WO2013012269A2 - 전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포의 제조 방법 - Google Patents

전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포의 제조 방법 Download PDF

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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to neural progenitor cells produced by the method and method for producing dendritic glial progenitor cells from pluripotent stem cells.
  • hESCs Human embryonic stem cells
  • ICM inner cell mass
  • hESCs Human embryonic stem cells
  • ICM inner cell mass
  • cardiomyocytes vascular endothelial cells
  • hematopoietic stem cells hepatocytes
  • pancreatic cells pancreatic cells
  • germ cells that make up the human body by controlling external environment.
  • Have 1 This feature is used as an effective tool for treating various intractable diseases and certain cell or tissue damage that is difficult to regenerate.
  • efficient and stable differentiation methods must be established and standardized.
  • spinal cord injury is caused mainly by spinal cord compression in spinal cord by displacement of spine due to trauma.
  • cell pathology At rupture bleeding of blood vessels and necrosis of nerve cells and glial cells occurs.
  • the two effects in the treatment of spinal cord injury are not recognized, there is a limit to the treatment or therapy that is recommended medications and early decompression cycles attempted to reduce the damage to the nerve tissue within 24 hours or 48 hours after the injury.
  • Oligodendrocytes are a type of glial cells in the brain that have the ability to form myelin sheath, which is responsible for enveloping axons of nerve cells in the Central Nervous System. The function is called myelination, and it helps the nerve cell to send the information quickly through the axon without losing it. 6_7 Thus, if the dendritic glial cells are damaged, the myelination that surrounds the axons of neurons fails, causing problems in the transmission of electrical signals through the axons. 8 When spinal cord injury occurs, cell bodies and myelin sheaths of motor neurons in the spinal cord are damaged or cut off, and the oligodendrocytes are lost, causing severe paralysis.
  • oligodendrocytes implanted in spinal cord injury are transplanted at the precursor stage, not at the mature stage.
  • functional recovery is well known by transplanting oligodendrocyte progenitor cells into spinal cord injury
  • a method of differentiating oligodendrocyte progenitor cells from most human embryonic cells that have been reported so far is known as Oligodendrocyte Precursor Cells; Differentiation to 0PC) requires a long period of 3 months, and therefore, many variables that may occur during the differentiation process result in differences in the efficiency of oligodendrocyte progenitor differentiation.
  • the present inventors endeavored to develop a method of producing dendritic glial progenitor cells from pluripotent cells in order to develop cell replacement therapeutics for the treatment of cerebral nervous system disease.
  • the present invention was completed by confirming that A2B5 positive cells, which are neural markers, can be produced more effectively than dendritic progenitor cells than in heterogeneous cell population by using antibodies.
  • Another object of the present invention is to provide a dendritic glial progenitor cell produced by the method of the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a dendritic glial cell differentiated from the dendritic glial progenitor cell isolated by the method of the present invention.
  • Another object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of diseases of the central nervous system comprising the dendritic glial progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preparing Oligodendrocyte Precursor Cells (OPC) from pluripotent stem eel Is comprising the following steps:
  • the present inventors endeavored to develop a method for effectively producing dendritic glial progenitor cells from pluripotent stem cells in order to develop cell replacement therapeutics for the treatment of cerebral nervous system diseases. As a result, it was confirmed that high purity oligodendrocyte progenitor cells can be prepared when cells are prepared using the A2B5 antibody.
  • the omnipotent stem cells into neural rosette to prepare a cell population including the neural precursor cells.
  • the cell population can be prepared in various ways. For example, cell populations which differentiated pluripotent stem cells (eg embryonic stem cells and induced pluripotent cells) into neural rosettes. Even when pluripotent stem cells are differentiated into neural rosettes by neural differentiation, their cell populations are heterogeneous, including a small amount of undifferentiated cells and a heterogeneous population of progenitor cells that do not form the nervous system. Using cells in this state as a cell therapy can be dangerous, and neural progenitor cells must be purely isolated.
  • the pluripotent stem cells are embryonic stem cells, embryonic germ eel is embryonic ic carcinoma eel Is or induced pluri potent stem cells (iPSCs).
  • pluripotent stem cells are embryonic stem cells.
  • the omnipotent stem cells used in the present invention are derived from humans, cows, horses, goats, sheep, dogs, cats, mice, rats or birds, and most preferably human omnipotent stem cells.
  • the cell population is cell population in which pluripotent stem cells are differentiated into neural progenitor cells, and the cell population comprises heterogeneous neural progenitor cells.
  • neural rosette refers to neural stem cells at an early stage of the neural differentiation process of human embryonic stem cells, and neural rosette has a columnar radial form.
  • the neural rosette consists of cells expressing early neuroectodermal markers such as Pax6 and Soxl, and can differentiate into various neuronal cells and glial cells.
  • the 'nerve stem cells' produce the main cells of the nervous system as self-renewal and multipotent cells.
  • the term 'cell population' refers to a cell in which stem cells are differentiated into neural progenitor cells by nerve differentiation stimulation.
  • the 'neural differentiation stimulation' is a method commonly practiced in the art, for example, a serum-free medium (Tropepe V et al., Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammal i an neural stem cell stage acquired through a default mechanism.Neuron. 30: 65-78 (2001)), treatment of morphogens such as fibroblast growth factors (FGFs), Wnt and RACretinoic acid (Ying QL et al. Conversion of embryonic stem eel Is into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.Nat Bio techno J. 21: 183-186 (2003)) may be differentiated by, but is not limited to.
  • morphogens such as fibroblast growth factors (FGFs), Wnt and RACretinoic acid
  • the cell population includes heterogeneous neuroprogenitor cells.
  • an antibody that specifically binds A2B5 to the cell population is contacted.
  • the antibody used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, most preferably a monoclonal antibody.
  • Antibodies to A2B5 can be prepared by methods commonly practiced in the art, such as the fusion method (K) hler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods ( US Pat. No. 4,816,56) or phage antibody library method (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991) General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E.
  • the techniques required for this procedure are well known to those skilled in the art and can be readily implemented:
  • the polyclonal antibodies are injected with the A2B5 antigen into a suitable animal, the antiserum collected from the animal, and then known affinity.
  • Antibodies can be isolated from antisera using the affinity technique.
  • antibody as used to refer to A2B5, is a specific antibody for A2B5, which specifically binds to an A2B5 target protein and includes antigen binding fragments of antibody molecules as well as complete antibody forms.
  • A2B5-positive cells are cultured in dendritic glial cell medium to differentiate into highly purified dendritic glial progenitor cells. Step (c): Isolation of A2B5 Antibody-Bound Cells
  • MACS is used to isolate cells bound to the A2B5 antibody.
  • FACS fluorescence-activated cell sorters
  • MCS magnetic activated cell sorters
  • complement-mediated lysis for the cell separation using antibodies.
  • the method is used, and more preferably, MACS is used.
  • the present invention can be implemented as follows:
  • MACS can be implemented by a direct labeling method and an indirect labeling method.
  • A2B5 antibodies bound to magnetic particles are bound to undifferentiated pluripotent stem cells, and then applied to magnetic separators to undifferentiated pluripotent stem cells bound to A2B5 antibodies. Disconnect.
  • an A2B5 antibody conjugated with a suitable mediator is bound to undifferentiated omnipotent stem cells.
  • A2B5 antibody conjugated with fluorescent material is bound to undifferentiated pluripotent stem cells.
  • the mediators include strapavividin, antibodies and avidin having specificity for the Fc region of the A2B5 antibody.
  • the A2B5 antibody in which the mediator is bound is bound to the undifferentiated pluripotent stem cells, and then the antibody is bound to the magnetic particles and treated with the antibody having specificity to the mediator. Then, it is applied to a magnetic separator to separate undifferentiated omnipotent stem cells to which the A2B5 antibody is bound.
  • MACS is basically based on an immunomagnetic separation process, the general contents of which are disclosed in US Pat. Nos. 5,385,707, 5,541,072, 5,646,001, 6,008,002 and 6,153,411. Magnetic particles or microbeads and separators are readily available from MiUenyi Biotech (Germany).
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • a fluorescently labeled A2B5 antibody is bound to undifferentiated pluripotent stem cells, followed by binding of a magnetic particle (or magnetic microbead) to which the antibody specific for the fluorophore is bound, and then using a separator to undifferentiated omnipotent Isolate stem cells.
  • the fluorescent materials bound to the A2B5 antibody may be different materials or the same materials, respectively.
  • Available phosphors include, but are not limited to, fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), eosin, carboxyfluorescein, fluorescein amarite, rose bengal, dilight fluorine, methyline blue, coumarin and rhodamine .
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • eosin carboxyfluorescein
  • fluorescein amarite rose bengal
  • dilight fluorine methyline blue
  • coumarin and rhodamine available phosphors
  • steps (b) and (c) are performed according to MACS.
  • A2B5-positive cells isolated by the method of the present invention are cultured in dendritic glial differentiation medium.
  • the composition of the differentiation medium depends on the embodiment.
  • the A2B5 positive cells exhibit at least 80% oligodendrocyte progenitor purity.
  • the dendritic glial progenitor cells isolated by the method of the present invention exhibit a bipolar or tripolar cell shape.
  • the dendritic glial progenitor cells isolated by the above method are dendritic glial progenitor cells isolated by the above method.
  • PDGFRa Sox family (Sox 8, Sox 9 and Sox 10), NG2, Oligl and 01ig2 are overexpressed.
  • the term 'overexpression' is confirmed by Western blot, the degree of detection of the translated protein after transcription in the gene is compared with the control group through the antibody-antigen reaction, indicating that the intensity of the band is high.
  • mRNA transcribed from the gene is reverse transcribed into cDNA, and the intensity of the band after PCR is shown to be higher than the control group.
  • differentiated in dendritic glial differentiation medium through partial quantitative PCR Overexpression of PDGFRa, Sox family (Sox 8, Sox 9 and Sox 10), NG2, Oligl and 01ig2 was confirmed in the cells.
  • the present invention provides a oligodendrocyte progenitor cell produced by the above-described production method of the present invention.
  • the present invention provides a dendritic glial cell differentiated from the rare oligodendrocyte progenitor cells produced by the present invention described above.
  • a composition for the prevention or treatment of central nervous system diseases comprising oligodendrocyte progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells of the present invention as an active ingredient.
  • the central nervous system disease treated by the composition of the present invention is a central nervous system disease resulting from physical, metabolic, toxic, chemical or immunological damage of the central nervous system, preferably atrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, Alzheimer's disease, traumatic Brain injury, stroke, ischemic brain disease, reversible or metabolic encephalopathy including hepatic encephalopathy and hypoxia, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including but not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophony, colophon, colophon, colophon, colophon, colophon, colophon, colophon, colophon, colophon,
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction response to the patient. Can be. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are 10 2 -10 10 cells per serving on an adult basis.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion of an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the dendritic glial progenitor cells are rare oligodendrocyte progenitor cells produced by the production method of the present invention.
  • the spinal glial progenitor cells of the present invention can provide a composition for the prevention and treatment of central nervous system diseases.
  • La shows the experimental schedule for inducing differentiation from human embryonic stem cells to neuronal progenitor cells. Briefly, the embryonic body treated with dorsomorphin and SB431542 at the same time, attached to the bottom of the matrigel-coated culture plate on the 4th day, incubated for 5 days in N2 medium and microscopically on the 9th day, the typical flower neuron rosette of the neural progenitor cells ( Neural rosette) was separated by a glass pipette, reattached to a matrigel-coated culture dish, and cultured for 7 days in a medium crystallized with glial cells.
  • Neural rosette typical flower neuron rosette of the neural progenitor cells
  • Figure 2 shows the results of cell characterization that differentiates from human embryonic stem cells to neural progenitor cells.
  • Figure 2a shows the results of confirming the expression of RNA in partial quantitative PCR.
  • the neuronal progenitor markers Pax6, Soxl, and Nestin were not expressed in human embryonic stem cells. Shows Western blot results confirmed that the expression.
  • 2b confirmed the expression of undifferentiated markers Oc and SSEA4 in human embryonic stem cells, and the expression of Soxl and Pax6, which are neuronal progenitor cell-specific markers.
  • the results of immunofluorescence staining confirmed the cells expressing A2B5 in GRKGlial-Restricted Precursor after proliferation of neural progenitor cells.
  • FIG. 3 shows the results of high purity analysis of A2B5-positive cells isolated by magnetic-activated cell sorting (MACS).
  • FIG. 3A shows the analysis of cells before and after the MACS (blue graph) and fluorescence blue graph with FACS, and the graph after the MACS shifted to the right more than before, that is, the fluorescence intensity was stronger, and the A2B5 positive cells It was confirmed that the separation of 983 ⁇ 4 high efficiency. It is the result of repeating three times and has a significant value.
  • Figure 3b shows the result of confirming the cell shape under the microscope by attaching cells before MACS (A2B5 positive cells and negative cells), MACS A2B5 negative cells and positive cells in a Matrigel coated culture dish. Negative cells scatter and grow in broad cell shapes, while positive cells grow and grow bipolar. This is the result of checking the same cell shape every time.
  • FIG. 4 shows the results confirming that there are no undifferentiated cells in the process of differentiation from embryonic stem cells to dendritic glial progenitor cells.
  • Embryonic stem cell neural progenitors and cell oligodendrocyte progenitor cells were identified through the immunostaining method of 0ct4 and Nanog.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the dendritic glial progenitor cell characteristics.
  • FIG. 5A shows the results of confirming that the dendritic glial progenitor cells were changed into typical bipolar / tripolar cells.
  • Figure 5b shows the results of immunofluorescence staining confirmed that the expression of markers A2B5, PDGFRa and NG2 specific to the dendritic glial progenitor cell surface. It was confirmed that -84% of the cells expressing PDGFRa and NG2. 6 shows proliferation of dendritic glial progenitor cells.
  • Figure 6a is a nuclear stained (DAPI) to confirm cell proliferation at 2 or 4 days treated with neuregulin (Neuregulin) as a proliferation signal, activated type expressed in the dying cells to examine cell survival Caspase 3 (cleaved_caspase3) was confirmed by immunofluorescence staining.
  • DAPI nuclear stained
  • Figure 6b is a comparison of RNA expression of PDGFRa, Sox family (8, 9, 10), NG2, Oligl and 01ig2 specific markers in partial quantitative PCR to confirm the proliferation of dendritic glial progenitor cells, It was confirmed that the cells were highly expressed after (Neuregulin) treatment.
  • Figure 7 shows that the dendritic glial progenitor cells are implanted in the spinal cord injury model and play a role in recovery of function.
  • Spinal cord injury-rats are almost paralyzed from hind limb motor function right after injury, but over time Some functions were restored and the BBB score was about 6-7 points.
  • one group was implanted with dendritic glial progenitor cells in the other group with the same amount of DPBS.
  • the behavioral test score increased slightly after transplantation, and the behavioral test score was around 9 points after 2 weeks, and the score lasted more than 8 weeks.
  • hESC colonies were isolated from the feeder cell layer to form embryoid bodies (EB), including ESC culture medium without bFGF. Moved to the Petri dish. During the formation of EB, 5 ⁇
  • DM docosaminomorphin
  • SB431 54 2 Calbiochem, San Diego, CA, USA
  • EB was then coated with Matrigel (Matrigel, BD bioscience, Maryland, USA) containing serum-free neurodifferentiation medium (N2 medium; DMEM / F12 plus 1XN2 additive, Invitrogen, USA) supplemented with 20 ng / m £ bFGF. Attached to a 35 mm culture dish and further incubated for 5-6 days.
  • a clear neural rosette structure is formed, which is physically separated using a pasteur pipette, which is thinly drawn on an anatomical microscope. After crushing, use a 200p pipette to grind them into small fish and attach them again to a Matrigel-coated 60 mm dish in N2B27 medium (DMEM / F12 supplemented with 1XN2 and 1XB27 supplement and 20 ng / ml bFGF). Further incubation for one week. Isolation of A2B5-positive Cells by Magnetic Immune Separation (MAC)
  • Neuroprogenitor cell proliferation medium N2B27, bFGF and EGF addition medium
  • 10 ⁇ M of ⁇ 27632 (Calbiochem, USA) for about an hour and washed with PBS (phosphate buffered saline), followed by AccutaseCMilipore, Messachusetts) was treated in an incubator (37 ° C.) for about 15 minutes to make complete single cells.
  • A2B5 positive cells were then isolated using anti-A2B5-microbeads (Milteny, Cat # 130-093-388) by MACS cell separation kit (Milteny, Bergisch Gladbach, Germany) by the manufacturer's manual.
  • signals added during development were added and processed.
  • the signals are recombinant human PDGF-MU0 ng / ml, Peprotechinc); Recombinant human IGF-1 (10 ng / ml, Peprotechinc); Forskolin (5 uM, Sigma); SHH (100 ng / ml, R &D); NAC (60 ug / ml, Sigma); Recombinant human NRGl-betal / HRG-betal extracellular wholesaler (200 ng / ml, R & D System).
  • the cultured cells were completely separated into single cells with Accutase, and then washed once with PBS, and then blocked with PBS containing 5% BSACbovine serum albumin) for 10 minutes at 4 ° C. After reaction with anti-A2B5 antibody (Milipore, 1: 100) at 4 ° C for 10 minutes, washed twice with PBS and then Alexa secondary antibody (Molecular Probe, Eugene, OR, USA) in 5% BSA-PBS After reaction at 4 ° C for 10 minutes, washed twice with the same method, and then prepared a cell suspension with PBS 250-300 ⁇ and analyzed by FACS CaliberCBD bioscience and its analysis program. Immunostaining and Quantitative Analysis
  • DAPI 4-6-diamidino-2-phenyl indole, Vector, Burlingame, CA, USA
  • Cell images were observed with an Olympus 1 ⁇ 71 microscope and DP71 digital camera and analyzed with Image-Pro Plus ver 5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).
  • To detect markers expressing at the cell surface cells were fixed using 4% para-formaldehyde-PBS for 30 minutes. After blocking with 5% donkey serum (Calbiochem, CA, USA) or 2% BSA for 1 hour at room temperature, the reaction was repeated for 12 hours with primary antibody at 41:.
  • RNAs in the cells were extracted using the Easy-Spin total RNA purification kit (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea), and then 1 fig using the iScriptcDNA synthesis kit (BioRad, Hercules, CA, USA). RNAs were reverse transcribed. PCR reactions were performed in a 2700 Master Cycler (Appl ied Biosystems, USA) using an EmeraldAmp GT PCR master mix (Takara Bio Inc, Shiga, Japan). Finished samples were analyzed by electrophoresis on 1.5% agarose gel and gel Doc system (Bio Rad) via Ethidium Bromide staining. DNA fragments amplified by US) were analyzed. All data were finally confirmed by at least three independent experiments, and the sequences and conditions of the primers used are shown in Table 1.
  • human embryonic stem cells H9 were cultured on STO feeders composed of mouse embryonic fibroblasts and strongly expressed undifferentiated markers 0ct4 and SSEA4 (FIGS. Lb and 2b).
  • 9 Human embryonic stem cells are isolated from supporting cells through collagenase enzyme treatment to form embryoid bodies (Fig. Lb) and dorsomorphin and SB431542 for 3-4 days to inhibit BMP and Activin / Nodal signals. After further promoting induction of differentiation into neural progenitor cells, they were allowed to adhere to a Matrigel coated culture dish and then serum-free neuronal differentiation medium supplemented with basic-fibroblast growth factor (bFGF) and inslin for 5-6 days.
  • bFGF basic-fibroblast growth factor
  • N2 medium the composition is described in Example 'Induction of neural progenitor cell differentiation of human pluripotent stem cells'
  • the structure of the neural rosette (neural rosette) form in the center of the colony (Fig. Lb) . 10
  • This structure strongly expressed Pax6 and Soxl, which are neuronal progenitor cell-specific markers (FIG. 2B).
  • A2B5 a specific marker
  • Neuronal progenitor cells and glial cells are proliferated by bFGF and EGF, in which A2B5 positive cells are present.
  • the cells expressing A2B5 are expressed on the cell surface at an early stage even in the dendritic glial progenitor stage.
  • MACS method Using the features expressed on the cell surface, only A2B5 positive cells were isolated by MACS method. In other words, A2B5 negative cells were isolated, and these cells are more likely to differentiate into unwanted cells in this study, and are highly likely to form tumors during cell transplantation for cell therapy. Is very important. In order to selectively separate only cells required for this study, only A2B5 positive cells were selectively isolated by MACS method using A2B5 antibody with magnetic beads.
  • the MACS method is generally much less damaging to cells compared to Fluorescence-activated cell sorting (FACS), and it is very cost effective to separate unwanted or unwanted cells with efficiency similar to FACS. Can pay There is an advantage. Briefly, the process of amplifying neuronal progenitor cells in N2B27 medium for one week into an enzymatic treatment called Accutase, reacting with A2B5-specific antibodies bound with magnetic beads, and extracting only filtered cells to be. The A2B5 positive cells extracted after MACS were attached to the bottom of the matrigel-coated culture dish and cultured in 0PC-1 medium to show typical shapes of dendritic glial progenitor cells and adjacent cells gathered together (FIG. 3b).
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • A2B5 negative cells it was confirmed that they were grown as single cells (FIG. 3B).
  • A2B5-specific antibodies were reacted with neural progenitor cells before MACS and neural progenitor cells after MACS to determine how efficiently A2B5-positive cells were filtered after before MACS.
  • the wavelength (FL-1 intensity) was shown to be greater in the graph, confirming that the positive neural precursor cells with strong A2B5 expression were filtered (FIG. 3A).
  • pure population can be obtained by selectively separating only A2B5 positive cells through MACS from differentiation-induced neuronal progenitor cells through inhibition of BMP and Activin / Nodal signaling mechanisms from human embryonic stem cells.
  • progenitor cells When differentiated into progenitor cells, high yield of differentiation was expected.
  • oligodendrocyte progenitor cells that can be used to treat diseased cells, such as differentiation and proliferation of spinal cord injury. The factors necessary for the differentiation and survival and the markers suitable for tracking the differentiation process were recruited and tested based on these factors.
  • Dendritic glial progenitor cells begin to develop under the influence of Sonic hedgehog homolog (SHH) signals in the subventricular zone (SVZ) during development, and from other surrounding cells, for example, astrocytes. ) And differentiation, proliferation, and survival by receiving signals such as PDGF P late let-derived growth factor), IGF ⁇ Klnsul in ⁇ 1 ike growth factor 1), and neuregulin. 16 These cells are divided into two bipolar cells in a circular cell body in differentiation. There are markers such as A2B5, PDGF, and NG2 that are specifically expressed at that stage, with three tripolar stretches of specific cell shapes. By analyzing the characteristics of the cells and confirmed that the differentiation. 17
  • A2B5 positive cells isolated purely by the MACS method were attached to the bottom of the matrigel-coated petri dish in an appropriate number of about 2 ⁇ 10 6 in a 35 mm culture dish, followed by 5 days in 0PC-1 medium and then in 0PC-2 medium. Incubated for 4 days.
  • Mitogen is a substance that acts to stimulate mitosis by stimulating upon differentiation into specific cells.
  • mitogens of PDGF-A, IGF and SHH, and forskolin and NAC (N- Acetyl-Cysteine) required for survival are added.
  • A2B5 positive cells cultured for 5 days in 0PO1 medium showed bipolar or tripolar cells and stained all A2B5, PDGFRa, and NG2 which were specifically expressed at this cell stage by immunostaining. This was confirmed (Fig. 5A-B).
  • RG Neuroregulin
  • RNA transcript When the amount of RNA transcript was confirmed by RT-PCR, the markers expressed in oligodendrocyte progenitor cells, PDGFRa, Sox fami 1 ies (8/9/10), NG2, and 01igl / 2, were expressed higher. (FIG. 6B).
  • the oligodendrocyte progenitor cells thus produced were found to be stored in liquid nitrogen using normal cell pulsation techniques and maintained in the same state even after thawing.The stored cells were then released and multiplied as needed, followed by spinal cord injury and Can be ported to the same model. Dendritic Glia Progenitor Cell Transplantation in a Spine Injured Rat Model
  • mice modeled only Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (GIBC0, USA), the other group mixed the dendritic progenitor cells (500, 000 cells) in DPBS and crushed the gerorans , Republic of Korea), and re-exposed the damaged spinal cord and blown it directly into the mouth using a thinly drawn glass tube in the spinal cord augmentation to prevent the transplanted cells from dying due to an immune response in a rat model.
  • the immune rejection reaction inhibitor cyclosporin, N0VARTIS, Switzerland
  • weekly BBB experiment was performed for 8 weeks from the day of transplantation to see the functional recovery.
  • the behavioral test score increased slightly after transplantation, and the behavioral test score was about 9 points after 2 weeks.

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Abstract

본 발명은 전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포의 제조 방법 및 방법에 의해 제조된 신경전구세포에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, (a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 얻는 단계; (b) 상기 세포 파퓰레이션에 A2B5에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계; (c) 상기 A2B5에 대한 항체가 결합된 A2B5 양성 세포를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 A2B5 양성 세포를 희소돌기아교 전구세포로 분화하는 단계에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존의 방법과 비교하여 효율적이고 안정된 희소돌기아교 전구세포의 제조 방법을 확립하고 표준화 할 수 있으며, 분화과정을 추적하기에 적합한 표지인자제공 할 수 있다. 또한, 분화 과정 중에 생길 수 있는 변수에 의한 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점을 극복할 수 있으며, 분화과정을 단축하여 보다 고순도 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭]
전능성 줄기세포로부터 회소돌기아교 전구세포의 제조 방법 【기술분야】
본 발명은 전능성 줄기세포로부터 회소돌기아교 전구세포의 제조 방법 및 방법에 의해 제조된 신경전구세포에 관한 것이다.
【배경기술】
인간 배아줄기세포 (Human embryonic stem cells, hESC)는 착상 전 배아의 배반포의 내부세포괴 (inner cell mass, ICM)로부터 확립된 세포로서 특정 배양 조건에서 미분화 상태로 자가증식 (self-renewal)을 하는 특징을 가지며， 적절한 외부환경의 조절에 의해 인체를 구성하는 다양한 종류의 세포-신경계세포， 심근세포， 혈관내피 세포, 조혈모세포， 간세포, 췌장세포 및 생식세포 등 거의 모든 세포로 분화가 가능한 전분화능을 갖는다 .1 이런 특징은 각종 난치성질환 및 재생이 어려운 특정 세포나 조직손상을 치료하기 위한 효과적인 도구로 사용되어진다. 배아줄기세포를 세포치료에 이용될 특정세포로 생산하기 위해서는 효율적이고 안정된 분화방법을 확립하고 표준화해야 한다. 이를 위해 배아줄기 세포의 분화유도 및 억제인자， 그리고 분화과정을 추적하기에 적합한 분화단계별 표지인자들의 발굴이 무엇보다 중요하며, 이를 기반으로 한 분화방법이 개발되어야 한다. 즐기세포를 이용한 세포치료의 가능성이 높은 질병 중에서 특히, 척수손상은 주로 외상에 의한 척추의 변위에 의하여 척수가 척수강 내에서 압박되면서 발생하는데， 세포병리 (cellular pathology)적 측면에서 보면, 손상부위 주위에 혈관의 파열 출혈 그리고 신경세포와 교세포의 괴사가 일어난다.2 현재 척수 손상의 치료에 효과가 인정된 것은 손상 후 24 시간 또는 48 시간 이내에 신경조직의 손상을 줄여주기 위하여 시도 되는 약물치료와 조기 감압술이 권장되는 치료 방법이나 치료 효과에 한계가 존재한다. 따라서 최근에는 이미 손상된 신경 조직의 재생 혹은 복구를 시도하는 치료들에 대한 연구가 매우 활발하게 진행되고 있으며， 전분화능을 갖는 줄기세포를 이식하여 손상된 신경 및 각종 교세포를 대치하거나 축색의 재생을 유도하는 치료법들에 대한 관심이 높아지고 있고， 이미 척수 손상 동물 모델에서 기능적 회복을 유도 할 수 있다는 연구 결과들이 발표되어 그 치료 가능성을 인정받고 있다.3_5
회소돌기아교세포 (oligodendrocyte)는 뇌에 있는 교세포의 한 종류이며， 수초 (myelin sheath)를 형성하는 능력이 있어 중추신경계 (Central Nervous System)에서 신경세포의 축삭 (axons)을 감싸는 기능을 하는데, 이러한 기능을 마이엘린화 (myelination)라 하며， 신경세포에서 축삭을 통하여 전기적으로 보내는 정보를 잃지 않고 빠르게 보낼 수 있도록 도와주는 역할을 한다.6_7 따라서 회소돌기아교세포가 손상되면 신경세포의 축삭을 감싸는 마이엘린화 (myelination)를 하지 못하여 축삭을 통한 전기신호의 전달에 문제가 발생하게 된다.8 척수 손상이 발생하면， 척수 내 운동 신경의 세포체 및 수초가 손상 혹은 절단됨은 물론 회소돌기아교세포까지 소실이 되어 심각한 마비 증상이 나타나게 된다. 하지만 최근 연구결과에 따르면 척수 손상 후에도 절단되지 않고 남아 있는 운동신경의 축삭 (하지만 수초는 손상을 받은 상태)에 회소돌기아교세포의 이식을 통한 마이엘린화를 시켜주면 기능적 회복을 유도 할 수 있다는 연구 결과들이 발표되었다. 따라서 줄기세포로부터 분화된 회소돌기아교세포 혹은 그 전구체의 이식은 척수손상 치료를 위한 중요한 수단으로 인식되고 있다.
다른 뇌신경계 질환 치료에 이식되는 세포들과 마찬가지로 척수 손상에 이식되는 희소돌기아교세포 역시 완전히 성숙한 단계의 세포가 아닌 전구체 단계에서 이식을 진행하게 된다. 이미 척수 손상에 희소돌기아교 전구세포를 이식하여서 기능적인 회복은 잘 알려져 있으나, 이제까지 보고된 대부분의 인간 배아즐기세포로부터 희소돌기아교 전구세포로 분화시키는 방법은 회소돌기아교 전구세포 (Oligodendrocyte Precursor Cells; 0PC)로 분화를 시키는데 3 개월이라는 긴 기간을 필요로 하며, 따라서 분화과정 중에 일어날 수 있는 많은 변수들에 의해 희소돌기아교 전구세포의 분화효율에 차이가 생기게 된다. 따라서 일정한 효과를 기대하기 힘들며， 분화과정 중에 자연 분화하여 발생 할 수 있는 특성을 알 수 없는 세포로 인하여 종양 혹은 비정상적 세포구조물이 생길 수 있다. 그래서 본 연구는 기존 연구의 단점 (분화기간 및 일정한 분화효율)을 보완하고 임상에 실제 이용될 수 있는 회소돌기아교 전구세포를 보편적이고 효과적으로 그리고 빠른 기간 내에 생산해내고자 하였다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 뇌신경계 질환 치료를 위한 세포 대체 치료제를 개발하기 위해 전능성 즐기세포로부터 회소돌기아교 전구세포의 제조 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 항체를 이용하여 신경 마커인 A2B5 양성세포를 분리하는 경우에 비균질 세포 파풀레이션에서보다 회소돌기아교 전구세포를 매우 효과적으로 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 제조된 회소돌기아교 전구세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 분리된 회소돌기아교 전구세포로부터 분화된 회소돌기아교세포을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 전능성 줄기세포로부터 분화된 회소돌기아교 전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 전능성 줄기세포 (pluripotent stem eel Is)로부터 회소돌기아교 전구세포 (Oligodendrocyte Precursor Cells: OPC)의 제조 방법을 제공한다:
(a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트 (neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파풀레이션을 얻는 단계;
(b) 상기 세포 파풀레이션에 A2B5 에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;
(c) 상기 A2B5항체가 결합된 A2B5 양성 세포를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 A2B5 양성 세포를 회소돌기아교 전구세포로 분화하는 단계. 본 발명자들은 뇌신경계 질환의 치료를 위한 세포 대체 치료제를 개발하기 위하여 전능성 줄기세포로부터 회소돌기아교 전구세포를 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， A2B5 항체를 이용하여 세포를 제조하는 경우에 고순도의 희소돌기아교 전구세포를 제조할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 전능성 줄기세포로부터 회소돌기아교 전구세포의 제조 방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다: 단계 (a): 세포 파풀레이션의 준비
본 발명에 따르면， 전능성 줄기세포를 신경 로제트로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파풀레이션을 준비한다.
상기 세포 파풀레이션은 다양하게 준비될 수 있다. 예를 들어, 전능성 줄기세포 (예컨대, 배아줄기세포 및 유도 전능즐기세포)를 신경 로제트로 분화시킨 세포 파풀레이션이다. 전능성 줄기세포를 신경분화법에 의해 신경 로제트로 분화시켰다고 하여도 그 세포 파풀레이션은 소량의 미분화세포를 포함한, 신경계 및 신경계를 이루지 않는 여러 종류의 전구세포들로 구성된 비균질 파풀레이션을 이룬다. 이 상태의 세포를 세포 치료제로 이용하는 것은 위험할 수 있으며， 따라서 신경전구세포를 순수하게 분리해야 한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면， 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 배아생식세포 (embryonic germ eel Is) 배아종양세포 ( embryon i c carcinoma eel Is) 또는 유도전능줄기세포 (induced pluri potent stem cells: iPSCs)이다.
바람직하게는 전능성 줄기세포는 배아줄기세포이다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 전능성 줄기세포는 인간， 소， 말， 염소， 양， 개， 고양이， 마우스， 래트 또는 조류로부터 유래된 것이고， 가장 바람직하게는 인간 전능성 줄기세포이다.
보다 더 바람직하게는， 상기 세포 파풀레이션은 전능성 줄기세포는 신경전구세포로 분화시킨 세포 파풀레이션이며, 상기 세포 파풀레이션은 비균질 신경전구세포를 포함한다.
본 명세서의 용어 '신경 로제트' 는 인간 배아줄기세포의 신경분화 과정의 초기단계의 신경줄기세포를 말하며， 신경 로제트 (neural rosette)는 원주형의 방사상 형태를 갖는다. 상기 신경 로제트는 Pax6 및 Soxl 같은 초기 신경외배엽 (neuroectodermal) 마커를 발현하는 세포로 구성되며, 다양한 뉴우론 세포 및 신경교세포로 분화할 수 있다.
상기 '신경줄기세포' 는 자기재생능 및 다분화능 세포로 신경계의 주된 세포를 생산한다.
본 명세서의 용어 '세포 파풀레이션' 은 줄기세포가 신경 분화 자극에 의해 신경전구세포로 분화가 진행된 세포이다.
상기 '신경 분화 자극' 은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들， 예를 들어 , 무혈청 배지 (Tropepe V et al. , Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammal i an neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron. 30:65- 78(2001))， FGFs( fibroblast growth factors), Wnt 및 RACretinoic acid)와 같은 모르포겐 (morphogens)의 처리 (Ying QL et al. Conversion of embryonic stem eel Is into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Bio techno J. 21: 183- 186(2003))에 의해 분화 할 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
바람직하게는， 상기 세포 파풀레이션은 비균질 신경전구세포를 포함한다. 단계 (b): 세포 파풀레이션에 A2B5 항체의 접촉
이어, 상기 세포 파풀레이션에 A2B5 특이적으로 결합하는 항체를 접촉한다.
보다 바람직하게는， 본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며， 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
A2B5 에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융¾" 방법 (K)hler and Mi lstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976))， 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 (Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol. , 222:58， 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D. , Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999； Zola, H. , Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984； 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wi ley /Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며 , 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체 -생산 림프구와 융합시켜 이루어지며， 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 A2B5 항원을 적합한 동물에게 주사하고， 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성 (affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서， A2B5 를 언급하면서 사용되는 용어 "항체" 는 A2B5에 대한 특이 항체로서， A2B5 타깃 단백질에 대해 특이적으로 결합하며， 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면， A2B5 양성 세포를 회소돌기아교세포 배지에서 배양하면 고순도의 회소돌기아교 전구세포로 분화하게 된다. 단계 (c): A2B5 항체가 결합된 세포의 분리
상기 A2B5 항체가 결합된 세포를 분리하기 위해 MACS를 이용한다 . 바람직하게는， 항체를 이용한 상기 세포 분리를 위해 형광- 활성세포분류기 (fluorescence一 activating cell sorters: FACS) , 자성활성세포분류기 (magnetic activated cell sorter: MACS) 및 보체 매개성 용해 (complement -mediated lysis) 방법을 이용하며， 보다 바람직하게는 MACS를 이용하여 실시한다 .
만일, 본 발명을 MACS를 이용하여 실시하는 경우， 본 발명은 다음과 같이 실시할 수 있다:
본 발명에서 MACS 는 직접적 표지방법 및 간접적 표지방법으로 실시할 수 있다.
예를 들어, 직접적 표지방법에 따라 MACS 를 실시하는 경우， 자성입자에 결합된 A2B5 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 자성을 갖는 분리기 (separator)에 적용하여 A2B5 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다.
예를 들어， 간접적 표지방법에 따라 MACS 를 실시하는 경우， 적합한 중개물질이 결합된 A2B5 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 예컨대， 형광물질이 결합된 A2B5 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 형광물질 이외에도， 중개물질은 스트랩타비딘， A2B5 항체의 Fc 부위에 특이성을 갖는 항체 및 아비딘을 포함한다. 중개물질이 결합된 A2B5 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨 다음， 자성입자에 결합되어 있고 상기 증개물질에 특이성을 갖는 항체를 처리한다. 그런 다음, 자성을 갖는 분리기 (separator)에 적용하여 A2B5 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다.
MACS 는 기본적으로 면역자기 분리 과정에 따른 것으로서， 상기 과정의 일반적인 내용은 미합중국 특허 제 5,385,707호， 제 5,541,072호， 제 5,646,001 호, 제 6，008，002 호 및 제 6,153,411 호에 개시되어 있으며, 이용되는 자성 입자 또는 마이크로비드 및 분리기는 MiUenyi Biotech (독일연방국)에서 용이하게 구입할수 있다.
본 발명은 FACS를 이용하여 실시할 수 있다. FACS는 Flow Cytometry First Principles by Alice Longobardi Givan. ISBN 0471382248 및 Practical Flow Cytometry by Howard M. Shapiro. ISBN 0471411256 에 개시된 방법에 따라 실시할 수 있다. 보다 더 바람직하게는 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 MACS 에 의해 실시한다. 보다 더욱 더 바람직하게는 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 간접적 표지를 이용하는 MACS에 의해 실시한다.
예를 들어, 형광물질로 표지된 A2B5 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 상기 형광물질에 특이적인 항체가 결합된 자성입자 (또는 자성 마이크로비드)를 결합시키고， 그런 다음 분리기를 이용하여 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다. 이 경우, 상기 A2B5 항체에 결합된 형광물질은 각각 다른 물질 또는 동일한 물질일 수 있다.
이용 가능한 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate) , PE(phycoerythrin), 에오신, 카르복시플루오르세인， 플루오르세인 아마이다이트， 로즈 벤갈, 다이라이트 플루오르， 메틸린 블루， 쿠마린 및 로다민을 포함하지만 이에 한정된 것은 아니다.
바람직하게는， 상기 단계 (b) 및 (c)는 MACS에 따라 실시한다. 단계 (d): A2B5 양성 세포의 희소돌기아교 전구세포로의 분화
본 발명의 방법에 의해 분리된 A2B5 양성 세포를 회소돌기아교세포 분화배지에 배양한다. 분화배지의 조성은 실시 예에 따른다.
바람직하게는， 상기 A2B5 양성 세포는 80% 이상의 희소돌기아교 전구세포 순수도 (purity)를 나타낸다.
바람직하게는， 본 발명의 방법으로 분리한 회소돌기아교 전구세포는 양극 또는 3극의 세포모양을 나타낸다.
바람직하게는， 상기 방법으로 분리한 회소돌기아교 전구세포는
PDGFRa, Sox 패밀리 (Sox 8， Sox 9 및 Sox 10), NG2, Oligl 및 01ig2 를 과발현 한다.
본 명세서에서， 용어 '과발현' 은 웨스턴 블럿을 통해 확인할 경우， 유전자에서 전사 후 번역된 단백질의 검출 정도를 항체 -항원 반웅을 통해 대조군과 비교하여 밴드의 인텐시티가 높게 나타난 것을 말한다. 또한 부분정량적 PCR 을 통해 확인할 경우， 유전자에서 전사된 mRNA 를 cDNA 로 역전사하여 PCR 을 수행한 후 나타나는 밴드의 인텐시티로 대조군에 비해 높은 결과를 나타내는 것을 말한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면， 부분정량적 PCR 을 통해 회소돌기아교세포 분화배지에서 분화된 세포에서 PDGFRa, Sox 패밀리 (Sox 8, Sox 9 및 Sox 10), NG2, Oligl 및 01ig2의 과발현을 확인하였다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 희소돌기아교 전구세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명에 의해 제조된 희소돌기아교 전구세포로부터 분화된 회소돌기아교세포를 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 전능성 줄기세포로부터 분화된 희소돌기아교 전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 예방또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 의해 치료되는 중추신경계 질환은 물리적, 대사적， 독성， 화학적 또는 면역학적인 중추신경계의 손상으로부터 유래한 중추신경계 질환이며, 바람직하게는 근위축성측생경화증， 다발성경화증, 알츠하이머병, 외상성 뇌손상， 뇌졸중， 허혈성 뇌질환， 간성 뇌증 및 저산소증을 포함하는 가역성 또는 대사성 뇌병증 등을 포함하나， 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스, 덱스트로스， 수크로스， 솔비를, 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘, 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈, 셀를로스, 물， 시럽， 메틸 샐를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제, 감미제, 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다, 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식, 가장 바람직하게는 척수내 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식， 환자의 연령， 체중, 성, 병적 상태, 음식， 투여 시간， 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1 회 당 102-1010 세포이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질증의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제， 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 회소돌기아교 전구세포는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 희소돌기아교 전구세포다.
【유리한 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 효율적이고 안정된 희소돌기아교 전구세포의 제조 방법을 확립하고 표준화 할 수 있다.
(b) 분화과정을 추적하기에 적합한 표지인자제공 할 수 있다.
(c) 분화 과정 중에 생길 수 있는 변수에 의한 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점을 극복할 수 있다.
(d) 기존의 방법과 비교하여 분화과정을 단축할 수 있으며 보다 순수한 분리방법을 제공할 수 있다.
(e) 미분화 세포 및 비신경계 세포들이 세포 분리과정 중에 제거됨으로써 종양 생성의 위험성을 줄일 수 있다.
(f) 본 발명의 제조된 회소돌기아교 전구세포는 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1 은 인간 배아 줄기세포로부터 희소돌기아교 전구세포를 고효율로 분화시키는 방법을 나타낸다. 도 la 는 인간 배아 줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화를 유도하기 위한 실험 스케줄을 보여준다. 간단히 설명하면 배아체에 dorsomorphin 및 SB431542를 동시에 처리한 후 4 일째에 마트리젤 코팅된 배양접시 바닥에 붙인 후 N2 배지에서 5 일 동안 배양하여 9 일째에 현미경으로 신경전구세포의 전형적인 꽃모양 신경 로제트 (neural rosette)을 유리 파이펫으로 분리하여 마트리젤이 코팅된 배양접시에 다시 부착하고 아교세포로 결정지어주는 배지에서 7 일 동안 배양하였다. 16 일째에 MACS 를 이용하여 A2B5 양성 세포만을 걸러주어서 마트리젤이 코팅된 35 mm 배양접시에 2X106 개를 부착하여서 0PC-1 배지에서 5 일 동안 배양하고 0PC-2 배지에서 4 일 동안 배양하였다. 분화를 시작하고 25 일에 회소돌기아교 전구세포 ·¾ 생산하여 척수손상 모델에 이식하였다. 도 lb 는 배아줄기세포로부터 회소돌기아교 전구세포 분화단계에서 세포모양을 보여준다.
도 2 는 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포로 분화하는 세포 특성 분석한 결과를 보여준다. 도 2a 는 부분 정량적 PCR 에서 RNA 의 발현을 확인한 결과를 보여준다. 미분화 마커인 0ct4(0ctamer— binding transcription factor 4)가 인간 배아줄기세포에서 발현하고 분화 단계에서는 발현하지 않음을 확인하였고 신경전구세포 마커인 Pax6, Soxl 및 Nestin 은 인간 배아줄기세포에서는 발현되지 않고 분화과정에서 발현되었음을 확인한 웨스턴 블럿 결과를 보여준다. 도 2b 는 인간 배아줄기세포에서 미분화 마커인 Oc 및 SSEA4 발현을 확인하였고, 신경전구세포 특이적 마커인 Soxl 및 Pax6 발현을 확인하였다. 신경전구세포를 증식한 후의 GRKGlial-Restricted Precursor)에서 A2B5 가 발현되는 세포를 확인한 면역형광염색법 결과를 나타낸다.
도 3 은 MACS(Magnetic-activated Cell Sorting)로 분리한 A2B5 양성 세포의 높은 순수성 분석한 결과를 보여준다. 도 3a 는 FACS 로 MACS 전 (파란색 그래프)과 후 (형광파란색 그래프)에 세포를 분석한 결과로 MACS 후 그래프가 전보다 더 오른쪽으로 이동， 즉, 형광 강도가 더 강하게 나타났으며， A2B5 양성 세포가 98¾ 고효율로 분리된 것을 확인한 결과이다. 세 번 반복한 결과이며, 유의한 값을 갖는다. 도 3b 는 마트리젤 코팅된 배양접시에 MACS 하기 전 세포 (A2B5 양성세포 및 음성세포), MACS 후 A2B5 음성세포 그리고 양성세포를 부착하여서 현미경으로 세포 모양을 확인한 결과를 보여준다. 음성세포는 넓적한 세포모양으로 흩어져서 자라며， 양성세포는 모여서 자라며 날씬하게 양극 (bipolar)을 뻗는다. 매번 같은 세포모양을 확인한 결과이다.
도 4 는 배아줄기 세포로부터 회소돌기아교 전구세포로 분화하는 과정에서 미분화 세포가 없는 것을 확인한 결과를 보여준다. 배아줄기세포신경전구 및 세포희소돌기아교 전구세포 각각의 세포를 미분화 마커인 0ct4 및 Nanog을 확인하니 면역염색법을 통해 확인되지 않았다. 도 5 는 회소돌기아교 전구세포 특성을 분석한 결과를 보여준다, 도 5a 는 현미경으로 회소돌기아교 전구세포 전형적인 바이폴라 (bipolar)/트리폴라 (tripolar) 세포모양으로 변했음을 확인한 결과이다. 도 5b 는 회소돌기아교 전구세포 표면에 특이적인 마커 A2B5, PDGFRa 및 NG2가 발현하는 것을 확인한 면역형광염색법의 결과를 보여준다. 전체 세포 중 PDGFRa 및 NG2를 발현하는 세포가 -84%에 달함을 확인하였다. 도 6 은 회소돌기아교 전구세포의 증식을 보여준다. 도 6a 는 증식 신호로 뉴레굴린 (Neuregulin)을 처리 /비처리 세포를 2 일 또는 4 일에 세포 증식을 확인하기 위해 핵 염색 (DAPI)하였으며， 세포 생존을 알아보기 위해 죽는 세포에서 발현되는 활성화형 카스파아제 3(cleaved_caspase3)을 면역형광염색법을 통해 확인하였다. 세포 (DAPI 양성세포) 수는 처리 /비처리 세포 모두 시간이 지날수록 증가하였으나， 처리한 세포에서 1.3 배 더 증가함을 확인한 결과이다. 활성형 카스파아제 3 를 발현하는 세포 수는 두 가지 경우 모두 증가 하였으나， 처리해 준 경우에서 더 적음을 확인한 결과를 나타낸다. 도 6b 는 회소돌기아교 전구세포의 증식을 확인하기 위해 부분정량적 PCR 에서 특이적 마커인 PDGFRa, Sox family(8, 9， 10)， NG2, Oligl 및 01ig2 의 RNA 발현양을 비교한 결과, 뉴레굴린 (Neuregulin) 처리 후에 높게 발현되어 있음을 확인하였다.
도 7 은 회소돌기아교 전구세포를 척추손상 모델에 이식하여 기능 회복에 있어서 층분한 역할을 하고 있음을 보여준다. 척수손상-랫트는 손상 직후부터 뒷다리의 운동기능의 거의 마비된 상태지만 시간이 지나면서 일부 기능이 회복되어 BBB 점수는 6~7 점 정도가 되었다. 이 시점에서 한 그룹에는 회소돌기아교 전구세포를 다른 그룹에는 DPBS 를 같은 양으로 이식해주었다. DBPS 를 이식한 그룹의 경우 이식 후에 행동검사 점수가 조금 상승하여 이식 2 주 후에는 행동검사 점수가 9 점 내외가 되고 이 점수는 8 주 이상 지속되었다. 반면 희소돌기아교 전구세포를 이식한 그룹의 경우 이식 후부터 점수가 꾸준히 올라 이식 하고 6 주가 지난 시점에는 12 점 정도까지 오르며 이 점수는 실험이 종료되는 시점인 8주까지 지속 되는 것을 확인한 결과이다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
재료 및 방법
인간 줄기세포 (hESC) 배양
인간 줄기 세포주 H9(human Embryonic Stem Cells: hESC, P31-45,
WiCelllnc, Madison, Wisconsin, 미국)을 20% KSR(Knockout Serum Replacement , Invitrogen, Carlsbad, 미국) , lx비필수 아미노산 (Invitrogen, 미국)， 0.1 mM β-머갑토에탄올 (Sigmaᅳ St. Louis, MO, 미국) 및 4 ng/m bFGF(basic fibroblast growth factor, Invitrogen, 미국)가 첨가된 DMEM-F12 배지에서 배양하였다. hESC들을 유사분열적으로 정지된 STCXATCC, Manassas, VA, 미국) 피더 세포층에서 성장시켰다. 7일 동안 매일 공지된 계대배양 방법 1 에 의하여 hESC 콜로니를 신선한 피더 층에 옮겼다. 인간전분화능 줄기세포의신경전구세포 분화 유도
30 분 동안 IV 형 콜라게나아제 (Invitrogen, 미국)를 2 mg/ 로 처리한 후 피더 세포층으로부터 hESC 콜로니를 분리하여 배아체 (embryoid bodies: EB) 형성을 하도록 하였으며， bFGF가 없는 ESC배양 배지가 포함된 페트리디쉬로 이동하였다. EB 를 형성하는 동안, 5 μΜ 의
DM(dorsomorphin; Sigma, 미국) 및 5-10 μΜ 의 SB431542(Calbiochem, San Diego, CA, 미국)를 배지에 첨가하였으며， 약 4 일 동안 매일 한번 배지를 교환하였다. 그 다음 EB 를 20 ng/m£ bFGF 가 보층된 무혈청 신경분화배지 (N2 배지; DMEM/F12 plus 1XN2 첨가제, Invitrogen, 미국)가 들어 있는 마트리젤 (Matrigel, BD bioscience, Maryland, 미국)이 코팅된 35 mm 배양 디쉬에 부착시켜 5-6 일간 추가적으로 배양하였다. 배아체 (Embryoid body; EB)가 부착하여 형성한 콜로니의 중심부에는 뚜렷한 신경 로제트 (neural rosette) 구조가 형성되는 것을 확인할 수 있는데 이를 해부현미경 상에서 가늘게 뽑은 파스퇴르 피펫 (Pasteur pipette)을 이용해 물리적으로 분리해 낸 후， 200p 피펫을 이용해 작은 명어리들로 분쇄하여 다시 마트리젤이 코팅된 60 mm 디쉬에 부착시켜 N2B27 배지 (DMEM/F12 에 1XN2 및 1XB27 supplement 와 20 ng/ml 의 bFGF 가 첨가된 배지)에서 일주일간 추가 배양하였다. 자성면역분리법 (Magnet i c-act i vated Cell sorting: MACS)에 의한 A2B5 양성세포의 분리
신경전구세포 증식 배지 (N2B27, bFGF 및 EGF 첨가 배지)에서 일주일동안 배양된 세포에 10 μΜ 의 Υ27632 (Calbiochem, 미국)을 한 시간가량 처리한 다음 PBS (phosphate buffered saline)로 씻어낸 후， AccutaseCMilipore, Messachusetts)를 약 15 분간 인큐베이터 (37°C)에서 처리하여 완전한 단일세포로 제조하였다. 그 후 MACS 세포 분리 키트 (Milteny, BergischGladbach, 독일)로 제조사의 매뉴얼에 의해 항- A2B5-마이크로비드 (Milteny, Cat #130-093-388)를 이용해 A2B5 양성세포를 분리하였다. 분리된 A2B5 양성 세포 2X106 개를 마트리젤이 코팅된 35圆 디쉬에 부착한 후 0PC-1(N2B27, PDGF(Platelet~Derived Growth Factor)-A, IGF( Insulin- like Growth Factor) , SHH( sonic hedgehog) , 포스콜린 (Forskolin) 및 NAC 첨가 배지) 및 0PC-2 배지 (N2B27, PDGF-A, IGF, 포스콜린， NAC(N-acetyl-L-cysteine) 및 NRG(Neuregulin))로 배양하였다. 회소돌기아교 전구세포 분화 및 증식
· 희소돌기아교 전구세포로 분화를 시키고 증식시키기 위해서 발달과정에서 필요로 하는 신호들을 첨가하여 처리하여 주었다. 그 신호들은 재조합 인간 PDGF-MU0 ng/ml , Peprotechinc); 재조합 인간 IGF- 1(10 ng/ml , Peprotechinc); Forskolin(5 uM, Sigma); SHH(100 ng/ml , R&D)； NAC(60 ug/ml , Sigma); 재조합 인간 NRGl-betal/HRG-betal 세포외 도매인 (200 ng/ml , R&D System)이다. 세포를 넁동보관 하기 위해서는 배양중인 회소돌기아교 전구세포를 Accutase 처리한 후 회소돌기아교 전구세포 넁동배지 (0PC-1 배지: Demethylsulfoxide(DMS0):KSR=4:l:5)로 2X106 세포 농도의 세포현탁액을 만들어 CryoFeezing 용기 (Nalgene, Roschester, NY, 미국)에 담은 후 초저온 냉동고 (deep freezer)에 24 시간 보관 후 액체질소 통에 보관하였다. 해동은 일반적인 N2B27 배지를 이용해 동물세포 해동법을 따랐다. 면역형광분석 (Fluorescence-Act ivated Cell Sorting ： FACS)
배양하던 세포를 Accutase 로 단일세포로 완전히 분리한 다음 PBS 로 1 회 세척 후 5% BSACbovine serum albumin)이 포함된 PBS 로 4°C에서 10 분간 블로킹하였다. 그 후 항 -A2B5 항체 (Milipore, 1:100)로 4°C에서 10 분간 반웅시킨 후 2 회 PBS 로 세척한 다음 5% BSA-PBS 에 Alexa 2 차 항체 (Molecular Probe, Eugene, OR, 미국 )로 10 분간 4°C에서 반웅시킨 후 동일한 방법으로 2회 세척 한 다음 PBS 250-300 ^로 세포 현탁액을 만들어 FACS CaliberCBD bioscience)와 그 분석 프로그램으로 분석하였다. 면역염색및 정량분석
30분간 4% 파라-포름알데히드 -PBS를 이용하여 세포들을 고정하였다. 1 구획 당 0.01% 트리톤 X-100/PBS (세포내 마커)으로 처리하고， 실온에서 1 시간 동안 5¾ 당나귀 혈청 (Calbiochem, CA, 미국) 혹은 2% BSA 으로 블로킹 시킨 후 4°C에서 일차 항체로 12 시간 반응하였다. 본 연구에서 이용한 세포내 마커를 확인하기 위한 일차항체는 다음과 같다: 0ct4(l:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, 미국); SSEA4( 1:200， Santa Cruz Biotechnology); Nanog(l:50, R&D )； Soxl (1:200, Millipore, Billerica, MA, 미국); Pax6(l:200, DSHB, Iowa, IA, 미국) 일차 항체 반웅 후， 결합시킨 일차 항체를 검출하기 위하여 형광( 6 3-1?1110 또는 594)- 결합 2 차 항체 (Molecular Probes, Eugene, OR, 미국)를 이용하였다. 핵을 검출하기 위하여 DAPI(4-6-diamidino-2-phenyl indole, Vector, Burlingame, CA, 미국)이 포함된 마운팅 용액을 이용하였다. 올림푸스 1X71 현미경 및 DP71 디지탈 카메라로 세포 이미지를 관찰하였으며， 이미지 -프로 플러스 ver 5.1(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, 미국)로 분석하였다. 세포 표면에서 발현하는 마커를 검출하기 위해서는, 30 분동안 4% 파라-포름알데히드 -PBS 를 이용하여 세포들을 고정하였다. 실온에서 1 시간 동안 5% 당나귀 혈청 (Calbiochem, CA, 미국) 또는 2% BSA 로 블로킹 한 후 41：에서 일차 항체로 12 시간 반웅하였다. 본 연구에서 사용된 일차 항체는 A2B5( 1:200 ,MILLIP0RE); PDGFRa 1:50, SANTA CRUZ)； NG2(1 :200, MILLIPORE)이다. 실험을 통해 얻어진 면역표지된 세포에 대해 7-8 개 또는 15-20 개의 임의표본 촬영을 통해 육안 또는 MetaMorph(v.7.17, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 미국) 프로그램을 통해 카운팅 하여 정량적 평가를 실시하였다. 평균士표준오차로 값을 표현하였다. 통계적 유의성은 스튜든트 t-테스트 또는 SPSS 소프트웨어 버젼 12.0을 이용하는 One-Way AN0VA 테스트를 이용하였다.
RT-PCR 및 데이터 분석
제조사의 프로토콜에 따라 Easy-Spin total RNA 정제 키트 (iNtRON Biotechnology, Seoul , 대한민국)을 이용하여 세포 내 존재하는 총 RNAs 를 추출한 후, iScriptcDNA 합성 키트 (BioRad, Hercules, CA, 미국)를 이용하여 1 fig RNAs 를 역전사 하였다. EmeraldAmp GT PCR master mix(Takara Bio Inc, Shiga, 일본)를 이용하여 2700 Master Cycler(Appl ied Biosystems, 미국)에서 PCR 반응을 수행하였다. 끝난 샘플은 1.5% 아가로즈 젤에서 전기영동을 통해 분석하였고 이티디움 브로마이드 (Ethidium Bromide) 염색을 통해 젤 닥 (Gel Doc) 시스템 (Bio Rad 미국)을 통해 증폭된 DNA 절편을 분석하였다 . 적어도 3 회 이상의 독립적 인 실험을 하여 모든 데이터를 최종 확인하였으며， 사용된 프라이머의 서 열 및 조건은 표 1 에 나타내었다.
【표 11
Figure imgf000018_0001
인간 배아줄기세포로부터 효율적인 신경전구세포의 유도
미분화 상태를 유지하기 위해서 마우스 배아 섬유아세포로 이루어진 지지세포 (STO feeder) 위에서 인간 배아줄기세포 (H9)를 배양하였으며 미분화 마커 인 0ct4 및 SSEA4 가 강하게 발현하였다 (도 lb 및 도 2b) .9 인간 배아줄기세포는 콜라게나아제 (Collagenase) 효소처리를 통해 지지세포와 분리한 후에 배아체 (도 lb)를 만들고 dorsomorphin 및 SB431542 를 3-4 일간 처리 하여 BMP 신호와 Activin/Nodal 신호를 억제를 하여 신경 전구세포로의 분화 유도를 더욱 촉진한 후에， 마트리젤이 코팅된 배양접시에 부착하게 한 다음 5-6 일간 bFGF(basic-fibroblast growth factor) 및 인슬린이 추가로 첨가된 무혈청 신경분화배지 (이후 N2 배지， 조성은 실시 예 '인간 전분화능 줄기세포의 신경전구세포 분화 유도' 에 설명되어 있음)에서 배양을 하면 콜로니의 가운데 부분에 신경 로제트 (neural rosette) 모양의 구조가 생긴다 (도 lb).10 이 구조는 신경전구세포 특이적인 마커인 Pax6 및 Soxl 가 강하게 발현하였다 (도 2b). 신경 로제트를 해부 현미경 하에서 조심스럽게 분리하여 가벼운 피펫팅으로 작은 조각들로 부순 다음 다시 마트리젤이 코팅된 배양접시에 재부착하여， bFGF와 EGF( epidermal growth factor)가 첨가된 N2B27 배지에서 일주일동안 더 배양을 하면 신경전구세포가 활발히 증식하고 이른 희소돌기아교 전구세포 표면에 특이적 마커인 A2B5 를 발현하는 세포들이 존재한다 (도
MACS법을 이용해고수율로 A2B5양성세포의 분리
bFGF 와 EGF 에 의해 신경전구세포와 교세포가 증식되며， 그 안에서 A2B5 양성 세포들이 존재한다. 14 A2B5 가 발현되는 세포는 회소돌기아교 전구세포 단계에서도 이른 단계에 세포표면에 발현한다. 세포표면에 발현되는 특징을 이용하여， MACS법에 따라 A2B5 양성 세포만을 분리하였다. 즉， A2B5 음성 세포는 분리해 내었으며， 이 세포의 경우에는 본 연구에서는 원하지 않는 세포로 분화 할 가능성이 높으며 , 세포치료를 위해 세포 이식 시에 종양을 형성 할 가능성이 매우 높으므로 이를 제거 하는 과정은 매우 중요하다. 본 연구에서 필요로 하는 세포들만을 선택적으로 분리하기 위하여 자성 비드가 결합된 A2B5 항체를 이용， MACS 법을 통해 A2B5 양성 세포만을 선택적으로 분리하였다.15 MACS 법은 일반적으로 형광면역분리법 (Fluorescence-activated cell sorting; FACS)과 비교해서 세포 분리 과정이 훨씬 세포에 손상을 덜 주며, 월등히 저렴한 비용으로 FACS 법과 비슷한 효율로써 원하는 혹은 원하지 않는 세포를 분리해 낼 수 있는 장점이 있다. 간단히 그 과정을 설명하면 N2B27 배지에서 일주일간 증폭된 신경전구세포를 Accutase라는 효소처리를 통해 단일세포 현탁액으로 만들고 자성 비드가 결합된 A2B5 특이적 항체와 반웅시킨 후 자성에 의해 걸러진 세포만을 추출해 내는 방법이다. MACS 후 추출된 A2B5 양성세포를 마트리젤이 코팅된 배양접시 바닥에 부착시키고 0PC-1 배지에서 배양하면 회소돌기아교 전구세포의 전형적인 모양을 보이고 인접한 세포끼리 서로 모인다 (도 3b). 반면에 A2B5 음성세포의 경우 단일세포로 홀어져 자라고 있음을 확인하였다 (도 3b). 또한 MACS 를 하기 전보다 한 후에 얼마나 높은 효율로 A2B5 양성세포가 걸러졌는가를 A2B5 특이적 항체를 MACS 전의 신경전구세포와 MACS 후의 신경전구세포와 반웅시킨 후에 형광면역분리법으로 확인하였더니 MACS 후에 그 추율을 확인해 보면 약 98%가 A2B5 양성 세포임을 확인하였으며， 그래프에서 파장 (FL-1 intensity)이 더 크게 나타나는 것으로 보아 A2B5 발현이 강한 양성의 신경전구세포가 걸러졌음을 확인하였다 (도 3a). 결과적으로 인간 배아줄기세포로부터 BMP 및 Activin/Nodal 신호전달 기전의 억제를 통해 분화 유도된 신경전구세포에서 MACS 법을 통해 A2B5 양성세포들만을 선택적으로 분리하면 순수한 파풀레이션을 얻을 수 있으며, 회소돌기아교 전구세포로 분화 시켰을 때 순도가 높은 분화 수율을 기대하였다. 분리된 신경전구세포의회소돌기아교 전구세포로 분화 및 증식 척수 손상과 같은 질병 세포치료에 이용 가능한 희소돌기아교 전구세포를 생산하기 위해서 효율적이고 안정된 분화방법을 확립하고자 실제 체내 발달과정을 기초로 한 분화유도 및 생존에 필요한 인자들과 분화과정을 추적하기에 적합한 표지인자들을 모집하여， 이를 기반으로 실험하였다. 회소돌기아교 전구세포는 발달 과정 중 뇌실하 영역 (subventricular zone; SVZ)에서 SHH( Sonic hedgehog homo log) 신호의 영향을 받아서 발달하기 시작하며， 주변의 다른 세포로부터， 예를 들면, 별아 교세포 (astrocyte)와 신경세포로부터 분비되는 PDGF P late let - derived growth factor) , IGFᅳ Klnsul inᅳ 1 ike growth factor 1) 및 뉴레굴린 (Neuregulin) 등의 신호를 받아서 분화, 증식 그리고 생존한다.16 이 세포는 분화에 있어서 동그란 세포바디에 두개의 극 (bipolar)이나 세개의 극 (tripolar)이 뻗어 나오는 특이적인 세포 모양의 변화를 겪으며ᅳ 그 단계에 특이적으로 발현되는 A2B5, PDGF 및 NG2 등 같은 마커들이 있어 분화과정을 추적하기에 적합한 표지인자들이 층분하여 이를 이용하여 세포의 특성을 분석하고 맞게 분화하였음을 확인하였다.17
MACS 법에 의해 순수하게 분리된 A2B5 양성 세포를 35 mm배양접시에 약 2X106 의 적절한 수로 세포를 마트리젤이 코팅된 배양접시 바닥에 부착시키고 0PC-1 배지에서 5 일 그리고 나서 0PC-2 배지에서 4 일 동안 배양하였다. 특정 세포로의 분화 시에 자극해서 유사분열을 촉진시키는 작용을 하는 물질을 미토젠 (mitogen)이라 한다. 0PC-1 배지에는 PDGF-A, IGF 및 SHH 의 미토젠과 생존에 필요한 폴스콜린 (forskolin) 및 NAC(N- Acetyl-Cysteine)가 첨가되어 있다. 0PO1 배지에서 5 일 동안 배양 된 A2B5 양성 세포는 양극 (bipolar ) 또는 3 극 (tripolar )의 세포모양을 보였으며， 면역염색법을 통해 이 세포 단계에서 특이적으로 발현되는 A2B5, PDGFRa, 및 NG2 모두 염색이 된 것을 확인하였다 (도 5a-b). RG(Neuregulin)은 희소돌기아교 전구세포의 안에서 일어나는 PI3K 신호경로를 통하여 증식과 생존을 높인다 .18 NRG를 첨가한 0PC-2 배지에서 4 일 동안 배양한 결과， 면역염색법에서 처리하지 않은 경우와 비교해 보았을 때, 배양 2 일째 및 4 일째 모두 핵 (DAPI)의 개수의 차이가 1.3배의 증가율을 보였으며， 세포가 죽을 때 발현하는 활성화 형태의 캐스페이즈- 3(cleaved— caspase-3)로 염색 하였을 때 더 적은 세포가 염색되었다 (도 6a). RNA 전사체의 양을 RT-PCR 을 통하여 확인해 보았을 때에도 희소돌기아교 전구세포에서 발현되는 마커인 PDGFRa, Sox fami 1 ies(8/9/10) , NG2 및 01igl/2 가 더 높게 발현되었음을 확인하였다 (도 6b). 이렇게 생산된 희소돌기아교 전구세포는 일반적인 세포 넁동 기법을 이용하여 액체질소에 보관하였다가 해동하여도 같은 상태를 유지할 수 있게 됨을 확인하였고 보관해 두었던 세포는 필요할 때면 풀어서 증식을 시킨 다음에 척수 손상과 같은 모델에 이식이 가능하다. 척추 손상쥐모델에회소돌기아교 전구세포 이식
이미 줄기세포로부터 분화된 회소돌기아교세포 혹은 그 전구체의 이식은 척수손상 치료를 위한 중요한 수단으로 인식되고 있다. 인간 줄기세포로부터 25 일만에 분화 및 증식을 시켜 만든 회소돌기아교 전구세포가 척추손상 치료에 효과가 있는지 확인하기 위해 척추손상 쥐 모델에 이식하여서 행동검사를 실시하였다.
우선 척추 손상 모델을 만들기 위하여 200 g 내외의 자성 랫트 (Sprague Daw ley rat, 5 주령)를 엔토발 (한림제약 (주)， 대한민국)로 마취한 후 Th9 척추후궁절제술 (laminectomy, 척추뼈를 제거하는 과정)를 실시하였다. NYU 임팩터 (Impactor) (뉴욕 유니버시티 (NYU), 미국)를 이용하여 25 mm 높이에서 10 g 의 막대를 이용하여 노출된 척수 위로 떨어뜨려서 척수 손상을 유발하였다. 상처는 배타딘 (성광제약 (주)， 대한민국)으로 잘 소독한 후 수초 (봉합)해주었으며 배뇨기능이 정상으로 돌아을 때까지 매일 인위적으로 배뇨해주었다. 척수 손상 모펠이 잘 만들어 졌는지 확인하기 위하여 척추손상을 실시 한 후 1， 4 및 7 일에 BBB 테스트 (Basso, Beat tie 및 Bresnahan 의 세 명의 이름으로 명명한 척추손상 후에 다리를 잘 쓰지 못하는데 못쓰던 다리가 얼마나 회복되는지를 알아보는 행동검사을 BBB 테스트라고 함.)를 실시하였다. 척수손상을 받은 쥐는 그 직후부터 뒷다리의 운동기능의 거의 마비된 상태지만 시간이 지나면서 일부 기능이 회복되어 BBB 점수는 6-7 점 정도가 된다. 이 시점에서 쥐 모델을 한 그룹은 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(GIBC0, 미국)만을 다른 한 그룹은 DPBS 에 회소돌기아교 전구 세포 (500, 000 세포)를 흔합하여 갈은 볼륨으로 게로란 (중외제약， 대한민국)으로 호흡마취 한 후 손상 받은 척수 부분을 다시 노출시킨 후에 척수 증앙에 가늘게 뽑은 유리관을 이용하여 입으로 직접 불어서 이식하였다. 이식한 세포가 쥐 모델에서 면역반응으로 인하여 죽는 것을 방지하기 위해 이식하기 하루 전 날부터 면역거부 반웅 억제제 (사이클로스포린， N0VARTIS, 스위스)를 매일 투여하였으며， 기능 회복을 보기 위하여 이식한 날부터 매주 BBB실험을 8주 동안 실시하였다.
DPBS 를 이식한 그룹의 경우 이식 후에 행동검사 점수가 조금 상승하여 이식 2 주 후에는 행동검사 점수가 9 점 내외가 되고 이 점수는
8주 이상 지속되었다. 반면 회소돌기아교 전구세포를 이식한 그룹의 경우 이식 후부터 점수가 꾸준히 올라 이식 하고 6 주가 지난 시점에는 12 점 정도까지 오르며 이 점수는 실험이 종료되는 시점인 8 주까지 지속 되는 것을 확인 하였다 (도 7). 이는 인간 배아줄기세포로부터 단기간 (25 일)내에 높은 수율로 분화 증식한 회소돌기아교 전구세포가 척추손상 모델에 기능회복에 있어 충분한 역할을 하고 있음을 보여준다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참조 문헌
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Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
다음 단계를 포함하는 전능성 줄기세포 (pluripotent stem eel Is)로부터 회소돌기아교 전구세포 (Oligodendrocyte Precursor Cells: 0PC)의 제조 방법：
(a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트 (neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파풀레이션을 얻는 단계;
(b) 상기 세포 파풀레이션에 A2B5 에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;
(c) 상기 A2B5 에 대한 항체가 결합된 A2B5 양성 세포를 분리하는 단계; 및
(d) 상가 A2B5 양성 세포를 회소돌기아교 전구세포로 분화하는 단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어세 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells), 배아생식세포 (embryonic germ cells), 배아종양세포 (embryonic carcinoma eel Is) 또는 iPSCs( induced pluripotent stem eel Is)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포 (embryonic stem cells)인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 전능성 줄기세포는 인간， 소， 말, 염소, 양， 개， 고양이, 마우스， 래트 또는 조류로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 5]
제 1 항에 있어서， 상기 세포 파풀레이션은 비균질 신경전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b) 및 (c)는 MACSCmagnetic activated cell sorter)에 따라 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 7]
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 80% 이상의 회소돌기아교 전구세포 순수도 (purity)를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서, 상기 회소돌기아교 전구세포는 양극 또는 3 극 이상의 세포모양을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 9]
제 1 항에 있어서， 상기 회소돌기아교 전구세포는 PDGFRa, Sox 패밀리 (Sox 8, Sox 9 및 Sox 10)， NG2, Oligl 및 01ig2를 과발현 하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 10】
상기 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 희소돌기아교 전구세포.
【청구항 11】
상기 제 10 항의 희소돌기아교 전구세포로부터 분화된 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte). 【청구항 12]
전능성 줄기세포로부터 분화된 회소돌기아교 전구세포를 유효성분으로 포함하는 증추신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물. 【청구항 13】
제 12 항에 있어서， 상기 회소돌기아교 전구세포는 제 10 항의 회소돌기아교 전구세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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