CN102325878A

CN102325878A - 少突胶质前体细胞的靶向细胞群及制备与使用方法

Info

Publication number: CN102325878A
Application number: CN2009801574087A
Authority: CN
Inventors: A·卡佩拉; 内田伸子
Original assignee: StemCells California Inc
Current assignee: StemCells California Inc
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2012-01-18
Also published as: EP2379711B1; EP3187581A1; EP2379711B8; US20180187148A1; WO2010075500A1; US20100158878A1; EP2379711A1; US10400214B2

Abstract

本申请提供了富集靶向少突胶质前体细胞(OPCs)的细胞群的方法，少突胶质前体细胞(OPCs)可以分化成少突胶质细胞。靶向OPCs可扩增，并且任选诱导其分化成少突胶质细胞。靶向OPCs及其后代有益于治疗中枢神经系统轴突脱髓鞘相关疾病。

Description

少突胶质前体细胞的靶向细胞群及制备与使用方法

发明领域

本发明涉及少突胶质前体细胞群的分离、鉴定、增殖、分化和移植。

背景技术

中枢神经系统(“CNS”)发育期间，多能神经前体细胞，也被称为神经干细胞，增殖并瞬时产生分裂祖细胞，最终分化成组成成人大脑的细胞类型。干细胞(来自其他组织)通常定义为具有自我更新(例如，形成更多的干细胞)、增殖、并分化成不同表型谱系的能力。在神经干细胞中，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞已从若干种哺乳动物，包括小鼠、大鼠、猪和人体中分离出。参见，例如，WO 93/01275、WO94/09119、WO94/10292、WO94/16718，以及Cattaneo et al，MoI.Brain Res.，42，pp.161-66(1996)，通过引述全部合并于本文中。少突胶质细胞的主要功能是高等脊椎动物中枢神经系统轴突的髓鞘形成。少突胶质前体细胞(OPCs)优于少突胶质细胞。

发明内容

本发明提供了富集的靶向少突胶质前体细胞群(OPCs)，其可以进一步分化成少突胶质细胞。根据一些实施方案，提供了少突胶质前体细胞(OPCs)的细胞群，其充分富集了表达PDGFRα抗原的细胞。

根据一些实施方案，靶向OPCs是PDGFRα⁺和又是CD105^-。根据一些实施方案，靶向细胞群富集OPCs，呈PDGFRα(PDGFRAα⁺)免疫阳性并且呈CD105免疫阴性(CD 105^-)。根据一些实施方案，靶向细胞群富集OPCs，呈PDGFRα免疫阳性(PDGFRα⁺)，并且呈CD133免疫阳性(CD133⁺)，以及呈CD105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向OPCs是PDGFRα⁺和又是A2B5^lo、A2B5^-，或其混合物(A2B5^lo/-)。根据一些实施方案，靶向细胞群富集OPCs，呈PDGFRα免疫阳性(PDGFRAα⁺)，呈CD 133免疫阳性(CD 133⁺)，并且呈A2B5免疫阴性(A2B5^-)。根据一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFRα⁺、A2B5^lo/-。根据其他一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFR α⁺、CD133⁺、A2B5^-。根据其他一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFRα⁺、CD133⁺，A2B5^lo/-。根据其他一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^-，PSA -NCAM^-。根据一些其他实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^-。根据一些其他实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^-、PSA-NCAM^lo/-。根据一些其他实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFR α⁺、CD133⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-。

根据一些实施方案，靶向OPCs是PDGFRα⁺、CD 105^-，又是A2B5^lo、A2B5^-，或其混合物(A2B5^lo/-)。根据一些实施方案，靶向OPCs细胞群富集OPCs，呈PDGFRα免疫阳性(PDGFRα⁺)，呈CD133免疫阳性(CD133⁺)，并且呈A2B5免疫阴性(A2B5^-)，呈CD 105免疫阴性(CD105^-)。根据一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFRα⁺、CD 105^-、A2B5^lo/-。根据一些其他实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFRα⁺、CD133⁺、CD 105^-、A2B5^-。根据其他一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFR α⁺、CD133⁺、CD 105^-、A2B5^lo/-、PSA -NCAM^-。根据其他一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFR α⁺、CD133⁺、CD 105^-、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^-。根据一些其他实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFR α⁺、CD133⁺、CD 105^-、A2B5^-、PSA-NCAM^lo/-。根据其他一些实施方案，靶向OPCs细胞群是PDGFR α⁺、CD133⁺、CD 105^-、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-。

根据一些实施方案，鉴别、分离、或富集靶向少突胶质前体细胞群的方法，将一种试剂接触包含至少一个OPC的细胞群，这种试剂结合表达于OPC细胞表面的表面标记抗原。根据优选的实施方案，靶向少突胶质前体细胞富集细胞群是通过将含有至少一个OPC的细胞群与结合PDGFRα的一种试剂接触而得到。优选地，该试剂是一种结合PDGFRα的抗体。使用传统的细胞分选技术，如通过免疫筛选(如，FACS)，鉴别、分离、和/或富集细胞，其中试剂与PDGFRα抗原接触被检测到。

根据一些实施方案，本发明提供了生产富集靶向少突胶质前体细胞的细胞群的方法，用单克隆抗体接触神经细胞或神经来源细胞，这种单克隆抗体结合不在靶向少突胶质前体细胞内的负筛择标记；筛选结合单克隆抗体的细胞；并除去标记细胞。细胞群内剩余细胞富集少突胶质前体细胞。本领域的技术人员应认识到，一个负选择标记是一个仅存在于非OPC细胞的标记物(如，抗原)。在多个实施方案中，单克隆抗体可能被荧光标记或者可能结合磁性粒子，并且筛选可通过荧光激活细胞分选、高梯度磁筛选、固定相吸脱附，或任何其他常用筛选技术。在优选实施方案中，含有神经或神经来源细胞的细胞群是从悬浮培养、贴壁培养中获得，或来自新鲜的神经组织。这些方法还可能涉及使用第二抗体或系列抗体接触剩余细胞进一步富集少突胶质前体细胞的细胞群。举例来说，靶向OPCs细胞群的富集可通过采用特异性结合CD 133的抗体接触神经或神经来源细胞，随后采用特异性结合PDGFRα的抗体接触剩余细胞获得富集呈CD 133和PDGFRα免疫阳性的少突胶质前体细胞的细胞群。此外，神经或神经来源细胞培养基可与一种特异性结合PDGFRα的抗体接触，产生富集了呈PDGFRα免疫阳性的OPCs细胞群。

根据一些实施方案，本发明提供了分离少突胶质前体细胞(OPC)的方法，通过从神经或神经来源细胞群筛选呈CD133免疫阳性的细胞(CD133⁺细胞)；从细胞群去除非免疫反应(CD133^-)细胞；并从剩余细胞群中筛选至少一个细胞，该细胞是PDGFRα免疫阳性的(PDGFRα⁺)，例如，结合单克隆抗体PDGFRα。在其它实施方案中，本发明提供了生产富集少突胶质前体细胞群的方法，通过用特异性结合PDGFRα的抗体接触神经或神经来源细胞，筛选是PDGFRα^hi细胞的那些细胞，其中，与神经或神经来源细胞对比，所筛选的细胞富集少突胶质细胞前体细胞。本领域的技术人员应认识到，神经或神经来源细胞可以从神经球培养中获得(细胞团或细胞聚集体)，或从贴壁培养中获得。在一些实施方案中，这种方法还涉及从细胞群中去除PDGFRα^lo/med细胞的步骤。

根据一些实施方案，本发明提供了分离神经或神经来源细胞(OPC)的方法，通过从神经或神经来源细胞中筛选呈CD105免疫阴性的细胞(CD105^-细胞)；从细胞群中去除非免疫阳性的细胞(CD105⁺)；从剩余细胞群中筛选至少一个细胞，该细胞呈PDGFRα免疫阳性(PDGFRα⁺)，例如，结合单克隆抗体PDGFRα。根据一些实施方案，本发明提供了分离少突胶质前体细胞(OPC)的方法，通过从神经或神经来源细胞群中筛选呈PDGFRα免疫阳性的细胞(PDGFRα⁺细胞)，例如结合单克隆抗体PDGFRα；从细胞群中去除非免疫阴性的细胞(PDGFRα^-)；并从剩余细胞群中筛选至少一个细胞，该细胞呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

在其它实施方案中，本发明提供生产富集了少突胶质前体细胞的细胞群，通过特异性结合PDGFRα的抗体接触神经或神经来源细胞，神经或神经来源细胞包含至少一个多能神经干细胞，其中，与神经或神经来源细胞对比，所筛选的细胞富集了少突胶质细胞前体细胞。本领域的技术人员应了解，神经或神经来源细胞可以从神经球培养中获得(细胞团或细胞聚集体)，或从贴壁培养中获得。在一些实施方案中，这种方法还涉及去除细胞群中的PDGFRα^lo/med细胞的步骤。

根据一些实施方案，本发明提供了生产富集少突胶质前体细胞的方法，去除神经或神经来源细胞群中的分化细胞或成纤维细胞标记呈阳性的细胞(例如，CD105)。这可以通过用抗分化细胞标记的单克隆抗体接触细胞群，并去除结合单克隆抗体的那些细胞来完成。所获得的细胞群可能进一步使用本文所述的方法之一进行富集。通过非限制实施例，该方法可涉及进一步富集少突胶质前体细胞群的步骤，通过特异性结合PDGFRα的抗体接触剩余细胞。在多种其他优选实施方案中，部分可以任选通过剩余细胞中筛选的细胞进行富集，所筛选的细胞是PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-和其混合物及组合。

根据额外的实施方案，本发明提供了增殖富集少突胶质前体细胞群的方法，将至少一个所选细胞引入到无血清培养基中，无血清培养基包含一个或多个生长因子，该生长因子选自由LIF、EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、Sonic hedgehog(Shh)、IGF1、CTNF、Noggin、和NT3，及其组合组成的组；增殖至少一个选自培养基的细胞。优选地，增殖富集少突胶质前体细胞群的方法包括：将至少一个所选细胞引进到无血清培养基，无血清培养基包含一个或多个生长因子，生长因子选自PDGF-AA、NT3、bFGF、IGF1及其组合组成的组；增殖选自培养基的至少一个细胞。

另外提供了增殖并分化靶向OPCs的方法。根据一些实施方案，诱导OPCs的增殖(和分化)可以通过将细胞培养在悬浮液中或细胞附着在基板上培养来完成。可供选择地，在适当条件下，OPCs的增殖和分化可按下列组合在宿主体内被诱导：(1)在体外增殖和分化，然后移植，(2)体外增殖，移植，然后体内再增殖并且分化，(3)体外增殖，移植，体内分化，以及(4)体内增殖和分化。体内或原位增殖和分化可涉及非手术方法，采用制药操作使OPCs在体内增殖。

根据一些实施方案，提供了治疗或改善哺乳动物脱髓鞘或髓鞘形成不良性疾病或紊乱的方法，包括对哺乳动物给药靶向OPC或靶向OPCs细胞群。

哺乳动物优选患有脱髓鞘或髓鞘形成不良性疾病，包括，但不限于，多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性脑硬化、出血性坏死性脑炎，辐射诱导髓鞘形成病症、横贯性脊髓炎、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)、脑瘫(CP)和脑白质营养不良。疾病优选多发性硬化症、Pelizaeus-Merzbacher病，或脑瘫。哺乳动物可以另外服用至少一种生物制剂，它可提高OPCs数量和/或至少一个因素是众所周知刺激少突胶质细胞分化、生长、增殖、或存活。该OPCs，少突胶质细胞促进因子(S)，生物试剂(S)，和/或其他因素(S)可能以任何方式施用，接触哺乳动物的该因子和/或/具有目标OPCs的试剂，例如全身(例如，皮下)或原位。优选的，OPCs、少突胶质细胞促进因子(S)、生物剂(S)、和/或其他因子(S)，可施用进大脑，更优选施药进大脑侧脑室或施药进脑实质。

附图说明

图1.采用甲基绿复染shiverer/scid小鼠加亮细胞核矢状面。箭头表示用人OPCs注入脑部的3个区域。缩写：cc，胼胝体；fb，菌毛；cb，小脑。

图2.在新生儿shiverer/scid小鼠中植入OPC的实施例。上排显示scl21染色，加亮所有供体来源细胞。下排显示一系列完全相同部分进行MBP染色。划出的虚线地区指出植入区和对应的髓鞘形成区。在该实施例中，靶向上丘。细胞系信息：FBR 2711，P6，移植后第8周。使用的缩写：str，纹状体；cc，胼胝体；sc，上丘。

图3.在新生儿shiverer/scid小鼠中植入MBP-GFP转导的OPC的实施例。上排显示绿色荧光蛋白染色，加亮活性转录MBP基因的供体来源细胞。下排显示一系列完全相同部分进行MBP染色。小脑周围划出虚线地区，在右侧放大显示。请注意，MBP图上如白色箭头指出的小脑数字错位。细胞系信息：FBr 2703，P6，移植后第8周。使用的缩写：cb，小脑。

具体实施方式

除非另外定义，本文中使用的所有科技术语具有普遍被本发明所属领域的技术人员所理解的相同涵义。尽管类似于或等同于本文描述的方法和材料可以在本发明的实施或测试中使用，适宜的方法和材料在下文进行了描述。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引述全部合并于本文中。发生冲突情况下，本说明书，包括定义，将进行调节。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的，不是故意限制。本发明的其它特征和优势从下面的详细描述和权利要求书来看是显而易见的。

节标题在这里只用于组织目的，而不是被视为以任何方式限制主旨。

定义

为了促进理解本文所述的实施例，以下将参照本发明优选实施方案，具体的语言将用来描述同样的事情。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案，而不是为了限制本发明的范围。除非本文另外清楚说明，正如本公开内容中使用的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数。因此，举例来说，一种“细胞”的提法包括多种这种细胞，一种“抗体”的提法是一个或更多的抗体，等等。

本文中所使用的术语“靶向细胞群”是指那些刻意被提纯或富集的细胞。优选地，靶向细胞群是少突胶质前体细胞，显示如本文所述的独特模式的细胞标记。

“少突胶质细胞”(OLs)或少突神经胶质周知为中枢神经系统(CNS)的成髓鞘胶质细胞。术语“少突胶质前体细胞”或“OPC”指的是未成熟的少突胶质细胞，在一定条件下能够分化成中枢神经系统的成髓鞘胶质细胞。该术语包括从原发性组织分离出来的少突胶质前体细胞和体外培养成OPCs的细胞，以及少突胶质前体细胞的后代，因此包括OPCs和子代OPCs。

术语“神经干细胞”是用于未分化、多能、自我更新、神经细胞的更普遍的术语。神经干细胞是一种克隆多能干细胞，它能够分化，适当条件下，具有自我更新能力，并且可以在其后代子细胞内，可以分化形成神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞。因此，神经干细胞是“多能的”，因为干细胞后代具有多种分化途径。神经干细胞能够自我维护，即伴随每次细胞分裂，一个子细胞也将成为干细胞。

神经干细胞的非干细胞后代通常称为“祖细胞”或“前体”细胞，能够在一个或多个谱系内产生多种细胞类型。术语“神经祖细胞”或“神经前体细胞”指的是源自神经干细胞的未分化细胞，本身不是干细胞。一些祖细胞能产生后代，能够分化成多种细胞类型。举例来说，O-2A细胞是一种神经胶质祖细胞，生成少突胶质细胞和Ⅱ型星形胶质细胞，因此，可称为“双向”祖细胞。祖细胞的一个显着特点是，不像干细胞，它不会出现自我维护。此外，祖细胞通常被认为是分化的特殊路径，适当条件下，将最终分化成胶质细胞或神经元。

术语“神经细胞”或“神经来源细胞”广泛地指与有机体的中枢神经系统(CNS)相关的细胞，例如神经元、神经胶质细胞、和前体细胞。如本文中所使用的神经细胞可能是从神经组织分离出来或者源自神经组织，以及任何细胞，不论其起源如何，至少具有神经元或神经胶质表型的显示，如对一个或多个神经元或神经胶质标记进行染色，或者将分化成显示神经元或神经胶质标记的细胞。因此，术语可作为一般术语提到，举例来说，被分离且体外培养的原代细胞，培养的源自神经组织的永生细胞，神经组织细胞；和/或者培养表现神经表型的细胞。术语，就是包括所有表现神经细胞表型和/或神经组织中分离出的细胞。因此，术语神经细胞还包括是神经前体细胞和分化神经细胞的细胞。本文中所使用的术语“神经细胞”是指神经元。

术语“阳性选择”是指具有亲合力的试剂直接结合靶向细胞群从混合细胞群中除去靶向细胞群对进行靶向细胞群进行纯化和富集的方法。

相反，术语“阴性选择”是指具有亲合力的试剂直接结合非靶向细胞群从混合细胞群中除去非靶向细胞群对进行靶向细胞群进行纯化和富集的方法。举例来说，CD45是T200/白细胞共同抗原。人中枢神经系统干细胞(CNS-SC)，优选那些可以诱发神经球，并将其包含在内的培养基，另外的特征是缺乏某些细胞表面标记如CD45。因此，识别CD45的试剂可能在阴性选择方法中有助于去除非靶细胞。

“原代克隆球”是由脑组织培养产生的神经球。典型地，脑组织在适当培养基内培养之前经解剖并机械分离，形成神经球。对示范性方法进行了描述，例如，美国专利5,750,376，通过引述全部并入本文中。

“次级神经球体”是由分离(传代)原代神经球体并在由单细胞形成神经球体的条件下培养被分离的细胞而生成的一种神经球体。“哺乳动物”是哺乳动物家庭内的任何成员。哺乳动物优选灵长类动物、啮齿类动物、猫、狗、家畜(如牛、羊、山羊、马、猪)，最优选人。

一个“脱髓鞘疾病”或“髓鞘形成不良症”是一种疾病、紊乱，或病症，由髓磷脂数量不足造成或与其有关。脱髓鞘是髓鞘去除的过程，例如原来存在的髓磷脂的损失。没有髓磷脂形成或者数量不足的髓磷脂形成，发生了髓鞘形成障碍，例如，由于功能失调的OPCs或少突胶质细胞(OLS)。脱髓鞘和髓鞘形成障碍的最终结果是髓鞘形成减少。这些疾病、紊乱或病症的实施例包括，举例来说，多发性硬化症(包括复发和慢性进展型多发性硬化症、急性多发性硬化症、视神经脊髓炎(Devic病))、弥漫性脑硬化(包括Shilder弥漫性轴周脑炎和Balo同心圆性硬化)。脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍还包括多种疾病，其中脱髓鞘是由病毒感染、疫苗、脊髓损伤、和遗传性疾病引发的。这些脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍的实施例包括急性播散性脑脊髓炎(患得麻疹、水痘、风疹、流感、腮腺炎之后发生的；或者接种狂犬病疫苗或牛痘疫苗之后发生的)、坏死性出血性脑炎(包括出血性白质脑炎)和脑白质营养不良(包括Krabbe globboid脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病变、肾上腺脊髓神经病变，辐射诱导髓鞘化障碍、横贯性脊髓炎，佩-梅病(PMD)，海绵状脑白质营养不良症和亚历山大病)。脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍优选多发性硬化症、脑性麻痹、弥漫性脑硬化、或佩-梅病(PMD)，并且，最优选佩-梅病。

“治疗”或“改善”是指减少或彻底消除了疾病或身体状况的症状。

“有效剂量”是一种足以达到预期目的的治疗剂用量。一种给定治疗药物的有效剂量会随一些因素如药物性质、给药途径、接受这种治疗剂的动物大小和动物品种以及给药目的而有所不同。在个别情况下，有效剂量可能会由医师根据本领域制定的方法凭经验确定。

术语“脑室”是指中枢神经系统内脑脊髓液流过的任何腔或者通道。因此，该术语不仅包括侧脑室、第三脑室和第四脑室，也包括中央管、中脑水管和其他中枢神经系统腔室。

细胞标记

本发明提供了鉴别、分离、或富集靶向少突胶质前体细胞群的方法。少突胶质前体细胞(OPCs)靶向细胞群的表征为细胞表面标记物的表达。虽然本领域普遍根据特定标记物将细胞称为“阳性的“或”阴性的“，实际表达水平是数量性状的。细胞表面的分子数量可以几个对数级变化，仍然被定性为“阳性的”。本领域技术人员也应了解，那些细胞是阴性染色，标记物特异性试剂结合水平没有检测出不同于对照组，例如，同型匹配对照组；可表达少量标记物。染色水平的鉴别在细胞群之间存在微妙差别。

细胞染色强度可以用流式细胞仪进行监测，其中激光检测定量水平的荧光染料(与特异性试剂(如抗体)结合的细胞表面标记物的数量成正比)。流式细胞仪，或FACS，也可基于结合特异性试剂的强度以及其他参数如细胞大小和光散射来分离细胞群。虽然染色的绝对水平可能不同于特定荧光染料和反应制剂，可以将数据归一化到对照组。

为了归一化分布进行对照，每个细胞记录为具有特定强度染色的数据点。这些数据点可根据对数坐标绘制，度量单位是任意的染色强度。在一个实施例中，细胞群中的最大细胞被指定为4个对数级(即10,000倍)，远远高于具有最低水平染色的细胞。当以这种方式绘制时，很明显，最高对数级染色强度的细胞是亮的，而最低强度染色的细胞是阴性的。“低”染色细胞，2-3个对数级(即100-1000倍)染色强度，可具有不同于阳性细胞和阴性细胞的属性。可供选择的对照组可利用其表面具有确定密度的标记物的底物，举例来说，制备的微珠或细胞株，提供了强度的阳性对照。“低”标记表明，染色水平高于同型相匹配对照组的亮度，但并不像细胞群中通常发现的最明亮的染色细胞那么强。

为界定特定抗体染色强度的目的，同型匹配对照将界定“非特异性”或“阴性”染色的信号强度。而任何导致信号强度高于对照组的染色被认为是“阳性”染色。划定阴性和阳性染色的界线按常规设定，使得事件频率在边界左边，低于边界，边界＞0.99且＜1.0。阳性染色强度可以被进一步细分和归类为低、中、高，分别定义任意标度从对照组边界至最高记录信号强度，并且确定在33^rd和66^th百分点处划分另两条线。这些定义的组间低段、中段、高段测量的信号可以分别被命名为低、中、高染色强度。

细胞分选

使用细胞表面抗原分离、筛选、或富集少突胶质前体细胞(OPCs)提供了靶向OPC细胞群阳性免疫筛选和阴性免疫筛选，以及使用流式细胞仪表型分析靶向OPC细胞群的方法。制备大体纯化的靶向OPC细胞群，经PDGFRα结合，OPCs亚群从其他细胞中分离出来。OPCs可能进一步通过结合本领域周知的其他表面标记物被分离。筛选出的表达PDGFRα抗原的细胞，举例来说，可能通过本文中公开的其他靶向OPC标记物的阳性和阴性免疫筛选进一步纯化。

分离步骤可能包括磁分离，采用抗体包被磁珠，亲和层析和采用附着于固体载体(如平板)的抗体“淘选”，或者其他简便技术。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选机，它可能具有不同程度的掺杂，例如多种颜色通道、低角度和钝光散射探测通道、阻抗通道等。死细胞染色后通过筛选被除去(碘化丙啶[PI]，LDS)。选取对所筛选细胞的存活没有太大不利的任何技术。

合宜地，抗体与标记物结合，以便分离特定细胞类型，如磁珠；生物素，高亲和力结合抗生物素蛋白或者链霉亲和素；荧光染料，可以与荧光激活细胞分选器一起使用；半抗原；和类似物质。可能采用多色分析与FACS或者多色分析与免疫磁性分离和流式细胞仪组合。利用多表面抗原，如PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、CD24^-等，多色分析利于细胞分离。荧光染料，发现在多色分析方法中采用，包括，举例来说，藻胆蛋白，如藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素和得克萨斯红。阴性标记表明，染色水平是同型匹配阴性对照组的亮度或低于其亮度，“dim”、“lo”或“low”标记表明，染色水平可能接近负染色的水平，但也可能比同型匹配对照组亮。

举例来说，PDGFRα抗体直接或间接地结合到磁化剂，如超顺磁性微粒(微粒)。通过使用如本领域周知的多种化学连接基团直接结合到磁性粒子上。抗体可通过侧链氨基或巯基和杂官能交联试剂耦合至微粒上。大量的杂官能化合物用于连接实体。优选的连接基团为与抗体上的活性巯基和磁性粒子上的活性氨基连接的3-(2-吡啶二硫)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)。

或者，抗体间接耦合于磁性粒子。该抗体可直接结合到半抗原上，半抗原特异性、第二阶段抗体结合于粒子上。适宜的半抗原的实施例包括，举例来说，地高辛、地高辛配基、FITC、二硝基苯基、硝基苯基、抗生物素蛋白、生物素等。半抗原结合蛋白质的方法，例如，本领域已知的，市面上有售的用于这种结合的试剂盒。

靶向OPC细胞群通过引入神经或神经来源细胞与抗体或结合表面标记物的试剂接触进行筛选。举例来说，抗体被添加到细胞样本中。结合特定的细胞亚群所必需的抗体或其他试剂的用量由执行测试分离和分析经验确定。举例来说，细胞和抗体/试剂被孵育足够长时间形成配合物，优选至少约5分钟，更优选至少约10分钟，通常不超过一个小时，更通常不超过约30分钟。这些细胞另外可以与对细胞表面标记物具有特异性的抗体或结合分子一起孵育，细胞标记物已知存在于OPCs中或不存在于OPCs中。

标记的细胞按照特异性抗体制备所述进行分离。荧光标记抗体对流式细胞仪分离、免疫磁性细胞分选的磁性粒子、尤其高梯度磁性分选(HGMS)等等是有用的。示范性磁性分离器在WO90/07380、PCT/US96/00953、和EP 438520中进行了描述，通过引述其公开内容合并于本文中。

纯化的细胞群可从任何适当培养基中收集。多种培养基市面有售并可以与5mM EDTA一起使用，包括达氏修正依氏培养基(DMEM)，汉克平衡盐缓冲液(HBSS)，Dulbecco′s磷酸缓冲盐(DPBS)、RPMI、IMDM细胞培养基(IMDM)、磷酸盐缓冲液(PBS)，等等，经常附加小牛血清(FCS)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)，等等。

靶向OPCs高度富集细胞群以这种方式获得。所需的细胞会占细胞组合的30％或者30％以上，优选为细胞群的50％或以上(例如，60％或以上，70％或以上，75％或以上，80％或以上，85％或以上，90％或以上，95％以上)，更优选为细胞群的90％或以上(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)，最优选为细胞群的95％或以上(例如，97％、99％)(大体纯化的)。获得的富集程度，实际采用的，取决于一些因素，包括，但不限于，筛选方法、生长方法、和/或放置在细胞培养基内的细胞量。

细胞的分离、富集、和筛选

本发明提供了OPCs的分离和鉴定。使用特异性结合PDGFRα的抗体或其他试剂，本发明的方法可以用来从PDGFRα细胞中分离PDGFRα⁺细胞，抗体或试剂结合包含一小部分OPCs的神经或神经来源细胞群，然后筛选PDGFRα⁺细胞，与分选前的神经或神经来源细胞群比较，产生富集在PDGFRα⁺OPCs中所筛选出的细胞群。

OPCs被分离出来的细胞群优选为神经组织，神经组织分离出的细胞群，产生神经细胞或神经组织的细胞群，或者细胞培养基中的细胞群，例如，神经球培养或者贴壁神经干细胞培养中的细胞。少突胶质细胞前体细胞(OPC)鉴别涉及采用结合细胞表面标记物的试剂接触细胞群或神经细胞群(或者包含神经或神经来源细胞的组织)，细胞表面标记物由OPCs靶向细胞群表达。举例来说，该方法可包括采用结合PDGFRα(如，一种单克隆抗体)的试剂接触神经或神经来源细胞群，并检测结合PDGFRα的试剂和细胞表面上的PDGFRα之间的接触反应。靶向OPCs包括在试剂结合试剂的细胞群内。这些细胞的鉴别可通过本领域已知的一些测试方法证实，证明细胞是，事实上，OPCs，如能够增殖并分化为成熟的少突胶质细胞。

根据一些实施方案所述的OPCs可进一步表现为呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。因此，鉴别、分离、或富集少突胶质前体细胞群的方法可以另外包括从神经或神经来源细胞中筛选呈CD105免疫阴性的细胞(CD 105^-细胞)，并从细胞群中去除CD 105⁺细胞。筛选CD 105^-细胞之后，从现有细胞群中筛选出至少一个呈PDGFRα免疫阳性(PDGFRα⁺)的细胞。在备选方案中，本发明提供了分离少突胶质前体细胞(OPC)的方法，通过从神经或神经来源细胞群筛选呈PDGFRα免疫阳性(PDGFRα⁺)的细胞，例如，结合单克隆抗体PDGFRα；从细胞群中去除呈免疫阴性(PDGFRα^-)细胞，并从现有细胞群中筛选出呈免疫阴性CD 105(CD105^-)的细胞，例如从细胞群中去除CD105^-细胞。

根据一些实施方案所述的OPCs可进一步表现为呈CD 133免疫阳性(CD 133⁺)。因此，鉴别、分离、或富集少突胶质前体细胞群的方法可以另外包括从神经或神经来源细胞中筛选呈CD133免疫阳性的细胞(CD 133⁺细胞)，并从细胞群中去除CD133⁺细胞。筛选CD 133⁺细胞之后，从现有细胞群中筛选出至少一个PDGFRα免疫阳性(PDGFRα⁺)的细胞。

因此，本发明进一步提供了从神经组织或神经干细胞培养基中富集靶向OPCs(如，悬浮培养或贴壁培养)的方法。本发明的方法和组合物是有利于从神经组织中富集靶向OPC，其中干细胞和祖细胞出现频率低，或者可能已经所剩无几，如后期胚胎、青少年和成人组织。因此，本领域的一个技术人员可以使用一种试剂结合包含了一部分OPCs的神经或神经来源细胞，这种试剂特异性结合如PDGFRα细胞，然后筛选出PDGFRα⁺细胞。与筛选前的神经或神经来源细胞群比较，采用这种方式，筛选的PDGFRα⁺细胞在一部分OPCs中富集。依据优选的实施方案，靶向OPCs可基于中表达到高表达来进行定性(例如，PDGFRα^med或者PDGFRα^high)。举例来说，基于中表达到高表达(PDGFRα^med或者PDGFRα^high)，靶向OPCs包括在悬浮神经球中分选出的PDGFRα⁺细胞中。靶向OPCs可进一步依据本发明所述的标记CD105、CD133、A2B5、PSA-NCAM、O4、和/或NG2的表达来鉴别。

基于本领域中已知的细胞标记表达，筛选细胞群的方法可用于筛选本发明的OPCs细胞。举例来说，PDGFRα⁺和/或CD133⁺靶向细胞群的鉴别可能涉及采用结合到PDGFRα和/或CD133的试剂接触神经细胞群(或组织，其包含神经或神经来源细胞)，检测结合到PDGFRα和/或CD133的试剂和在细胞表面上的PDGFRα和/或CD133之间的接触。靶向OPCs包括在该试剂结合的那些细胞群内。而这些细胞的鉴别可以通过一些测试方法证实，证明细胞是，事实上，OPCs，如它们能够分化为成熟的少突胶质细胞。细胞分选的利用传统技术，如采用免疫反应筛选(例如，荧光激活细胞分离(FACS))，进行细胞的鉴别、分离和/或富集，其中试剂和PDGFRα抗原之间的接触被检测出。

本领域中的一个技术人员将分离出的靶向OPC(s)引入到培养基中；培养基中分离出的靶向OPC(s)增殖；该条件下孵育分离出的靶向OPC(s)的后代细胞，其中被分离出的靶向OPC(s)分化为少突胶质细胞；检测到少突胶质细胞的存在。分离出目标OPC(s)的特征是存在少突胶质细胞。

本领域已知的一些细胞标记也可用于OPCs细胞的阳性和阴性筛选。例如，抗人CD45单克隆抗体(mAb)可以用来排除胎儿组织中的血液细胞污染。在某些情况下，抗人CD34单克隆抗体(mAb)可以用来排除内皮细胞和内皮-神经祖细胞配合物。在某些情况下，抗人CD24抗体可以用来排除不太可能诱发神经球的那些细胞。这些抗体中一些可单独使用、组合使用、或在本方法中按顺序富集本文中公开的靶向细胞群。

使用本文所公开的技术和方法，使用适宜抗体或优选抗体系列，本领域中的一位技术人员可以通过免疫筛选得到靶向OPCs细胞群。根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺OPCs细胞，优选至少50-70％的PDGFRAα⁺OPCs细胞，更优选大于90％PDGFRα⁺OPCs细胞(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。更优选大体纯化的PDGFRα⁺OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺OPCs细胞(例如，97％或99％)。

根据一些实施方案，靶向细胞群含有至少30％的PDGFRα⁺、CD105^-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、CD 105^- OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、CD105^- OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、CD105^- OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、CD105^- OPCs(例如，97％或99％)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺、A2B5^-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、A2B5^-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、A2B5^-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、A2B5^- OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、A2B5^- OPCs(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/- OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、A2B5^lo/- OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/- OPCs(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα^med/high、A2B5^-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα^med/high、A2B5^- OPCs，更优选大于90％的PDGFRα^med/high、A2B5^-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα^med/high、A2B5^-OPCs细胞，包括至少95％的PDGFRα^med/high、A2B5^-OPCs(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，另外，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/- OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/- OPCs，更优选大于90％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/- OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/- OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/-OPCs，(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^- OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^- OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^- OPCs，(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，目标细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^lo/- OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、PSA-NCAM^lo/- OPCs，(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，目标细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^- OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^- OPCs，更优选大于90％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^- OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^- OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^- OPCs，(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^lo/-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^lo/-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^lo/-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^lo/-OPCs，包括至少95％的PDGFRα^med/high、PSA-NCAM^lo/-OPCs，(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^lo/-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^lo/-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^lo/-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^lo/-OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、CD133⁺、A2B5^lo/-OPCs(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺、CD133⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、CD133⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、CD 133⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、CD133⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、CD133⁺、PSA-NCAM^lo/-OPCs(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群包含至少30％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα^med/high、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-OPCs，(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。

根据一些实施方案，靶向细胞群含有至少30％的PDGFRα⁺、O4^-OPCs，优选至少50-70％的PDGFRα⁺、O4^-OPCs，更优选大于90％的PDGFRα⁺、O4^-OPCs(例如，92％或以上，94％或以上，96％或以上，或98％或以上)。最优选大体纯化的PDGFRα⁺OPCs细胞群、O4^-OPCs细胞群，包括至少95％的PDGFRα⁺、O4^-OPCs(例如，97％或99％)。根据一些实施方案，靶向细胞群又呈CD 105免疫阴性(CD 105^-)。富集程度，实际使用的，取决于一些因素，包括分选方法、增长方法、和/或培养基中放入的细胞量。

深低温保存和处理

根据一些实施方案，本实施方案的OPCs可按常规程序深低温保存。在一些实施方案中，深低温保存涉及在冷冻介质中冷冻约一个至一千万个细胞，其中可能包括增殖培养基和抗氧化剂如NAC(0.1至2mM，例如，0.5mM，1mM等)。增殖培养基优选无生长因子有丝分裂原。举例来说，悬浮细胞可被离心分离，吸出一些生长介质，用冷冻介质取代。然后，细胞慢慢被冻结，例如，-80℃下放置在容器内或冷冻在液氮中。细胞在37℃浴器内旋转解冻，再悬浮在新鲜的增殖培养基中，并正常生长。

根据一些实施方案，本实施方案的OPCs可以准备使用的形式(如医药级小瓶或容器)冻存。在一些实施方案中，OPCs在使用前解冻并培养。在一些实施方案中，OPCs在使用前解冻和在悬浮液中培养。在一些实施方案中，OPCs在使用前解冻并在贴壁基质上培养。解冻后培养期可能是1至24个小时。在一些实施方案中，解冻后培养期可能从1到2天。

根据一些实施方案，本发明的OPCs可处于悬浮培养液中。根据一些实施方案，本发明的OPCs细胞从培养板脱离后(如，胰蛋白酶后处理)可处于悬浮培养液中。举例来说，粘附的OPCs用胰蛋白酶处理脱离，并转移到悬浮培养液中。OPCs保存在悬浮液的时间可称为“保存”期。悬浮液中的保存期至少有以下3个原因的优势：1)移植和/或冷冻保存之前将使细胞从潜在破坏性酶处理中恢复；2)动物手术安排中更灵活；3)等待移植的OPCs能够装运到非现场处(实验室或诊所)。根据一些实施方案，保存期可能是2、4、6、8、12、18或24个小时。根据一些实施方案，保存期可能是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10天。

组织源

任何合适的组织源可用于得到本发明的OPCs。成人中枢神经系统已被证明包含具有增殖能力的少突胶质前体细胞，适当的条件下能长成为髓鞘少突胶质细胞。因此，细胞群可以从后期胚胎、青少年和成年哺乳动物中枢神经系统组织得到，也可能从神经干细胞现有培养基中得到，如Weiss申请的美国专利5,750,376，或者Johe申请的美国专利介绍5,753,506中描述的。OPCs也可从能够产生神经组织的任何组织或细胞源中得到。在一个优选的实施方案中，OPCs来自人。

OPCs可从几种哺乳动物的神经或神经来源细胞中分离得到，包括，但不限于，小鼠、大鼠、猪、非人灵长类动物、和人。神经或神经来源细胞可从胚胎、胎儿、产后、青少年、成人神经组织中得到，包括脑和脊髓。举例来说，神经或神经来源细胞可以从大脑皮层、小脑、中脑、脑干、脊髓和心室，以及包括颈动脉体和肾上腺髓质的PNS区域得到。其他优先区域包括基底神经节内的区域，优选由尾和壳组成的纹状体，或多种细胞群如苍白球、丘脑底核、基地核、黑质致密部，以及来自发现衬里中枢神经系统脑室的脑室组织，包括室管膜下区。在脑室下区和腹侧神经上皮是在成年动物中OPCs的优选来源。

除了OPCs，存在于成人中枢神经系统的细胞群，其表现出干细胞特性，能够自我更新并产生成人中枢神经系统的分化成熟细胞表型如少突胶质细胞。这些干细胞被发现在整个中枢神经系统内，尤其是在脑室下区和海马齿状脑回中，表明靶向OPCs细胞可从其中分离出的神经或神经来源细胞群的来源。神经干细胞也从多种成人中枢神经系统脑室区中分离出，包括额叶、圆锥脊髓、胸椎脊髓、脑干和丘脑下部。

生长因子响应干细胞可以从小鼠、鼠、哺乳动物和人中枢神经系统组织的神经轴的许多区域分离出并且处于不同发展阶段。这些细胞根据生长因子如EGF、碱性FGF(bFGF、FGF-2)和转化生长因子(TGFα)的应答而变化，可以未分化状态在培养基内保持并扩增一段较长时间。(参见，例如WO93/01275和WO94/16788，通过引述合并于本文中)。

增殖

OPCs可以在悬浮液或贴壁基质上培养细胞诱发增殖。参见，例如，美国专利5,750,376和5,753,506(通过引述全部都合并于本文中)，这里描述的培养基。同种异体移植和自体移植都拟用于移植目的。

通常情况下，本实施方案的OPCs在培养基中培养，使其生长和增殖。分离的OPCs增殖的培养基可能为一种无血清培养基，其包含有效诱导增殖的一个或多个预定的生长因子。培养液可附加生长因子，该生长因子选自血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2，bFGF)、NT3、IGF1或其组合。培养基可进一步附加N2和B27。OPCs分化成少突胶质细胞的条件包括在培养基内涂有层粘连蛋白或层粘连蛋白加纤维连接蛋白的表面上培养OPC后代，培养基含有胎牛血清(FBS)或T3(三碘甲状腺氨酸)而无EGF、bFGF、PDGF、NT3、IGF1或LIF。

根据一些实施方案，本实施方案的OPCs可能为从初生组织源分离后被传代1到20倍(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20倍)，并可在悬浮液或者贴壁基板上培养细胞而诱发增殖。传代(a.k.a，接种或分裂)通常涉及采用胰蛋白酶消化或机械手段从主要培养容器表面分离细胞。然后，由此产生的细胞悬液再细分，或补种，成新的培养基。二级培养基定期检查生长和进料，随后可能继代培养产生三级培养基等。细胞传代之间次数变化，取决于增长速度。

增殖培养基可以是本领域中已知的培养基，在无诱导其分化的情况下诱导OPCs的增殖。本文的实施例3提供了用于增殖本实施方案的OPCs的示范性培养基。细胞传代或分裂是维持细胞呈指数增长所必需的。细胞传代或分裂的方法是本领域中众所周知的。OPCs可使用本领域中周知的任何已知方法进行传代。

分化

当OPCs在分化的条件下培养，祖细胞分化为少突胶质细胞。细胞的分化能够采用本领域中已知的任何方法进行诱导，包括释放三磷酸肌醇和细胞内Ca²⁺、释放甘油二酯、激活蛋白激酶C、和其他细胞激酶，以及类似方法。采用佛波醇酯处理，诱导分化的生长因子、激素和其他化学信号可以诱导分化。生长因子耗尽可诱导分化，例如，通过去除有丝分裂原，细胞留在没有介质更新的培养基中，或者无传代的情况。

可以通过在悬浮液或在粘附基质上培养细胞实现诱导OPCs增殖(和分化)。或者，在适当条件下，在宿主体内，按照下列组合可诱发OPCs的增殖和分化：(1)在体外增殖和分化，然后移植，(2)在体外增殖，移植，然后体内再增殖和分化，(3)体外增殖，移植，体内分化，以及(4)在体内增殖和分化。在体内或者原位增殖和分化可能涉及非手术方法，采用制药操作让OPCs在体内增殖。涉及OPCs移植的这些方法在下文中进一步详细讨论。

纯化干细胞/祖细胞的使用。

使用本文所述的方法鉴别靶向OPC细胞群在多种方法中是有效的，包括药物筛选、诊断、移植和治疗。OPCs可被用于重建宿主，宿主细胞已因疾病或受伤而丧失。细胞相关遗传性疾病的治疗可采用自体或异体OPCs的基因改造，以纠正基因缺陷或者治疗而对疾病有抵抗力。或者，正常的异体OPCs可被移植。除了细胞相关那些疾病之外的疾病也可进行治疗，这种疾病涉及一种特定的分泌物不足，如激素、酶、生长因子、或类似物质。

中枢神经系统疾病包括许多病痛如神经退行性疾病(例如，老年痴呆症和帕金森氏)、急性脑损伤(例如，中风、局部缺血、颅脑损伤、脑性麻痹)和许多中枢神经系统功能障碍(如抑郁症、癫痫和精神分裂症)。近年来，神经退行性疾病已成为一个重要的问题，不断扩大的老龄人口成为这些疾病的最大风险。这些疾病，包括，举例来说，阿尔茨海默氏症、多发性硬化症(MS)、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病，关系到中枢神经系统特定位置的神经细胞变性，导致这些细胞或者大脑区域失去能力执行其预定功能。通过特异性不同的生长因子，达到成熟、增殖并分化为少突胶质细胞，少突胶质祖细胞可被用作少突胶质细胞的来源。

靶向OPC细胞群也可能用在细胞分化和成熟相关的分离以及因素评估中。因此，这些细胞可在检测中使用，以确定培养基的活性，如条件培养基，评估液体的生长因子活性，参与建立谱系，或类似行为。

靶向OPC细胞群可在液氮温度下冻结并存储较长时间，解冻，能够被重复使用。这些细胞通常会被储存在7.5％DMSO和4％HSA(人血清白蛋白)中。一旦解冻，使用生长因子或OPC增殖和分化相关的细胞，这些细胞可被扩增。

移植

从神经细胞群或神经组织中获得的靶向OPC细胞群可引入到哺乳动物中(例如，通过移植)，尤其用于补偿损失的或不正常的少突胶质细胞。哺乳动物优选是人、犬、猫、鼠、羊、山羊、牛、马、猪、或者非人类灵长类动物。最优选的，哺乳动物是人。由于OPCs可能来自任何年龄的哺乳动物的脑组织，包括成人，优选采用哺乳动物自己的组织自体移植生长神经干细胞。同种异体和异种移植也是可能的，尤其是当移植部位在大脑或眼睛，由于血脑或血液视网膜屏障，免疫排斥反应不严重。

在某些实施方案中，本实施方案的OPCs以至少大于1X10²⁰个总有核细胞等级的剂量移植，或至少在10¹⁹、或10¹⁸、或10¹⁷、或10¹⁶、或10¹⁵、或10¹⁴、或10¹³、或10¹²、或10¹¹、或10¹⁰、或10⁹、或10⁸、或10⁷、或10⁶、或10⁵个细胞等级。在一些实施方案中，本实施方案的OPCs可能被移植剂量为1X 10⁶至1X10¹²、1X 10⁶至1X 10⁹、1X 10⁸至1X 10¹⁰、1X 10⁹至1X 10¹²、1X 10⁹至1X 10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，细胞配制在一个密封制药瓶中，以备对患者给药。

靶向OPCs可被移植到哺乳动物体中并诱导少突胶质细胞在体内形成。因此，采用已有的方法，靶向OPC细胞群可在培养基中扩增，移植到哺乳动物体中，并在体内接触少突胶质细胞促进因子产生少突胶质细胞。任选地，通过对哺乳动物给药已知用于增加OPCs数量的一些生物制剂，移植的OPCs能够在体内再扩增。

根据一些实施方案，本发明的OPCs是介于传代后1至5天内被移植，优选在传代后1至2天内被移植。本实施方案的OPCs可能以细胞团或没有关联的细胞悬液移植。使用这种方式获得的细胞的移植数据(未显示)是健康的，导致含有大量的髓鞘少突胶质细胞的移植。根据一些实施方案，本实施方案的OPCs在传代后可在制药瓶内的悬浮液中保存10分钟至5天(例如，30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、4天等)，以备对患者给药。本实施方案一些OPCs在悬浮液中的剂量可能至少在大于1X10²⁰个总有核细胞的等级，或至少在10¹⁹、或10¹⁸、或10¹⁷、或10¹⁶、或10¹⁵、或10¹⁴、或10¹³、或10¹²、或10¹¹、或10¹⁰、或10⁹、或10⁸、或10⁷、或10⁶、或10⁵个细胞的等级。在一些实施例中，本实施例的OPCs在悬浮液中的剂量可能在1X 10⁶至1X 10¹²、1X 10⁶至1X10⁹、1X 10⁸至1X 10¹⁰、1X 10⁹至1X 10¹²、1X 10⁹至1X 10¹⁰个细胞之间。在一些实施方案中，细胞配制在一个密封制药瓶中，以备对患者给药。

少突胶质细胞促进因子或生物制剂可通过本领域的任何适宜路线给药，包括，举例来说，口服、局部给药、直肠给药、阴道给药、鞘内注射、血管内给药、静脉注射、肌肉注射、腹腔给药、透皮给药、皮层内给药、皮下给药、鼻腔给药或吸入给药。给药途径主要取决于试剂的性质。举例来说，GM-CSF能够穿越血脑屏障，因此它可以全身给药，以及施药给大脑。优选的给药方法是注射(例如，用针或导管)或输液。

按照常规技术，靶向OPCs可移植给患者中枢神经系统，举例来说，美国专利5,082,670和5,618,531，公开内容通过引述合并于本文中，或者移植进体内的任何其他适宜部位。在一些实施方案中，OPCs直接移植到中枢神经系统。实质和鞘内位置也被考虑。应了解，中枢神经系统内确切部位会根据疾病状态而变化。

根据一些实施方案，OPCs可能在植入前积聚，或可能直接以分离的单个细胞被采用。当使用OPC聚集体时，移植优选使用约10-500微米直径的小尺寸聚集体进行移植，优选直径40-50微米。优选地，从约100万个细胞至约10亿个细胞被移植。举例来说，总数约100万、约500万、约1000万、约2500万、约5000万、约7500万、约1亿、约2.5亿、约5亿、约7.50亿，或者约10亿个细胞被移植。

OPCs优选引入到哺乳动物的大脑或脊髓中，尤其是在少突胶质细胞不足和/或功能失调的位置，举例来说，已脱髓鞘轴突周围。人体中，脱髓鞘区域一般与斑块结构有关。采用磁共振成像(MRI)可视化。这些细胞也可能被移植到中枢神经系统其它区域。一个特别有效的方法是移植到在另一半球靶病变的“镜像”位置，因为细胞已知有效地通过胼胝体迁移到对侧半球的相应位置。

根据一些实施方案，OPCs直接引入到大脑或脊髓区域。OPCs直接引入可使用本领域中已知的任何方法实施。因此，根据一些实施方案，OPCs通过注射引入到靶向大脑区域。优选地，OPCs引入到严重有髓的大脑区域(白质丰富)。菌毛是沿海马内侧边缘的主条带的白质。白质构成了大脑深部的主体及脊髓表面部分。胼胝体是大脑中的最大白质结构，连接左、右大脑半球。在一些实施方案中，靶向脑区包括菌毛、胼胝体、大脑脚、内囊、脊髓、脑干、运动皮质、嗅皮质、体感皮层、前扣带回、下颞叶、背外侧前额叶皮层和延髓。

灰质聚集体，如基底神经节(尾状核、壳核、苍白球、丘脑底核、伏隔核)和脑干核(红核、黑质、颅神经核)分布在大脑白质内。这些区域也是靶向脑区。靶向脑区包括，但不限于，端脑(大脑半球、前脑)、间脑(丘脑、下丘脑、上丘脑、prethalamus或丘脑底部和前顶盖)、中脑(脑)、小脑、桥脑和延髓。中脑包括顶盖(下丘和上丘)和大脑脚(中脑被盖、小腿脑瘤、黑质)。黑质是基底神经节的一部分；基底神经节的其他部分包括纹状体(尾状核、壳核和伏隔核)、苍白球和丘脑底核。靶向脑区可能包括脑干、纹状体、内囊、尾状核和壳核。

OPCs的遗传改良

本实施例OPCs细胞可通过遗传改良提供一种治疗有效的生物活性分子。在一些实施方案中，遗传改良OPCs可能被移植或引入到如上所述需要治疗的主体内。

在某些实施方案中，本实施方案的OPCs细胞可能进行遗传改良表达一种特殊形式的髓鞘蛋白脂质(PLP)，如在自体移植中。此外，本实施方案的OPCs可进行遗传改良表达下列中一个或多个：端粒酶(防止端粒侵蚀)、生长因子、成形素、酶、抗凋亡基因(例如，SHH蛋白、FGF2、NT3、BDNF、PDGF、IGF、NGF)、arylsuphatase A(异染性脑白质病变)、半乳糖神经鞘氨醇酶(krabbe′s)、超氧化物歧化酶和抗氧化防御的其他蛋白，和Bc1-XL。

根据已知的方法，本文中描述的OPCs可进行遗传工程或改良。术语“遗传改良”是指通过引进外来DNA稳定或瞬时改变细胞基因型。DNA可为合成的，或者天然来源，可包含基因，部分基因，或者其他有效的DNA序列。术语“遗传改良”并不意味着包括自然存在改变，例如通过自然病毒活性、天然基因重组、或类似情况而发生。

使用标准技术，目的基因(例如，编码一种生物活性分子的基因)可插入到适宜表达载体的克隆位点。这些技术是本领域中的技术人员众所周知的。参见，例如，WO94/16718，通过引述合并于文本中。

包含目的基因的表达载体可被用来转染预期细胞株。标准转染技术如磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔、基因枪法、或病毒转染可被采用。市售哺乳动物转染试剂盒可从如Stratagene公司购买。人腺病毒转染可按照Berg et al.Exp.CellRes.，192，pp.(1991)中描述的方法完成。同样，脂质体基转染可以按照Cattaneo，MoI.Brain Res.，42，pp.161-66(1996)中描述的方法完成。

一个宿主/表达载体的多种组合可以用来表达编码目的生物活性分子的基因。参见，例如，美国专利5,545,723，通过引述合并于本文中，适宜的细胞基生产表达载体。

生物活性分子的表达增加，可以使用本领域中已知扩增方法通过增加或扩增转基因拷贝数实现。这种扩增方法包括，如DHFR扩增(参见，例如，Kaufman et al.申请的美国专利No.4,470,461)或谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增(参见，例如，美国专利5,122,464，欧洲公开申请EP 338,841)，通过引述全部合并于本文中。

本领域中已知的任何表达载体可用于表达生物活性分子。在一些实施方案中，慢病毒衍生载体对外源基因传输尤其有效。这种慢病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，外源基因可能需要将其引入到靶向OPCs表达中。这种基因可能在影响最佳共表达的组成型或诱导启动子控制下。外源DNA可能通过病毒载体(逆转录病毒、改性疱疹病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和类似病毒)或直接DNA转染(脂质体转染、CaPO₄转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔和类似方法)引入到前体细胞中。

本实施方案的OPCs可能通过基因改良用于药物筛选目的或用于检测少突胶质细胞或OPC谱系。在一些实施方案中，OPCs可使用一个或多个报告基因进行基因改良。这些报告基因包括荧光蛋白基因(例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白，等等)、DsRed2、mCherry、tdTomato和AmCyanl。优选的启动子包括以下启动子中的一个或多个：MBP、CNPase、OLig2、Sox10、P1p、和PDGFR启动子。

治疗

许多神经系统疾病都与髓鞘和神经元动态平衡和功能中的缺陷有关。这些脱髓鞘疾病或病症或脱髓鞘紊乱的实施例包括，但不限于，多发性硬化症(包括复发和慢性进展型多发性硬化症、急性多发性硬化症、视神经脊髓炎(Devic′s病))、弥漫性脑硬化(包括Shilder弥漫性轴周脑炎和Balo同心圆性硬化)。脱髓鞘疾病还包括多种疾病，其中脱髓鞘是由病毒感染、疫苗、脊髓损伤、和遗传性疾病引发的。这些脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍的实施例包括，但不限于，急性播散性脑脊髓炎(患得麻疹、水痘、风疹、流感、腮腺炎之后发生的；或者接种狂犬病疫苗或牛痘疫苗之后发生的)、坏死性出血性脑炎(包括出血性白质脑炎)和脑白质营养不良(包括Krabbe globboid脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病变、肾上腺脊髓神经病变，辐射诱导髓鞘化障碍、横贯性脊髓炎，佩-梅病(PMD)，海绵状脑白质营养不良症和亚历山大病)。脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍优选多发性硬化症、脑性麻痹、弥漫性脑硬化、或佩-梅病(PMD)，并且，最优选佩-梅病。

本发明的细胞和方法可以有效地治疗多种神经退行性疾病、脱髓鞘疾病和/或脱髓鞘紊乱。假定这些细胞将取代宿主体内病变、损坏或功能丧失的组织。或者，移植的组织可能增加内源性影响宿主组织的功能。

根据一些实施方案，提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法，在导致少突胶质细胞形成条件下，给哺乳动物施用靶向OPCs。产生的少突胶质细胞具有哺乳动物体内髓鞘形成(或髓鞘再生)脱髓鞘神经元的能力，从而哺乳动物体内髓鞘发育不良性疾病和/或脱髓鞘疾病是可以治愈或改善。

根据一些实施方案，提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法，通过鉴别和分离靶向OPCs细胞群，促进其增殖的条件下培养靶向OPCs细胞群，在导致少突胶质细胞形成条件下给哺乳动物施用靶向OPCs。产生的少突胶质细胞具有哺乳动物体内髓鞘形成(或髓鞘再生)脱髓鞘神经元的能力，从而哺乳动物体内髓鞘发育不良性疾病和/或脱髓鞘疾病是可以治愈或改善。

根据一些实施方案，提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法，通过鉴别和分离靶向OPCs细胞群，促进其增殖的条件下培养靶向OPCs细胞群，靶向OPCs细胞群分化成少突胶质细胞，在导致少突胶质细胞形成条件下给哺乳动物施用靶向OPCs。产生的少突胶质细胞具有哺乳动物体内髓鞘形成(或髓鞘再生)脱髓鞘神经元的能力，从而哺乳动物体内髓鞘发育不良性疾病和/或脱髓鞘疾病是可以治愈或改善。

根据一些实施方案，提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法，通过鉴别和分离靶向OPCs细胞群，在导致少突胶质细胞形成条件下给哺乳动物施用靶向OPCs。产生的少突胶质细胞具有哺乳动物体内髓鞘形成(或髓鞘再生)脱髓鞘神经元的能力，从而哺乳动物体内髓鞘发育不良性疾病和/或脱髓鞘疾病是可以治愈或改善。

药物筛选

本发明的OPCs也可用在药物筛选和药物发现的方法中。本领域已知的任何细胞基药物筛选方案可与本发明的OPCs结合使用。多种检测可用于此目的，包括毒理学试验；蛋白质结合免疫测试；细胞生长、分化和功能活性的确定；激素产生，类似测试。该检测可在体外、原位、体内和间接体内进行。举例来说，本发明的OPCs可用在药物筛选方法中，包括a)选自富集靶向OPC细胞群；b)对非人的哺乳动物移入所产生的富集细胞群；c)对非人的哺乳动物施用一种测试化合物；和d)施用上述测试化合物的移入哺乳动物和未施用上述测试化合物的对照非人哺乳动物进行比较。

根据一些实施方案，本发明提供了一种筛选化合物的方法，这种化合物影响富集靶向少突胶质前体细胞的细胞群的生物功能，包括：(a)测试化合物接触由权利要求1所述的方法获得的靶向少突胶质前体细胞；(b)检测少突胶质前体细胞生物功能的变化。生物功能变化可能包括，但不限于，下列中的一种或多种变化：髓鞘、分化为少突胶质细胞、增殖率、细胞迁移、细胞活力、基因表达、蛋白表达、培养基中蛋白质水平、去分化、生长特性，和/或细胞形态。

通过向至少一个、通常多个细胞样本中加入药剂筛选药剂的生物活性。测量响应该药剂的参数变化，结果与参照培养基比较，例如，存在和不存在药剂的情况，使用其他药物获得，等等。药物可方便地加入到溶液中，或易于可溶解形式，加入到细胞培养基内。这些药物可加在流动体系中，如流体，间歇或连续的，或者，单独地或增量地向另外的静态溶液中加入化合物丸剂。在流动体系中，使用两种液体，其中一种是生理中性溶液，另一种加入了测试化合物的是相同溶液。第一种液体穿过细胞，随后第二种液体穿过细胞。在单一溶液中方法中，测试丸加到细胞外围介质中。培养基成分的整体浓度不应随着丸剂加入显著改变，或者在流动方法中两种溶液之间浓度不应随着丸剂加入显著改变。

多种方法可以用于定量所选定的标记物。为了测量分子的数量，一种简便方法使用检测基团标记分子，这可能具有荧光、发光、放射性、酶活性，等等，尤其是特异性结合与高亲和力的荧光基团的分子都是极易标记生物分子、结构或细胞类型。免疫荧光基团可不仅直接结合特定蛋白质，而且结合特异性构象、裂解产品，或者像磷酸化位点的改变。单个肽和蛋白质可以设计自动发荧光，如通过细胞内表达的绿色荧光蛋白嵌合体。因此，对抗体进行改良，提供作为其一部分结构的一种荧光染料。根据所选择的标记，不采用荧光标记，采用如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)、同质酶免疫测定法，以及相关的非酶法技术测量参数。核酸量化，尤其是信使RNAs，也作为参数。采用杂交技术测量，取决于核酸核苷酸序列。这些技术包括聚合酶链反应方法，以及基因芯片技术。

封装

本领域已知的任何封装方案可用于本发明的OPCs。本发明的OPCs可能被封装并且用于运载生物活性分子，根据已知的封装技术，包括微胶囊(参见，例如，美国专利4,352,883；4,353,888；和5,084,350，通过引述合并于本文中)，大胶囊(参见，例如，美国专利5,284,761、5,158,881、4,976,859和4,968,733和公布的PCT专利申请WO92/19195、WO 95/05452，通过引述都合并于本文中)。

如果OPCs被封装，大胶囊如美国专利5,284,761；5,158,881；4,976,859；4,968,733；5,800,828和公布的PCT专利申请WO95/05452中描述的大胶囊，优选通过引述都合并于本文中。设备中细胞数量可以变化。优选地，每个设备包含10³-10⁹个细胞，最优选10⁵-10⁷个细胞。大量大胶囊装置可植入到患者体内；优选1个至10个装置。

下列实施例为了举例说明性的，但不限制于，本发明的方法和组合物。在本实施方案的精神和范围内，通常在治疗中遇到的条件和参数变化进行适当修正和更改对本领域中技术人员将变得显而易见的。

实施例1：PDGFR阳性细胞的筛选

胎儿大脑(16-20孕周)采用胶原酶/透明质酸酶和胰蛋白酶组合进行酶处理，生成一种单细胞悬液。细胞再悬浮在Hank′s平衡盐溶液中，并用CD 133抗体染色，Hank′s平衡盐溶液含有1mM丙酮酸钠和0.1％人血清白蛋白(染色缓冲液)。富集模式下，CD133⁺细胞无菌条件下使用BD流式细胞仪进行分选。CD133⁺富集片断进行离心分离，再悬浮在染色缓冲液中，用1∶100的兔抗PDGFRα多克隆抗体(IgG)4℃下孵育2个小时。染色缓冲液冲洗两次后，PDGFRα标记细胞孵育多克隆羊抗兔IgG-FITC抗体(Caltag)。纯化模式下，PDGFRα阳性(FITC标记)细胞无菌条件下使用BD流式细胞仪进行分选。分选细胞在涂有聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白和纤维连接蛋白的培养瓶内DMEM培养基中孵育，DMEM培养基添加了B27、N2、NAC、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、FGF2、PDGF-AA和NT3(完全培养基)，添加或没有添加胰岛素样生长因子1。轻度胰蛋白酶处理和同一培养基中再接种达到细胞传代。

用于PDGFRα阳性细胞纯化的另一种方法使用小鼠单克隆抗体1∶50 PDGFRα-PE(Pharmingen公司)4℃下对全部脑细胞(有CD 133富集或者没有CD 133富集)染色2个小时，随后，使用BD流式细胞仪进行纯化无菌分选。

实施例2：CD105阴性细胞的筛选

CD105细胞作为筛选标记是基于本发明者发现，纯化PDGFRα⁺细胞的培养基以比其它更快的速度扩增。这种加速增长一般伴随着具有不同于少突胶质细胞祖细胞形态的细胞类型的外观。基于形态和培养基中的加速增长，这些细胞很可能是PDGFRα⁺成纤维细胞；包含介质的FGF2中成纤维细胞生长优势是被证实。此外，除了耗尽有丝分裂原，成纤维细胞也可能不适应培养基，在体外和体内，影响少突胶质细胞祖细胞到少突胶质细胞的生长动力学和分化过程。成纤维细胞的存在，因此降低了获得少突胶质细胞祖细胞扩增培养基的效率。

我们预期，尤其是在受污染细胞具有生长优势情况下，确定更纯净和同种少突胶质细胞祖细胞群。因此，启动搜索成纤维细胞内特异性表达细胞表面标记，用于将其区分于PDGFRα+少突胶质祖细胞。一组抗体用与于对含有成纤维细胞和少突胶质细胞的混合物的培养基进行染色。结果显示，单克隆抗体至CD 105，识别出糖蛋白endoglin，是将PDGFRα⁺细胞群细分成两个亚群的有效试剂：PDGFRα⁺CD 105⁺(成纤维细胞)和PDGFRα⁺CD 105^-(少突胶质前体细胞)。

胎儿来源的人少突胶质前体细胞的分选方案包括两种抗体，CD 105-APC和PDGFRα-PE。采用两种抗体方案产生多种细胞批。结果表明，这些细胞批具有相似的生长特性和少突胶质细胞分化潜能。此外，成纤维细胞的出现没有在这些培养基中观察到，直到第15代，最高传代检测到。结果表明，CD 105是获得预期的少突胶质前体细胞群中使用的有效阴性筛选标记物。

实施例3：OPCs增殖介质

增殖培养基采用下列组分按照指定浓度制备：组分最终浓度DMEM，谷氨酰胺(Invitrogen公司，cat#25030-081)2mM，丙酮酸钠(Sigma公司，cat#S8636)，1mM，NAC(Sigma公司，cat#A9165)，1mM，N2补充(Invitrogen公司，cat#17502-048；含有铁传递蛋白、胰岛素、腐胺、硒和孕激素)，B27补充(Invitrogen公司，cat#17504-044)，20ng/ml人bFGF(Biosource公司，cat#PHG0024)，20ng/ml PDGF-AA(Peprotech，cat#100-13A)，10ng/ml NT3(Peprotech公司，cat#450-03)，100ng/mlIGF1(Peprotech公司，cat#AF-100-11)。

实施例4：OPCs分化

在第一个分化方案中，通过加入三碘甲状腺氨酸(T3)物理去除或耗尽细胞培养基中的生长因子有丝分裂原，OPCs增殖被诱导分化。

少突胶质细胞染色方案如下：

少突胶质细胞O4染色。细胞采用一抗至O4(杂交瘤细胞上清液，小鼠单克隆；按1∶2比例使用)在室温下孵育30分钟。细胞用0.1M PBS洗涤一次，pH值＝7.4。细胞用冰冷的4％多聚甲醛固定20分钟。细胞用0.1M PBS5在分钟内洗涤2次，pH值＝7.4。室温下，细胞制备在0.1M PBS稀释的10％马血清(“HS”)中封闭30min，pH值＝7.4。细胞用第二抗体(驴抗小鼠IgG/Alexa488，按1∶500比例使用，Invitrogen公司，Cat#A21202)孵育；或者，采用羊抗小鼠IgM/Alexa488(Invitrogen公司，Cat#A21042)孵育，黑暗中室温下用1％HS稀释1小时。细胞用0.1M PBS于黑暗中5分钟内洗涤2次。用封固剂(Vectashield封固剂，载体实验室，Cat#H-1000)面向下将细胞固定在载玻片上或者留在培养孔内量化和评定染色并于4℃下保存。

在某些情况下，Hoechst(核染色)染色可按照如下使用。上述准备的细胞用Hoechst液(按照1∶10000比例用0.1％皂角苷稀释，Sigma公司，Cat#S4521)洗涤。室温下，细胞在Hoechst液中孵育5分钟，随后用0.1M PBS洗涤2次。

实施例5：OPCs分化

在第二分化方案中，通过去除生长因子有丝分裂原并加入1％血清诱导OPCs分化。该分化方案产生高产量少突胶质细胞培养基。

在第三分化方案中，通过去除生长因子有丝分裂原并加入30nM T3(Sigma公司，cat#T5516)诱导OPCs分化。该分化方案产生高产量少突胶质细胞培养基。

实施例6：封装

如果封装OPCs，可采用下列步骤：中空纤维由聚醚砜(PES)制得，外径720米，壁厚100米(AKZO-Nobel Wuppertal，德国)。这些纤维在美国专利4,976,859和4,968,733中进行了描述，通过引述合并于本文中。该纤维用于截留分子量。PES #5膜，具有大约280kd MWCO，偶尔使用。在其他研究中，PES #8膜，具有大约90KD MWCO，也可使用。

该装置通常包括：1)半透聚醚砜中空纤维膜，AKZO NobelFaser AG公司制造；2)轮轴膜结构；3)光固化丙烯酸甲酯(LCM)树脂前端；和4)有机硅系绳。

使用的半透膜通常具有以下特点：内径500+30m壁厚100+15m 扯断力100+15cN断裂伸长率44+10％液压渗透率63+8(ml/min m² mmHg)nMWCO(右旋糖酐)280+20kd。

该装置组件是市面有售的。该LCM胶由Ablestik实验室(Newark，Del.)提供；Luxtrak粘合剂LCM23和LCM24)。系绳由特种有机硅材料加工商(Robles，Calif.)提供。系绳尺寸是外径0.79mm X内径0.43mm X长度202mm。该装置形状如下：内表面有选择性渗透皮肤。壁上有一个开孔泡沫结构。外表面有一个开放式结构，孔达1.5米，占外表面的30+5％。

纤维材料第一次切成5厘米长段，用光敏聚合的丙烯酸胶(LCM-25，ICI)密封每一段的远端。经环氧乙烷灭菌和除气，利用汉密尔顿注射器，使用25号针头从附加进样口向纤维段填充10⁴-10⁷个细胞的悬浮液，或者液体培养基，或者水凝胶基质(例如，胶原蛋白溶液(Zyderm^TM)，藻酸钠，琼脂或壳聚糖)。胶囊的近端使用同种丙烯酸胶密封。

有机硅系绳(特种有机硅制造，Taunton，Ma.)(内径：690m；外径：1.25mm)放置在便于操作和取出装置的纤维近端处。

实施例7：OPCs移植

靶向OPCs可被移植到啮齿动物大脑中，用于评估移植可行性、整合、移植细胞的表型，以及健康动物体内细胞移植相关的行为改变。

移植按照标准技术执行。举例来说，成年老鼠用戊巴比妥钠麻醉(45mg/kg，腹腔注射)，安置在Kopf立体定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使用连接在10μl汉密尔顿注射器上的玻璃毛细管将靶向OPCs移植到大鼠纹状体内。每个动物接收到约250,000-500,000个细胞，总体积为2μl。传代后1-2天细胞被移植，细胞悬液由5-20个细胞的未分化的OPC细胞群构成。植入之后，皮肤被缝合。

实施例8：OPCs移植到患有脱髓鞘疾病的啮齿动物模型中

靶向OPCs可能被移植到啮齿动物大脑中，用于评估移植可行性、整合、移植细胞的表型，以及损伤或患病动物体内细胞移植相关的行为改变。

移植按照标准技术执行。举例来说，新生儿老鼠或小鼠低温麻醉，安置在Kopf立体定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使用连接在10μl汉密尔顿注射器上的玻璃毛细管将靶向OPCs移植到动物的胼胝体、菌毛、大脑脚和/或脊髓中。每个动物接收到约300,000-600,000个细胞，总体积为6μl。传代后细胞立即移植或1-2天后移植，细胞悬液由5-20个细胞的未分化的OPC细胞群构成。植入之后，皮肤被缝合或者钉住。或者，新生儿或少年shiverer小鼠低温麻醉或者采用异氟醚麻醉，安置在Kopf立体定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使用连接在10μl汉密尔顿注射器上的玻璃毛细管将靶向OPCs移植到老鼠的胼胝体、菌毛、大脑脚和/或脊髓中。每个动物接收到约300,000-600,000个细胞，总体积为6μl。传代后细胞立即移植或1-2天后移植，细胞悬液由未分化的单个OPC或者5-20个细胞群构成。植入之后，皮肤被缝合或者钉住。

实施例9：采用靶向OPCs后代体外治疗神经退行性疾病

常规吸入流产后，从胎儿脑组织得到靶向OPCs，收集进无菌收集装置中。按照实施例1或2所述，2x4x1毫米组织被解剖分离。然后，靶向OPCs增殖。靶向OPC后代神经移植进血型匹配并患有神经退行性疾病的宿主体内。使用BRW电脑断层扫描(CT)立体定向引导完成手术。病人静脉注射咪唑安定与局部麻醉suppiemencea。该病人进行CT扫描，建立接受移植区域的坐标。注射插管由17号不锈钢外层插管和19号细针组成。插入脑内校正坐标，然后取出并替换为19号注射插管，19号注射插管预装了30μL组织悬液。插管被撤回时，细胞以3μL/分钟的速度慢慢注入。多个立体定位核芯针穿过目标区，相隔约4毫米。病人进行CT扫描检查术后出血或水肿。手术后不同时间间隔进行神经评价，以及PET扫描，确定被植入细胞的代谢活性。

实施例10：使用磷酸钙转染进行靶向OPC后代遗传改良

靶向OPC后代按照本文所述方法繁殖。然后，使用磷酸钙转染技术转染细胞。为了标准磷酸钙转染，细胞机械分离成单个细胞悬液，涂在组织培养基处理过的器皿上，汇合度50％(50,000-75,000个细胞/厘米²)，并且附着过夜。

改进后的磷酸钙转染程序执行如下：用TE将含有DNA(15-25微克)的无菌TE缓冲液(10mM Tris，0.25mM EDTA，pH值＝7.5)稀释至440μL，向DNA/TE缓冲液中加入60μl的2M氯化钙(pH值至5.8，1M HEPES缓冲液)。总体积500μl的2XHeBS(HEPE S-缓冲盐水；275mM氯化钠，10mM氯化钾，1.4mM磷酸氢二钠，12mM葡萄糖，40mM HEPES缓冲剂粉末，pH值＝6.92)滴加到该混合物中。该混合物室温下放置20分钟。细胞用IX HeBS和1ml沉淀DNA的磷酸钙溶液进行简单洗涤，加入到每个培养板内，细胞在37℃下孵育20分钟。孵育之后，10mis完全培养基添加到细胞中，培养板又放置在孵化器内(37℃，充有9.5％CO₂)3-6个小时。DNA和培养基在孵化期结束被抽除，而细胞用完全培养基洗涤3次，然后放回到孵化器中。

实施例11：使用病毒载体进行靶向OPCs的遗传改良

靶向OPCs按照本文所述方法增殖，然后用含有除了报告基因如GFP(绿色荧光蛋白)之外的目的基因的慢性病毒载体感染。慢病毒悬浮液加入到培养基里，OPCs增殖并孵育24个小时。24个小时后，培养基被除去，用新鲜培养基替换，OPCs又孵育3天。收集细胞，离心分离，用流式细胞仪分选表达目的基因的细胞。阳性细胞返回到增殖培养基。

采用前述实施例中描述的程序，转导OPC后代移植到啮齿动物或人患者体内。

实施例12：OPCs移植到脊髓损伤的啮齿动物模型中

靶向OPCs可能被移植到啮齿动物脊髓中，评估移植可行性、整合、移植细胞的表型，以及脊髓损伤动物体内细胞移植相关的行为改变。

动物接受椎体高度T9椎板切除手术。使用脊髓打击器(精密系统和仪表，列克星敦，肯塔基州)，动物则受到50千达因(KD)脊髓挫伤损伤。脊髓损伤七天后，使用的Basso、Beattie、和Bresnahan评分表(BBB评分法)测试小鼠，随机接受OPCs或载体对照。使用贴附到纳米管注射器上的斜面轻型微吸管，将细胞从病灶中心前后两侧注入。每个动物接收5万至8万个细胞。

实施例13：OPCs移植到MS啮齿类动物模型中

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是研究多发性硬化症的临床和病理特点被广泛接受的模型。

移植按照标准技术执行。举例来说，MOG诱导EAE影响的成年老鼠用异氟醚气体麻醉，并安置在Kopf立体定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使用连接在10μl汉密尔顿注射器上的玻璃毛细管将靶向OPCs移植到动物胼胝体、菌毛、大脑脚、侧脑室空间和/或脊髓中。每个动物接收到约300,000-600,000个细胞，总体积为6μl。传代后细胞立即移植或1-2天后移植，细胞悬液由未分化的单个OPC或者5-20个细胞群构成。植入之后，皮肤被缝合或者钉住。

实施例14：扩增PDGFR+CD105-少突胶质细胞祖(OPC) 细胞群移入能力的鉴定

为了确定是否FACS被分离，体外扩增少突胶质细胞祖细胞存活，迁移，并具有体内髓鞘化的能力，使用shiverer小鼠、脱髓鞘的啮齿类动物模型，进行一系列移植研究。shiverer小鼠天然具有大部分mbp基因缺失，导致不完全的中枢神经系统髓鞘形成。为了避免人体细胞异种排斥反应，shiverer小鼠与免疫缺陷的NOD-Scid小鼠回交。研究两种不同的shiverer/Scid年龄组的少突胶质细胞祖细胞植入：青少年(P21-P30)和新生儿(P0-P1)。shiverer/Scid小鼠有大约8周相对较短的寿命，因此研究的移植后最长的时间点针对新生儿注射是8周和幼年注射是5周。

少突胶质祖细胞生长为单层。为了准备用于移植的细胞，采用类似于传代OPCs的方案之后，使用胰蛋白酶OPCs从烧瓶中剥离。然后，细胞接触到胰蛋白酶抑制剂阻止蛋白水解消化，用培养液洗涤两次，再悬浮在体外培养基中，体外培养基含有最终密度10⁵个细胞/μl的抗氧化剂NAC(1mM)。

对OPCs以悬浮培养形式在胰蛋白酶处理后保存至少一天的能力进行测试。悬浮液中的保存期1天有以下3个原因的优势：1)移植和/或冷冻保存之前将使细胞从潜在破坏性酶处理中恢复；2)动物手术安排中更灵活；3)等待移植的OPCs能够装运到非现场处(实验室或诊所)。最后，考虑到OPCs的临床应用潜力，对深低温冷冻保存后OPCs的植入能力和髓鞘化潜力进行了测试，取得积极成果。

实施例15：移植

少年或新生儿shiverer/Scid小鼠放置在立体定位框架内，1μlOPC悬浮液注射在2-3大脑位置，双侧注射(4-6注射/小鼠)。注射靶向胼胝体、菌毛和小脑脚(见图1)，髓鞘型动物的脑区严重髓鞘化(白质丰富)，但shiverer/Scid小鼠严重脱髓鞘。小鼠在不同时间点死掉，直到第8周，使用单克隆抗体SC 121分析小鼠脑部存在的人体细胞，使用MBP抗体分析存在的人来源少突胶质细胞，能够形成髓鞘的小鼠神经轴突。由于shiverer小鼠突变，删除了大部分MBP基因，MBP蛋白不是由小鼠少突胶质细胞产生，因此抗MBP抗体检测到的任何MBP是来自人。

表15-1-源自4种不同供体组织的4种OPC细胞株中获得的植入数据汇总。

注射了含有人细胞(SC121染色确定)的OPCs的所有幼年和新生儿动物测试了所有年龄段。当MBP染色时，所有动物也证实阳性染色(参见图2，系列部分SC121和MBP染色的一个实施例)。

也测试了使用慢病毒载体基因改良的OPCs的可能性。为证明该想法，在MBP启动子控制下，我们使用了表达报告基因GFP的慢病毒载体(绿色荧光蛋白)。直接目测观察OPCs(无抗体染色)，OPCs活跃转录MBP基因(亮绿色细胞)，并具有成熟的髓鞘化少突胶质细胞形貌(如具有像电缆的形貌，与轴突束平行排列)。图3显示MBP-GFP OPCs移植的shiverer/Scid小鼠的一个实施例，移植后第8周死掉。

体内研究表明，新生儿和青少年shiverer小鼠是适于测试扩增OPCs的植入和髓鞘形成能力的模型。没有观察到新生儿和青少年shiverer/scid小鼠之间植入质量的主要差异。

体内研究表明，OPCs植入和髓鞘形成未显著受到传代数量的影响；例如，注射供体2703的新生儿，在人细胞总数量和髓鞘化程度上没有性质上的区别，表明效力(能够植入和髓鞘化的能力)没有随着第16次传代而减少，最大传代数被测出。

体内研究表明，新鲜传代的OPCs(从未冻结)的效力与相同传代或类似传代的预先深低温冷冻保存的OPCs的效力对比时，植入和髓鞘化没有主要性质上的差别。虽然只有新生动物移植了先前深低温冷冻保存的细胞，我们并不期望在少年动物中得到不同的结果。这一结果表明，在效力没有检测到任何损失的情况下OPC培养可以深低温保存。同样，由于停药时间1天，没有效力损失(植入或髓鞘化能力)，这表明该方案可以被用来促进以备用形式OPC培养基转移至非现场处。

等同物

本发明的一个或多个实施方案在上述描述中进行了阐述。虽然相似或等同于本文中描述的方法和材料可在本发明的实施或测试中使用，对优选的方法和材料进行了描述。本发明的其他特征、目标、和优势从描述和权力要求书来看是显而易见的。在说明书和附加权利要求书中，除非另外清楚说明，单数形式包括复数。除非另外规定，本文中使用的所有科技术语具有普遍被本发明所属领域的技术人员所理解的相同涵义。

Claims

1.一种源自神经或神经来源细胞的富集靶向少突胶质前体细胞(OPCs)的细胞群，其中细胞群富集靶向OPCs，靶向OPCs是PDGFRα⁺和CD105^-，其中细胞群中至少30％的细胞是靶向OPCs。

2.根据权利要求1所述的细胞群，靶细胞也是PSA-NCAM^lo/-。

3.根据权利要求1所述的细胞群，靶细胞也是A2B5^lo/-。

4.根据权利要求1所述的细胞群，靶细胞也是CD133⁺。

5.根据权利要求1所述的OPCs细胞群，其中细胞群中至少50％的细胞是靶向OPCs。

6.根据权利要求1所述的OPCs细胞群，其中细胞群中至少70％的细胞是靶向OPCs。

7.根据权利要求1所述的OPCs细胞群，其中细胞群中至少90％的细胞是靶向OPCs。

8.根据权利要求1所述的OPCs细胞群，其中靶向OPCs是PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、A2B5^-。

9.根据权利要求1所述的OPCs细胞群，其中靶向OPCs是PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^-。

10.一种由神经或神经来源细胞生产富集靶向少突胶质前体细胞(OPCs)的细胞群的方法，包括使用结合细胞表面抗原的至少一种试剂接触神经或神经来源细胞，靶向OPCs表达细胞表面抗原，其中靶向OPCs是PDGFRα⁺和CD 105^-，其中细包群富集包含至少30％的靶向OPC。

11.根据权利要求10所述的方法，其中靶向OPCs也是PSA-NCAM^lo/-。

12.根据权利要求10所述的方法，其中靶细胞也是A2B5^lo/-。

13.根据权利要求10所述的方法，其中靶细胞也是CD 133⁺。

14.根据权利要求10所述的方法进一步包括选择性除去非靶向细胞群阴性筛选靶向OPCs。

15.根据权利要求10所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、A2B5^-。

16.根据权利要求10所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^-。

17.一种增加细胞培养基中靶向少突胶质前体细胞(OPCs)数量的方法，包括培养细胞群来提高细胞培养基中靶向OPCs的数量，该细胞群包括至少30％的靶向OPCs，其中靶向OPCs是PDGFRa⁺和CD105^-。

18.根据权利要求17所述的方法，其中靶向OPCs也是PSA-NCAM^lo/-。

19.根据权利要求17所述的方法，其中靶细胞也是A2B5^lo/-。

20.根据权利要求17所述的方法，其中靶细胞也是CD 133⁺。

21.根据权利要求17所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、A2B5^-。

22.根据权利要求17所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRα⁺、CD 105^-、CD133⁺、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^-。

23.根据权利要求17所述的方法进一步包括使用有效剂量的至少一种生物试剂接触OPCs，这种生物试剂能够提高OPCs的数量。

24.根据权利要求23所述的方法，其中生物试剂选自白血病抑制因子(LIF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2，bFGF)、IGF1、NT3、Shh、CTNF、PDGF-AA或其组合组成的组。

25.一种增殖少突胶质前体细胞(OPCs)的方法，包括：在无血清培养基中增殖OPCs，该无血清培养基包含有效诱导OPC增殖的一个或多个预先确定的生长因子，其中：(a)细胞群包括OPCs，OPCs是PDGFRα⁺和CD 105^-；(b)在诱导分化条件下，该细胞产生分化成少突胶质细胞的后代细胞。

26.根据权利要求25所述的方法，其中靶向OPCs也是PSA-NCAM^lo/-。

27.根据权利要求25所述的方法，其中靶细胞也是A2B5^lo/-。

28.根据权利要求25所述的方法，其中靶细胞也是CD 133⁺。

29.根据权利要求25所述的方法进一步包括OPCs在培养条件下诱导少突胶质细胞分化而产生正分化和已分化的少突胶质细胞。

30.一种包括由权利要求25所述方法产生的少突胶质前体细胞(OPCs)的组合物。

31.一种包括由权利要求25所述方法产生的正分化或已分化的少突胶质前体细胞的组合物。

32.一种治疗遭受中枢神经系统轴突脱髓鞘相关疾病的哺乳动物个体的方法，包括向哺乳动物个体体内引入治疗该疾病的有效剂量的权利要求1所述的富集OPCs的细胞群。

33.根据权利要求32所述的方法，其中哺乳动物是人。

34.根据权利要求32所述的方法，其中OPCs通过细胞移植对该哺乳动物个体给药。

35.根据权利要求32所述的方法，其中该疾病是多发性硬化症、Pelizaeus-Merzbacher病、脑瘫、辐射诱导髓鞘形成病症、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、脱髓鞘遗传疾病、脊髓损伤、病毒诱导脱髓鞘疾病、进行性多灶性白质病、人淋巴T-细胞病毒I(HTLVI)-相关脊髓病、或者营养代谢紊乱。

36.根据权利要求32所述的方法，其中该疾病是多发性硬化症、Pelizaeus-Merzbacher病、或脑瘫。

37.一种治疗遭受中枢神经系统轴突脱髓鞘相关疾病的哺乳动物个体的方法，包括向哺乳动物个体体内引入治疗该疾病的有效剂量的权利要求1所述的OPCs。

38.根据权利要求37所述的方法，其中哺乳动物是人。

39.根据权利要求37所述的方法，其中OPCs通过细胞移植对该哺乳动物个体给药。

40.根据权利要求37所述的方法，其中该疾病是多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、脱髓鞘遗传疾病、脊髓损伤、病毒诱导脱髓鞘疾病、进行性多灶性白质病、人淋巴T-细胞病毒I(HTLVI)-相关脊髓病、或者营养代谢紊乱。

41.一种治疗遭受中枢神经系统轴突脱髓鞘相关疾病的哺乳动物个体的方法，包括向哺乳动物个体体内引入治疗该疾病的有效剂量的由权利要求21所述方法制备的正在分化或已分化的少突胶质细胞。

42.根据权利要求41所述的方法，其中哺乳动物是人。

43.根据权利要求41所述的方法，其中正在分化或已分化的少突胶质细胞通过细胞移植对该哺乳动物个体给药。

44.根据权利要求41所述的方法，其中该疾病是多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、脱髓鞘遗传疾病、脊髓损伤、病毒诱导脱髓鞘疾病、进行性多灶性白质病、人淋巴T-细胞病毒I(HTLVI)-相关脊髓病、或者营养代谢紊乱。

45.一种筛选化合物的方法，这种化合物影响富集靶向少突胶质前体细胞的细胞群的生物功能，其包括：(a)测试化合物接触由权利要求1所述方法获得的靶向少突胶质前体细胞；(b)检测少突胶质前体细胞生物功能的变化。

46.根据权利要求45所述的方法，其中上述靶向少突胶质前体细胞是PDGFRα⁺、CD 105^-、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^lo/-、和CD 133⁺。

47.根据权利要求45所述的方法，其中上述靶向少突胶质前体细胞是PDGFRα⁺、CD 105^-、A2B5^-、和CD133⁺。

48.根据权利要求45所述的方法，其中上述靶向少突胶质前体细胞是PDGFRα⁺、CD 105^-、A2B5^lo/-、PSA-NCAM^-、和CD 133⁺。

49.根据权利要求45所述的方法，其中选自由髓鞘、分化为少突胶质细胞、增殖率、细胞迁移、细胞活力、基因表达、蛋白表达、培养基中蛋白质水平、去分化、生长特性，和/或细胞形态组成的组的至少一个特征发生变化。

50.一种生产富集少突胶质前体细胞的细胞群的方法，包括：

(a)用特异性结合PDGFRα的抗体接触包括一个或多个多能中枢神经干细胞的神经或神经来源细胞；(b)筛选上述神经或神经来源细胞，神经或神经来源细胞是PDGFRα^hi，其中与神经或神经来源细胞对比，所筛选细胞富集了少突胶质前体细胞。

51.根据权利要求50所述的方法，其中上述神经或神经来源细胞从神经球培养或贴壁培养中获得。

52.根据权利要求50所述的方法，其中上述方法进一步包括去除是PDGFRα^lo/med的那些细胞的步骤。

53.根据权利要求50所述的方法，其中上述方法进一步包括去除是CD 105^-的那些细胞的步骤。