CN105132368A - 细胞诱导培养基及诱导培养间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞诱导培养基，包括TGF-β、地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸钠和ITS+Premix；本发明进一步提供一种采用该细胞诱导培养基诱导培养软骨细胞的方法。该细胞诱导培养基能够促进间充质干细胞转化为软骨细胞，并提高细胞活性，因此，通过本发明提供的诱导培养软骨细胞的方法能够实现单独诱导间充质干细胞转化为软骨细胞的目的，并且提高间充质干细胞的诱导转化率，获得较多的软骨细胞。

Description

细胞诱导培养基及诱导培养间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及一种诱导培养基及诱导培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细胞、软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、骨髓、脂肪组织来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为软骨细胞，为临床治疗关节软骨损伤提供新的技术方案。但目前多采用间充质干细胞与软骨细胞共培养的方式诱导间充质干细胞转化为软骨细胞，这种共培养方法不仅需要一定的软骨细胞源，过程较繁琐，花费较大，而且所获得的更多为散在软骨细胞，数量较少，软骨细胞团几乎没有，而且散在的软骨细胞相对较小，细胞活性差，难以达到临床移植要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中利用间充质干细胞和软骨细胞共培养方式诱导间充质干细胞转化成软骨细胞的方式存在成本高，间充质干细胞转化率低等缺陷，提供一种能够实现单独诱导间充质干细胞转化成软骨细胞的细胞诱导培养基及采用该细胞诱导培养基诱导培养间充质干细胞的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种细胞诱导培养基，包括TGF-β、地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸钠和ITS+Premix。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述TGF-β的浓度为5-15ng/ml、地塞米松的浓度为7-10mmol/l、抗坏血酸的浓度为50-100ug/ml、甘油磷酸钠的浓度为5-15mmol/l和ITS+Premix的浓度为50-150ng/ml。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述细胞诱导培养基中，TGF-β的浓度为10ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为70ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为10mmol/l，ITS+Premix的浓度为100ng/ml。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述细胞诱导培养基还包括胰岛素和转铁蛋白。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述胰岛素的浓度为5-10mg/ml，转铁蛋白的浓度为5-10mg/ml。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述细胞诱导培养基中，TGF-β的浓度为10ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为70ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为10mmol/l，ITS+Premix的浓度为100ng/ml，胰岛素的浓度为6.25mg/ml，转铁蛋白的浓度为6.25mg/ml。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述细胞诱导培养基还包括谷氨酰胺。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述谷氨酰胺的浓度为1-10mmoL/L。

在本发明提供的细胞诱导培养基中，所述细胞诱导培养基中，TGF-β的浓度为15ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为100ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为15mmol/l，ITS+Premix的浓度为150ng/ml，胰岛素的浓度为10mg/ml，转铁蛋白的浓度为10mg/ml，谷氨酰胺的浓度为10mmoL/L。

本发明进一步保护一种诱导培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

获取间充质干细胞，并用诱导液进行体外诱导培养至转化为软骨细胞；

所述诱导液为上述细胞诱导培养基。

实施本发明提供的细胞诱导培养基，可以达到以下有益效果：该细胞诱导培养基不仅可实现单独诱导间充质干细胞转化为软骨细胞，而且通过本发明提供的细胞诱导培养基可提高间充质干细胞的诱导转化率，所获得的软骨细胞数量较多，活性较强；相较于现有的共培养方式，本发明提供的诱导培养软骨细胞的方法，不仅可省去获取软骨细胞源的过程，而且使用过程较简便。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明提供的检测实验中，根据Chs标准样品工作液的浓度及其OD值所制作的标准曲线图。

具体实施方式

为解决现有技术中共培养方式所获得软骨细胞数量少、细胞较分散且需要软骨细胞源等缺陷，本发明的创新点在于提供一种细胞诱导培养基，该细胞诱导培养基可实现单独诱导间充质干细胞转化为软骨细胞的目的，且获得的软骨细胞数量较多，活性较强。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的细胞诱导培养基，包括TGF-β、地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸钠和ITS+Premix。

其中，TGF-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β转化生长因子-β)是一族广泛存在、结构相关、功能相似的多功能活性肽，具有多种功能的多肽生长因子，可以促进间充质干细胞的增殖与分化，促进细胞外基质的合成，促进胶原产生，刺激软骨细胞的合成与分泌细胞外基质蛋白，促进骨细胞的增殖。TGF-β有三种异构体，分别为TGF-β1、β2和β3，TGF-β2、β3较β1可更快速有效地促进间充质干细胞向软骨细胞分化，但TGF-β2、β3之间诱导干细胞的水平基本相同。由于TGF-β在骨生长中的生物学功能呈双向调节作用，既能刺激细胞的增殖分化作用，也能进行抑制作用，一般来说，低浓度TGF-β起刺激作用，促进细胞的增殖分化；高浓度起抑制作用，因此，优选地，TGF-β的浓度为5-15ng/ml。

地塞米松，购于Sigma公司，能够刺激碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原等的表达，显著地增加碱性磷酸酶的活性，碱性磷酸酶是骨形成过程中必须的酶，碱性磷酸酶的表达情况代表着骨形成的状况，可以激活位于间充质干细胞表面的糖皮质激素受体，促进间充质干细胞向软骨细胞分化，同时，提高间充质干细胞向软骨细胞的分化率；优选地，地塞米松的浓度为7-10mmol/ml。

抗坏血酸又称维生素c，是水溶性维生素的一种，参与氧化还原过程，在生物的氧化和还原过程以及细胞呼吸作用中扮演重要角色，同时，抗坏血酸是胶原合成所必需的，还可调节ATP酶与ALP活性及非胶原基质蛋白质的合成；抗坏血酸对软骨细胞分化的促进作用，主要是通过增加胶原的累积，然后增加碱性磷酸酶在软骨细胞中的表达；此外，作为一种抗氧化剂还可抑制或减少诱导过程中细胞凋亡的产生。优选地，抗坏血酸的浓度为50-100ug/ml。

甘油磷酸钠可以为软骨细胞提供磷酸离子，同时促进生理性钙盐的沉积和钙化，是骨髓基质间充质干细胞产生矿化结节的必要条件；优选地，甘油磷酸钠的浓度为5-15mmol/ml。

ITS+Premix为一种生长因子，购于BD公司，其成份包含有牛血清白蛋白和亚油酸等，能够促进细胞的增殖生长；优选地，ITS+Premix的浓度为50-150ng/ml。

由以上细胞诱导培养基成份作用可知，通过本发明提供的细胞诱导培养基能够促进间充质干细胞转化为软骨细胞，提高间充质干细胞的转化率，并能够增强细胞的活性。

进一步地，本发明提供的细胞诱导培养基还包括胰岛素和转铁蛋白；胰岛素可降低蛋白质降解，增加氨基酸和葡萄糖的摄入，为细胞生长和分化提供能量，促使间充质干细胞处于低糖环境，保持细胞活性，有利于间充质干细胞向软骨细胞的分化，优选地，胰岛素的浓度范围为5-10mg/ml；而转铁蛋白能够干预软骨细胞内离子代谢，促进软骨细胞的生成，优选地，转铁蛋白的浓度范围为5-10mg/ml。

更进一步地，本发明提供的细胞诱导培养基还包括谷氨酰胺，谷氨酰胺参与蛋白质的合成和核酸代谢，可作为细胞诱导培养基中的能量来源，另外，谷氨酰胺通过细胞增容作用，也可促进细胞的生长和分化；优选地，谷氨酰胺的浓度范围为1-10mmol/l。

综上所述，本发明提供的细胞诱导培养基，不仅能够保持细胞的活性，促进细胞的增殖分化，并且能够促进软骨细胞的生成。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明进一步诱导培养软骨细胞的方法，包括以下步骤：

1、获取间充质干细胞；

2、对步骤1获取的间充质干细胞进行传代培养；

3、采用细胞诱导培养基对步骤2中传代培养的间充质干细胞进行诱导培养。

步骤1中，获取间充质干细胞的过程为：

将空气注入新西兰大白兔耳缘静脉，使其死亡。用75％的酒精涂抹大白兔的四肢，消毒并减少兔毛的污染。剪下兔四肢的股骨和腔骨，除去皮肤组织保留关节处的肌肉结缔组织，其余部位的肌肉组织剪去。将处理过的组织浸泡在75％的酒精，30min之后取出，用无菌PBS溶液清洗，放置在超净台中。用无菌手术刀切掉关节处的肌肉，使关节暴露。用骨剪剪开关节，使骨腔暴露。使用一次性注射器吸取无菌PBS，反复冲洗骨腔，使骨腔内的骨髓都冲洗到一次性平皿中。将液体转移至无菌的200目的筛网上，过滤除去大组织，获得悬浮液。将悬浮液缓慢加入到事先装有15mL的Ficoll淋巴分离液(购自于Sigma公司)的50mL离心管，2790rpm离心30min。离心结束后，用尖吸管吸取液体中间白色雾状层细胞，将细胞转移至T150大方瓶后，加入50mL间充质干细胞生长培养基，3天后换液。

步骤2中，待步骤1中的细胞融合度达到90％后传代，胰酶消化3-5min，吸取悬浮液转移至新的方瓶中培养，此细胞记为P2细胞，部分冷冻保存，其余部分继续传代。细胞融合度达到90％左右时即可消化传代。吸出培养基，用无菌PBS溶液清洗细胞表面，洗去残留培养基。加入5mL胰酶，静置5min，显微镜观察多数细胞变为球形，可以浮动时，加入含有FBS的培养基终止消化。吸出细胞悬液，血球计数板计数，同时观察细胞活力。再以1.0×10⁴cells/cm₂的密度接种于T150方瓶。将方瓶置于37℃，5％CO₂动物细胞培养箱中培养。待融合度达到90％即可再次消化传代，获得P3代间充质干细胞。

步骤3中，取步骤2中获得的P3代间充质干细胞，并调整细胞密度为2×l0⁷个/mL。使用注射器吸取等体积的无菌4％海藻酸钠，与细胞悬液均匀混合，此时细胞密度为l×10⁷个/mL，海藻酸钠终浓度为2％(W/V)。使用注射器吸取混合液，装上无菌的针头，排除注射器内的空气。之后缓慢推动注射器，将细胞悬液均速滴入装有100mL的CaCl₂溶液的烧杯中。尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平，细胞悬液勾速滴入。待反应10min后，细胞悬液己经交联形成了微球。吸出CaCl₂，用10mL无菌0.9％NaCl洗涤微球，再用10mL不含FBS的α-MEM洗涤两次后分装在转瓶中，转瓶内添加50mL软骨诱导培养基，每周全量换液3次，半量换液1次，培养28天。将转瓶置于转瓶机上，转速为50rpm。转瓶机放置于37℃，5％CO₂动物细胞培养箱中培养。

其中，软骨诱导培养基为无血清培养基，其中含有本发明提供的细胞诱导培养基，包括10ng/ml的TGF-β、10mmol/l地塞米松、70ug/ml抗坏血酸、10mmol/l甘油磷酸钠和100ng/ml的ITS+Premix。

实施例2

与实施例1的不同之处仅在于，在该实施例中，细胞诱导培养基中含有的：TGF-β的浓度为10ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为70ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为10mmol/l，ITS+Premix的浓度为100ng/ml，胰岛素的浓度为6.25mg/ml，转铁蛋白的浓度为6.25mg/ml。

实施例3

与实施例1的不同之处仅在于，在该实施例中，细胞诱导培养基中含有的：TGF-β的浓度为15ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为100ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为15mmol/l，ITS+Premix的浓度为150ng/ml，胰岛素的浓度为10mg/ml，转铁蛋白的浓度为10mg/ml，谷氨酰胺的浓度为10mmol/l。

为进一步验证本发明提供的用于将间充质干细胞转化成软骨细胞的细胞诱导培养基具有显著的有益效果，本发明通过以下检测实验进行验证：

一、检测对象：

对照组：采用现有技术获得的软骨细胞；

实验组：本发明实施例1-3所获得的软骨细胞。

二、检测过程：

软骨细胞分泌的GAG(葡萄糖胺聚糖)含量测定

1、取Chs(硫酸软骨素，共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，广泛存在于动物软骨组织中)标准样品工作液制作标准曲线。

制作方法：

精密称量硫酸软骨素标准品适量，制成0.5mg/ml水溶液，取六只比色管一次编号，0号为空白，加0.5ml蒸馏水，1-5号管分别吸取上液0.10，0.20，0.30，0.40，0.50ml置于50ml比色管中，用蒸馏水补至0.5ml，分别加入硫酸：水(2：1)的硫酸液各6ml,边加边摇动，然后置于95℃水中加热60min，取出冷至室温后，测量OD值,如下表1所示。图1中，纵坐标为OD值，横坐标为标准品浓度。

表1

2、分别对对照组和实验组执行以下操作：

分别取实验组0、7、14、21、28及35天的微球各9个，以及对照组细胞悬液，平均分成3组置于EP管内(n＝3)。加入300μL木瓜蛋白酶，60℃水浴过夜。-20℃冷冻保存。使用时，取出样品,室温融化,振荡,4000rpm离心5min，取上清转移至新EP管。

3、取50μL样品加入到2mL的DMMB(1,9-二甲基甲叉基蓝)溶液，混匀，防止产生气泡。使用紫外分光光度计在525nm处测0D值，代入标准曲线方程y＝0.9930x+0.0041，标准偏差R＾2＝0.9991，算出GAG含量(μg/珠)，各组GAG含量如下表2所示。

表2：

检测对象

0d

7d

14d

21d

28d

35d

对照组

7.3±0.7

7.4±0.8

7.5±0.9

7.9±0.5

7.6±0.7

7.0±0.4

实施例1

7.3±0.7

8.2±0.6

8.9±0.9

9.3±0.6

10.2±0.5

9.1±0.3

实施例2

7.3±0.7

8.3±0.3

9.1±0.5

9.8±0.6

11.2±0.5

10.1±0.3

实施例3

7.3±0.8

8.5±0.5

9.6±0.6

10.7±0.9

12.2±0.3

11.3±0.9

由表2数据可知，本发明实施例1-3的OD值均大于对照组，通过本发明提供的细胞诱导培养基所获得的软骨细胞所含有的GAG较多，由此说明，通过本发明提供的细胞诱导培养基所获得软骨细胞活性较强、数量较多。

综上所述，本发明提供的用于将间充质干细胞转化为软骨细胞的细胞诱导培养基，不仅能够促进间充质干细胞的增殖分化，提高间充质干细胞的转化率，而且通过本发明提供的细胞诱导培养基所获得的软骨细胞的细胞活性较强，数量较多。

以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种细胞诱导培养基，其特征在于，包括TGF-β、地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸钠和ITS+Premix。

2.根据权利要求1所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述TGF-β的浓度为5-15ng/ml、地塞米松的浓度为7-10mmol/l、抗坏血酸的浓度为50-100ug/ml、甘油磷酸钠的浓度为5-15mmol/l和ITS+Premix的浓度为50-150ng/ml。

3.根据权利要求2所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述细胞诱导培养基中，TGF-β的浓度为10ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为70ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为10mmol/l，ITS+Premix的浓度为100ng/ml。

4.根据权利要求1所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述细胞诱导培养基还包括胰岛素和转铁蛋白。

5.根据权利要求4所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述胰岛素的浓度为5-10mg/ml，转铁蛋白的浓度为5-10mg/ml。

6.根据权利要求5所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述细胞诱导培养基中，TGF-β的浓度为10ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为70ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为10mmol/l，ITS+Premix的浓度为100ng/ml，胰岛素的浓度为6.25mg/ml，转铁蛋白的浓度为6.25mg/ml。

7.根据权利要求4所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述细胞诱导培养基还包括谷氨酰胺。

8.根据权利要求7所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述谷氨酰胺的浓度为1-10mmol/l。

9.根据权利要求7所述的细胞诱导培养基，其特征在于，所述细胞诱导培养基中，TGF-β的浓度为15ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为100ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为15mmol/l，ITS+Premix的浓度为150ng/ml，胰岛素的浓度为10mg/ml，转铁蛋白的浓度为10mg/ml，谷氨酰胺的浓度为10mmoL/L。

10.一种诱导培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取间充质干细胞，并用诱导液进行体外诱导培养至转化为软骨细胞；

所述诱导液为权利要求1至9任一项所述的细胞诱导培养基。