量物质制备使用，通过抑制剂处理可促进神经干细胞的增殖。向培养基中加入TGF-βI型受体抑制剂A83-01以使其以有效浓度包含。有效浓度可以受到本领域公知的参数的影响，例如培养基类型、培养方法等。
在本发明中，已知“N-苄基-[2-(嘧啶-4-基)氨基]噻唑-4-甲酰胺(噻唑乙酮)”阻断诱导神经细胞和神经干细胞凋亡的Rho/ROCK信号和抑制神经干细胞增殖的PTEN信号，预期抑制神经干细胞的凋亡并增加自我更新活性和自我增殖活性(Matthias Groszer,etal.,Science 294:2186,2001)。噻唑维林是由ROCK抑制剂选择性抑制Rho相关激酶(ROCK)的物质，除噻唑维林外，还可以使用Y-27632等。将噻唑维林加入到培养基中以使其以有效浓度包含，并且有效浓度可以受到本领域众所周知的参数的影响，例如培养基类型、培养方法等。
在本发明中，“2-丙基戊酸(VPA)”或“丙戊酸(VPA)”是抑制组蛋白脱乙酰酶的物质，已知通过促进细胞增殖抑制因子和基因的表达而表现出较强的细胞生长抗癌活性，该基因是通过以高乙酰化状态形成染色质以诱导癌细胞的分化并抑制血管生成以及通过将细胞周期固定在G1状态引起癌细胞凋亡而诱导分化所必需的基因。组蛋白脱乙酰酶(HDAC)通过pRB/E2F抑制基因转录，并且组蛋白乙酰化的降解涉及各种类型的癌症的产生。HDAC在缺氧、低血糖、细胞癌等严重环境条件下高表达以通过抑制细胞增殖抑制因子的表达来促进细胞增殖，已知其被认为是细胞癌变和分化调节的关键调控因子。特别是，已知VPA诱导肌醇减少，抑制GSK-3β，激活ERK途径，并促进PPAR活化。曲古菌素(TSA)或其衍生物以及2-丙基戊酸(VPA)可以用作HDAC抑制剂，并且该衍生物包括各种类型的药学上可接受的无机盐或有机盐。当处理浓度太低时，效果较差，而当浓度太高时，则变成有毒的，因此，根据细胞类型，应确定合适的浓度。
在本发明中，“2,6,9-三元取代嘌呤”是嘌呤化合物，并且已知涉及Shh信号系统。对2,6,9-三元取代嘌呤没有特别限制，只要可以诱导Shh信号即可，可以使用其各种衍生物。例如，可以使用市售的2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉代苯胺基)-9-环己基嘌呤)。将2,6,9-三元取代嘌呤加入到常规使用的培养基中以诱导去分化成神经干细胞样的细胞。在作为Shh衍生物的2,6,9-三元取代嘌呤的处理中，有利的是不必引入基因以由人成纤维细胞产生神经干细胞。2,6,9-三元取代嘌呤将以有效浓度包含在培养基中。2,6,9-三元取代嘌呤的有效浓度可能受到本领域众所周知的参数的影响，例如培养基类型和培养方法。
在本发明中，本文使用的“毛喉素”用于通过直接激活腺苷酸环化酶的催化亚基来增加细胞内cAMP浓度，“反苯环丙胺”用于抑制单胺氧化酶(MAO)，其是一种通常在神经末梢降解去甲肾上腺素的酶。
在本发明中，培养基包括常规用于神经干细胞培养的所有类型的培养基，培养中使用的培养基通常包括碳源、氮源和微量元素。本发明的培养基可以是含有N2、B27、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、bFGF、PDGF和抗坏血酸的DMEM，但是本发明并不限于此。
作为本发明中诱导细胞培养的培养基，可以使用本领域已知的基础培养基而没有限制。基础培养基可以通过人工合成来制备，或者可以使用市售培养基。市售培养基的实例可以包括但不限于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、最低基础培养基(MEM)、eagle基本培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最低基础培养基(α-MEM)、Glasgow最低基础培养基(G-MEM)、Isocove改良Dulbecco培养基等，培养基优选为DMEM。在本发明的一种示例性实施方式中，细胞在DMEM中培养。
在本发明中，人体细胞可以是但不限于包皮成纤维细胞、毛囊真皮乳头、IMR90肺成纤维细胞或真皮成纤维细胞。此外，还可以从羊膜来源的干细胞或脂肪来源的干细胞诱导OPC，而不是从人体细胞。
本发明的Oct4可以以蛋白质或编码该蛋白质的核酸的形式提供，并且本发明的Oct4蛋白质包括具有野生型Oct4蛋白质的氨基酸序列的蛋白质，以及Oct4蛋白质的变体。
Oct4蛋白的变体是指由于Oct4的天然氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基或其组合的缺失、插入和保守或保守置换而具有不同序列的蛋白质。所述变体可以是展现与天然蛋白质相同生物活性的功能性等同物，或者如果需要的话，变体相对于物理或化学环境具有增强的结构稳定性，或通过改变所述蛋白质的物理或化学性质具有增强的生理学活性。
更优选地，变体是具有编码Oct4蛋白的核苷酸序列的核酸，编码Oct4的核苷酸序列是编码野生型或变体型Oct4蛋白的核苷酸序列。核苷酸序列可以通过取代、缺失、插入一个或多个碱基或其组合来修饰，或者可以是天然分离的或通过化学合成来制备的核苷酸序列。具有编码Oct4蛋白的核苷酸序列的核酸可以是单链或双链的，并且可以是DNA分子(基因组或cDNA)或RNA分子。
编码Oct4蛋白的核酸可以通过本领域已知的方法引入到细胞中，例如，使用载体形式的裸DNA(Wolff et al.Science,1990:Wolff et al.J Cell Sci.103:1249-59,1992)，或者使用脂质体或阳离子聚合物等。脂质体可以是通过混合用于基因引入的阳离子性磷脂(例如DOTMA或DOTAP)而制备的磷脂膜，通过将阳离子性脂质体和阴离子性核酸以预定的比例混合而形成核酸-脂质体复合体。
本文使用的术语“载体”是能够在合适的宿主细胞中表达所需蛋白质的表达载体，以及包含可操作地连接以表达基因插入物的必需调控元件的基因构建体。
本文使用的术语“可操作地连接”是指核酸表达调控序列与编码所需蛋白质以实施常规功能的核酸序列之间的功能性连接。可以使用本领域众所周知的基因重组技术形成与重组载体的可操作连接，并且对于位点特异性DNA切割和连接，可以使用本领域通常已知的酶。
本发明的载体可以包括用于膜靶向或分泌以及表达调控元件如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强剂的信号序列或前导序列，并且可以根据目的以各种形式制备。载体的启动子可以是组成型的或诱导型的。而且，表达载体可以包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择标志物，并且可复制表达载体包括复制起点。载体可以自我复制或整合到宿主DNA中。
这种载体可以是质粒载体、粘粒载体或病毒载体，并且优选病毒载体。病毒载体可以是但不限于来源于以下的病毒的载体：人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠白血病病毒(MLV)、禽肉白血病病毒(ASLV)、脾脏坏死病毒(SNV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)或小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒。
在本发明中，OPC可以表达选自由PDGFRα、A2B5、Olig2、Sox10、S100b和ZFP536组成的组中的任一种或多种标志物，并且可以不表达Sox1、Sox2和Pax6标志物。
在另一方面中，本发明涉及用于通过直接重编程由其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子或用Oct4蛋白处理的人体细胞诱导OPC的组合物，所述组合物包括(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)ROCK抑制剂；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)Shh激动剂作为活性成分。
在本发明中，所述组合物可进一步含有钙通道激动剂，并且进一步含有选自由RG108、BIX01294、SP600125、溶血磷脂酸、Bayk8644、毛喉素、地塞米松、EX527和咯利普兰组成的组中的任一种。
在本发明中，TGF-βI型受体抑制剂可以是A83-01，ROCK抑制剂可以是噻唑维林，组蛋白脱乙酰酶抑制剂可以是丙戊酸，Shh激动剂可以是2,6,9-三元取代嘌呤，以及钙通道激动剂可以是毛喉素，但是本发明并不限于此。
在本发明中，OPC可能不表达Sox1、Sox2和Pax6标志物。
在本发明的另一种示例性实施方式中，确认了在生长因子和特定低分子量物质从传统的诱导培养基中除去之后使用含有三碘代-l-甲状腺氨酸(T3)、噻唑维林、毛喉素和LIF的分化培养基诱导的OPC分化成少突胶质细胞。
因此，在另一方面中，本发明涉及将OPC分化成少突胶质细胞的方法，其包括在含有ROCK抑制剂、钙通道激动剂和LIF的培养基中培养通过上述方法制备的OPC。
在本发明中，培养基可以是含有N2、B27、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、抗坏血酸和T3的DMEM，但是本发明并不限于此。
在本发明的OPC已知在大脑中极微量存在的情况下，在构成大脑的神经干细胞中分化率低，因此从上部干细胞建立OPC中存在许多困难。因此，在现有技术中，在进行各种研究以有效地建立OPC的同时，OPC可以通过至少70天的长期分化而建立。
本发明可以在短时间内以高细胞转化率解决这样的问题，因为OPC可以通过直接重编程而在比较短的培养期(例如大约1至2周)内建立，也就是说，没有通过神经干细胞。此外，由于仍然没有关于通过使用人体细胞直接重编程来建立OPC的报道，所以脱髓鞘疾病相关治疗剂预计将在未来的细胞治疗剂市场中有用，并且本发明的低分子量物质预计在治疗神经系统中起关键作用。
脱髓鞘疾病是由于少突胶质细胞的缺乏而发生的难治性神经性疾病，并且在现有技术中，大多数研究集中于通过由胚胎干细胞建立OPC来治疗神经疾病。然而，在建立胚胎干细胞作为治疗剂中存在困难，因为存在道德问题以及免疫排斥限制。因此，通过直接重编程由根据本发明的体细胞建立OPC的方法可以解决道德问题，并且由于没有免疫排斥，所以也可以对建立个性化细胞治疗剂有很大的贡献。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本申请。这些实施例仅用于更全面地描述本申请，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，本申请的范围不限于以下实施例。
实施例1：选择低分子量物质并建立诱导条件
1-1：使用Sox10报告系统选择低分子量物质
本发明人已经建立了能够仅用低分子量物质由小鼠细胞诱导神经干细胞而无需基因引入的条件(KR10-1357402)。因此，为了在先前研究中建立的低分子量物质的基础上建立能够将人体细胞诱导成OPC的新条件，使用Sox10报告系统(Sox10::eGFP)选择低分子量物质，这是已知在少突胶质细胞发育中重要的基因(图1)。
当引入Oct4基因的细胞在重编程培养基(RM：具有高葡萄糖的DMEM+5％敲除血清替代物(KSR)+1％青霉素/链霉素+1％非必需氨基酸+20ng/ml碱性FGF(bFGF)+20ng/ml人重组血小板衍生生长因子(PDGF)+50μg/ml抗坏血酸)中培养诱导后1周，确认了细胞长度更短了，细胞大小通过从间充质向上皮转化(MET)而更小了，从而形成上皮样菌落。将这些细胞在涂有基质胶的培养皿中进行继代培养，并从含有A83-01、噻唑维林、丙戊酸和2,6,9-三元取代嘌呤的培养基中选择，所述培养基是通过另外将影响神经系统发育的表观遗传调节剂(epigenetic modulator)和低分子量物质结合来诱导神经干细胞的低分子量物质的组合(具有高葡萄糖的DMEM+1X N2+1X B27(无维生素A)+1％青霉素/链霉素+1％非必需氨基酸+碱性20ng/ml FGF(bFGF)+20ng/ml人重组血小板衍生生长因子(PDGF)+50μg/ml抗坏血酸+0.5μM A83-01+0.5μM噻唑维林+0.1mM丙戊酸(VPA)+0.5μM2,6,9-三元取代嘌呤)。
将低分子量物质结合的条件如下：
ATVP：0.5μM A83-01+0.5μM噻唑维林+0.1mM丙戊酸(VPA)+0.5μM2,6,9-三元取代嘌呤、RG108：0.5μM RG108、BIX01294：0.25μM BIX01294、SP600125：2μM SP600125、LPA：2μM溶血磷脂酸、Bayk：2μM Bayk8644、Fsk：10μM毛喉素、Dex：1μM地塞米松、EX527：5μM EX527、咯利普兰：2μM咯利普兰。
结果是，FACS分析显示在10μM毛喉素添加条件下Sox10::eGFP表达最高(3.31％)(图3)，实时PCR显示Olig2、NKX2.2和ZFP536(已知为OPC的标志物)有最高的mRNA表达，并且Sox10也在该条件下显现(图4)。
1-2：排除KSR诱导条件的建立
据报道，当实施例1-1的重编程培养基(RM)中所含的敲除血清替代物(KSR)与Oct4过表达一起使用时，有可能进行向神经干细胞的转变。
因此，在排除KSR的条件下诱导OPC以排除由分化诱导的OPC而不是由重编程的结果是，确认了OPC形态出现，并且通过PCR确认了Olig2、Sox10和ZFP536(OPC的标志物)的表达(图5)。
另外，在实施例1-1的诱导条件下逐个除去处理的低分子量物质以选择最佳的低分子量物质组合的结果是，确认了在含有全部低分子量物质的培养基中观察到最高的Sox10表达(图6)。
因此，建立的条件(IM：具有高葡萄糖的DMEM+1X N2+1X B27(不含维生素A)+1％青霉素/链霉素+1％非必需氨基酸+20ng/ml碱性FGF(bFGF)+20ng/ml人重组血小板衍生生长因子(PDGF)+50μg/ml抗坏血酸+0.5μM A83-01+0.5μM噻唑维林+250μM丙戊酸(VPA)+0.5μM2,6,9-三元取代嘌呤+10μM毛喉素)被确定为OPC的诱导条件(图2)。
实施例2：由人体细胞诱导并确认的OPC
因为用作实施例1-1的报告细胞系的Sox10::eGFP成纤维细胞是通过由胚胎干细胞(ES细胞)分化而获得的细胞，所以可能不完全排除成纤维细胞之外的其它干细胞，并且因此它可能不被视为体细胞直接重编程。另外，由于美国的Shengding和Mickie Bhatia研究小组在人体细胞中过表达Oct4后，使用含有KSR的培养基来建立神经干细胞，因此在本实施例中，为了诱导不是通过神经干细胞来源于胚胎的人体细胞(OPC的上部干细胞)直接重编程，不使用含有KSR的重编程培养基(RM)(图7)。
也就是说，将Oct4基因引入BJ细胞，在涂布基质胶的培养皿中继代培养，并在诱导条件(IM)下对实施例1-2中建立的OPC进行培养4天的结果是，观察到具有经历MET的细胞，并在培养7天后，观察到看起来像少突胶质细胞的细胞(图8)。
另外，在培养7天后，为了检查细胞是否是OPC，FACS分析(图9)和免疫组织化学染色(图10)显示OPC的代表性标志物如PDGFRα和A2B5在约10％的细胞中表达，并且实时PCR显示源自去分化干细胞的OPC(例如Olig2、SOX10、S100b的和ZFP536)中表达的标志物在诱导的OPC中表达(图11)。
基于上述结果，建立的细胞被命名为iOPC。
实施例3：OPC向少突胶质细胞的分化
3-1：向少突胶质细胞的分化
为了确认将实施例2中诱导的OPC分化成少突胶质细胞的能力，从常规培养基中除去生长因子，并用分化培养基(具有高葡萄糖的DMEM+1X N2+1X B27(不含维生素A)+1％青霉素/链霉素+1％非必需氨基酸+50μg/ml抗坏血酸+40ng/ml T3(三碘代-1-甲状腺氨酸)+0.5μM噻唑维林+10μM毛喉素+10ng/ml人白血病抑制因子(LIF))替代。
结果显示了少突胶质细胞的典型分支类型形态，实时PCR显示MBP和MAG表达增加(图12)。
此外，由于与大鼠的海马体获得的神经元共培养以确认由分化的少突胶质细胞在体外的髓鞘形成，确认了神经元由分化的少突胶质细胞而髓鞘化(图13)。
3-2：确认体内分化活性和治疗活性
为了确认OPC作为细胞治疗剂的体内分化活性和治疗活性，将实施例2中诱导的OPC移植到多发性硬化症动物模型(实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型(EAE小鼠模型))中。
结果确认了虽然在注射PBS的对照中未显示出髓磷脂，但在iOPC移植组中，观察到与正常小鼠相似的髓磷脂(图14)。换句话说，可以看出，iOPC在体内分化并因此显示出作为细胞治疗剂的功效。
实施例4：通过直接重编程诱导OPC
在本实施例中，为了确认iOPC是通过直接重编程建立，而不是由建立iOPC期间在Oct4过表达后诱导的神经干细胞中分化出来，在诱导7天期间基因表达的变化通过实时PCR确认。
结果确认了已知为神经干细胞的标志物的所有Sox1、Sox2和Pax6在7天内均未表达(图15)。
此外，观察到在诱导的7天期间，通过已知为OPC的生长因子的FGF2和PDGF-AA使细胞增殖，并且FACS分析显示增殖的细胞是显现出PDGFRα和A2B5的细胞(图16)。
因此，基于上述结果，可以证明，在诱导7天期间，iOPC通过直接重编程而不经由神经干细胞建立OPC。
实施例5：由各种人体细胞诱导OPC
为了确认诱导成OPC是否可能在其它人体细胞以及包皮成纤维细胞中进行，将其中过度表达Oct4的五种不同类型的细胞(毛囊真皮乳头、羊膜来源的干细胞、IMR90肺成纤维细胞、真皮成纤维细胞和脂肪衍生的干细胞)诱导成OPC。
结果是，与包皮成纤维细胞一样，通过RT-PCR、免疫组织化学染色和FACS分析确认了作为OPC的代表性标志物的PDGFRα、A2B5和Olig2的表达(图17和18)。
因此，证明了Oct4和低分子量物质的组合是可以应用于各种人体细胞的诱导方法，而不限于BJ细胞的诱导方法。
工业适用性
根据本发明通过用低分子量物质处理Oct4-过表达的人体细胞诱导OPC的方法可以通过直接重编程而不经由神经干细胞在短时间内高效率地建立OPC，因此作为难治性脱髓鞘疾病的细胞治疗剂是有用的。
在上文中，已经详细描述了本发明的具体部分。然而，对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，这样的详细描述仅仅是示例性实施方式，因此本发明的范围不限于此。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求书及其等同物限定。

Claims (19)

1.一种通过直接重编程由人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞的方法，其包括：
在含有以下物质的培养基中培养其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的人体细胞：(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)Rho相关激酶抑制剂(ROCK抑制剂)；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)音猬因子激动剂(Shh激动剂)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基还包含钙通道激动剂。
3.一种通过直接重编程由人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞的方法，其包括：
在含有以下物质的培养基中培养人体细胞：(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)Rho相关激酶抑制剂(ROCK抑制剂)；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)音猬因子激动剂(Shh激动剂)，
其中，在培养之前、期间或之后用Oct4蛋白处理所述人体细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述培养基还包含钙通道激动剂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述培养基还包含选自由RG108、BIX01294、SP600125、溶血磷脂酸、Bayk8644、毛喉素、地塞米松、EX527和咯利普兰组成的组中的任一种。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述TGF-βI型受体抑制剂是A83-01，所述ROCK抑制剂是噻唑维林，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂是丙戊酸，所述Shh激动剂是2,6,9-三元取代嘌呤。
7.根据权利要求2或4所述的方法，其中，所述钙通道激动剂是毛喉素。
8.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述培养基是含有N2、B27、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、bFGF、PDGF和抗坏血酸的DMEM。
9.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述人体细胞选自由包皮成纤维细胞、毛囊真皮乳头、IMR90肺成纤维细胞和真皮成纤维细胞组成的组。
10.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述少突胶质细胞前体细胞表达选自由PDGFRα、A2B5、Olig2、Sox10、S100b和ZFP536组成的组中的任一种或多种标志物。
11.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述少突胶质细胞前体细胞不表达Sox1、Sox2和Pax6标志物。
12.一种用于通过直接重编程由其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的或者用Oct4蛋白处理的人体细胞诱导少突胶质细胞前体细胞的组合物，其包含：
(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)Rho相关激酶抑制剂(ROCK抑制剂)；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)音猬因子激动剂(Shh激动剂)作为活性成分。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，该组合物还包含：
钙通道激动剂。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中，该组合物还包含：
选自由RG108、BIX01294、SP600125、溶血磷脂酸、Bayk8644、毛喉素、地塞米松、EX527和咯利普兰组成的组中的任一种。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述TGF-βI型受体抑制剂是A83-01，所述ROCK抑制剂是噻唑维林，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂是丙戊酸，所述Shh激动剂是2,6,9-三元取代嘌呤。
16.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述钙通道激动剂是毛喉素。
17.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述少突胶质细胞前体细胞不表达Sox1、Sox2和Pax6标志物。
18.一种使少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞的方法，其包括：
在含有Rho相关激酶抑制剂(ROCK抑制剂)、钙通道激动剂和白血病抑制因子(LIF)的培养基中培养通过权利要求1-4中任一项所述的方法制备的少突胶质细胞前体细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述培养基为含有N2、B27、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、抗坏血酸和三碘代-l-甲状腺氨酸(T3)的DMEM。
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