CN103484431A - 一种少突胶质前体细胞的扩增培养基及其扩增方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物学、神经生物学领域，特别是涉及一种少突胶质前体细胞的扩增培养基及其扩增方法和用途。本发明提供的少突胶质前体细胞的扩增培养基的关键组份为bFGF、PDGF-AA、NT-3、乳酸钠。通过本发明提供的培养基及方法可以使OPCs稳定扩增至少10代，在扩增过程中保持OPCs的生物学性状维持不变。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学、神经生物学领域，特别是涉及一种少突胶质前体细胞的扩增培养基及其扩增方法和用途。
背景技术
各种各样的髓鞘相关疾病，如脑白质损伤、脊髓损伤、多发性硬化等疾病由于神经元的髓鞘化障碍或脱髓鞘化，导致了神经元不能正常传递电兴奋，从而导致机体运动等功能失能，给这些疾病的患者及家庭带来了极大的伤害，但是目前还没有任何一种药物可以有效地治疗这些髓鞘相关疾病。
不论是髓鞘化障碍还是脱髓鞘病变，其根源都是神经元轴突髓鞘程度减少或丢失，因此如果能够恢复神经元轴突的髓鞘化程度，使得神经元电流得以稳定快速地传导，理论上这些疾病就可以被治愈。研究发现，少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)是负责中枢神经系统髓鞘化的关键细胞，在中枢神经系统中，OPCs可以分化为少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)，OL进一步包绕神经元轴突形成完整的髓鞘结构，从而保证神经元电流的稳定快速传导。髓鞘相关的疾病一方面是因为疾病破坏了已经形成的髓鞘结构，另一方面更是由于神经系统中OPCs受到了损伤，使得OL失去了源泉，因此难以髓鞘再生。动物实验研究发现，向先天性髓鞘化形成障碍的shiver小鼠或脑白质损伤大鼠移植OPCs时，移植的OPCs可以在体内正常包绕神经元轴突形成髓鞘使得这些动物的神经功能恢复，表明OPCs移植可能是治疗髓鞘损伤疾病的一个新的方向。
人OPCs是一种状态不稳定的细胞，非常容易进一步分化成熟为OL，但OL将失去OPCs的迁移能力，一旦OPCs在体外分化为OL，其在临床上的治疗意义将完全丧失，因此，在体外维持OPCs的性状非常重要，但在已知的文献中均未有体外稳定长时间扩增培养人OPCs的报道。
发明内容
鉴于以上缺陷，本发明的主要目的在于提供一种少突胶质前体细胞的扩增培养基及其扩增方法和用途，该种OPCs扩增培养基可以使OPCs稳定扩增至少10代，在扩增过程中保持OPCs的生物学性状维持不变。
为了达到以上目的，本发明提供的该种少突胶质前体细胞的扩增培养基，其关键组份为碱性成纤维生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)和神经营养因子3(NT3)、乳酸钠。
更进一步的，本发明提供的该种少突胶质前体细胞的扩增培养基由基础培养基和添加物构成，所述基础培养基采用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任一一种；另外加上商用Neural Basal Medium(无糖型)；所述商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium与商用无糖型Neural BasalMedium两者的体积比为(1-3)∶1；
DF medium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)∶1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml。
所述添加物包括B27、乳酸钠、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA、神经营养因子3、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素，其中，B27为1×，乳酸钠浓度为3-10mmol/L，碱性成纤维生长因子浓度5-25ng/ml，血小板源性生长因子-AA浓度10-20ng/ml，神经营养因子3浓度5-25ng/ml，转铁蛋白浓度5-50μg/ml，孕酮5-20mmol/L，腐胺20-50μmol/L，亚硒酸钠10-20mmol/L，胰岛素5-20μg/ml，肝素2-10μg/ml，青链霉素(可选)100U/ml。
本发明还提供一种少突胶质前体细胞的扩增方法，包括以下步骤：
1.将OPCs收集至离心管中；
2.400g离心5分钟收集细胞；
3.弃上清，将细胞重悬于扩增培养基，调整密度为2～10×105/ml；
4.将细胞悬液接种于细胞培养瓶中；
5.每3～5天更换一次扩增培养基；
6.待OPCs生长至80％左右汇合时(约需一周)，进行OPCs传代，传代方法同上步骤1-5所述，如此循环。
上述方法所采用的扩增培养基由基础培养基和添加物构成，所述基础培养基采用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任一一种；另外加上商用Neural Basal Medium(无糖型)；所述商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium与商用无糖型Neural Basal Medium两者的体积比为(1-3)∶1；
DF medium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)∶1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml。
所述添加物包括B27、乳酸钠、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA、神经营养因子3、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素，其中，B27为1×，乳酸钠浓度为3-10mmol/L，碱性成纤维生长因子浓度5-25ng/ml，血小板源性生长因子-AA浓度10-20ng/ml，神经营养因子3浓度5-25ng/ml，转铁蛋白浓度5-50μg/ml，孕酮5-20mmol/L，腐胺20-50μmol/L，亚硒酸钠10-20mmol/L，胰岛素5-20μg/ml，肝素2-10μg/ml。
本发明方法及通过该方法扩增获得的少突胶质前体细胞，可应用于治疗神经系统损伤疾病的体内外实验研究和临床治疗研究。
本发明方法及通过该方法扩增获得的少突胶质前体细胞，可应用于制备治疗神经系统损伤疾病药物。
上述神经系统疾病包括：脑白质损伤、多发性硬化症、脊髓损伤等髓鞘相关疾病。
本发明具有以下有益效果：
1、本方法不但有助于髓鞘疾病的临床治疗和药物筛选，也有利于髓鞘发育基础理论的研究：①获得高纯度OPCs有望应用于髓鞘相关疾病的临床治疗研究；②通过体外扩增获得大量OPCs为临床应用提供足够量的细胞；③研究少突胶质前体细胞的发育调控机制；④为髓鞘相关的疾病提供药物筛选模型；
2、本发明方法使得OPCs可以在体外扩增至少10代以上同时维持生物学性状不变，扩增倍数上千倍，因此可以为基础或临床研究提供足够的细胞；
3、本发明所扩增获得的OPCs可以冷冻保存和复苏继续培养，且冻存复苏后其生物学性状维持不变，这将进一步有助于OPCs临床移植治疗临床研究的广泛推广。
附图说明
图1为采用本发明方法扩增第1代OPCs的可见光图片；
图2为采用本发明方法扩增第3代OPCs的可见光图片；
图3为采用本发明方法扩增第5代OPCs的可见光图片；
图4为采用本发明方法扩增第10代OPCs的可见光图片；
图5为采用本发明方法扩增第10代OPCs的O4免疫荧光染色，结果显示OPCs阳性率仍然高达80-90％；
图6为采用本发明方法扩增第10代OPCs的神经元标志物Tuj-1免疫荧光染色；
图7为采用本发明方法扩增第10代OPCs的星形胶质细胞标志物GFAP免疫荧光染色。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进一步说明，但不作对其的限定：
实施例1
本实施例所来源OPCs是通过本实验室诱导技术获得的OPCs。
1.OPCs生长至80％左右汇集时可以进行传代操作；
2.采用巴斯德吸管轻轻吹打细胞，使细胞脱落；
3.将OPCs收集至离心管中，400g离心5分钟收集细胞；
4.弃上清，将细胞重悬于扩增培养基，调整密度为2～10×105/ml，将细胞悬液接种于细胞培养瓶中。扩增培养基组成如下：
5.每3～5天更换一次培养基；
6.待OPCs生长至80％左右汇合时(约需一周)，进行OPCs传代，传代方法同上步骤1-5所述，如此循环。
7.分别将扩增获得的第1、3、5、10代OPCs进行可见光鉴定，如图1-4所示，结果显示在扩增过程中OPCs细胞形态维持不变。
8.再将第10代OPCs进行细胞染色鉴定，如图5-7所示，可见细胞低表达神经元标志物tuj-1、星形胶质细胞标志物GFAP，仍高表达OPCs标志物O4。
实施例2
本实施例所来源OPCs是通过本实验室诱导技术获得的OPCs。
1、OPCs生长至80％左右汇集时可以进行传代操作；
2、采用巴斯德吸管轻轻吹打细胞，使细胞脱落；
3、将OPCs收集至离心管中，400g离心5分钟收集细胞；
4、弃上清，将细胞重悬于扩增培养基，调整密度为2～10×105/ml，将细胞悬液接种于细胞培养瓶中。扩增培养基组成如下：
5、每3～5天更换一次培养基；
6、待OPCs生长至80％左右汇合时(约需一周)，进行OPCs传代，传代方法同上步骤1-5所述，如此循环。
上述实施例中，DMEM、F12为细胞培养中常见的培养基，可任何商业公司，本实施中这两种培养基购自Invitrogen公司，DMEM货号为11965-118，具体配方可参见http://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Product-Technical-Resources/media formulation.8.html，F12货号为11765-054，具体配方可参见http://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Product-Technical-Resources/media formulation.64.html。
B27是神经细胞培养中常用的添加剂，可购自商业公司，本实施中购自Invitrogen公司，B27货号是17504-044，其成分可参考http://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Product-Technical-Resources/media formulation.250.html。
Neural Basal Medium是神经细胞培养中常用的培养基，可购自商业公司。本实施中这两种培养基购自Invitrogen公司，货号为10888022：具体配方可参见：http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.253.html
Neural Basal Medium(无糖型)是神经细胞培养中常用的培养基，可购自商业公司。本实施中这两种培养基购自Invitrogen公司，货号为0050128DJ：具体配方可参见：http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.256.html
表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子-AA和神经营养因子3是细胞培养中常见的细胞因子，可购自商业公司，本实施中购自Peprotech公司，货号为：表皮生长因子：AF-100-15，碱性成纤维细胞生长因子：AF-100-18B，血小板源性生长因子-AA：100-13A-10，神经营养因子3：450-03-10。
乳酸钠、D-葡萄糖、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、胰蛋白酶、胰酶抑制剂购自Sigma公司，货号分别为：乳酸钠：L7022，D-葡萄糖：G8644，转铁蛋白：T2036，孕酮：P8783，腐胺：P5780，亚硒酸钠：S5261，胰岛素：I3536，肝素：H3149，胰蛋白酶：T4674，胰酶抑制剂：T6522。
HEPES购自Corning公司，货号是25-060-CI。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种少突胶质前体细胞的扩增培养基，其特征在于，其关键组份为碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA、神经营养因子3、乳酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种少突胶质前体细胞的扩增培养基，由基础培养基和添加物构成，其特征在于：
所述基础培养基采用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任一一种；另外加上商用无糖型Neural Basal Medium；
所述商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium与商用无糖型Neural Basal Medium两者的体积比为(1-3)∶1；
DF medium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)∶1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml；
所述添加物包括B27、乳酸钠、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA、神经营养因子3、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素，其中，B27为1×，乳酸钠浓度为3-10mmol/L，碱性成纤维生长因子浓度5-25ng/ml，血小板源性生长因子-AA浓度10-20ng/ml，神经营养因子3浓度5-25ng/ml，转铁蛋白浓度5-50μg/ml，孕酮5-20mmol/L，腐胺20-50μmol/L，亚硒酸钠10-20mmol/L，胰岛素5-20μg/ml，肝素2-10μg/ml。
3.根据权利要求2所述的一种少突胶质前体细胞的扩增培养基，其特征在于，所述添加物还可以根据需要包括浓度为100U/ml的青链霉素。
4.一种少突胶质前体细胞的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将OPCs收集至离心管中；
2)400g离心5分钟收集细胞；
3)弃上清，将细胞重悬于扩增培养基，调整密度为2～10×105/ml；
4)将细胞悬液接种于细胞培养瓶中；
5)每3～5天更换一次培养基；
6)待OPCs生长至80％左右汇合时，进行OPCs传代，传代方法同上步骤1)-5)所述，如此循环。
5.根据权利要求4所述的一种少突胶质前体细胞的扩增方法，其特征在于，所述扩增培养基由基础培养基和添加物构成，所述基础培养基采用商用NeuralBasal Medium或自行配制的DF medium任一一种；另外加上商用无糖型NeuralBasal Medium；
所述商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium与商用无糖型Neural Basal Medium两者的体积比为(1-3)∶1；
DF medium培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)∶1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/ml；
所述添加物包括B27、乳酸钠、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子-AA、神经营养因子3、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素，其中，B27为1×，乳酸钠浓度为3-10mmol/L，碱性成纤维生长因子浓度5-25ng/ml，血小板源性生长因子-AA浓度10-20ng/ml，神经营养因子3浓度5-25ng/ml，转铁蛋白浓度5-50μg/ml，孕酮5-20mmol/L，腐胺20-50μmol/L，亚硒酸钠10-20mmol/L，胰岛素5-20μg/ml，肝素2-10μg/ml。
6.根据权利要求5所述的一种少突胶质前体细胞的扩增方法，其特征在于，所述扩增培养基的添加物还包括浓度为100U/ml的青链霉素。
7.权利要求4所述的方法及通过其方法扩增获得的少突胶质前体细胞在制备治疗神经系统损伤疾病药物中的应用。
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