CN103243070A - 一种干细胞培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种干细胞培养基及其应用，所述培养基组分包括有基础培养基、胎牛血清、细胞因子或蛋白多肽、维生素及脂类。本发明提供的培养基能够快速扩增干细胞同时又不影响干细胞的潜能，干细胞的扩增速度较常规培养基提高3-5倍，而且能用于培养多种组织的干细胞，具有极佳的适用性，所培养的干细胞分化能力强，可分化成多种功能细胞，具有很高的科研和医学应用价值。

Description

一种干细胞培养基及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种干细胞培养基及其应用。
背景技术
诸多研究表明干细胞不仅可以自我更新，在条件合适的情况下能分化成其他功能细胞，因此干细胞有望成为治疗人类疑难疾病的有效手段。然而，干细胞在正常成体组织中含量甚微，在体外如何快速扩增与培养干细胞培养是研究干细胞的作用机制及探索其在治疗人类疾病治疗方法的重要技术。
干细胞尽量含量甚微，但广泛分布于哺乳动物的各个组织器官，这些组织或器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤等。大量研究表明，这些低含量的干细胞在体外可以通过适当的方法进行进一步扩增，最常规的一种干细胞培养基就是添加有10%胎牛血清的培养基。然而，采用这种培养基培养的干细胞，不仅生长比较缓慢，而且传递次数超过5代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种干细胞培养基及其应用，旨在解决目前干细胞培养方法落后造成干细胞培养困难，其分化潜能降低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种干细胞培养基，其中，所述培养基组分包括基础培养基，胎牛血清，细胞因子或蛋白多肽，维生素以及脂类；
所述基础培养基为DMEM/F12培养基；
所述细胞因子或蛋白多肽包括有纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、干细胞因子、转铁蛋白；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钠、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C、维生素E；
所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸、脂质混合物。
所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基还包括肝素钠、D-葡萄糖、还原性谷胱甘肽、牛磺酸、β-巯基乙醇、酚红。
所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下成分，各成分的浓度或用量如下：
基础培养基DMEM/F12          1升；
胎牛血清                    1-25%；
纤维细胞生长因子1        1-10 mg/L；  
成纤维细胞生长因子2      1-10 mg/L；
表皮生长因子              1-10 mg/L；
血小板衍生生长因子        1-10 mg/L；
胰岛素                    1-25mg/L；
胰岛素样生长因子1        1-10 mg/L；
血管内皮细胞生长因子      1-10 mg/L；
胎盘生长因子              1-10 mg/L；
白血病抑制因子           1-10 mg/L；
干细胞因子               1-10 mg/L；
转铁蛋白                 4-100 mg/L；
生物素                   6-150 mM；
氯化胆碱                 12-300mM；
D-泛酸钠                 1-25 mM；
叶酸                     1.2-30 mM；
肌醇                     14-350 mM；
烟酰胺                   4-100mM；
吡哆醇盐酸盐             0.03-0.75mM；
核黄素                   0.11-2.75mM；
盐酸硫氨                 0.11-2.75 mM；
维生素B12               0.1-2.5 mM；
腐胺二盐酸盐             0.1-2.5mM；
维生素C                 10-250mg/L；
维生素E                 0.05-1.25mg/L；
地塞米松                   2-50 nM；
油酸                        0.5-12.5 mg/L；
胆固醇                     1-25 mg/L；
乙醇胺                     12-300 ml/L；
亚油酸                      0.3-7.5 mg/L；
硫辛酸                      0.02-0.5 mg/L；
脂质混合物                     0.2-5 ml/L；
肝素钠                          0.08-2g/L；
D-葡萄糖                        3.6-90mM；
还原性谷胱甘肽               0.0002-0.005mg/L；
牛磺酸                      0.00144-0.036g/L；
β-巯基乙醇                    0.01-0.25 mg/L；
酚红                      1.62-40.5mg/L。
所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下成分，各成分的浓度或用量如下：
DMEM/F12                 1L；
胎牛血清                   5%；
纤维细胞生长因子1        1-10 mg/L；  
成纤维细胞生长因子2      1-10 mg/L；
表皮生长因子              1-10 mg/L；
血小板衍生生长因子        1-10 mg/L；
胰岛素                    5 mg/L；
胰岛素样生长因子1        5mg/L；
血管内皮细胞生长因子      5mg/L；
胎盘生长因子              5mg/L；
白血病抑制因子          5 mg/L；
干细胞因子               5mg/L；
转铁蛋白                 20 mg/L；
生物素                   30 mM；
氯化胆碱                 60 mM；
D-泛酸钠                 5 mM；
叶酸                     6 mM；
肌醇                     70 mM；
烟酰胺                   20 mM；
吡哆醇盐酸盐             0.15 mM；
核黄素                   0.55 mM；
盐酸硫氨                 0.55 mM；
维生素B12               0.5 mM；
腐胺二盐酸盐             0.5 mM；
维生素C                  50 mg/L
维生素E                 0.25 mg/L；
地塞米松                  10 nM；
油酸                      2.5 mg/L；
胆固醇                    5 mg/L；
乙醇胺                    60 ml/L；
亚油酸                    1.5 mg/L；
硫辛酸                    0.1 mg/L；
脂质混合物                1 ml/L；
肝素钠                     0.4g/L；
D-葡萄糖                  18 mM；
还原性谷胱甘肽             0.001 mg/L；
牛磺酸                     0.0072 g/L；
β-巯基乙醇                 0.05 mg/L；
酚红                       8.1mg/L。
所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基pH值为7.1。
一种如上所述的干细胞培养基的应用，其中，将所述干细胞培养基用于培养干细胞。
所述的干细胞培养基的应用，其中，所述干细胞包括人与哺乳动物来源的干细胞。
所述的干细胞培养基的应用，其中，所述干细胞从组织或器官里分离得到；所述组织与器官包括骨髓、脐带、脂肪组织。
有益效果：本发明提供的一种干细胞培养基及其用途，该培养基能够快速扩增干细胞同时又不影响干细胞的潜能，干细胞的扩增速度较常规培养基提高3-5倍，而且能用于培养多种组织的干细胞，具有极佳的适用性，所培养的干细胞分化能力强，可分化成多种功能细胞，具有很高的科研和医学应用价值。
附图说明
图1为本发明的培养基对人体脂肪组织干细胞增殖的加速作用的实验结果。
图2为本发明的培养基对人体骨髓间干细胞增殖的加速作用的实验结果。
图3为本发明的培养基对人体脐带干细胞增殖的加速作用的实验结果。
图4为本发明的培养基对增殖后间充质干细胞体外分为成软骨细胞的潜能分析影响实验结果。
图5为本发明的培养基对成脂肪细胞的潜能分析影响实验结果。
图6为本发明的培养基对成神经细胞的潜能分析影响实验结果。
图7为本发明的培养基对成视网膜上皮细胞的潜能分析影响实验结果。
图8为利用本发明的培养基增殖后干细胞对细胞退行性模型的保护作用影响实验结果。
具体实施方式
本发明提供一种干细胞培养基及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供的干细胞培养基适合用于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。与常规培养基相比，该培养基能大大加速干细胞的生长速度并延长干细胞细胞的传代次数。组成包括：基础培养基、5%胎牛血清、维生素、脂类、细胞因子或蛋白多肽，并用酸或碱调pH值为pH7.1。
具体地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。所述细胞因子或蛋白多肽的成分包括有纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、干细胞因子、转铁蛋白。所述维生素为生物素、氯化胆碱、D-泛酸钠、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C、维生素E。所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸、脂质混合物（Sigma，L5416）。
所述干细胞培养基以1升计算，包括以下成分：
基础培养基DMEM/F12，1升；
所述胎牛血清（FBS）的浓度为1-25%；较佳的是，胎牛血清的浓度为1-5%；
所述细胞因子或蛋白多肽各成分浓度或量为：
纤维细胞生长因子1        1-10 mg/L；  
成纤维细胞生长因子2      1-10 mg/L；
表皮生长因子              1-10 mg/L；
血小板衍生生长因子        1-10 mg/L；
胰岛素                    1-25mg/L；
胰岛素样生长因子1        1-10 mg/L；
血管内皮细胞生长因子      1-10 mg/L；
胎盘生长因子              1-10 mg/L；
白血病抑制因子           1-10 mg/L；
干细胞因子               1-10 mg/L；
转铁蛋白                 4-100 mg/L；
所述维生素各成分的浓度或量为：
生物素                   6-150 mM；
氯化胆碱                 12-300mM；
D-泛酸钠                 1-25 mM；
叶酸                     1.2-30 mM；
肌醇                     14-350 mM；
烟酰胺                   4-100mM；
吡哆醇盐酸盐             0.03-0.75mM；
核黄素                   0.11-2.75mM；
盐酸硫氨                 0.11-2.75 mM；
维生素B12               0.1-2.5 mM；
腐胺二盐酸盐             0.1-2.5mM；
维生素C                 10-250mg/L
维生素E                 0.05-1.25mg/L；
所述脂类各成分的浓度或量为：
地塞米松                  2-50 nM；
油酸                      0.5-12.5 mg/L；
胆固醇                    1-25 mg/L；
乙醇胺                    12-300 ml/L；
亚油酸                    0.3-7.5 mg/L；
硫辛酸                    0.02-0.5 mg/L；
脂质混合物（Sigma，L5416）0.2-5 ml/L；
所述干细胞培养基还包括以下成分，其浓度或量为：
肝素钠（Heparin sodium）               0.08-2g/L；
D-葡萄糖（D-Glucose）                 3.6-90mM；
还原性谷胱甘肽（Reduced Glutathione）   0.0002-0.005mg/L；
牛磺酸（Taurine）                      0.00144-0.036g/L；
β-巯基乙醇（BME）                    0.01-0.25 mg/L；
酚红（Phenol red）                      1.62-40.5mg/L。
最后用酸或碱将所述干细胞培养基调节pH值至7.1。
本发明所述培养基适合培养适合于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，可用于培养的干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。该培养基能让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能。而用于培养的干细胞可以从骨髓、脐带、脂肪组织等具有干细胞的组织或器官里分离到。经本发明所描述的培养基培养之后的干细胞在适当的条件下可以分化成脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、视网膜色素细胞等功能细胞。经本发明培养基培养之后的干细胞在移植后对包括具有遗传突变修饰的视网膜退行性模型在内的退行性组织或器官具有保护作用。
对本发明提供的干细胞培养基进行了一系列的测定实验如下：
其中，下述实施例1~6中，本发明所提供的干细胞培养基pH值为7.1，其具体成分的质量浓度或用量如下：
DMEM/F12                 1L；
胎牛血清                   5%；
纤维细胞生长因子1        1-10 mg/L；  
成纤维细胞生长因子2      1-10 mg/L；
表皮生长因子              1-10 mg/L；
血小板衍生生长因子        1-10 mg/L；
胰岛素                    5 mg/L；
胰岛素样生长因子1        5mg/L；
血管内皮细胞生长因子      5mg/L；
胎盘生长因子              5mg/L；
白血病抑制因子          5 mg/L；
干细胞因子               5mg/L；
转铁蛋白                 20 mg/L；
生物素                   30 mM；
氯化胆碱                 60 mM；
D-泛酸钠                 5 mM；
叶酸                     6 mM；
肌醇                     70 mM；
烟酰胺                   20 mM；
吡哆醇盐酸盐             0.15 mM；
核黄素                   0.55 mM；
盐酸硫氨                 0.55 mM；
维生素B12               0.5 mM；
腐胺二盐酸盐             0.5 mM；
维生素C                  50 mg/L
维生素E                 0.25 mg/L；
地塞米松                  10 nM；
油酸                      2.5 mg/L；
胆固醇                    5 mg/L；
乙醇胺                    60 ml/L；
亚油酸                    1.5 mg/L；
硫辛酸                    0.1 mg/L；
脂质混合物（Sigma，L5416）1 ml/L；
肝素钠                     0.4g/L；
D-葡萄糖                  18 mM；
还原性谷胱甘肽             0.001 mg/L；
牛磺酸                     0.0072 g/L；
β-巯基乙醇                 0.05 mg/L；
酚红                       8.1mg/L。
实施例1：对干细胞增殖的加速作用的实验
1、受试培养基：常规培养基组分：DMEM/F12基本培养基，10% 胎牛血清（FBS）；本发明的培养基。
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC, BMSC, UMBSC)。
3、体外细胞培养实验。细胞接种密度控制在10-20%之间，接种后加入培养基培养（37°C，5% CO2）。通过MTT法每隔12小时测一次细胞密度。图1-3为本实施例的实验结果，从图中可以看出，经本发明的培养基培养的干细胞（实心柱形）比经常规培养基培养的细胞（空心柱形）表现出更快的扩增速度，〔数据为三次独立实验的平均值±SEM（P<0.0001）〕。由此，采用本发明的培养基对干细胞的扩增与常规的培养基相比达到100%细胞密度的时间大大缩短。
实施例2：对增殖后间充质干细胞体外分为成软骨细胞的潜能分析影响实验
1、受试培养基：常规培养基组分：DMEM/F12 基本培养基，10% 胎牛血清（FBS）；本发明的培养基。
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC, BMSC, UMBSC)。
3、体外细胞培养实验。按文献所描述的方法测定脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增之后的成软骨细胞分化实验（Nat Protoc 2010; 5: 1294–1311; Biomaterials. 2004 Jul;25(16):3211-22; Tissue Eng Part A. 2009 Feb;15(2):231-41）。待干细胞长到合适密度（细胞密度20-80%），加入成软骨诱导培养基 （1% FBS的DMEM/F12培养基, 10 mg/L TGF, 50 nM维生素C，6.25 mg/L胰岛素, 1% 双抗），每天换一次液，总共诱导3周。诱导成功之后进行阿尔新蓝染色，1% 阿尔新蓝配方：称取0.1 g阿尔新蓝，溶于10 ml 3% 冰醋酸溶液，待沉淀溶解后，用0.22 mm的滤器过滤后再使用。具体染色方法是，吸去细胞培养基后用PBS洗一遍； 再加入4% 多聚甲醛溶液固定30 分钟后用PBS洗2-3遍；加入新配的1% 阿尔新蓝染液染色40 分钟，用PBS洗3次 （每次2分钟），置显微镜下观察。对软骨细胞染色后统计阳性细胞的数量，实验结果如图4所示，经本发明描述的培养基培养的干细胞（实心柱形）与经常规培养基培养的干细胞（空心柱形）分化成软骨细胞的比率均在80-90% 之间，因此表现出相似的成软骨细胞的能力（数据为三次独立实验的平均值±SEM）。结果表明干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成软骨细胞的效率与常规干细胞培养基培养后的成软骨细胞的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成软骨细胞的潜能。
实施例3：对成脂肪细胞的潜能分析影响实验
1、受试培养基：常规培养基组分：DMEM/F12基本培养基，10% 胎牛血清（FBS）；本发明的培养基。
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC, BMSC, UMBSC)。
3、体外细胞培养实验。为进一步检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增8代后对其分化潜能的影响，我们按文献所描述的脂肪来源的干细胞（ADSC）成脂诱导及油红O染色方法我们测定了按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增之后成脂肪细胞的分化实验（Methods in Molecular Biology, 2011, Volume 702, Part 3, 193-200; Methods. Volume 45, Issue 2, June 2008, Pages 115–120; Cytotherapy. 2003, Vol.5, No.5,Pages 362-369). 具体的方法是，待干细胞密度为80%左右换成成脂培养基进行诱导，成脂培养基的配方为：1% FBS的DMEM/F12培养基、1 mM 地塞米松、200 mM 吲哚美辛、0.5 nM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤( IBMX)、10 mg/ml 胰岛素。两天换一次液，诱导两周后进行油红O染色。油红O染色液由油红O 配置而成，油红O储存液：称取0.5 g油红O加入到100 ml异丙醇中，0.22 mm过滤；油红O工作液：吸取6ml油红O储存液加入到4 ml蒸馏水中，混合均匀即可。具体方法是，成脂诱导成功后吸去培养基并用PBS洗2遍；加入新配置的油红O染色液染色1小时；去掉染色液，用PBS洗3遍，每次2 min，用显微镜观察。对脂肪细胞染色后统计阳性细胞的数量，实验结果如图5所示，结果表明经本发明描述的培养基培养过的干细胞（实心柱形）与经常规培养基培养的干细胞（空心柱形）分化成软骨细胞的比率均在80%以上，因此表现出相似的成脂肪细胞的能力（数据为三次独立实验的平均值±SEM）。干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成脂肪细胞的效率与常规干细胞培养基培养后的成脂肪细胞的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成脂肪细胞的潜能。
实施例4：对成神经细胞的潜能分析影响实验
1、受试培养基：常规培养基组分：DMEM/F12基本培养基，10% 胎牛血清（FBS）；本发明的培养基。
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC, BMSC, UMBSC)。
3、体外细胞培养实验。为进一步检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对其分化潜能的影响，我们按文献所描述测定了按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增7代之后成神经细胞的分化实验 （Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Aug 21;104(34):13821-6.）。具体地，细胞接种植后待达到70%～80%细胞密度时, 加入诱导分化的培养基, 即DMEM/F12、10% FBS、1～2 mM BME, 24 h后吸去培养基, PBS洗2次, 换成 DMEM、1～4 mM BME, 处理1～5 h, 吸去培养基, 换成N2培养基、20 ng bFGF 继续培养。DMEM/F12：N2添加剂比例为1：1。向神经细胞诱导分化30 min到10 d直接在培养皿上进行免疫细胞化学检查。需检查的神经元特异标志物有神经元特异性烯醇化酶(NSE) 和神经微丝（NF）。首先，0. 01 mol/ L PBS洗去培养液, 4%的多聚甲醛固定15 min；PBS洗3次, 每次5 min；0. 25% Triton X-100处理15 min； PBS洗3次, 每次5 min；含有1%羊血清的一抗37℃处理1. 5 h，4℃过夜; PBS洗3次, 每次5 min; FITC结合的兔抗鼠 IgG二抗；37℃孵育1 h；PBS洗3次，每次5 min；荧光染色直接在荧光显微镜下观察、照相; ABC法染色按说明书进行。对神经细胞标志物染色后统计阳性细胞的数量，实验结果如图6所示，经本发明描述的培养基培养过的干细胞（实心柱形）与经常规培养基培养的干细胞细胞（空心柱形）分化成神经细胞的比率均在50-58% 左右，因此表现出相似的成神经的能力〔数据为三次独立实验的平均值±SEM （P<0.001）〕。结果表明干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成神经细细胞的效率与常规干细胞培养基培养后的成神经细胞的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成神经细胞的潜能。
实施例5：对成视网膜上皮细胞的潜能分析影响实验
1、受试培养基：常规培养基组分：DMEM/F12基本培养基，10% 胎牛血清（FBS）；本发明的培养基。
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC, BMSC, UMBSC)。
3、体外细胞培养实验。为进一步检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对其分化潜能的影响，我们按文献所描述测定了按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增8代之后视网膜上皮细胞（RPE）的分化实验（Nat Biotechnol. 2008 Feb;26(2):215-24.）。对RPE细胞标志物染色后统计阳性细胞的数量，结果如图7所示，经本发明描述的培养基培养过的干细胞（实心柱形）与经常规培养基培养的干细胞细胞（空心柱形）分化成RPE细胞的比率均在55-70% 之间，因此表现出相似的成RPE细胞的能力。干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成RPE细胞的效率与常规干细胞培养基的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成RPE细胞的潜能。
实施例6：增殖后干细胞对细胞退行性模型的保护作用
1、受试培养基：本发明的培养基
2、培养干细胞来源：分别来源于脂肪、骨髓间及脐带三种组织器官的人体干细胞(ADSC, BMSC, UMBSC)。
3、体外细胞培养实验。为检测干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对退行性疾病的治疗作用，我们选用了视网膜感光细胞退行性视网膜疾病小鼠模型 （rd1）（Nature. 1990 Oct 18;347(6294):677-80），将8代扩增后的脂肪、骨髓以及脐三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC或UMBSC) 扩增之后植入rd1退行性视网膜之后，组织学检测感光细胞的数量，以确定其对视网膜感光细胞的保护作用。图8中，WT：正常视网膜，Untreated：未植入干细胞的rd1退行性视网膜。实验结果如图8所示，结果表明，视网膜感光细胞退行性小鼠经干细胞治疗1个月之后，感光细胞的数量由原来不到5%提高到40-50%，干细胞经本发明的培养基培养之后保护减缓组织细胞退化的能力仍然维持，〔数据为三次独立实验的平均值±SEM（P<0.0001）〕。干细胞细胞移植之后rd1小鼠视网膜感光细胞退化明显变慢，因此经本发明所描述的培养基扩增后的干细胞在对退行性视网膜具有保护作用。
本发明提供的一种干细胞培养基及其用途，该培养基能够快速扩增干细胞同时又不影响干细胞的潜能，干细胞的扩增速度较常规培养基提高3-5倍，而且能用于培养多种组织的干细胞，具有极佳的适用性，所培养的干细胞分化能力强，可分化成多种功能细胞，具有很高的科研和医学应用价值。经本发明所描述的培养基培养的干细胞象常规培养基培养的干细胞一样能很好的分化成其功能细胞，其功能细胞包括但不局限于脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、视网膜色素上皮细胞。一方面，经本发明所描述的培养基培养过的干细胞像常规培养基培养过的干细胞一样，细胞移植后对退行性组织或器官具有很好的保护作用；另一方面，经本发明所描述的培养基培养过的干细胞像常规培养基培养过的干细胞一样，经移植后可以部分恢复原有的功能。因此本发明所描述的培养基较常规培养基相比更适合用于培养干细胞。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种干细胞培养基，其特征在于，所述培养基组分包括基础培养基，胎牛血清，细胞因子或蛋白多肽，维生素以及脂类；
所述基础培养基为DMEM/F12培养基；
所述细胞因子或蛋白多肽包括有纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、干细胞因子、转铁蛋白；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钠、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C、维生素E；
所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸、脂质混合物。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基还包括肝素钠、D-葡萄糖、还原性谷胱甘肽、牛磺酸、β-巯基乙醇、酚红。
3.根据权利要求2所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下成分，各成分的浓度或用量如下：
基础培养基DMEM/F12          1升；
胎牛血清                    1-25%；
纤维细胞生长因子1        1-10 mg/L；  
成纤维细胞生长因子2      1-10 mg/L；
表皮生长因子              1-10 mg/L；
血小板衍生生长因子        1-10 mg/L；
胰岛素                    1-25mg/L；
胰岛素样生长因子1        1-10 mg/L；
血管内皮细胞生长因子      1-10 mg/L；
胎盘生长因子              1-10 mg/L；
白血病抑制因子           1-10 mg/L；
干细胞因子               1-10 mg/L；
转铁蛋白                 4-100 mg/L；
生物素                   6-150 mM；
氯化胆碱                 12-300mM；
D-泛酸钠                 1-25 mM；
叶酸                     1.2-30 mM；
肌醇                     14-350 mM；
烟酰胺                   4-100mM；
吡哆醇盐酸盐             0.03-0.75mM；
核黄素                   0.11-2.75mM；
盐酸硫氨                 0.11-2.75 mM；
维生素B12               0.1-2.5 mM；
腐胺二盐酸盐             0.1-2.5mM；
维生素C                 10-250mg/L；
维生素E                 0.05-1.25mg/L；
地塞米松                   2-50 nM；
油酸                        0.5-12.5 mg/L；
胆固醇                     1-25 mg/L；
乙醇胺                     12-300 ml/L；
亚油酸                      0.3-7.5 mg/L；
硫辛酸                      0.02-0.5 mg/L；
脂质混合物                     0.2-5 ml/L；
肝素钠                          0.08-2g/L；
D-葡萄糖                        3.6-90mM；
还原性谷胱甘肽               0.0002-0.005mg/L；
牛磺酸                      0.00144-0.036g/L；
β-巯基乙醇                    0.01-0.25 mg/L；
酚红                      1.62-40.5mg/L。
4.根据权利要求3所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下成分，各成分的浓度或用量如下：
基础培养基DMEM/F12          1L；
胎牛血清                   5%；
纤维细胞生长因子1        1-10 mg/L；  
成纤维细胞生长因子2      1-10 mg/L；
表皮生长因子              1-10 mg/L；
血小板衍生生长因子        1-10 mg/L；
胰岛素                    5 mg/L；
胰岛素样生长因子1        5mg/L；
血管内皮细胞生长因子      5mg/L；
胎盘生长因子              5mg/L；
白血病抑制因子          5 mg/L；
干细胞因子               5mg/L；
转铁蛋白                 20 mg/L；
生物素                   30 mM；
氯化胆碱                 60 mM；
D-泛酸钠                 5 mM；
叶酸                     6 mM；
肌醇                     70 mM；
烟酰胺                   20 mM；
吡哆醇盐酸盐             0.15 mM；
核黄素                   0.55 mM；
盐酸硫氨                 0.55 mM；
维生素B12               0.5 mM；
腐胺二盐酸盐             0.5 mM；
维生素C                  50 mg/L
维生素E                 0.25 mg/L；
地塞米松                  10 nM；
油酸                      2.5 mg/L；
胆固醇                    5 mg/L；
乙醇胺                    60 ml/L；
亚油酸                    1.5 mg/L；
硫辛酸                    0.1 mg/L；
脂质混合物                1 ml/L；
肝素钠                     0.4g/L；
D-葡萄糖                  18 mM；
还原性谷胱甘肽             0.001 mg/L；
牛磺酸                     0.0072 g/L；
β-巯基乙醇                 0.05 mg/L；
酚红                       8.1mg/L。
5.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基pH值为7.1。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，将所述干细胞培养基用于培养干细胞。
7.根据权利要求6所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，所述干细胞包括人与哺乳动物来源的干细胞。
8.根据权利要求6所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，所述干细胞从组织或器官里分离得到；所述组织与器官包括骨髓、脐带、脂肪组织。
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Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263698A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 江苏华亿细胞组织工程有限公司 临床治疗级细胞治疗用成纤维细胞规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
CN104928244A (zh) * 2015-06-05 2015-09-23 芜湖医诺生物技术有限公司 细胞培养基及其制备方法和应用
CN105200008A (zh) * 2015-10-23 2015-12-30 新乡医学院 干细胞培养基
CN106148275A (zh) * 2016-08-08 2016-11-23 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种提高表皮干细胞贴壁性的培养基
CN106754659A (zh) * 2016-12-31 2017-05-31 成都育芽科技有限公司 一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法
CN106754675A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN107232186A (zh) * 2016-03-06 2017-10-10 李倩 一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液
CN107475184A (zh) * 2016-06-07 2017-12-15 广州美萨生物科技有限公司 一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基
CN108699519A (zh) * 2016-01-12 2018-10-23 康干细胞生物技术有限公司 干细胞衍生的含有大量生长因子的外来体
CN108913647A (zh) * 2018-08-08 2018-11-30 新乡医学院 一种干细胞培养基及其制备方法
CN110295140A (zh) * 2019-06-04 2019-10-01 河北贝特赛奥生物科技有限公司 一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法
CN111748522A (zh) * 2020-07-31 2020-10-09 贵州医科大学附属医院 一种干细胞培养基及其应用
CN111961643A (zh) * 2020-08-26 2020-11-20 杭州优渡生物科技有限公司 一种干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
CN112608884A (zh) * 2020-12-08 2021-04-06 生物岛实验室 培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法
CN112779211A (zh) * 2019-11-04 2021-05-11 东莞市恩联干细胞生物科技研究院 一种优化的人脂肪间充质干细胞培养体系
CN114958734A (zh) * 2021-10-22 2022-08-30 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种人间充质干细胞培养基

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101475934A (zh) * 2009-01-16 2009-07-08 湖南惠霖生命科技有限公司 人类胚胎干细胞无饲养细胞培养体系培养基及培养方法
CN101525594A (zh) * 2009-04-17 2009-09-09 中国医学科学院血液学研究所 一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法
CN102732476A (zh) * 2012-07-19 2012-10-17 中国农业大学 一种胚胎干细胞培养基及其应用
CN103060264A (zh) * 2012-12-20 2013-04-24 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101475934A (zh) * 2009-01-16 2009-07-08 湖南惠霖生命科技有限公司 人类胚胎干细胞无饲养细胞培养体系培养基及培养方法
CN101525594A (zh) * 2009-04-17 2009-09-09 中国医学科学院血液学研究所 一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法
CN102732476A (zh) * 2012-07-19 2012-10-17 中国农业大学 一种胚胎干细胞培养基及其应用
CN103060264A (zh) * 2012-12-20 2013-04-24 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263698A (zh) * 2014-09-19 2015-01-07 江苏华亿细胞组织工程有限公司 临床治疗级细胞治疗用成纤维细胞规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
CN104928244A (zh) * 2015-06-05 2015-09-23 芜湖医诺生物技术有限公司 细胞培养基及其制备方法和应用
CN104928244B (zh) * 2015-06-05 2018-11-16 张竞方 细胞培养基及其制备方法和应用
CN105200008A (zh) * 2015-10-23 2015-12-30 新乡医学院 干细胞培养基
CN108699519A (zh) * 2016-01-12 2018-10-23 康干细胞生物技术有限公司 干细胞衍生的含有大量生长因子的外来体
CN107232186A (zh) * 2016-03-06 2017-10-10 李倩 一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液
CN107232186B (zh) * 2016-03-06 2018-09-21 郑州欧范医疗器械有限公司 一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液
CN107475184A (zh) * 2016-06-07 2017-12-15 广州美萨生物科技有限公司 一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基
CN106148275A (zh) * 2016-08-08 2016-11-23 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种提高表皮干细胞贴壁性的培养基
CN106754675A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN106754659A (zh) * 2016-12-31 2017-05-31 成都育芽科技有限公司 一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法
CN106754659B (zh) * 2016-12-31 2020-10-30 浙江领蔚生物技术有限公司 一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法
CN108913647A (zh) * 2018-08-08 2018-11-30 新乡医学院 一种干细胞培养基及其制备方法
CN108913647B (zh) * 2018-08-08 2021-06-04 新乡医学院 一种干细胞培养基及其制备方法
CN110295140A (zh) * 2019-06-04 2019-10-01 河北贝特赛奥生物科技有限公司 一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法
CN112779211A (zh) * 2019-11-04 2021-05-11 东莞市恩联干细胞生物科技研究院 一种优化的人脂肪间充质干细胞培养体系
CN111748522A (zh) * 2020-07-31 2020-10-09 贵州医科大学附属医院 一种干细胞培养基及其应用
CN111961643A (zh) * 2020-08-26 2020-11-20 杭州优渡生物科技有限公司 一种干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
CN112608884A (zh) * 2020-12-08 2021-04-06 生物岛实验室 培养基补充组合物、干细胞培养基及其制备方法
CN114958734A (zh) * 2021-10-22 2022-08-30 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种人间充质干细胞培养基

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