CN105695402A - 诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物和方法，所述组合物包含：20-80 μM L-抗坏血酸-2-磷酸酯，2-10 ng/ml TGF β3，50-150 nM地塞米松，10-50 μg/ml维生素C，10-50 μg/ml脯氨酸， 0.5-5 μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10 μg/ml的氯地孕酮酯。该组合物在用作培养基的诱导剂时，能够提高分化活性和分化定向性。

Description

诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物和方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，更具体地涉及间充质干细胞向软骨诱导的组合物及诱导方法。
背景技术
间充质干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，具有很强的自我复制能力及多向分化潜能，在一定诱导条件下可定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等，近年来作为种子细胞和细胞载体被广泛应用于软骨组织工程和基因治疗。
目前采用间充质干细胞分化成软骨细胞的方法一般是将间充质干细胞培养至传代的间充质干细胞后，再在含有定向诱导为软骨细胞的因子的培养基中进行诱导培养，将间充质干细胞诱导成软骨细胞。但是由于间充质干细胞的定向诱导分化受很多不同信号通路的影响，而且诱导培养间充质干细胞的细胞微环境变化对于间充质干细胞诱导分化及其分子结构有着非常重要的影响。因此。导致现有的间充质干细胞分化成软骨细胞的方法所需周期都较长，通常需要2-4周，并且诱导后II型胶原的表达效率较低。
举例而言，关节软骨因损伤而导致退变，甚至发生退行性骨关节炎，随着人口的老龄化骨关节炎的发病率正在逐渐增加。由于没有神经、血管和淋巴的分布，软骨虽然有一定的自我修复能力，但是大于5mm以上的局部软骨损伤就很那进行自我修复，关节炎类软骨疾病一直不能得到很好的手术治疗。软骨组织的传统修复方法是自体组织分离的软骨细胞经体外培养，但是却面临着成熟软骨组织扩增能力有限，随着传代次数的增加，细胞逐渐老化而丧失增殖能力，难以满足组织构建需要和逐渐丧失其原有特性而分化成其他组织的问题。而骨髓干细胞具有自我更新和多功能分化潜能的特性，在适当培养条件下可被诱导分化成软骨细胞，通过体细胞核转移技术有可能提供无免疫原性的“通用型”种子细胞，这将为软骨疾病的治疗提供大量的健康备用组织。干细胞向软骨细胞的分化成为医学界的热点研究问题之一。
CN101014699A公开了一种去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基，其用于使去分化而软骨特性减弱的去分化型软骨细胞向原来的软骨细胞再分化，含有胰岛素和从BMP-2及其类似物中选择的至少一种。
CN101748095A公开了一种定向诱导软骨细胞的方法，具体涉及一种采用人类羊膜上皮细胞定向诱导软骨细胞的方法，其依据组织工程基因学原理，通过体外培养人羊膜上皮细胞，进行羊膜上皮细胞的原代、传代培养，观察调整羊膜上皮细胞基因型，利用细胞因子和BMP-7诱导和调控其定向诱导分化成软骨细胞，通过分子生物学方法检测诱导分化的细胞的软骨细胞特性及软骨细胞活性，明确人羊膜上皮细胞定向诱导软骨细胞的调控机制，结果表明人羊膜上皮细胞可以作为软骨细胞诱导分化的种子源。
CN102399745A公开了一种软骨干细胞分离培养方法，其中所述的软骨干细胞为由软骨组织细胞筛选而来，经特定培养基培养条件维持的成纤维样细胞，具骨、软骨及脂肪分化能力，与成体细胞相比还具有良好的扩增能力，自原代收获后可传至15代以上而保持原来特性，其利用特定培养条件进行筛选，纯化出软骨干细胞，使软骨干细胞含量在95％以上，此技术将促进软骨组织性特异干细胞的收获和应用于骨、软骨组织工程。
CN103146645A公开了一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，包括如下步骤：获取间充质干细胞和软骨细胞；将所述软骨细胞接种于软骨细胞培养液中进行培养；将所述间充质干细胞接种于插入式细胞培养皿中，再将接种有所述间充质干细胞的所述插入式细胞培养皿置于所述软骨细胞培养液中，并将所述软骨细胞培养液更换成软骨细胞诱导分化培养基后进行共同培养；其中，所述软骨细胞诱导分化培养基中含有甲状旁腺激素相关蛋白1-34。
WO2014/078579A1公开了一种用于将成纤维细胞分化成脂肪细胞的方法，其包括：a)在标准条件下将成纤维细胞在成纤维细胞培养基中生长至汇合；b)在第一分化细胞培养基中培养所述细胞；c)在第二分化细胞培养基中培养所述细胞；和d)确认脂肪细胞的存在。
“转化生长因子β及周期性拉伸应变条件下骨髓间充质干细胞向软骨样细胞的分化”，郝耀等，中国组织工程研究，2014(28)，研究了转化生长因子β对骨髓间充质干细胞的软骨方向分化所具有显著的诱导作用，研究发现，周期性拉伸应变可以模拟软骨细胞在体内的力学环境，对细胞的增殖和分化起着重要的调节作用，转化生长因子β及周期性拉伸应变在诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化过程中是否具有协同作用。
CN102899287A公开了一种采用小球法诱导培养间充质干细胞的方法，该方法可以制得无支架软骨，通过定时晃动离心管使细胞球与管底分离，保证了细胞球与诱导分化培养基充分接触，细胞球中的间充质干细胞分化状态均一，脐带源间充质干细胞相对于常规的骨髓源间充质干细胞分离制备简便，来源丰富。然而，发现在该方法中，诱导的定向性仍有待提高，例如仍含义一定量的脂肪细胞、基质细胞等其它细胞。本发明人在该专利的基础上，对其诱导成分进行改进，使得能够更好地模拟体内多因素联合调控的作用，更加有利于促进其软骨分化，同时通过引用将该专利全文并入本文。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明人在上述现有技术的基础上，经过深入研究和大量实验，提出了如下技术方案。
在本发明的一方面，提供了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物，该组合物包含：20-80μML-抗坏血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mlTGFβ3，50-150nM地塞米松，10-50μg/ml维生素C，10-50μg/ml脯氨酸，0.5-5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix(即，10μg/mlInsulin,5.5μg/mltransferrin,5ng/mlselenium,5.35μg/mllinoleicacid)，0.5-10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮酯，所述浓度是指在培养基中的浓度：
优选地，该组合物包含：50μg/mlL-抗坏血酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)所示的氯地孕酮酯。
当然，本领域技术人员可以理解的是，所述组合物也可以是培养基与上述诱导组分的组合。
本发明人发现，氯地孕酮酯的浓度为1μg/ml可以获得最佳的分化效果(可例如参见图1)，浓度继续增加，分化效果反而下降，这样的效果是先前所未曾预料到的。
本发明人经研究还发现，所述氯地孕酮酯可有效诱导间充质干细胞向软骨细胞的分化。在软骨分化条件下，氯地孕酮酯可提高hBMSCs中ALP的活性，并且由成骨诱导后的茜素红S染色证实氯地孕酮酯提高了成熟成骨细胞中矿物质集聚和钙沉积(参见图1)。
优选地，该组合物还包含10-100μM的β-甘油磷酸钠。β-甘油磷酸钠在培养液中迅速被水解，产生大量磷酸离子，促进生理性钙盐的沉积和钙化，是骨髓基质细胞诱导发生矿化结节的必要条件，可以和维生素C一起加速骨髓基质细胞向成骨细胞分化，促进钙化结节的形成。
优选地，脯氨酸替换为左旋谷氨酰胺。
在一个特别优选的实施方式中，所述组合物还包含50-200μM雪莲和/或藏红花的提取物。所述雪莲优选为天山雪莲。
所述雪莲和/或藏红花的提取物通过如下方法制得：
(1)将干燥的雪莲和/或藏红花粉碎，然后加入为其体积约5-30倍的水和乙醇混合物(水:乙醇＝1:1体积)，搅拌均匀，之后置于60-90℃的恒温水浴锅中进行浸提，浸提时间为1-5小时；
(2)将浸提后的混合物进行过滤，然后将滤液在不高于80℃的温度下进行减压浓缩，获得浓缩液；
(3)将上述浓缩液溶解在乙醇中，用乙酸乙酯/石油醚混合液(体积比为1:1-1:3)做流动相，经过大孔吸附树脂进行层析纯化，用硅胶柱进行层析纯化，采用HPLC进行洗脱组分的监测，获得经纯化的提取物浓缩液；
(4)采用纳滤将步骤(3)得到的经纯化的提取物浓缩液再次进行纯化分离，在低于60℃的温度下除去溶剂，得到固体形式的提取物。
实验结果证明所述提取物的加入，可明显进一步增强干细胞向软骨细胞的分化，显著促进Sox9的表达，诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，还能增加细胞的collagenII、collagenX表达。
另外，所述提取物含有直接刺激骨髓问充质干细胞不断增殖的成分，例如东莨菪素、β-谷甾醇，从而使骨髓间充质干细胞数量不断增加，并诱导骨髓问充质干细胞不断向软骨细胞分化，进而促进软骨细胞分泌的II型胶原。
此外，发现通过上述提取方法得到的提取物具有非常高的纯度，能够满足诱导分化的品质要求，而一般的提取方法例如简单的水提取法或醇提取法，提取物会由于杂质的存在导致分化受到严重抑制。
在本发明中，该组合物优选用作培养液(培养基)的成软骨诱导剂，即成软骨诱导组合物。
所述培养液可以包括DMEM培养液、α-MEM培养液中的任一种。DMEM培养液可以是高糖DMEM培养液、DMEM+10％FBS培养基等。
在本发明的另一方面，还提供了一种利用上述诱导组合物诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其中，在15ml尖底离心管中使用小球法诱导培养间充质干细胞，并且每隔约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，使用的诱导分化培养基为高糖DMEM加入前述组成和浓度的组合物。
优选地，诱导分化培养时间为14-21天。
优选地，所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞。
在一个特别优选的实施方案中，所述诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法包括以步骤：
1)在每个75cm2培养瓶中加入13.5ml间充质干细胞生长培养基培养P3代脐带源间充质干细胞，细胞生长达到70-80％融合，用D-Hank’s洗液洗两遍后，加入1.5ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用1.5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取200微升计数确定细胞数量，其余细胞悬液离心，1000rpm，维持10min；倒掉离心后的上清，以1:3的比例传代，培养至P4代，细胞生长达到70-80％融合，用D-Hank’s洗液洗两遍后，加入1.5ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用1.5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，离心，1000rpm，10min；倒掉离心后的上清，加入30mlD-hank’s洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入30mlD-hank’s洗液，混匀后，取出200微升计数，其余细胞悬液离心，1000rpm，10min；离心后去掉上清；其中，所述间充质干细胞生长培养基为DMEM/F12加入10％人血清、20ng/mlEGF、5ng/mlFGF2；
2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1×106细胞/ml；
3)小球法诱导培养细胞：将1ml含有1×106个细胞的细胞悬液加入15ml尖底离心管中，240g离心5分钟，将离心管放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，轻轻晃动离心管，使细胞球与管底分离，之后换加入诱导分化培养基，所述培养基含有50μg/mlL-抗坏血酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)所示的氯地孕酮酯；每隔24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，每两天更换一次诱导分化培养基；21天后，取出小球。
在一个替代的或另外的实施方案中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，在该情况下，所述诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法包括以步骤：
1)骨髓间充质干细胞的分离纯化与培养：将4周龄SD大鼠处死后，无菌条件下分离四肢，体积分数75％乙醇浸泡15min，用含体积分数10％FBS的DMEM培养基冲洗四肢的骨髓腔，外接肝素(3000U，0.2mL)润洗过的20mL无菌注射器，抽取骨髓5mL，加入等量PBS溶液，混匀后以1000r/min的速度离心6min，吸弃上层脂肪组织及上清，反复2次，剩余液体混匀后缓慢置于等量Percoll淋巴细胞分离液(密度1.073g/mL)上，以2500r/min的速度离心20min，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一离心管，悬浮于含体积分数为10％胎牛血清的α-MEM培养基(含青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)，轻轻吹打均匀，接种到25cm2培养瓶，置37℃，体积分数为5％CO2及饱和湿度培养箱中培养。两三天首次半量换液，以后每3d或4d换液1次，12～14d细胞生长融合达80％以上，以0.25％胰蛋白酶消化，按1:2比例传代培养，每2d或3d换液1次，倒置显微镜下逐日观察细胞形态；
2)取步骤1)经分离纯化与培养的髓间充质干细胞，以1×108/L的细胞浓度接种于内含盖玻片的12孔培养板内，培养24h后，待细胞完全贴壁，，培养液为含有上文所述成软骨诱导组合物的H-DMEM常规培养液，每2d或3d换液1次，显微镜下观察到软骨细胞的形成。
说明书附图
图1为根据本发明实施例1的向软骨诱导分化21天后的UC-MSCs小球的茜素红S染色照片图；
其中紫红色证明为软骨细胞，GM是无诱导剂的对照组，0、0.01、0.1、1和10表示氯地孕酮酯的浓度为0、0.01、0.1、1和10μg/ml
图2为根据本发明实施例1的软骨诱导分化茜素红S染色放大150倍的照片图。
图3为根据本发明实施例2的软骨诱导分化茜素红S染色放大300倍的照片图。
具体实施方案
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
该实施例按照CN102899287A的实施例1进行操作，不同之处仅在于诱导分化培养基包含如下组成的诱导组合物：50μg/mlL-抗坏血酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)所示的氯地孕酮酯。如图1所示，紫红色的长梭形细胞证明该方法成功获得了软骨细胞。与CN102899287A的实施例1的分化结果对比，例如由分化照片图对比可知，本发明实施例1的分化效果和分化定向性明显更好，例如形态更为良好且表型稳定。
实施例2
该实施例与实施例1的区别仅仅在于诱导组合物还包含100μM天山雪莲提取物。该雪莲提取物按照上文所述提取方法制备。
参考图3，与实施例1相比，实施例2中的分化定向性更好，其中几乎看不到软骨细胞外的其它细胞。
本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims (10)

1.一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物，该组合物包含：20-80μML-抗坏血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mlTGFβ3，50-150nM地塞米松，10-50μg/ml维生素C，10-50μg/ml脯氨酸，0.5-5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮酯，所述浓度是指在培养基中的浓度：
2.根据权利1所述的组合物，该组合物包含：50μg/mlL-抗坏血酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)所示的氯地孕酮酯。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，该组合物还包含10-100μM的β-甘油磷酸钠。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，该组合物还包含50-200μM雪莲和/或藏红花的提取物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，该组合物用作培养基或培养液的成软骨诱导剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，所述培养基或培养液包括DMEM培养液、α-MEM培养液中的任一种。
7.一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括：在15ml尖底离心管中使用小球法诱导培养间充质干细胞，并且每隔约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，使用的诱导分化培养基为高糖DMEM中加入权利要求1-3所述组成和浓度的组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，诱导分化培养时间为14-21天。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
10.根据权利要求7或8所述的方法，该方法包括以下步骤：
1)充质干细胞为脐带源间充质干细胞，其中，在每个75cm2培养瓶中加入13.5ml间充质干细胞生长培养基培养P3代脐带源间充质干细胞，细胞生长达到70-80％融合，用D-Hank’s洗液洗两遍后，加入1.5ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用1.5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取200微升计数确定细胞数量，其余细胞悬液离心，1000rpm，维持10min；倒掉离心后的上清，以1:3的比例传代，培养至P4代，细胞生长达到70-80％融合，用D-Hank’s洗液洗两遍后，加入1.5ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用1.5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，离心，1000rpm，10min；倒掉离心后的上清，加入30mlD-hank’s洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入30mlD-hank’s洗液，混匀后，取出200微升计数，其余细胞悬液离心，1000rpm，10min；离心后去掉上清；其中，所述间充质干细胞生长培养基为DMEM/F12加入10％人血清、20ng/mlEGF、5ng/mlFGF2；
2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1×106细胞/ml；
3)小球法诱导培养细胞：将1ml含有1×106个细胞的细胞悬液加入15ml尖底离心管中，240g离心5分钟，将离心管放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，轻轻晃动离心管，使细胞球与管底分离，之后换加入诱导分化培养基，所述诱导分化培养基为高糖DMEM中加入权利要求1-3所述组成和浓度的组合物；每隔24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，每两天更换一次诱导分化培养基；21天后，取出小球。
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