CN114540301B - 少突胶质前体细胞亚群及其用途 - Google Patents

少突胶质前体细胞亚群及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种少突胶质前体细胞亚群，其特征在于，所述少突胶质前体细胞亚群针对下列标志物至少之一呈阳性：VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4。本发明的细胞亚群易于筛选及制备，在制备药物中具有重要作用，特别是治疗或者预防神经、血管或肌肉损伤性疾病的药物。

Description

少突胶质前体细胞亚群及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及少突胶质前体细胞亚群，具体地，涉及少突胶质前体细胞亚群的外泌体、少突胶质前体细胞亚群的制备方法、少突胶质前体细胞亚群及其外泌体在制备药物中的用途、筛选药物的方法、药物组合物。
背景技术
少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells,OPC)是定位于神经系统的具有高度增殖能力和分化能力的一群具有干细胞特性的细胞，OPC细胞可分化成少突胶质细胞，并可能参与少突胶质细胞异常所导致的疾病。外泌体(exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30～150nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。
脑卒中(Stroke)是全球导致死亡的第二大原因,也是引起成年人致残的主要原因,具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。脑卒中后认知障碍(Post-stroke cognitive impairment，PSCI)是脑缺血(cerebral ischemia，CI)患者的主要后遗症。PSCI的患病率从20％到80％不等，因国家，种族和诊断标准的不同而异。PSCI可能导致生活质量下降，生存率降低，社会负担加重等，并且越来越引起人们对PSCI治疗的关注。
目前尚针对脑卒中后认知障碍的治疗主要以康复治疗为主，尚未有特效药，因此研发一种针对脑卒中后认知障碍的药物非常重要。
发明内容
为了解决上述问题，发明人团队经过对认知障碍性疾病致病机理等方面的研究，发现了高表达VCAN(Versican)、LARS2(Leucyl-TRNA Synthetase 2,Mitochondrial)、TTR(Transthyretin)、MAL(Mal,T Cell Differentiation Protein)、PCDH15(ProtocadherinRelated 15)和CSPG4(Chondroitin Sulfate Proteoglycan 4)的一类少突胶质前体细胞亚群能分泌外泌体，其外泌体成分中含有VWF(Von Willebrand factor)、VEGF(VascularEndothelial Growth factor)、PSAP(Prosaposin)和TTR(Transthyretin)，OPCs细胞和外泌体可促进血管和肌肉生成并抑制神经元死亡，发挥神经保护作用，改善的功能。
为此，在本发明的第一个方面，本发明提出了一种少突胶质前体细胞亚群。根据本发明的实施例，所述少突胶质前体细胞亚群针对下列标志物至少之一呈阳性：VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4。发明人发现，根据本发明实施例的细胞亚群所分泌的外泌体在促进血管和肌肉生成，抑制神经元死亡，修复受损伤的神经元，神经保护，改善认知障碍中具有显著作用。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备在本发明第一方面所提出的细胞亚群的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对少突胶质前体细胞进行分选，获得下列标志物至少之一呈现阳性的细胞：VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4。针对少突胶质前体细胞，以VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4为生物标志物，筛选上述生物标志物至少之一为阳性的细胞，即可得到所需细胞亚群。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种外泌体。根据本发明的实施例，所述外泌体是由本发明第一方面所提出的细胞亚群产生的。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种外泌体。根据本发明实施例的外泌体含有VWF、VEGF、PSAP和TTR中的一种或几种。根据本发明实施例的外泌体含有VWF、VEGF、PSAP和TTR蛋白中的一种或几种，可以促进神经、血管、肌肉的损伤修复，发挥保护作用，对认知障碍性疾病具有显著作用。根据本发明的又一实施例，所述外泌体可以为本发明第一方面所提出的细胞亚群产生的，也可以为人工合成的具有上述4种蛋白至少之一的物质，其具有与外泌体相似的结构。
在本发明的第五方面，本发明提出了在第一方面所提出的细胞亚群和在第三方面所提出的外泌体在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防神经、血管或肌肉损伤性疾病。
根据本发明的实施例，所述药物用于促进血管和/或肌肉生成。
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防认知功能障碍性疾病。
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防脑卒中后认知障碍。
根据本发明的实施例，患者的病灶适于使所述细胞亚群分泌外泌体，所述外泌体含有VWF、VEGF、PSAP和TTR蛋白中的一种或几种。
根据本发明的实施例，在第一方面所提出的细胞亚群可以分泌外泌体，外泌体中含有VWF、VEGF、PSAP和TTR等物质，有利于血管、神经、肌肉组织的损伤修复，抑制神经元死亡，在第三方面所提出的外泌体，可以为人工合成的，也可以是第一方面所提出的的细胞生成的，外泌体中含有上述4中蛋白，可以发挥神经、肌肉、血管组织的保护作用，对于认知障碍性疾病，特别是脑卒中后认知障碍、阿兹海默症等具有治疗或者预防效果。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防脑卒中后认知障碍。根据本发明的实施例，将待筛选药物与细胞亚群进行接触，所述细胞亚群如本发明第一方面所提出的，以及比较待筛选药物与细胞亚群接触前和接触后的细胞亚群中细胞的数量和/或细胞亚群分泌蛋白的数量，确定待筛选药物。根据本发明实施例的方法，所述细胞亚群既是药物作用对象，也是药物是否有效的指示，细胞亚群中细胞数量的大小、特定蛋白表达量的多少，特定蛋白所对应核酸量的多少均为药物有效性的指示。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物中含有第一方面所提出的细胞亚群和/或第三方面所提出的外泌体。根据本发明实施例的药物可以利用上述外泌体或上述细胞亚群所分泌的外泌体，对神经、血管、肌肉损伤进行修复或保护，进而达到治疗或者预防认知障碍性疾病的目的。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：本发明第七方面所提出的药物，还可以包括其他与所述药物产生协同作用的药物。根据本发明实施例的药物组合物，其他与上述药物产生协同作用的药物可以为血管、肌肉、神经保护类药物，也可以为抑制血管、神经、肌肉组织损伤因子的药物。根据本发明实施例的药物组合物相对于第七方面所提出的药物，药效更好，更有利于保护神经、血管、肌肉等组织，有利于治疗认知障碍性疾病，特别是脑卒中后认知障碍。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的细胞分群结果；
图2是根据本发明实施例的少突胶质前体细胞鉴定图；
图3是根据本发明实施例的细胞亚群中VCAN蛋白、LARS2蛋白、TTR蛋白、MAL蛋白、PCDH15蛋白、CSPG4蛋白阳性表达率；
图4是根据本发明实施例的外泌体分离及鉴定结果，
其中，图4A为外泌体形态电镜图，图4B为外泌体粒径检测结果；图4C为外泌体标志物CD9、CD81和CD63检测结果；
图5是根据本发明实施例的外泌体诱导血管生成，抑制神经元死亡结果，
其中图5A为外泌体诱导血管生成显微图，图5B血管生成统计图，图5C为神经元死亡数量统计图；
图6是根据本发明实施例的外泌体改善小鼠脑卒中后认知功能障碍结果，
其中，图6A为小鼠行走路径长度统计图，图6B为小鼠逃避潜伏期统计图，图6C为小鼠在目标象限时间统计图；
图7是根据本发明实施例的外泌体中VWF、VEGFA、PSAP和TTR的浓度测定图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
少突胶质前体细胞亚群
在本发明的第一方面，本发明提出了一种少突胶质前体细胞亚群。根据本发明的实施例，所述少突胶质前体细胞亚群针对下列标志物至少之一呈阳性：VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4。所述少突胶质细胞在动物体中分布于中枢神经系统，发明人经过严谨的试验设计和文献调研，基于对脑卒中后认知障碍致病机理和治疗方法地研究，发现了上述细胞亚群，其在神经、血管、肌肉组织的损伤修复中发挥重要作用，并且，在脑卒中后认知障碍的动物模型体内注射上述细胞亚群，可以缓解脑卒中后认知障碍。
根据本发明的实施例，所述细胞亚群可以为单一表达VCAN的细胞群体，可以为单一表达LARS2的细胞群体，可以为单一表达TTR的细胞群体，可以为单一表达MAL的细胞群体，可以为单一表达PCDH15的细胞群体，可以为单一表达CSPG4的细胞群体，可以为上述六种细胞群体的任一组合，可以为表达VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4蛋白一种或几种的细胞所组成的细胞群体。
根据本发明的实施例，所述神经、血管、肌肉组织包括位于动物体内的组织，也包括离体的组织，或者经过干细胞等诱导分化的体外培养组织。所述动物包括但不限于人、猴子、大鼠、小鼠、豚鼠、驴、骡、马、骆驼等。
根据本发明的实施例，在所述少突胶质前体细胞亚群中，所述LARS2蛋白的表达率不低于85％。当所述少突胶质前体细胞亚群中的细胞表达LARS2时，表达LARS2蛋白的细胞占总细胞数的比例不低于85％、90％、95％，确保细胞亚群保护神经、血管、肌肉组织的有效性。
根据本发明的实施例，所述VCAN蛋白的表达率不低于90％。当所述少突胶质前体细胞亚群中的细胞表达VCAN时，表达VCAN蛋白的细胞占总细胞数的比例不低于90％、95％，确保细胞亚群保护神经、血管、肌肉组织的有效性。
根据本发明的实施例，所述TTR蛋白的表达率不低于80％。当所述少突胶质前体细胞亚群中的细胞表达TTR时，表达TTR蛋白的细胞占总细胞数的比例不低于80％、85％、90％、95％，确保细胞亚群保护神经、血管、肌肉组织的有效性。
根据本发明的实施例，所述MAL蛋白的表达率不低于70％。当所述少突胶质前体细胞亚群中的细胞表达MAL时，表达MAL蛋白的细胞占总细胞数的比例不低于70％、75％、85％、90％、95％，确保细胞亚群保护神经、血管、肌肉组织的有效性。
根据本发明的实施例，所述PCDH15蛋白的表达率不低于80％。当所述少突胶质前体细胞亚群中的细胞表达PCDH15时，表达PCDH15蛋白的细胞占总细胞数的比例不低于80％、85％、90％、95％，确保细胞亚群保护神经、血管、肌肉组织的有效性。
根据本发明的实施例，所述CSPG4蛋白的表达率不低于80％。当所述少突胶质前体细胞亚群中的细胞表达CSPG4时，表达CSPG4蛋白的细胞占总细胞数的比例不低于80％、85％、90％、95％，确保细胞亚群保护神经、血管、肌肉组织的有效性。
根据本发明的实施例，所述细胞亚群为活细胞，细胞亚群中活细胞的比例不低于80％。需要注意的是，细胞亚群中的活细胞数量能够满足传代培养和分化培养等的条件即可。根据本发明实施例的细胞亚群，连续传代到30代依然能保持良好外泌体分泌潜能，且外泌体成分包括VWF、VEGF、PSAP和TTR，蛋白含量稳定，依然具有良好的功效。
根据本发明的实施例，所述细胞亚群进一步表达下列蛋白的至少之一：VWF、VEGF、PSAP和TTR。根据本发明的实施例，所述细胞亚群通过表达VWF、VEGF、PSAP或TTR发挥其功能。此外，还可以利用本领域技术人员已知的生物技术，如克隆载体等，将带有上述四种蛋白对应基因的表达载体等转入细胞内，进而过表达上述四种蛋白任意组合，或使本不表达上述四种蛋白的细胞表达上述四种蛋白任意组合，进而增强细胞亚群的功能或者使不具有神经、血管、肌肉组织保护功能的细胞具有上述功能。
细胞亚群制备方法
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备在本发明第一方面提出的细胞亚群的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对少突胶质前体细胞进行分选，获得下列标志物至少之一呈现阳性的细胞：VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4。根据本发明实施例的方法，对获得的少突胶质前体细胞进行分选，以VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15或CSPG4作为标志物，VCAN+、LARS2+、TTR+、MAL+、PCDH15+或CSPG4+细胞即为目的细胞。可以利用抗体技术通过对上述标志物蛋白进行染色，以便利用流式细胞仪等完成分选，也可以利用核酸探针或引物等标记上述蛋白，以便完成目的细胞的分选。
根据本发明的实施例，所述少突胶质前体细胞由原代细胞分化培养获得。原代细胞经过体外培养得到原代神经细胞亚群，再将原代神经细胞亚群向少突胶质前体细胞分化，所的细胞以PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha)为标志物进行筛选，筛选后PDGFRA+细胞为少突胶质前体细胞。
根据本发明的实施例，所述少突胶质前体细胞由商业化干细胞系分化获得。所述商业化干细胞系包括但不限于诱导多能干细胞(iPSC)、神经干细胞等。
根据本发明具体实施例，所述制备细胞亚群的方法包括：
1、将诱导多能干细胞(iPSC)的单细胞悬液接种到无血清完全培养基中，进行悬浮培养，得到原代细胞；
2、将原代细胞培养12-16天，得到原代神经细胞亚群，将所述原代神经细胞亚群进行重复的以此进行的消化、传代培养，传代至第四代，得P4代细胞；
3、将P4代细胞进行PDGFRA染色后分选，在PDGFRA阳性的细胞中，VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15或CSPG4阳性合格的细胞作为种子细胞；
4、将种子细胞进行扩增传代培养，传代至P6-P10代，得到细胞亚群。
根据本发明的实施例，P5代细胞-P10代细胞可扩增10-40代，在本发明中,将所述细胞亚群连续传代,在体外可连续传代到30代，并且保持特异性标记物的表达不变，分泌外泌体的能力以及外泌体VWF、VEGF、PSAP和TTR含量不变。
外泌体
在本发明的第三方面，本发明提出了一种外泌体。根据本发明的实施例，所述外泌体是由本发明第一方面所提出的细胞亚群产生的。
根据本发明的实施例，所述外泌体包含下列蛋白至少之一：VWF、VEGF、PSAP和TTR。根据本发明的实施例，外泌体由囊泡及其内部的蛋白和RNA构成，所述外泌体中的蛋白包含VWF、VEGF、PSAP和TTR中的一种或几种，也可以包含上述四种蛋白任一组合对应的RNA，包括但不限于单链RNA、双链RNA、mRNA或经过化学基团修饰的RNA。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种外泌体，含有VWF、VEGF、PSAP和TTR蛋白中的一种或几种，可选的，所述外泌体是由本发明第一方面所提出的细胞亚群产生的。根据本发明实施例的外泌体含有VWF、VEGF、PSAP和TTR蛋白中的一种或几种，可以促进神经、血管、肌肉的损伤修复，发挥保护作用，对认知障碍性疾病具有显著作用。根据本发明的又一实施例，所述外泌体可以为本发明第一方面所提出的细胞亚群产生的，也可以为人工合成的具有上述4种蛋白至少之一的物质，其具有与外泌体相似的结构。
根据本发明具体的实施例，上述外泌体的制备方法包括：
1、将在本发明第二方面所提出的制备细胞亚群的方法中得到的P6-P10代PDGFRA阳性，VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15或CSPG4阳性合格的少突胶质前体细胞用无血清培养基培养2天以上，收取细胞上清液进行外泌体提取；(所述阳性合格指：所述LARS2蛋白的表达率不低于85％；所述VCAN蛋白的表达率不低于90％；所述TTR蛋白的表达率不低于80％；所述MAL蛋白的表达率不低于70％；所述PCDH15蛋白的表达率不低于80％；或者，所述CSPG4蛋白的表达率不低于80％)。
2、稳定细胞株培养上清液4℃/300g离心10分钟,取上清；再4℃/2000g离心10分钟,取上清，以便去除死细胞；去除死细胞的上清液4℃/10000g离心30分钟，取上清；
3、沉淀外泌体:上清液4℃/100000g离心70分钟，沉淀即为外泌体，用适量PBS重悬,分装保存于-80℃冰箱。
4、取100L1×PBS均匀吹打离心沉淀物,待其均匀悬浮在PBS中后，将重悬液转移至新的1.5mL离心管中；将含有重悬液的1.5mL离心管于4℃以12000g离心2min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。
5、将上清液于4℃以3000g离心10min,离心后收集柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒；
6、外泌体的保存:纯化后的外泌体以保存于-80℃低温冰箱中,以备后继实验使用。
制药用途
在本发明的第五方面，本发明提出了在第一方面所提出的细胞亚群和在第三方面所提出的外泌体在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防神经、血管或肌肉损伤性疾病。
根据本发明的实施例，所述药物用于促进血管和/或肌肉生成。
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防认知功能障碍性疾病。所述认知功能障碍性疾病包括但不限于：阿尔茨海默症、路易体痴呆、额颞叶痴呆、帕金森病、脑卒中等后遗症，脑缺血、脑梗死、脑出血等引发的认知障碍，外伤、中毒、酗酒等引起的认知障碍。
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防脑卒中后认知障碍。
根据本发明的实施例，患者的病灶适于使所述细胞亚群分泌外泌体，所述外泌体含有VWF、VEGF、PSAP和TTR蛋白中的一种或几种。
根据本发明的实施例，在第一方面所提出的细胞亚群可以分泌外泌体，外泌体中含有VWF、VEGF、PSAP和TTR等物质，有利于血管、神经、肌肉组织的损伤修复，抑制神经元死亡，在第三方面所提出的外泌体，可以为人工合成的，也可以是第一方面所提出的的细胞生成的，外泌体中含有上述4中蛋白，可以发挥神经、肌肉、血管组织的保护作用，对于认知障碍性疾病，特别是脑卒中后认知障碍、阿兹海默症等具有治疗或者预防效果。
筛选药物的方法
在本发明的第六方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防脑卒中后认知障碍。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待筛选药物与细胞亚群进行接触，所述细胞亚群如本发明第一方面所限定的，以及比较待筛选药物与细胞亚群接触前和接触后的细胞亚群中细胞的数量和/或细胞亚群分泌蛋白的数量，确定待筛选药物。
根据本发明的实施例，接触后，所述细胞亚群中细胞的数量增加是待筛选药物为目标药物的指示，若所述细胞数量未增加，则为待筛选药物无效或效果不明显的指示。
根据本发明的实施例，接触后，所述细胞亚群中下列蛋白至少之一的表达量：VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15和CSPG4增加是待筛选药物为目标药物的指示，若所述蛋白量或所述蛋白对应的核酸量未升高，则为待筛选药物无效或效果不明显的指示。
需要注意的是，对于细胞数量、蛋白含量和核酸含量的检测可以任选其一进行，也可以选择两项进行，也可以三项均进行。
所述核酸包括VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15或CSPG4蛋白对应的mRNA、双链RNA、单链RNA等。
药物
在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物中含有第一方面所提出的细胞亚群和/或第三方面所提出的外泌体。根据本发明实施例的药物可以利用上述外泌体或上述细胞亚群所分泌的外泌体，对神经、血管、肌肉损伤进行修复或保护，进而达到治疗或者预防认知障碍性疾病的目的。
根据本发明的实施例，所述药物为溶液剂、气雾剂、滴鼻剂、混悬剂、干粉剂或注射剂。
根据本发明的实施例，所述细胞在所述药物中的浓度为(1×106-1×107)个细胞/200μL。
根据本发明的实施例，所述外泌体在所述药物中的浓度为0.1～10mg/mL。所述外泌体在所述药物中的浓度为：0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2.0mg/mL、2.1mg/mL、2.2mg/mL、2.3mg/mL、2.4mg/mL、2.5mg/mL、2.6mg/mL、2.7mg/mL、2.8mg/mL、2.9mg/mL、3.0mg/mL、3.1mg/mL、3.2mg/mL、3.3mg/mL、3.4mg/mL、3.5mg/mL、3.6mg/mL、3.7mg/mL、3.8mg/mL、3.9mg/mL、4.0mg/mL、4.1mg/mL、4.2mg/mL、4.3mg/mL、4.4mg/mL、4.5mg/mL、4.6mg/mL、4.7mg/mL、4.8mg/mL、4.9mg/mL、5.0mg/mL、5.1mg/mL、5.2mg/mL、5.3mg/mL、5.4mg/mL、5.5mg/mL、5.6mg/mL、5.7mg/mL、5.8mg/mL、5.9mg/mL、6.0mg/mL、6.1mg/mL、6.2mg/mL、6.3mg/mL、6.4mg/mL、6.5mg/mL、6.6mg/mL、6.7mg/mL、6.8mg/mL、6.9mg/mL、7.0mg/mL、7.1mg/mL、7.2mg/mL、7.3mg/mL、7.4mg/mL、7.5mg/mL、7.6mg/mL、7.7mg/mL、7.8mg/mL、7.9mg/mL、8.0mg/mL、8.1mg/mL、8.2mg/mL、8.3mg/mL、8.4mg/mL、8.5mg/mL、8.6mg/mL、8.7mg/mL、8.8mg/mL、8.9mg/mL、9.0mg/mL、9.1mg/mL、9.2mg/mL、9.3mg/mL、9.4mg/mL、9.5mg/mL、9.6mg/mL、9.7mg/mL、9.8mg/mL、9.9mg/mL、10.0mg/mL。
根据本发明的实施例，所述药物中可以只包含所述细胞亚群，也可以只包含所述外泌体，也可以同时包含两种。所属药物中的细胞亚群和外泌体达到上述浓度时可以保证所述药物的效果，对于粉剂等固体制剂的药物，需要保证溶剂溶解后的浓度达到上述要求。
药物组合物
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：在本发明第七方面所提出的药物，还可以包括其他与所述药物产生协同作用的药物。
根据本发明的实施例，所述其他与所述药物产生协同作用的药物可以为血管、肌肉、神经保护类药物，也可以为抑制血管、神经、肌肉组织损伤因子的药物。
根据本发明的实施例，所述其他与所述药物产生协同作用的药物包括但不限于：乙酰胆碱抑制剂、抗氧化剂、神经营养剂、麦角碱类药物、谷氨酸受体阻滞剂。
本发明提供的药物组合物可以与不会损害预期的治疗作用的其它活性成分共同配制，或者与补充预期的作用的物质共同配制。
本发明提供的药物组合物可以以液体和固体剂型来提供，包括乳剂、溶液、干粉制剂、混悬剂。乳剂为二相系统，其中一种液体以小球形式完全分散在另一种液体中，其可以是水包油型或油包水型。乳剂可以包括药学上可接受的非水液体和溶剂、乳化剂和防腐剂。混悬剂可以包括药学上可接受的助悬剂和防腐剂。含水醇溶液可以包括药学上可接受的缩醛，比如低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛，例如乙醛二乙基缩醛；和具有一个或多个羟基的水溶性溶剂，比如丙二醇和乙醇。对于液体剂型，例如，在聚乙二醇中的溶液可以用足量的药学上可接受的液体载体例如水稀释，以精确方便地给药。
本发明提供的药物组合物还可以进一步包括：合适的抗微生物剂或防腐剂、合适的等渗剂、合适的局部麻醉剂、合适的助悬剂和分散剂、合适的乳化剂、合适的多价螯合剂或螯合剂、合适的pH调节剂等载体。
合适的抗微生物剂或防腐剂包括，但不限于，苯酚、甲酚、汞剂、苯甲醇、氯代丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(例如苄索氯铵)、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯及山梨酸。合适的等渗剂包括，但不限于，氯化钠、甘油和葡萄糖。合适的缓冲剂包括，但不限于，磷酸盐和柠檬酸盐。合适的局部麻醉剂包括，但不限于盐酸普鲁卡因。合适的助悬剂和分散剂为如本发明描述的那些，包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。合适的乳化剂包括本发明描述的那些，包括聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯。聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯80和油酸三乙醇胺酯。合适的多价螯合剂或螯合剂包括，但不限于EDTA。合适的pH调节剂包括，但不限于氢氧化钠、盐酸、柠檬酸和乳酸。
本发明提供的药物组合物可以配制成立即或改性释放剂型，包括延迟-、缓释-、脉冲-、控制-、靶向-和程序化释放形式。
本发明的药物组合物除了对人类血管、神经、肌肉损伤疾病有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物中的哺乳动物。另外一些动物的实例包括马、狗和猫。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
下面以VCAN+少突胶质前体细胞为例，进行VCAN+少突胶质前体细胞的制备及有效性验证
实施例1单细胞测序筛选实验鉴定
VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15、CSPG4阳性OPC细胞
对脑组织样本进行单细胞转录组测序，得到原始数据后根据基因表达marker对单细胞群体进行分群，根据Marker基因PDGFRA的表达鉴定到OPC类群(详见附图1)，利用主成分分析、聚类分析等判断不同基因在不同细胞的表达特异性，进而筛选可能用于进一步分群的marker，结果显示VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15、CSPG4的分群效果较好，用于后续进一步验证。
发明人利用iPSC诱导分化上述六种基因(VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15、CSPG4)阳性的细胞，并对细胞进行功能验证，发现上述细胞及相应的外泌体均具有促进血管和肌肉生成并抑制神经元死亡等作用，下面以VCAN+OPC细胞为示例进行描述。
实施例2 iPSC诱导分化PDGFRA+VCAN+OPC细胞制备
利用购买得到的iPSC细胞，在6孔板中培养iPSC细胞,培养基成分(KnockoutDMEM,1％非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，100-LM 2-巯基乙醇)，培养7天；然后换神经前体细胞(NPC)分化用的无血清N2培养基培养基(DMEM/F12、2％N2补充剂、2mM L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、1％丙酮酸钠+20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和20ng/mL表皮生长因子(EGF)中培养7天；为诱导其向OPC细胞分化，将神经前体细胞(NPC)接种在涂有聚D-赖氨酸(PDL，10lg/mL)-层粘连蛋白(5lg/mL)的盖片上，在添加10ng/mL血小板衍生生长因子(PDGF)的N2培养基中继续培养4天，前2天N2培养基中也含有20ng/mL的FGF2和20ng/mL的EGF。最后将培养的细胞用PDGFRA+染色鉴定其为OPC细胞，参考附图2，结果发现细胞亚群的VCAN蛋白阳性表达率为95.4％，LARS2蛋白阳性表达率为93.46％，TTR蛋白阳性表达率为87.55％，MAL蛋白阳性表达率为79.07％，PCDH15蛋白阳性表达率为85.31％和CSPG4蛋白阳性表达率为91.39％，参考附图3。
实施例3 PDGFRA+VCAN+OPC细胞来源外泌体分离和鉴定
通过超速离心法从PDGFRA+VCAN+OPC细胞中分离外泌体：
1)将P6-P10代PDGFRA阳性，VCAN或LARS2或TTR或MAL或PCDH15或CSPG4阳性合格的少突胶质前体细胞用无血清培养基培养2天以上,收取细胞上清液进行外泌体提取；
2)稳定细胞株培养上清液4℃/300g离心10分钟,取上清，细胞的上清液4℃/2000g离心10分钟,取上清；去除死细胞的上清液4℃/10000g离心30分钟,取上清；
3)沉淀外泌体:重悬液4℃/100000g离心70分钟,沉淀即为外泌体,用适量PBS重悬,分装保存于-80℃冰箱。
4)取100uL1×PBS均匀吹打离心沉淀物,待其均匀悬浮在PBS中后,将重悬液转移至新的1.5mL离心管中；将含有重悬液的1.5mL离心管于4℃以12000g离心2min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒。
5)将上清液于4℃以3000g离心10min,离心后收集柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒，通过电镜对外泌体形态进行观察，参考附图4A、通过粒径检测，参考附图4B，和外泌体标志物CD9、CD81和CD63等进行检测，参考附图4C，结果发现外泌体分离成功。
实施例4 PDGFRA+VCAN+OPC细胞来源外泌体促进血管生成和抑制神经元死亡结果
通过HUVEC血管形成实验研究PDGFRA+VCAN+OPC细胞来源外泌体对血管生成的影响：用Matrigel法检测血管生成情况。将预冷的96孔板每孔涂有100μL Matrigel胶，并在37℃孵育30min进行聚合。将外泌体促进处理血管内皮细胞，以4×105cells/mL的密度接种于聚合基质表面，37℃孵育6h，用奥林巴斯DP71显微镜随机采集3幅或3幅以上图像，用ImageJ软件测量小管总长度和分支数，结果发现PDGFRA+VCAN+OPC细胞来源外泌体可诱导血管生成，参考附图5A-5B；
神经元活性通过碘化丙啶(PI)和Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)双染色法测定：4PI是DNA特异的红色荧光染料，仅适用于死亡细胞，而Hoechst 33342是一种蓝色荧光染料，用于染色活细胞和死亡细胞的细胞核。将外泌体处理的神经元用磷酸盐缓冲液冲洗，然后用37℃稀释的Hoechst 33342(40μM)孵育15min，然后用含PI(50μM)的神经元基础培养液在37℃孵育10min。染色后立即在倒置荧光显微镜下观察培养液中的荧光信号。细胞死亡表示为PI阳性死亡细胞占Hoechst33342阳性细胞总数的百分比，结果发现PDGFRA+VCAN+OPC细胞来源外泌体可抑制神经元死亡，参考附图5C。
实施例5 PDGFRA+VCAN+OPC细胞来源外泌体改善小鼠脑卒中后认知功能障碍
将分离的外泌体以0.1-10mg/ml的浓度，采用注射或滴鼻的方式对脑卒中后认知功能障碍小鼠进行干预，通过静脉回输方式干预，进而通过Morris水迷宫实验对小鼠行为学进行研究，具体包括：路径长度(path length)、逃避潜伏期(Escape latency)和目标象限时间(Time in target quadrant(％))进行定量,结果发现：从第8(day8)到11(day11)天，Vcan+OPC来源的外泌体干预组显著改善了疾病组(PSCI)的路径长度和逃避潜伏期，参考附图6A-B，另外Vcan+OPC来源的外泌体干预组在目标象限时间也显著高于疾病组(PSCI)，参考附图6C，这些结果说明Vcan+OPC来源的外泌体可改善PSCI的脑卒中后认知功能障碍。
实施例6 PDGFRA+VCAN+OPC细胞来源外泌体中VWF、VEGFA、PSAP和TTR的浓度显著升高
分别对VCAN+OPC和VCAN-OPC来源的外泌体提取蛋白，然后通过ELISA试剂盒分别对VWF、VEGFA、PSAP和TTR的浓度进行检测。实验重复3次，通过SPSS统计两组中VWF、VEGFA、PSAP和TTR的浓度差异和显著性，结果发现与VCAN-OPC来源的外泌体相比，VCAN+OPC来源的外泌体中VWF(VCAN+OPC＝312.21±19.12，VCAN-OPC＝147.23±8.12)、VEGFA(VCAN+OPC＝467.30±15.40，VCAN-OPC＝175.00±12.40)、PSAP(VCAN+OPC＝345.12±23.12，VCAN-OPC＝135.23±16.23)和TTR(VCAN+OPC＝534.21±26.23，VCAN-OPC＝279.23±23.14)的含量显著升高，参考附图7。
由以上实施例可知,本发明提供了一种高表达VCAN、LARS2、TTR、MAL、PCDH15或CSPG4的一类OPCs细胞亚群(VCAN+OPC)和其来源的外泌体，外泌体成分含有VWF、VEGF、PSAP和TTR，OPCs细胞和外泌体可促进血管和肌肉生成并抑制神经元死亡，发挥神经保护作用，改善的功能。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种外泌体，其特征在于，所述外泌体是由VCAN呈阳性的少突胶质前体细胞亚群产生的。
2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体包含下列蛋白至少之一：VWF、VEGF、PSAP和TTR。
3.权利要求1或2所述的外泌体在制备药物中的用途，所述药物具有改善脑卒中认知功能障碍的功效。
4.一种药物，其特征在于，所述药物中含有权利要求1或2所述的外泌体。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物为溶液剂、气雾剂、滴鼻剂、混悬剂、干粉剂或注射剂。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述外泌体在所述药物中的浓度为0.1~10mg/mL。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求4-6任一项所述的药物。
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