KR20080109726A - 골수 줄기 세포(ｂｍｓｃ)의 골 분화 방법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 골수 줄기 세포로부터 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(osteoblast phenotype cell)와, 이 세포들을 포함하는 세포군을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 골수 줄기 세포와 인간 혈장 또는 혈청, 그리고 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 접촉시키는 단계를 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 신규의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와, 이 세포들을 포함하는 세포군을 제공하는데, 여기서, 상기 세포군은 추가의 세포 류 예를 들어, 바람직하게는 내피 세포 또는 이의 전구체를 포함할 수 있다. 관련 측면에서, 본 발명은 상기 방법, 이 방법을 통해서 생산될 수 있는 세포 및 세포군, 그리고 본원에 구체적으로 기술된 세포 류와 세포군의, 치료법, 바람직하게는 골 치료법 분야에서의 용도를 제공한다.

Description

골수 줄기 세포(ＢＭＳＣ)의 골 분화 방법 및 이의 용도{A METHOD FOR OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF BONE MARROW STEM CELLS (BMSC) AND USES THEREOF}

하나의 측면에서, 본 발명은 골수 줄기 세포(BMSC)의 골 분화, 바람직하게는 적어도 부분적으로 내피 분화를 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법, 그리고 이와 같이 분화된 세포의 용도에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 이전에 개시된 골전구세포 및 조골세포와 유사하되 신규한 특성을 나타내는 특정 세포 류 및 세포군에 관한 것이기도 하다. 관련 측면에서, 본 발명은 특히 치료, 바람직하게는 골 치료 분야에 있어서, 상기 방법, 이 방법을 이용하여 얻을 수 있는 세포 및 세포군과, 본원에 구체적으로 개시된 세포 류 및 세포군의 용도를 제공한다.

동종 이계 골수 이식의 실용성은 중증 골 형성 부전증 어린이를 통하여 입증되었다[Horwitz외 다수 1999. Nat Med 5(3): 309-13]. 이 연구에 있어서, 기능성 골수-유래 중간엽 세포를 이식한 결과, 새로운 밀도의 골이 형성되었는데, 이는 곧, 이식된 세포가 골-생산 조골세포로 분화되었음을 말해주는 것이다. 자가 골수 이식은 또한 상완골 두부의 골 괴사 환자에서도 행해졌다고 보고되었다[Hernigou외 다수 1997. J Bone Joint Surg Am 79:1726-1730]. 그러므로, 골 분화를 진행할 수 있는 줄기 세포 또는 골 분화될 세포를 이식하는 것은, 골-관련 질환의 치료법(특 히, 새로운 골의 생산을 필요로 하는 치료법)에 대한 훌륭한 밑받침이 될 수 있다.

그러므로, 골-관련 질환에 대한 치료 수단으로서 이식에 적당한 세포, 구체적으로 자가 세포를 충분한 양만큼 제공하는, 효과적인 기술이 절실히 필요하다.

미분화 골수 줄기 세포는 이식될 수 있지만, 이 줄기 세포는 이식되었다고 해서 바로 골원 계통으로 되는 것은 아니므로, 이식된 줄기 세포의 상당 부분은 골 조직 형성에 영구적으로 기여할 수는 없다. 뿐만 아니라, 골수 줄기 세포를 시험관 내 배양하면 이 줄기 세포의 증식 기능성과, FGF-2와 같은 성장 인자로 처리되었을 때 분화를 진행시킬 수 있는 능력도 감소한다는 사실이 입증된바 있다[Banfi외 다수 2000. Exp Hematol 28: 707-15]. 예를 들어, 이와 같은 연구에 있어서, 시험관 내 배양된 골수 줄기 세포의 골 형성 효율은 새로이 분리된 골수의 골 형성 효율에 비하여, 1차 계대 배양시 36배나 떨어졌다. 그러므로, 골수 줄기 세포를 시험관 내 증식시키면, 이 세포가 이식되었을 때 골-형성 조골세포의 근원으로서의 효율을 떨어뜨릴 수 있는 것이다.

문헌[Martin외 다수; Endocrinology 138: 4456-4462, 1997]에는, 제2형 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)의 존재 하에서 골수 줄기 세포를 우 태아 혈청(FCS) 성분과 함께 시험관 내 배양하면, 이 줄기 세포가 특정 골 형성 배양 조건 하에서 시험관 내 골 분화하기 적합할지라도, 상기 줄기 세포는 미성숙 상태(알칼리성 인산화효소의 양이 적으며 섬유아세포-유사 형태를 가지는 상태)로 유지된다고 기술되어 있다. 그러나, 이와 같은 미성숙 세포가 생체 내에서 골-생산 조골세포로 분화하는 과정은 이식시 적당한 신호를 제공하는 것에 의존적이다. 그러므로, 비록 이와 같 은 세포가 시험관 내 골 분화를 할 수 있다고 하더라도, 이 세포의 상당 부분은 여전히 생체 내에서 조골세포가 될 수 없다. 또한, 문헌[Chaudhary외 다수; Bone 34: 402-11 , 2004]에 의하면, FGF-2로 처리된 인간의 골수 줄기 세포는 어떠한 골원성 표현형도 나타내지 않으며(알칼리성 인산화 효소를 발현하지 않음), 실제로는 이영양성 형태를 가진다고 개시되어 있다. 이와 유사하게, 문헌[Kalajzic외 다수; J Cell Biochem 88: 1168-76, 2003]에는, FGF-2가 골 분화를 억제한다고 개시되어 있다.

뿐만 아니라, 인간의 치료법에 사용되는 물질을 제조할 때에는 배양 배지 중에 인간 이외의 동물성 성분 예를 들어, 혈청 성분(예를 들어, FCS)을 사용하지 않아도 된다. 그러나, 문헌[Kuznetsov외 다수; Transplantation 70: 1780-1787, 2000]에 따르면, 상동성 또는 자가 인간 혈청을 사용하면, 인간의 골수 줄기 세포가 콜로니를 형성하여 시험관 내에서 증식하고, 생체 내에서 골을 형성하는 능력이 상당히 떨어진다고 기술되어 있다. 그러므로, 쿠즈네쵸프(Kuznetsov)외 다수는 골수 줄기 세포를 효율적으로 증식시키고, 이 줄기 세포가 골을 형성하는 능력을 갖도록 만드는데에는, FCS를 반드시 사용하여야 한다고 주장한다.

타카기(Takagi)외 다수는 특정 조건 하에서, FGF-2가 보강된 공여체 혈청 중 에서 인간의 골수 흡인물을 항온 처리하였다[Takagi외 다수 2003; Cytotechnology 43: 89-96]. 상기 문헌[Takagi외 다수 2003]에 따라서 얻어진 세포군은 연골 발생 분화에 대한 가능성을 보여주었으므로, 상기 문헌의 저자는 상기 세포군을 연골의 재생에 사용하는 것도 고려하였다.

코바야시(Kobayashi)외 다수는 자가 공여체 혈청에서 인간의 BMSC를 분리 및 유지시키기 위한 구체적인 조건에 대해 기술하였는데[Kobayashi외 다수 2005; J Bone Joint Surg Br 87: 1426-3], 이에 따르면, 이러한 조건은 인간 BMSC의 복수 회 분화 가능성을 유지함과 동시에, 이 인간 BMSC를 세포 외에서 충분히 증식시킬 수 있다고 하였다. 코바야시(Kobayashi)외 다수는 BMSC를 분화시키지는 않고 추가로 증식을 촉진하기 위한 2차 배양에서 FGF-2를 사용한다. 코바야시(Kobayashi)외 다수의 문헌에는 인간 BMSC가 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포로 분화시킬 조건에 관하여는 개시되어 있지 않다.

문헌[Lin외 다수 2005; Transplant Proc 37: 4504-5]에는, 자가의 공여체 혈청 중 다능성 인간 BMSC의 증식을 연장하는 것에 관하여 개시되어 있다. 임의의 조건 하에서 상기 세포에 FGF-2 및 EGF를 첨가하면, 세포 증식에 영향을 미치지 않았으며, 또한 이 세포를 골로 분화시키지도 않았다.

골 형성을 최대화하기 위하여, 조골세포의 표현형을 나타내는 이식 세포를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 본질적으로, 이 세포가 입증된 골-형성 활성을 갖는 유일한 세포이기 때문이다. 그러나, 골수 줄기 세포를 조골세포로 시험관 내 분화시키는 과정은 골원성 배지 중에서 배양하는 과정을 포함하며[Jaiswal외 다수 1997. J Cell Biochem 64: 295-312], 또한 이로써 상기 세포의 시험관 내 증식률을 낮출 수 있다. 뿐만 아니라, 골원성 배지를 사용하면, 세포 배양액이 오염될 위험성을 높여줄 수 있는 추가의 성분들을 이 세포에 첨가하여야 한다는 단점이 있다.

그러므로, 세포의 증식 능을 높은 수준으로 유지시키고, 자가성 조건(autologous condition)을 유지하며, 세포 배양에 사용되는 성분의 수를 최소화하면서, 인간 성체 줄기 세포, 특히 인간 골수 줄기 세포로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 시험관 내에서 생산하는 간단하고도 신뢰할 수 있는 방법이 필요하다.

뿐만 아니라, 예를 들어, 골 치료법에 있어서 특히 유용한 특징을 갖는 골전구세포 또는 조골세포, 그리고 이러한 세포들을 포함하는 세포군도 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 당 업계의 전술한 문제점과 기타 문제점들을 해결한 것이다.

특히, 본 발명자들은, 본원에 개시된 배양 조건을 이용할 경우, 성체 줄기 세포, 구체적으로, 골수 줄기 세포(BMSC)(유리하게는 인간 기원의 골수 줄기 세포)가 생체 외에서 용이하게 증식할 수 있고, 유용한 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포, 그리고 이와 같은 세포들을 포함하며 기타 표현형을 나타내는 유용한 세포군으로 유도될 수 있음을 알아냈다.

그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 인간 골수 줄기 세포로부터 시험관 내 또는 생체 외에서 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(osteoblast phenotype cell)를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 골수 줄기 세포와 인간 혈장 또는 혈청, 그리고 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 발명자들은, 본 발명의 방법이 노출된 줄기 세포의 상당 부분 예 를 들어, 다수를 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포로 분화시킬 수 있음을 관찰하였다. 결과적으로, 본 발명의 방법에 관한 하나의 측면에서, 이 방법은 본질적으로 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하는데 사용될 수 있는 것이다.

하지만, 본 발명의 방법은 일반적으로 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 세포군, 일반적으로는 이러한 세포의 상당 부분 예를 들어, 다수를 포함하는 군집을 생산함을 알 수 있다. 본 발명의 발명자들은 또한 본 발명의 방법으로부터 생산된 세포군이 다른 세포 류를 포함할 수 있는데, 이 세포들 중 적어도 일부는 이와 같은 군집, 특히, 골 치료법에 사용되는 군집에 존재하는 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포의 유용한 특징들을 증가시킬 수 있음도 알게 되었다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 세포군은 내피 세포 또는 내피 전구체를 포함할 수도 있다.

그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 인간 골수 줄기 세포로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 세포군을 시험관 내 또는 생체 외에서 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 골수 줄기 세포와 인간 혈장 또는 혈청, 그리고 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 접촉시키는 단계를 포함한다.

실험을 통하여 입증된 바와 같이, 본 발명의 방법은 3주, 더욱 구체적으로 21일에 걸쳐서 골수 줄기 세포를 40,000∼710,000배 증식시킬 수 있다. 이와 같은 고도의 증식 기술은, 인간의 혈청이 인간 골수 줄기 세포의 증식을 상당 수준 감소 시키는 기존의 기술[Kuznetsov외 다수 2000]에 비하면, 당 업계에서 혁신적인 기술로서 여겨질 만한 것이다. 그러므로, 본 발명은 이식용 세포를 다수 생산할 수 있다. 이로 말미암아, 줄기 세포를 제공하기 위하여 개체로부터 채취해야 하는 골수 시료의 양을 줄일 수 있다는 점에서 유리하다. 뿐만 아니라, 본 발명은 분화된 세포가 환자에게 이식될 수 있는 시간을 단축할 수 있으므로, 치료도 보다 신속하게 행해질 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 섬유아세포 성장 인자, 구체적으로 FGF-b 즉, FGF-2를 사용한다. FGF-2가 골수 줄기 세포의 표현형을 더욱 미성숙하게 유도하며[Martin외 다수 1997, Kalajzic외 다수 2003], FGF-2와 인간의 혈장 또는 혈청 성분을 함께 사용하면 골수 줄기 세포의 분화를 촉진하여, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포의 표현상의 특징들을 얻을 수 있다는 점에서, 본 발명은 획기적이다.

그러므로, 본 발명의 방법은, 개별적으로 사용될 때 역효과를 나타내는 것으로 당 업계에 알려져 있는 요소들을 배합함으로써, 예상치 못했던 유리한 효과(고도의 증식성 및 조골세포의 표현형)를 얻을 수 있다. 더욱 놀라운 점은, 선행 기술에서는 조골세포로 시험관 내 분화시킬 때에는 덱사메타손, 아스코르브산 포스페이트 및 베타-글리세롤포스페이트와 같은 성분들을 함유하는 골원성 배지가 필요하다는 점이다. 본 발명에서는 놀랍게도, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하는데에 있어서 이러한 성분들이 필요하지 않다. 그러므로, 배지 중 이러한 성분들의 수를 줄일 수 있으며, 그 결과, 오류 발생 또는 오염의 가능성을 줄일 수 있거나, 이식시 이와 같은 성분들을 계속 사용할 수 있다는 접에서 유리하다.

추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 골수 줄기 세포와 자가성이고/이거나 골수 줄기 세포 배양액 중에서 임의의 인간 이외의 동물성 물질(예를 들어, 혈청 성분)을 포함하지 않는 인간의 혈장 또는 혈청을 사용한다. 이로 말미암아, 본 발명의 방법은 예를 들어, 생산된 세포의 거부 위험성을 줄이고/줄이거나 병원체로 인한 오염 위험을 줄임으로써, 인간의 치료법에 사용하기에 특히 유리하다.

본 발명의 방법에 관한 추가의 바람직한 구체예는 기타 특징들 예를 들어, 항온 처리 시간, 계대 배양 횟수, 성분의 양 등을 한정하는데, 즉, 상기 특징들 중 어느 하나 또는 전부는 선행 기술의 방법을 추가로 한정하고, 예를 들어, 골 이식에 있어서 우수하고 유리한 특징들을 가지는 세포와 세포군을 제공하는데 있어서 기틀을 마련한다.

본 발명의 발명자들은, 본 발명의 방법을 통하여 생산할 수 있는, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와 세포군들은 선행 기술에 비하여 몇몇 이점들을 가진다는 사실을 알게 되었다. 첫 째, 적어도 생체 외 배양시, 상기 세포는 증식률이 빠르다는 점이다(예상 증식 시간 = 약 2일). 그러므로, 비교적 짧은 시간 안에 충분한 수의 세포들이 생산될 수 있는데, 이로써, 환자의 치료 기간을 단축할 수 있다는 점에서 유리하다. 둘째, 상기 세포의 기질 무기질화 작용 속도는 비교적 짧은데, 이로써, 세포가 환자에게 이식될 때 골 형성 작용이 촉진될 수 있 다는 점이다. 셋째, 상기 세포는 기타 중간엽 표현형 세포, 구체적으로 지방 세포나 연골 세포로 분화되는 성향이 적거나 실질적으로 없다는 점이다. 이 점은 상기 세포가 이식될 때, 골 이외의 조직으로 형성되는 것을 막을 수 있다는 점에서 유리하다.

그러므로, 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 생산할 수 있거나 직접 생산된 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와, 이 세포들을 포함하는 세포군 및 배양액, 그리고 골-관련 질환에 있어서 이와 같은 세포들의 치료용으로서의 용도와, 이 세포를 포함하는 약학 제형을 제공한다.

본 발명을 추가로 개발함에 있어서, 본 발명의 발명자들은 치료법, 특히, 골 이식 치료법에서 구체적인 우수성을 제공할 수 있는, 새로운 골원성 세포 류 및 이 세포 류를 포함하는 새로운 세포군을 정의하기 위하여, 본 발명의 방법을 수행하여 생산된 세포 및 세포군들을 상세히 분석하였다. 결과적으로, 본 발명은 특히, 골 치료법에 있어서, 이와 같은 새로운 세포 류, 이러한 세포 류를 포함하는 군집, 그리고 이의 용도에 관한 것이기도 하다.

그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은, (1) 알칼리성 포스파타제(ALP), 더욱 구체적으로 골-간-신장 타입의 ALP, 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP) 및 골 시알로단백질(BSP)로부터 선택된 하나 이상의 조골세포 마커와, (2) CD63(예를 들어, 항체 HOP-26에 의해 인지되는 것; Zannettino외 다수 2003. J Cell Biochem. 89: 56-66) 및 CD166으로부터 선택되는 하나 이상의 줄기 세포/미성숙 골전구세포 마커를 함께 발현하는 것을 특징으로 하는, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(본원에서는 "OOP-1 세포"라 칭함)를 제공한다. 상기 (1)의 경우, 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-1 세포는 적어도 ALP를 발현할 수 있으며; 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-1 세포는 ALP, P1 NP 및 BSP, 예를 들어, 적어도 ALP 및 P1NP, 적어도 ALP 및 BSP, 또는 적어도 P1NP 및 BSP로부터 선택되는 2개 이상의 마커를 발현할 수 있고; 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-1 세포는 ALP, BSP 및 P1NP 중 적어도 3개 모두를 발현할 수 있다. 상기 (2)의 경우, 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-1 세포는 적어도 CD63을 발현할 수 있으며; 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-1 세포는 적어도 CD166을 발현할 수 있고; 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-1 세포는 적어도 CD63 및 CD166을 발현할 수 있다.

본 발명자들은, 당 업계에는 ALP, P1NP 및 BSP가 존재하지 않을 때 줄기 세포/미성숙 골전구세포에서는 오로지 CD63 및/또는 CD166만이 관찰되었다는 사실을 잘 알고 있다. 이와 같은 당 업계의 CD63 및/또는 CD166 양성 세포는 다능성을 가지므로, 연골 세포, 지방 세포 및 조골세포로 분화될 수 있었다. 그러므로, ALP, P1NP 또는 BSP 중 하나 이상과 CD63 및/또는 CD166이 함께 존재하면, 본 발명의 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1 세포)는 신규하고, 기존에 알려지지 않은 세포 류인 것으로 규정한다. 더욱이, 이와 같은 신규의 세포 류는 유리한 특성들 예를 들어, 높은 증식률, 높은 무기질화율, 그리고 연골 세포 및 지방 세포로의 분화 성향이 실질적으로 존재하지 않는 것과 같은 특성들(골 치료에 특히 유용한 특성들) 중 적어도 일부를 나타낸다.

바람직한 구체예에서, 상기 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1 세포)는 오스페오칼신(OCN)에 대해 음성이다. 당 업계에는, 상기 OCN은 바람직하게, 성숙한 조골세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 그러므로, OCN이 발현되지 않음은 곧, 이와 같은 세포가 덜 성숙하였음을 나타내는 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은, (1) 알칼리성 포스파타제(ALP), 더욱 구체적으로 골-간-신장 타입의 ALP, 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP) 및 골 시알로단백질(BSP)로부터 선택된 하나 이상의 조골세포 마커와, (2) 조혈/내피 전구세포 마커 CD34를 함께 발현하는, 즉, 상기 마커들에 대해 양성인 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(본원에 있어서 "OOP-2 세포"라 칭함)를 제공한다. 상기 (1)의 경우, 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-2 세포는 적어도 ALP를 발현할 수 있으며; 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-2 세포는 ALP, P1NP 및 BSP, 예를 들어, 적어도 ALP 및 P1NP, 적어도 ALP 및 BSP 또는 적어도 P1NP 및 BSP로부터 선택되는 2개 이상의 마커들을 발현할 수 있고; 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 OOP-2 세포는 ALP, BSP 및 P1NP 중 적어도 3개 모두를 발현할 수 있다.

본 발명의 발명자들은, CD34를 발현하는 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포가 알려진 바 없으며, CD34가 존재하지 않는 것은 통상적으로 골수 중간엽 줄기 세포의 특징 중 하나에 해당함을 잘 알고 있다. 그러므로, ALP, P1NP 또는 BSP 중 하나 이상과 CD34가 함께 존재하면, 본 발명의 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2 세포)는 신규하고, 기존에 알려지지 않은 세포 류인 것으로 규정한다. 더욱이, 이와 같은 신규의 세포 류는 유리한 특성들 예를 들어, 높은 증식률, 높은 무기질화율, 그리고 연골 세포 및 지방 세포로의 분화 성향이 실질적으로 존재하지 않는 것과 같은 특성들(골 치료에 특히 유용한 특성들) 중 적어도 일부를 나타낸다.

바람직한 구체예에 있어서, 상기 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2 세포)는 오스테오칼신(OCN)이 존재하지 않는다. 당 업계에는, 성숙한 조골세포에서 OCN은 바람직하게, 발현되는 것으로 알려져 있다. 그러므로, OCN이 발현되지 않음은 곧, 이와 같은 세포가 덜 성숙하였음을 나타내는 것이다.

본 발명의 발명자들은 전술한 본 발명의 골전구세포 또는 조골세포 류 사이에 중첩되는 부분이 있는 것으로 생각하고 있다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 상기 OOP-1 세포는 CD34도 함께 발현할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 OOP-2 세포는 예를 들어, CD63 및 CD166 중 하나 이상 예를 들어, 하나 또는 둘 다를 발현할 수도 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 예를 들어, 전술한 바와 같은 OOP-1 및/또는 OOP-2 세포 류를 포함하는 본 발명의 상기 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 세포군을 포함하기도 한다. 대표적인 세포군은 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 예를 들어, 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 예를 들어, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 예를 들어, 95% 이상의 OOP-1 및/또는 OOP-2 세포 류를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 세포군은 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 더욱 바람직하게는 30% 미만, 더욱 바람직하게는 20% 미만, 및 더욱 바람직하게는 10% 미만, 예를 들어, 7% 미만, 5% 미 만 또는 2% 미만의 세포 류(상기 OOP-1 및/또는 OOP-2 세포 류를 제외한 세포 류)를 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 세포군은 또한 내피 세포 또는 이의 전구세포를 포함할 수도 있다. 바람직하게, 이와 같은 내피 세포 또는 전구세포는 폰 빌레브란트 인자(vWF), VEGF 및 CD133 중 하나 이상 예를 들어, 2개 이상, 또는 3개 모두를 발현할 수 있다. 추가의 구체예에서, 상기 내피 세포는 또한 CD34도 함께 발현할 수 있다.

유리하게도, 본 발명의 발명자들은, 이와 같은 내피 세포 또는 이의 전구세포가 세포군 내에 본 발명의 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포와 함께 존재하면, 예를 들어, 이식된 세포 및 조직을 유지하고 이것들에 산소를 공급하는 혈관을 형성하는 것을 촉진하고/촉진하거나 성장 인자 예를 들어, VEGF를 방출함으로써, 환자에 있어서 상기 골원 계통 세포의 이식률을 개선할 수 있음을 알게 되었다.

관련 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 세포와 세포군을 포함하는 약학 제형과, 이의 치료적 용도를 제공한다.

본 발명의 이와 같은 특징들 및 기타 특징들은 이하 상세한 설명과 첨부된 청구 범위에 더욱 상세히 기술되어 있으며, 또한 비 제한적 실시예에 의해서 예시되어 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명에 의해 제조된 세포군을 골 괴사 환자의 상완골 두부에 주사한 결과를 나타낸 것이다(◆-◆). A: VAS 스코어; B: WOMAC 스코어, "B": 기준선, "3m": 3개월 경과시, "6m": 6개월 경과시, 점선: 병력상 대조군(대조군 생검편).

도 2는 본 발명의 세포/군집에 의한 무기질화 결과를 나타내는 것이다.

달리 언급이 없는 한, 본원에 사용된 단수형을 나타내는 용어 즉, "하나", "하나의" 및 "상기"라는 용어에는 단수형 및 복수형 용어 둘 다를 포함한다. 예를 들어, "하나의 세포"란, 하나 또는 하나 이상의 세포를 의미하는 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "~를 포함하는(comprising)", "~를 포함한다(comprise)" 및 "~로 이루어진(comprised of)"이란 용어는 "~를 포함하는(including)", "~를 포함한다(include)" 또는 "~를 함유하는(containing)", "~를 함유한다(contain)"라는 용어의 동의어로서, 부가의 인용되지 않은 일원들, 구성 요소 또는 방법의 단계들을 포함하거나, 이것들을 한정하지 않으며, 또한 이것들을 배제하지 않는 의미이다.

하한 및 상한에 의해 언급되는 수치 범위에는 그 범위 내에 포함되는 모든 수와 비율들, 그리고 상한 및 하한에 해당하는 수와 비율들을 모두 포함한다.

측정 가능한 수치 예를 들어, 매개 변수, 양, 지속 시간 등을 나타낼 때 본원에 사용된 "약"이라는 용어는, 지정된 수치의 ± 20% 이하, 바람직하게는 ± 10% 이하, 더욱 바람직하게는 ± 5% 이하, 더욱 바람직하게는 ± 1% 이하, 그리고 가장 바람직하게는 ± 0.1% 이하의 범위의 수치들을 포함하는 의미로서, 이와 같은 변수 범위는 본원에 개시된 본 발명을 실시하는데 적당하다.

본 발명의 명세서에 언급된 모든 서류들은 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용된 것이다. 특히, 본원에 구체적으로 언급된 모든 서류가 교시하는 바는 참고용으로 인용된 것이다.

달리 정의하지 않는 한, 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어들 예를 들어, 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당 업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 보유한다.

1. 본 발명의 방법

상기 "발명의 개요" 섹션에서 상세히 기술한 바와 같이, 하나의 측면에서, 본 발명은 인간의 골수 줄기 세포로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하는 방법과, 이와 같은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 세포군을 시험관 내 또는 생체 외 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 골수 줄기 세포를 인간의 혈장 또는 혈청, 그리고 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 단계를 포함한다.

골수는 장골의 골강, 하버스 관의 일부, 그리고 망상 골(cancellous bone) 또는 해면 골(sponge bone)의 골 소주 사이의 공간을 점유하고 있다. 골수로서는 두 가지 유형이 있는데, 통상적으로 다음과 같이 구분한다: 영유아의 경우에는 모든 뼈에서 발견되고 성인의 경우에는 제한된 부위(예를 들어, 해면 골)에서 발견되며, 주로 적혈구 생산과 관련된 적 골수(조혈 작용); 그리고 주로 지방 세포와 결합 조직을 포함하는 황 골수.

일반적으로, 골수는 조혈 줄기 세포, 적혈구 및 백혈구, 그리고 이의 전구체, 중간엽 줄기 세포(MSC), 기질 세포 및 이의 전구체, 그리고 섬유아세포, 망상 적혈구, 지방 세포 및 "기질"이라고 불리는 결합 조직 네트웍을 형성하는 세포들을 포함하는 세포군으로 이루어진 복합 조직이다.

골수 세포는 마우스 및 인간 둘 다에 전신 이식된 후 다수의 다양한 조직들을 만들어 낸다. 이와 같은 능력은 골수에 존재하는 다수의 줄기 세포 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 중간 엽 줄기 세포 및/또는 골수의 다능성 줄기 세포의 활성을 반영할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Krause외 다수; Cell 105: 369-377, 2001]에 따르면, 하나의 골수 유래 줄기 세포가 조혈 세포 계통 및 비-조혈 세포 계통 둘 다에 속하는 세포를 생산할 수 있다고 개시되어 있다. 이러한 사실은, 조혈 세포와 조골세포가 골수 이식 후 공통된 골수 전구세포로부터 유래될 수 있다는 사실을 규명한 도미니치(Dominici)외 다수에 의해 확인된다[Dominici외 다수; PNAS 101(32): 11761-6, 2004]. 다른 예에 있어서, 미국 특허 제5,486,359호에는, 중간엽 계열의 세포 예를 들어, 골, 연골, 근육, 힘줄, 결합 조직, 지방 또는 골수 기질 세포의 세포를 생산할 수 있는, 중간엽 줄기 세포의 골수로부터 상기 세포를 분리하는 것에 관하여 개시되어 있다. 뿐만 아니라, 문헌[Horwitz외 다수; Nat Med 5(3): 309-13, 1999]에는, 중증 골 형성 부전증 어린이의 경우에는 동종 이계의 골수를 이식하는 것이 효율적이라고 개시되어 있다. 이와 같은 연구에 있어서, 기능성 골수-유래 중간엽 세포가 이식되면, 새로이 밀집된 골이 형성된다. 문헌[Horwitz외 다수; PNAS 99(13): 8932-7, 2002]에 개시된 바와 같이, 이식된 조골세포의 비율은 중간엽 줄기 세포(플라스틱-부착성 골수 세포)만이 이식된 후에는 거의 증가하지 않았는데, 이로써, 중간엽 줄기 세포가 존재하는 것으로 생각되는 경우, 부착성 군집에 존재하는 중간엽 줄기 세포 이외의 골수 세포는 조골세포의 잠재적 전구세포일 수 있음을 알 수 있었다. 전술한 바에 따르면, 골수는 골 세포(골) 계통의 세포를 생산하는 잠재력을 가지는 몇몇 유형의 줄기 세포를 함유할 수 있다.

그러므로, 본원에 사용된 "골수 줄기 세포" 또는 "BMSC"라는 용어는, 골수, 구체적으로 골수 시료에 존재하거나 (부분적으로) 이로부터 분리된, 골수에 존재하는 임의의 성체 줄기 세포를 의미한다. 골수(BMSC) 시료는 예를 들어, 장골 능, 대퇴부, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 기타 개체의 골 간 공간에서 얻을 수 있다. BMSC라는 용어는 또한 BMSC의 자손 예를 들어, 개체의 시료로부터 얻어진 BMSC를 시험관 내 또는 생체 외 증식하여 얻어진 자손을 포함한다.

본원에 사용된 "줄기 세포"란 용어는, 적당한 조건에 노출되었을 때, 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 상이한 세포 류를 생산할 수 있는 임의의 세포를 의미하는 것이다. 이와 같은 줄기 세포는 생체 내 특정 조건 하에서, 그리고 시험관 내에서도, 과도하게, 또는 아미도 무한정 증식될 수 있는 세포로서, 이 줄기 세포의 자손은 모 세포의 표현형에 의한 특징과 증식 능을 보유할 수 있거나, 또는 적당한 조건에 노출될 경우, 보다 특화된, 즉, 한층 더 분화된 세포를 생산할 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포가 세포 분열이 진행된 적이 없는 기타 다른 세포로 분화될 때, 또는 만일 상기 기타 세포가 줄기 세포의 세포 분열 및/또는 분화 단계 중 하나 이상의 단계를 진행한 후 생산되면, 이 줄기 세포는 한층 더 분화된 다른 세포로 "분화될" 세포인 것으로 간주한다.

본원에 사용된 "성체 줄기 세포"라는 용어는, 태아 단계 또는 출생 후 유기체에 존재하거나 또는 이로부터 얻어진 줄기 세포를 의미하는 것이다.

바람직하게도, 본 발명에 의한 골수 줄기 세포는 적어도 골원성(골) 계통의 세포 예를 들어, 골원 세포 및/또는 골전구세포 및/또는 전-조골세포 및/또는 조골세포 및/또는 골 세포 등을 생산할 가능성을 갖는다.

바람직하게, 본 발명에 의한 골수 줄기 세포 중 적어도 일부는 본 발명의 방법에 의하여 생산된 세포군에 포함되는 추가의 세포들 예를 들어, 내피 계통의 세포 예를 들어, 내피 전구세포 및/또는 내피 세포를 생산할 가능성도 가질 수 있다.

대표적이되, 예시적인 BMSC 류 즉, 적어도 골원성 계통에 속하는 세포를 생산할 가능성을 가지는 BMSC 류는 중간엽 줄기 세포이다. 본원에 사용된 "중간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"("골수 간질 세포"라고도 알려짐)라는 용어는, 중간엽 계통, 통상적으로는 2개 이상의 중간엽 계통 예를 들어, 골 계통(골), 연골 계통(연골), 근 세포 계통(근육), 힘줄 계통(힘줄), 섬유아세포 계통(결합 조직), 지방 세포 계통(지방) 및 간질원성 계통(골수 간질)에 속하는 세포를 생산할 수 있는, 성체 중배엽-유래 줄기 세포를 의미한다. MSC는 예를 들어, 골수, 혈액, 제대, 태반, 태아의 난황낭, 피부(진피), 특히, 태아 및 젊은 사람의 피부, 골막 및 지방 조직으로부터 분리될 수 있다. 인간 MSC의 분리, 시험관 내 증식 및 분화에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제5,486,359호; 동 제5,811,094호; 동 제5,736,396호; 동 제 5,837,539호; 또는 동 제5,827,740호에 개시되어 있다. 이와 같은 MSC가 적어도 골 세포(골) 계통 예를 들어, 골원성 세포 및/또는 골전구세포 및/또는 전-조골세포 및/또는 조골세포 및/또는 골 세포 등에 해당하는 세포를 생산할 수 있다면, 당 업계에 공지되어 있으며, 당 업계에 공지된 임의의 방법에 따라서 분리된 임의의 MSC는 본 발명에 적당할 수 있다.

잠재적이되 예시적으로, 적어도 일부 MSC는 본 발명의 방법에 의하여 생산된 세포군에 포함되는 추가의 세포들 예를 들어, 내피 계통 세포 예를 들어, 내피 전구세포 및/또는 내피 세포를 생산할 수도 있다.

MSC라는 용어는 또한, MSC 자손 세포 예를 들어, 동물이나 인간 개체의 생물 시료로부터 얻어진 MSC의 시험관 내 또는 생체 외 증식에 의하여 생산된 자손 세포를 포함하기도 한다.

예로서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 인간 혈장 또는 혈청과, 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 접촉시켰을 때, 기재 표면 예를 들어, 배양 용기의 표면에 부착되는 BMSC 세포들을 선별하는 단계를 포함한다. 기재 표면 예를 들어, 플라스틱 표면에 부착될 수 있는 (단핵성) 세포들을 선별함으로써, MSC는 골수(또는 기타 공급원)로부터 분리할 수 있다는 사실은 당 업계에 공지되어 있다[실제로, MSC는 플라스틱-부착성 세포 또는 콜로니 형성 단위 섬유아세포라고 불리기도 함]. 그러므로, 어떠한 가설에도 국한되지 않고, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 방법에 있어서, MSC는 적어도 부분적으로나마 BMSC로부터 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하는데 사용될 수 있다고 생각한다.

그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 또한 인간의 중간엽 줄기 세포로부터 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 시험관 내 또는 생체 외에서 생산하는 방법에 관한 것이기도 한데, 이 방법은 상기 MSC와 인간의 혈장 또는 혈청 그리고 성장 인자를 접촉시키는 단계를 포함한다.

MSC는 생물 시료 예를 들어, BMSC를 포함하는 시료 중에 포함될 수 있거나, 또는 당 업계에 공지된 바와 같이, 이와 같은 시료로부터 적어도 부분적으로나마 분리될 수 있다. 뿐만 아니라, MSC는 골수 또는 골수 이외에 MSC를 포함하는 공급원 예를 들어, 혈액, 제대, 태반, 태아의 난황낭, 피부(진피), 구체적으로 태아 및 젊은 사람의 피부, 골막 및 지방 조직으로부터 적어도 부분적으로나마 분리될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 생물 시료에 존재하거나 적어도 부분적으로나마 이로부터 분리된, 증식된 적이 없는 BMSC 또는 MSC는, 이 BMSC나 MSC를 분화시키지 않고 세포 성장 및 증식시킬 수 있는 조건 하에서, 인간 혈장 또는 혈청 및 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉될 수 있다.

또한, 골수로부터 MSC를 증식시키는 방법은, 소형이고, 신속하게 증식하며, 낮은 밀도로 다시 도말될 때 주기적으로 재증식하고, 동일한 배양액 중에서 더욱 성숙한 MSC의 전구체인, 세포의 하위 군집을 포함한다. 이와 같은 세포의 하위 군집을 "신속하게 자기-증식을 하는 세포(rapidly self-renewing cell)"라고 부르며, 이는 RS-1과 RS-2와 같은 2개 이상의 성분들을 보유할 수 있다[Colter외 다수 PNAS 97(7): 3213-8, 2000; 본원에 참고용으로 인용됨]. 그러므로, 어떠한 가설에도 국한되지 않고서, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 방법에서 RS 세포가 BMSC, 가능하게는 더 성숙한 MSC의 중간체로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 적어도 부분적으로나마 생산해낼 수 있는 것으로 알고 있다[Colter외 다수 2000]. 잠재적이되 예시적으로, 본 발명의 발명자들은 RS 세포가 본 발명의 방법에 의하여 생산된 세포군 중에 포함된 다른 세포 예를 들어, 내피 계통 세포 예를 들어, 내피 전구세포 및/또는 내피 세포를 추가로 생산할 수 있는 것으로 생각한다.

그러므로, 하나의 구체예에서, 본 발명은 또한 신속하게 자기-증식된 인간 세포(RS)로부터, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포들을 포함하는 세포군을 시험관 내 또는 생체 외에서 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 RS와 인간 혈장 또는 혈청 그리고 성장 인자를 접촉시키는 단계를 포함한다.

또한, 골수는 "부 군집(side population)"(SP)라고 칭하여 지는 전구체 세포군을 포함하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 세포들을 CD34^저/음성 조혈 세포 전구체라고도 부르며, 이는 조혈 조직 및 비-조혈 조직의 재생에 있어서 상당한 적 응력(plasticity)을 갖는다[Goodell외 다수 1997. Nat Med 3(12):1337-45; 본원에 참고용으로 인용됨]. 그러므로, 어떠한 가설에도 국한되지 않고서, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 방법에 있어서, SP 세포들이 BMSC, 가능하게는 더 성숙한 MSC의 중간체로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 적어도 부분적으로나마 생산해낼 수 있는 것으로 알고 있다[Goodell외 다수 1997]. 잠재적이되 예시적으로, 본 발명의 발명자들은 SP 세포가 본 발명의 방법에 의하여 생산된 세포군 중에 포함된 세포 예를 들어, 내피 계통 세포 예를 들어, 내피 전구세포 및/또는 내피 세포를 추가로 생산할 수 있는 것으로 생각한다.

그러므로, 하나의 구체예에서, 본 발명은 또한 인간의 부 군집(SP)으로부터, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포들을 포함하는 세포군을 시험관 내 또는 생체 외에서 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 SP와 인간 혈장 또는 혈청 그리고 성장 인자를 접촉시키는 단계를 포함한다.

또한, 골수는 처음에는 (예를 들어, 밀도 구배 원심 분리시) 낮은 밀도로 동정되는 골원성 전구세포의 군집(비-부착성이며, 골원성 마커의 발현 수준이 낮은 전구세포군)을 포함하는 것으로 알려져 있다[Long외 다수 1995. J Clin Invest. 1995 Feb;95(2):881-7; 미국 특허 제5,972,703호; 본원에 참고용으로 인용됨]. 그러나, 이러한 세포들은 조골세포로 분화하도록 유도되므로, 기재 표면에 부착성이기도 하다. 그러므로, 어떠한 가설에도 국한되지 않고서, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 방법에 있어서, 골원성 전구체가 BMSC로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 적어도 부분적으로나마 생산할 수 있다고 생각한다.

그러므로, 하나의 구체예에서, 본 발명은 또한 인간의 골원성 전구체(OP)로부터, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포들을 포함하는 세포군을 시험관 내 또는 생체 외에서 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 OP와 인간 혈장 또는 혈청 그리고 성장 인자를 접촉시키는 단계를 포함한다.

또한, 골수는 조혈 세포 계통 및 비-조혈 세포 계통 둘 다에 해당하는 세포를 생산할 수 있는 원시 전구체 세포군을 포함하는 것으로 알려져 있다[Krause외 다수 2001. Cell 105:369-377; Dominici외 다수 2004. PNAS 101 (32): 11761-6]. 그러므로, 어떠한 가설에도 국한되지 않고, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 방법에 있어서, 상기와 같은 원시적 전구체가 BMSC, 가능하게는 더욱 성숙한 MSC의 중간체로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 적어도 부분적으로나마 생산해낼 수 있는 것으로 알고 있다. 잠재적이되 예시적으로, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 원시적 전구세포가 본 발명의 방법에 의하여 생산된 세포군 중에 포함된 세포 예를 들어, 내피 계통 세포 예를 들어, 내피 전구세포 및/또는 내피 세포를 추가로 생산할 수 있는 것으로 생각한다.

만일 골수 줄기 세포군에 복잡도가 부여된다면, 본 발명은 하나 이상의 특정 BMSC 류를 한정하는 것으로 간주하여서는 안 된다는 것을 알아야 한다. 오히려, 본 발명의 방법에 있어서, 전술한 바와 같은 하나 이상의 BMSC 세포 류는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하거나, 또는 이러한 세포들을 포함하는 세포군을 생산하기 위해서, 상이한 정도로 기여할 수 있다. 다른 한편으로, 본 발명의 방법은 또한 특정 BMSC 군집 예를 들어, 기타 BMSC 군집으로부터 적어도 부분적으로 분리된 MSC를 사용할 수도 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 측면에 따르면, 인간의 골수 줄기 세포로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하는 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다. 본원에 사용된 "시험관 내"란 용어는, 동물 또는 인간 신체의 바깥이나 외부를 의미하는 것이다. 본원에 사용된 "시험관 내"란 용어는, "생체 외"라는 용어를 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다. "생체 외"라는 용어는, 통상적으로 조직이나 세포가 동물이나 인간의 신체로부터 분리되어, 신체의 바깥 예를 들어, 배양 용기 내에서 유지 또는 증식되는 경우를 의미하는 것이다.

하나의 구체예에서, BMSC는 인간 개체의 생물 시료로부터 얻어진다.

본원에 있어서, "생물 시료" 또는 "시료"라는 용어는, 생물학적 공급원 예를 들어, 유기체 예를 들어, 동물이나 인간 개체, 세포 배양액, 조직 시료 등으로부터 얻어진 시료를 의미하는 것이다. 동물 개체 또는 인간 개체의 생물 시료란, 동물이나 인간 개체로부터 분리된 시료로서, 이 개체의 세포를 포함하는 시료를 의미하는 것이다. 동물 또는 인간 개체의 생물 시료는 하나 이상의 조직 류를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 조직 류의 세포를 포함할 수도 있다. 동물 또는 인간 개체의 생물 시료를 구하는 방법 예를 들어, 조직 생검법 또는 채혈법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다.

인간 개체의 유용한 생물 시료는 이 개체의 골수 줄기 세포를 포함한다. 이와 같은 시료는 개체의 골수 예를 들어, 장골 능, 대퇴부, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 기타 개체의 골 간 공간에서 얻을 수 있다. 기타 유용한 생물 시료는 중간엽 줄기 세포를 포함하며, 또한 예를 들어, 혈액, 제대, 태반, 태아의 난황막, 피부(진피), 구체적으로 태아 및 젊은 사람의 피부, 골막 및 지방 조직으로부터 유래할 수도 있다.

본원에 사용된 "개체"란 용어는, 진핵 생물 유기체 특히, 동물이나 인간 유기체를 의미하는 것이다. 동물 개체로서는 출생 전 상태인 동물 예를 들어, 태아를 포함한다. 인간 개체로서는 배아가 아닌 태아를 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, BMSC는 골-관련 질환이 발생할 위험이 있거나 또는 이미 발생한 인간 개체로부터 얻어진다. 본 발명의 발명자는, 본 발명의 방법에 따라서 이와 같은 개체의 BMSC로부터 얻어진 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 투여하면, 예를 들어, 새로이 골을 형성하거나 골 밀도를 증가시킴으로써, 상기 개체에서 골-관련 질환을 치료하는데 유용할 수 있음을 알게 되었다.

그러므로, 본원에 사용된 "골-관련 질환"이란 용어는, 임의의 유형의 골 질환을 의미하는 것으로서, 이 질환의 치료법은 골원성 계통의 세포 예를 들어, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 상기 질환이 발병한 개체에 투여함으로 인하여 효과를 볼 수 있다. 특히, 이와 같은 질환은 예를 들어, 골 형성률의 감소 또는 과다한 골의 재흡수, 골 내에 존재하는 조골세포 또는 골 세포의 수, 생존율 또는 기능의 감소, 개체 내 골 질량의 감소, 골의 첨멸(thinning), 골 강도 또는 유연성의 감퇴를 특징으로 한다.

예를 들어, 본 발명의 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 투여함으로 효과를 볼 수 있는 골-관련 질환으로서는 국소 질환 또는 전신 질환 예를 들어, 임의의 유형의 골다공증 또는 골 감소증 예를 들어, 1차적, 폐경기 이후, 노년기, 코르티코이드-유도성, 임의의 2차적, 단발성 또는 다발성 골 괴사, 임의의 종류의 골절 예를 들어, 불 유합, 부정 유합, 지연 유합 골절 또는 압박증, 골 융합이 발생하는 병상(예를 들어, 척추 관절병증 및 재구성), 맥실로 안면 골절(Maxillo-facial fracture), 골의 재구성 예를 들어, 외상 또는 암 수술 후의 재구성, 크래니오-안면 골 재구성(Cranio-facial bone reconstruction), 골 형성 부전증, 골 융해성 골 암, 파젯병, 내분비계 질환, 저 인산 혈증, 저 칼슘 혈증, 신성 골 이영양증, 골 연화증, 무력성 골 질환, 류머티즘성 관절염, 부갑상선 기능 항진증, 1차 부갑상선 기능 항진증, 2차 부갑상선 기능 항진증, 치주 질환, 고람-스타우트 병(Gorham-stout disease) 및 맥쿤-올브라이트 증후군(McCune-Albright syndrome)을 포함할 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 BMSC로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이와 같은 세포들을 포함하는 세포군을 생산하는 것이다.

본 발명의 방법에 사용된 용어 중 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포라는 용어는, 일반적으로 골 물질(bone material) 또는 골 기질(bone matrix)을, 세포가 될 수 있거나 또는 이를 형성할 수 있는 세포로 발생할 수 있는 세포들을 포함한다. 본 발명의 이와 같은 측면은, 발명자들에 의해 실험을 통하여 입증된 바와 같이 치료를 위해 골 형성 기능을 복원하는데 유용한 세포 및 세포군을 생산하는 방법을 제공할 것으로 생각된다. 결과적으로, 상기 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포라는 용어는 본 발명의 방법에 의하여 생산된 골원성 계열의 유용한 임의의 세포를 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는데 충분한 지침 예를 들어, 본원과 관련된 세포 및 세포군에 도달하는데 충분한 지침(일반적으로 전술한 바와 같음)을 제공한다. 원하는 세포 또는 세포군이 생산되었는지 여부를 확인함으로써, 당업자는 본원의 실시예에 기술된 표현형 평가 방법이나 기타 당 업계에 알려져 있는 테스트를 수행할 수 있다. 그러나, 임의의 추가 지침에 의해서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포는 다음과 같은 특징들 중 하나 이상을 나타낼 임의의 골원성 세포 계열의 세포와, 다음과 같은 특징들 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상을 나타낼 수 있는 임의의 골원성 세포 계열의 세포를 포함할 수 있다: (a) CD90, CD73 및 CD105에 양성; (b) 알칼리성 포스파타제(ALP)(더욱 구체적으로는 골-간-신장 타입의 ALP)에 양성; (c) (성숙한 조골세포에 있어서 특이적인) 오스테오칼신에 양성; (d) 밀도가 1.050∼1.090g/㎤; (e) 오스테오넥틴에 양성(조골세포 및 전구체에서 양성); (f) 세포 지름이 6∼70㎛이고 실질적으로 입방형; (g) 제I형 콜라겐(프로콜라겐) 및/또는 비멘틴 및/또는 골 시알로단백질에 양성; (h) 기타 조골세포-특이적 마커 예를 들어, BMP 수용체, PTH 수용체에 양성; (i) 골원성 배지에 노출될 때, 외부 환경을 무기질화시키거나, 칼슘-함유 세포 외 기질을 합성하는 능력을 가짐[Jaiswal외 다수 1997. J Cell Biochem 64: 295-312].

상기 세포-특이적 마커의 발현 여부는 당 업계에 공지된 임의의 적당한 면역학 기술 예를 들어, 세포 면역 화학 기술 또는 친화성 흡착 기술, 웨스턴 블럿 분석법, FACS 및 ELISA 등, 또는 효소 활성(예를 들어, ALP 활성)에 관한 임의의 적당한 생화학적 검정법, 또는 마커 mRNA의 양을 측정하는 임의의 적당한 기술 예를 들어, 노던 블럿, 준-정량 RT-PCR 또는 정량 RT-PCR 등을 사용하여 확인될 수 있다. 본원에 나열된 마커에 대한 서열 데이터는 공지되어 있으며, GenBank와 같은 공중이 이용 가능한 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 세포 내 칼슘 축적과 기질 단백질에의 침전 여부는, 세포를 ⁴⁵Ca^{2 +} 중에서 배양하고, 이를 세척한 다음 다시 배양한 후, 세포 내부에 존재하거나 세포 외 기질에 침전된 임의의 방사능을 측정하거나(미국 특허 제5,972,703호), 또는 Ca^{2 +} 검정 키트(Sigma Kit #587)를 사용하여 배양 기질이 무기질화되었는지를 검정하여 측정될 수 있거나, 또는 본원의 실시예에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.

세포가 특정 마커에 대해 양성이라는 의미를, 당 업자는, 적당한 측정법을 수행할 때 그 마커에 대해 분명한 신호가 발생하는 경우를 의미한다고 정의를 내릴 것이다. 이 방법이 특정 마커를 정량하여 평가할 수 있을 경우, 양성 세포는 대조군 세포(예를 들어, 본 발명의 방법을 실시하기 이전의 BMSC 세포, 또는 임의의 기타 비-골원성 세포)에 의해 발생한 신호보다 2배 이상 예를 들어, 4배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상 또는 50배 이상 높은 신호를 발생시킬 수 있다.

전술한 바와 같이, 생물 시료 중에 존재하거나 이 시료부터 적어도 부분적으로 분리된 BMSC는, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하기 위하여, 인간의 혈장이나 혈청 및 성장 인자나 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉하게 된다.

당 업자는 인간의 혈장과 혈청이 하나 이상의 성장 인자, 시토킨 또는 호르몬을 포함할 수 있는, 복잡한 생물학적 조성물인 것으로 알고 있다. 그러므로, "인간의 혈장 또는 혈청 및 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉한"이란 용어는, 상기 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체가 혈장 또는 혈청에 더하여 즉, 이 혈장이나 혈청에 대해 외부로부터 제공되거나 또는 이에 보충하여 제공되는 경우를 의미한다. 그러므로, BMSC는 상기 혈장 또는 혈청에 포함될 수 있는 성장 인자 이외에도, 이 혈장이나 혈청에 더하여 즉, 이 혈장이나 혈청에 대해 외부로부터 제공되거나 또는 이에 보충하여 제공되는 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉한다.

상기 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 상기 혈장 또는 혈청 중에 존재하지 않는 것일 수 있다. 이와 같은 경우, BMSC는 혈장이나 혈청 둘 중 어느 하나와 접촉하는 경우 접촉하지 않게 될(즉, 상기) 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉하게 된다. 상기 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 또한 혈장이나 혈청 중에 존재하는 것일 수도 있다. 이와 같은 경우, BMSC는 혈장이나 혈청 둘 중 어느 하나와 접촉하는 경우 보다 많은 양 또는 높은 농도의 (즉, 상기) 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉하게 된다.

본원에 있어서, "성장 인자"라는 용어는, 다양한 세포 류의 증식, 성장, 분화, 생존 및/또는 이동에 영향을 미치며, 단독으로 또는 다른 물질들에 의해 조정될 때, 유기체 내에서 발생, 형태 및 기능에 변화를 일으킬 수 있는 생물 활성 물질을 의미한다. 성장 인자는 통상적으로, 성장 인자에 반응성인 세포 내에 존재하는 수용체(예를 들어, 표면 또는 세포 내 수용체)에 리간드로서 결합하여 작용을 할 수 있다. 본원의 성장 인자는 특히 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질성 물질일 수 있다.

예를 들어, "성장 인자"라는 용어는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 군, 골 형성 단백질(BMP) 군, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 군, 변형성 성장 인자 베타(TGF베타) 군, 신경 성장 인자(NGF) 군, 상피 성장 인자(EGF) 군, 인슐린 관련 성장 인자(IGF) 군, 간 세포 성장 인자(HGF) 군, 조혈 세포 성장 인자(HeGF), 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF), 안지오포이에틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 군 및 글루코코르티코이드 등의 일원들을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 FGF 군의 상기 일원은 각각의 산성 및 염기성 FGF, FGF-1 및 FGF-2, int2(FGF-3), hst(FGF-4), FGF-5, hst2(FGF-6), 각질 세포 성장 인자(FGF-7), 안드로겐-유도 성장 인자(FGF-8); 신경 교세포-활성화 인자(FGF-9) 및 FGF-10∼23 중 임의의 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 구체예에서, 섬유아세포 성장 인자로서는 염기성 FGF(FGF-b라고도 칭함), FGF-2, BFGF, HBGH-2, 프로스타트로핀(prostatropin) 또는 헤파린-결합 성장 인자 2 전구체(HBGF-2)가 있다. 본 발명의 발명자들은 FGF-b가 본 발명의 방법에 특히 유용하다는 사실을 알게되었다.

하나의 구체예에서, FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체나 유도체는, 인간의 혈청이나 혈장 중에 존재할 가능성이 있는 물질에 대해 외재적으로 존재할 경우, 본 발명의 방법에서 BMSC와 접촉하는 유일한 성장 인자이다.

추가의 구체예에서, BMSC는 FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체나 유도체와, 이 FGF-2 이외에 하나 이상의 부가적 성장 인자와 접촉한다. 바람직하게, 상기 하나 이상의 부가적 성장 인자는 EGF를 포함하지 않는다.

다른 구체예에서, 성장 인자는 골 형성 단백질(BMP) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 BMP 군의 일원은 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-3b/GDF-10, BMP-6, BMP-7, BMP-8 및 BMP-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

하나의 구체예에서, 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 PDGF 군의 일원은 뉴로필린-2, PDGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, PDGF-AB 및 PIGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

하나의 구체예에서, 성장 인자는 변형성 성장 인자 베타(TGF 베타) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 TGF 베타 군의 일원은 TGF-베타-1 , TGF-베타-2, TGF-베타-3, TGF-베타-4, GDF1(성장/분화 인자 1), GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-11, GDF-15, INHA(인히빈 알파 사슬), INHBA(인히빈 베타 A 사슬), INHBB(인히빈 베타 B 사슬), INHBC(인히빈 베타 C 사슬), INHBE (인히빈 베타 E 사슬), MIS(뮬러-억제 인자), 및 GDNF 하위 군의 추가 일원 예를 들어, GDNF(신경 교 세포주-유래 향 신경성 인자), NRTN(뉴투린), PSPN(퍼세핀)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

하나의 구체예에서, 성장 인자는 신경 성장 인자(NGF) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 NGF 군의 일원은 BDNF(뇌-유래 향 신경성 인자), NGF(베타-신경 성장 인자), NT3(뉴로트로핀-3) 및 NT5로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

하나의 구체예에서, 성장 인자는 상피 성장 인자(EGF) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 EGF 군의 일원은 암피레귤린, 베타셀룰린, EGF, 에피레귤린, HB-EGF(헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자), NRG1(뉴레귤린-1) 동족체 GGF2, NRG1 동족체 SMDF, NRG1-알파, NRG1-베타, TGF알파, 토모레귤린-1 및 TMEFF2로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

하나의 구체예에서, 성장 인자는 인슐린 관련 성장 인자(IGF) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 IGF 군의 일원은 인슐린, IGF1A(인슐린-유사 성장 인자 1A), IGF1B, IGF2, INSL3(인슐린-유사 3), INSL5, INSL6 및 릴렉신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

하나의 구체예에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 군의 일원이다. 추가의 구체예에서, 상기 VEGF 군의 일원은 VEGF, VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

하나의 구체예에서, 성장 인자는 글루코코르티코이드이다. 추가의 구체예에서, 상기 글루코코르티코이드는 덱사메타손, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론, 코르티코스테론, 플루오시놀론, 코르티손, 베타메타손으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 성장 인자는 인간 성장 인자이다. 본원에 사용된 "인간 성장 인자"란 용어는, 천연 생성되는 인간의 성장 인자와 실질적으로 동일한 성장 인자를 의미하는 것이다. 예를 들어, 성장 인자가 단백질성 물질일 경우, 구성 펩티드(들) 또는 이의 폴리펩티드(들)는 천연 생성 인간 성장 인자와 동일한 1차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서 인간 성장 인자를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 성장 인자는 세포 기능에 원하는 효과를 이끌어낼 수 있을 것으로 기대되기 때문이다.

"천연 생성되는"이란 용어는, 그 대상이나 물질이 사람에 의해서 인공적으로 생산되는 것과는 구별되는 특징을 갖는 경우를 의미한다. 예를 들어, 천연의 공급원으로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체 내에 존재하는 폴리펩티드 서열은 천연 생성된 것이다. 특정 물질 예를 들어, 폴리펩티드 또는 단백질을 언급할 때, 상기 용어는, 예를 들어, 개체 간 정상적인 변이로 인하여 생성되는(즉, 자연적으로 생성되는) 모든 형태의 것과 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 단백질성 성장 인자를 언급할 때, 상기 "천연 생성되는"이란 용어는, 개체 간 정상적인 대립 형질 상의 변이로 인하여 성장 인자의 구성 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들)의 1차 서열에 차이가 나는 성장 인자를 포함한다.

본 발명의 방법은 성장 인자의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 성장 인자의 "생물 활성" 변이체 또는 유도체는, 기타 조건이 실질적으로 동일할 때, 각각의 성장 인자가 BMSC로부터 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산할 수 있는 정도와 적어도 거의 동일한 정도로, 이 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산할 수 있다.

성장 인자가 그것의 동족 수용체와 결합함으로써 이 성장 인자의 효능을 나타내는 경우, 상기 성장 인자의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 그것의 동족 수용체와 결합 친화성 및/또는 특이성을 나타낼 수 있는데, 이때, 상기 친화성 및/또는 특이성은 성장 인자와 그것의 동족 수용체와의 결합에 대한 친화성 및/또는 특이성과 적어도 거의 비슷하다. 예를 들어, 상기 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 동족 수용체에 대하여 결합 친화성 및/또는 특이성을 갖는데, 이때, 상기 결합 친화성 및/또는 특이성은 각각의 성장 인자와 그것의 수용체와의 결합 친화성 및/또는 특이성의 80% 이상, 예를 들어, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 또는 100% 이상이다. 상기 결합에 대한 매개 변수는 그 자체가 공지되어 있는 시험관 내 또는 세포 내 검종법을 사용하여 당 업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.

소정의 성장 인자의 활성이 확립된 검정법 예를 들어, 시험관 내 또는 세포내 검정법(예를 들어, 세포 배양액 중 유사 분열 촉진 활성 측정법)에서 용이하게 측정될 수 있는 경우, 상기 성장 인자의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 이와 같은 검정법에서 활성 즉, 성장 인자의 활성과 적어도 거의 비슷한 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 활성을 나타낼 수 있는데, 즉, 각각의 성장 인자 활성의 80% 이상 예를 들어, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 예를 들어, 90% 이상, 또는 100% 이상인 활성을 나타낼 수 있다.

폴리펩티드의 "변이체"는, 폴리펩티드의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한(즉, 상당 부분 동일하되, 완전히 동일하지는 않은) 아미노산 서열을 갖는다. 본원에 있어서, "실질적으로 동일한"이란, 85% 이상 예를 들어, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 예를 들어, 99% 이상 동일한 경우를 의미한다. 서열 차는 하나 이상의 아미노산이 삽입(부가), 결실 및/또는 치환된 결과로 생길 수 있다.

2개의 폴리펩티드 간 서열 동일성은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 정렬한 후, 한편으로는, 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드 배열 내 위치의 수와, 다른 한편으로는 서열이 상이한 2개의 폴리펩티드 배열 내 위치의 수를 바탕으로 하여 스코어를 메김으로써 측정될 수 있다. 2개의 폴리펩티드는, 이 폴리펩티드들이 그 위치에서 상이한 아미노산 잔기들을 함유하거나(아미노산 치환), 또는 폴리펩티드 중 하나가 어떤 위치에 아미노산 잔기를 함유하고 다른 하나는 함유하지 않거나, 또는 그 반대의 경우일 때(아미노산 삽입/부가 또는 결실), 배열 내 소정의 위치의 서열이 상이하다.

서열 동일성은, 폴리펩티드가 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 배열 내 위치 대 이 배열 내 위치의 총 수의 비율(백분율)로서 계산된다.

실질적으로 동일한 변이체의 아미노산 서열과 각각의 폴리펩티드의 아미노산 서열 간 차이 중 적어도 일부는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 차이의 85% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어, 100%는 아미노산 치환일 수 있다. 바람직하게, 상기 아미노산 치환은 보존적일 수 있다. 본원에 사용된 "보존적 치환"이란 용어는, 하나의 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우를 의미한다. 보존적 치환의 비 제한적인 예로서는, 하나의 소수성 아미노산 잔기 예를 들어, 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌의 다른 것으로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 다른 잔기로의 치환 예를 들어, 아르기닌과 리신 간 치환, 글루탐산과 아스파르트산 간 치환, 또는 글루타민과 아스파라긴 간 치환 등을 포함한다.

다양한 성장 인자는 하나 이상의 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들)를 포함할 수 있는데, 이들 중 적어도 하나는 성장 인자의 각 구성 펩티드 또는 폴리펩티드에 관하여 상기 정의한 바와 같은 변이체이다.

폴리펩티드의 "유도체"는, 예를 들어, 글리콜실화, 인산화, 아실화, 아세틸화, 황산화, 지질화 및 알킬화 등에 의하여, 하나 이상의 아미노산 잔기를 화학적으로 변형시키고/변형시키거나 하나 이상의 부분들을 하나 이상의 아미노산 잔기에 부가함으로써 유도체화될 수 있다. 통상적으로, 50% 미만 예를 들어, 40% 미만, 바람직하게는 30% 미만 예를 들어, 20% 미만, 더욱 바람직하게 15% 미만 예를 들어, 10% 미만 또는 5% 미만 예를 들어, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 유도체 폴리펩티드 내 아미노산이 이와 같이 유도체화될 수 있다. 유도 단백질성 성장 인자는 하나 이상의 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들)를 포함할 수 있으며, 이것들 중 하나 이상은 하나 이상의 아미노산 잔기 상에서 유도체화될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 성장 인자는 인간 이외의 성장 인자, 특히, 인간 이외의 포유동물 성장 인자, 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체일 수 있다. 본원에 사용된 "인간 이외의 동물 성장 인자" 및 "인간 이외의 포유동물 성장 인자"란 용어는, 각각 천연 생성되는 인간 이외의 동물 또는 인간 이외의 포유동물 성장 인자와 실질적으로 동일한 성장 인자를 의미한다. 예를 들어, 성장 인자가 단백질성 물질일 경우, 구성 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들)는 천연 생성되는 인간 이외의 동물 또는 인간 이외의 포유동물 성장 인자와 동일한 1차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 당 업자는, 인간 이외의 동물 성장 인자가 BMSC 세포와 동일한 기원의 것이기 때문에, 인간인 동물 성장 인자보다 그 정도가 낮기는 하지만, 인간 이외의 동물 또는 인간 이외의 포유동물 성장 인자를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다는 것을 알게 될 것이다. 특히, 인간 이외의 동물 또는 인간 이외의 포유동물 성장 인자가 원하는 효과 예를 들어, (유사한) 인간 성장 인자와 비슷한 효과를 나타내면, 이 성장 인자들을 사용할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는, 숙주 유기체 또는 이의 조상에 도입되어, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는, 재조합 핵산 분자의 발현을 통하여 숙주 유기체에 의해 생산되는 재조합체이다. 본원에 사용된 상기 "재조합 핵산 분자"란 용어는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 함께 결합된 분절들을 포함하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 cDNA 분자)를 의미한다.

재조합에 의해 발현된 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 사용하는 것이 특히 유리할 수 있다. 예를 들어, 만일 성장 인자가 인간 성장 인자라면, 인간의 생물 물질로부터 분리하는 것보다는 재조합 공급원으로부터 제조하는 것이 더욱 용이할 수 있다. 뿐만 아니라, 인간 또는 동물의 물질로부터 성장 인자를 분리하는 경우에는 병원체가 감염될 위험이 따른다. 이와 같은 위험은 재조합 발현시, 특히, 병원체가 존재하는지 여부를 항상 관찰할 수 있는 세포 발현 시스템을 사용할 때, 보다 효과적으로 억제 또는 제거될 수 있다. 이와 같은 위험은, 만일 세포 발현 시스템이 인간의 세포 발현 시스템과 떨어져 있을 경우(예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포) 더욱 용이하게 제거될 수 있는데, 그 이유는, 이와 같은 배양액에 존재할 수 있는 병원체는 인간 세포 또는 인간에게 해를 끼칠 수 있기 때문이다.

적당한 발현 시스템 예를 들어, 발현 벡터 예를 들어, 플라스미드 및 바이러스 벡터; 숙주 유기체 예를 들어, 박테리아[예를 들어, 이.콜라이(E. coli), 에스.타이피뮤리움(S. tymphim u rium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)], 효모[예를 들어, 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)], 배양된 식물 세포[예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 및 니코티아나 토바큠(Nicotiana tobaccum) 유래], 그리고 동물 세포[예를 들어, 포유동물 세포 및 곤충 세포], 그리고 다세포 유기체 예를 들어, 식물 또는 동물; 그리고 재조합적으로 발현되어 생산된 단백질 예를 들어, 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체의 분리 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 널리 공지된 참고 문헌[예를 들어, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed."(Sambrook외 다수, 1989), Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed., 1987), Methods in Enzymology(Academic Press) 시리즈, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed."(F. M. Ausubel외 다수, eds., 1987 & 1995); Recombinant DNA Methodology II(R. Wu ed., Academic Press 1995); 본원에 참고용으로 인용됨]를 참조하시오. 재조합 성장 인자는 또한 일반적으로 시판중에 있다[예를 들어, 시그마(Sigma), 바이올로지컬 인더스트리스(Biological Industries), R&D 시스템스, 펩프로테크(Peprotech) 등].

"혈장"이란 용어는 통상적으로 정의되는 바와 같다. 혈장은 일반적으로 전혈 시료, 즉, 혈액 시료를 채취할 때 또는 채취한 직후에 응고를 막기 위해 항응고제 예를 들어, 헤파린, 시트르산염(예를 들어, 시트르산나트륨 또는 산성 시트르산염 덱스트로스), 옥살산염 또는 EDTA와 함께 제공되거나 또는 이것과 접촉하게 되는 전혈 시료로부터 얻어지는 것이다. 추후, 혈액 시료의 세포 내 성분은 적당한 기술, 통상적으로 원심 분리에 의하여 액체 성분(혈장)으로부터 분리된다. 그러므로, "혈장"이라는 용어는 인간 또는 동물의 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 의미하는 것이다.

"혈청"이란 용어는 통상적으로 정의되는 바와 같다. 혈청은 일반적으로, 시료 중에서 혈액 응고를 일으킨 후, 이와 같이 형성된 혈병과 혈액 시료의 세포 내 성분을 적당한 기술, 통상적으로는 원심 분리에 의하여 액체 성분(혈청)으로부터 분리함으로써, 전혈 시료로부터 얻을 수 있다. 응혈 과정은 비활성 촉매 예를 들어, 유리 비드나 분말에 의해 촉진될 수 있다. 유리하게도, 혈청은 당 업계에 공지된 혈청-분리 튜브(SST) 즉, 응혈을 촉진하는 비활성 촉매를 함유하고, 원심 분리 후 액체 성분과, 혈병 및 세포 내 성분 사이에 위치하도록 디자인된 밀도를 가지는 겔을 추가로 포함하는 튜브를 사용하여 제조될 수 있으며, 이로써 분리 과정을 간소화할 수 있다. 대안적으로, 혈청은 항응고제와 피브린을 제거하여 혈장으로부터 얻을 수 있다. 그러므로, "혈청"이란 용어는, 인간 또는 동물의 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 의미한다.

분리된 혈장 또는 혈청은 본 발명의 방법을 통하여 직접 사용될 수 있다. 상기 분리된 혈장 또는 혈청은 추후에 본 발명의 방법에서 사용하도록 적당히 보관될 수도 있다. 통상적으로, 혈장 또는 혈청은 단기간 예를 들어, 약 1∼2주 이하의 기간 동안, 혈장이나 혈청의 각각의 동결 온도 이상이되, 상온보다는 높지 않은 온도에서 보관될 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 온도는 약 15℃ 이하, 바람직하게는 약 10℃ 이하, 더욱 바람직하게는 약 5℃ 이하 예를 들어, 약 5℃, 4℃, 3℃, 2℃ 또는 약 1℃, 가장 바람직하게는 약 5℃ 또는 약 4℃일 것이다. 대안적으로, 혈장 또는 혈청은 동결 장치에 의해 각각의 동결 온도 이하에서 보관될 수 있다. 당 업계에서 일반적인 바와 같이, 혈장이나 혈청의 동결 보관에 유리한 온도는 약 -70℃ 이하, 예를 들어, 약 -75℃ 이하 또는 약 -80℃ 이하일 수 있다. 유리하게도, 이와 같은 온도는 보관중인 혈장이나 혈청이 임의로 해동되는 것을 막을 수 있으며, 이로 말미암아 상기 보관중이던 혈장이나 혈청의 품질을 보존할 수 있다. 동결 보관법은 혈장이나 혈청을 보관할 필요가 있는 기간과는 무관하게 활용될 수 있지만, 더욱 장기간 동안 예를 들어, 수일 이상 또는 1∼2주 이상의 기간동안 보관할 필요가 있을 경우에 특히 적당할 수 있다.

보관 또는 사용하기 전, 분리된 혈장이나 혈청은 열에 의해 불활성화될 수 있다. 열 불활성화는 당 업계에서 보체를 제거하는데 주로 사용되는 수단이다. 본 발명의 방법이 혈장이나 혈청이 존재할 때 배양된 세포에 대해 자가성인 혈장 또는 혈청을 사용하는 경우, 상기 혈장이나 혈청을 열에 의해 불활성화시킬 필요는 없다. 혈장이나 혈청이 배양된 세포와 적어도 동종 이계인 경우, 상기 혈장이나 혈청을 열에 의해 불활성화하는 것이 유리할 수 있다. 열 불활성화 과정은 통상적으로 혈장이나 혈청을 56℃에서 30∼60분 동안 예를 들어, 30분 동안, 계속 혼합하여 주면서 항온 처리하는 과정으로 이루어지는데, 이 과정 후, 상기 혈장 또는 혈청의 온도를 상온으로 서서히 강하시킨다. 당 업자는 전술한 방법에 일반적인 변형을 가할 수 있음을 알게 될 것이며, 또한 상기 방법에 필요한 조건도 알 것이다.

임의로, 상기 혈장 또는 혈청은 또한 멸균된 후 보관 또는 사용될 수도 있다. 일반적인 멸균 수단으로서는 예를 들어, 공극 크기가 1㎛ 이하, 바람직하게는 0.5㎛ 이하 예를 들어, 0.45㎛, 0.40㎛, 0.35㎛, 0.30㎛ 또는 0.25㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 0.2㎛ 이하 예를 들어, 0.15㎛ 이하, 0.10㎛ 이하인 하나 이상의 필터를 사용하는 여과법을 포함할 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 인간의 혈청 또는 혈장과 접촉한 인간 BMSC에 대해 자가성인, 인간의 혈장 또는 혈청을 사용한다. 혈장 또는 혈청을 참고로 하였을 때 "자가성(autologous)"이란 용어는, 상기 혈장 또는 혈청이, 이 혈장 또는 혈청과 접촉할 BMSC의 공급원인 개체와 동일한 개체로부터 얻어지는 경우를 의미하는 것이다. 본 발명의 발명자들은, 자가성 혈장 또는 혈청을 사용하면 BMSC로부터 조골세포와 조골세포 표현형 세포를 생산하는데 유리한 조건을 제공한다는 사실을 알게 되었다. 뿐만 아니라, 생산된 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포가 이 BMSC가 유래된 개체와 동일한 인간 개체에 투여될 때, 자가성 혈장이나 혈청을 사용하면 예를 들어, 기타 혈청으로부터 유래하는 감염성 제제의 우연에 의한 감염을 피할 수 있으며/있거나 개체가 상기 세포를 적절하게 수용할 수 있도록 만들 수도 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 인간의 혈장 또는 혈청과 접촉한 인간의 BMSC에 "상동성인" 인간 혈장 또는 혈청 즉, BMSC가 얻어진 개체 이외의 1명 이상의(풀링된;pooled) 인간 개체로부터 얻어진 인간 혈장 또는 혈청을 사용할 수 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 정의한 바와 같은, 자가성 및 상동성 혈장 또는 혈청의 혼합물을 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "접촉"이란 용어는, 하나 이상의 분자, 성분 또는 물질과 다른 분자, 성분 또는 물질이, 직접적으로 또는 간접적으로 서로 합쳐져서, 이들 사이의 상호 작용을 촉진하는 경우를 의미한다. 통상적으로, 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와, 인간의 혈장 또는 혈청은, BMSC가 배양된 배지 중에 포함되어, 이 BMSC와 접촉할 수 있다.

하나의 구체예에서, 인간의 혈장 또는 혈청은 비율(혈청 부피/배지 부피) 0.5∼30%, 바람직하게는 1∼20%, 더욱 바람직하게는 2∼10%, 예를 들어, 5∼10%, 예를 들어, 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%로 배지 중에 포함될 수 있다. 본 발명의 발명자들은, 놀랍게도, 인간 혈장 또는 혈청이 비교적 소량 예를 들어, 약 5부피% 이하, 예를 들어, 1∼5%, 2∼5%, 3∼5%, 또는 4∼5%로도 BMSC로부터 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하는데 충분할 수 있음을 알게 되었다. 유리하게도, 이로써 상기 BMSC를 배양하기 위하여, 공여체(예를 들어, 자가성 혈장이나 혈청의 경우 환자)로부터 수집하여야 하는 혈장 또는 혈청의 부피를 줄일 수 있다.

성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는, 상기 지정된 비율 중 어느 하나의 비율로, 동일한 배지 중에 포함된 인간 혈장 또는 혈청과 함께, BMSC를 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포로 분화시키는데 충분한 농도로서 배지 중에 포함될 수 있으며, 이로써 상기 세포들을 생산할 수 있다. 통상적으로, 성장 인자 예를 들어, FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 0.01∼100ng/㎖, 바람직하게는 0.1∼50ng/㎖ 예를 들어, 0.5∼30ng/㎖, 더욱 바람직하게는 1∼20ng/㎖ 예를 들어, 1∼10ng/㎖ 예를 들어, 바람직하게는 5ng/㎖ 이하 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5ng/㎖의 농도로 배지 중에 포함될 수 있다. 성장 인자가 글루코코르티코이드 예를 들어, 덱사메타손일 경우, 상기 농도는 10^-9∼10^-5 mMol인 것이 바람직할 수 있다. 상기 농도는 혈장이나 혈청에 부가적으로, 즉, 외부로부터 제공되거나 또는 보충하여 제공되는 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체의 농도임을 당 업자는 알게 될 것이다(본 명세서의 임의의 부분 참조).

바람직한 구체예에서, FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 20ng/㎖ 이하, 바람직하게는 10ng/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 5ng/㎖ 이하 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5ng/㎖ 이하의 농도로 포함된다. 본 발명의 발명자들은 이와 같이 FGF-2의 농도가 낮으면 분화시키는데 특히 바람직할 수 있음을 가정하고 있다.

하나의 구체예에서, 전술한 농도는 배지 중 상기 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체의 총 농도 즉, 혈장이나 혈청에 의해 제공되는 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체와, 또한 이 혈장이나 혈청에 의해 제공되는 것 이외의 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체의 총 농도를 의미할 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 농도는 혈장이나 혈청에 의해 이미 제공된 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체 이외에 제공되는, 상기 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체의 농도를 의미하는 것일 수 있다. 알다시피, 만일 첨가될 성장 인자가 보통 혈장이나 혈청 중에 존재하지 않으면(검출되지 않으면), 상기 성장 인자의 총 농도 및 첨가된 농도는 (실질적으로) 동일할 것이다.

하나의 구체예에서, BMSC는 이 BMSC가 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포로 분화되는데 충분한 시간 동안, 인간의 혈장 또는 혈청 및 이의 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 연속적으로 접촉할 수 있으며, 그 결과, 상기 세포들을 생산할 수 있다. "연속적으로 접촉된"이란 용어는, 상기 성분들이 모든 배지 즉, BMSC 즉, 상기 세포들의 자손 및/또는 이로부터 유래하는 세포가 상기 기간 동안 배양되는 모든 배지 중에 포함됨을 의미할 수 있다. 통상적으로, 인간의 혈장 또는 혈청과 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 상기 기간 동안 BMSC를 배양하는데 사용된 모든 (신선한) 배지 중에, 실질적으로 동일한 각각의 농도로 공급될 수 있다.

그러므로, 통상적으로 t=0일은, 분리된 BMSC가 성장 호르몬 및 인간 혈청 또는 혈장의 존재하에 처음 도말되는 시점에 해당한다(1차 배양).

하나의 구체예에서, 상기 노출 기간은 5일 이상, 바람직하게는 10일 이상, 더욱 바람직하게는 15일 이상 및 더욱 바람직하게는 18일 이상 예를 들어, 20일 이상일 수 있다. 예를 들어, 상기 기간은 5∼30일, 바람직하게는 10∼30일, 더욱 바람직하게는 15∼25일, 및 더욱 바람직하게는 약 20일 예를 들어, 20, 21, 22 또는 23일일 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 상기 기간은 12∼16일 예를 들어, 12, 13, 14, 15 또는 16일, 특히 바람직하게는 약 14일일 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 기간은 18∼24일 예를 들어, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일, 특히 바람직하게는 약 21일일 수 있다.

추가의 구체예에서, 상기 기간 동안에는 세포를 1회 이상 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4회 이상 계대 배양할 수 있으며, 바람직하게는, 1, 2 또는 3회, 더욱 바람직하게는 1 또는 2회 예를 들어, 1회 계대 배양할 수 있다. 계대 배양 횟수는 세포군이 배양 용기로부터 분리되어, 2차 배양 즉, 계대 배양을 수행한 횟수를 의미한다. 당 업자가 알고 있는 바와 같이, 배양액 중에서 성장한 세포는 통상적으로, 원하는 정도의 합류 상태가 될 때 계대 배양된다. 예를 들어, 만일 세포가 단일 층으로 존재하면, 이 세포는 합류 상태의 정도가 60% 이상 예를 들어, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 또는 100%가 될 때 계대 배양될 수 있다. 통상적으로, 세포는 1/8∼2/3 예를 들어, 1/4∼1/2의 비율로 계대 배양될 수 있다. 이와 같은 비율은 계대 배양 후 동일 부피의 배지에 도입되는 세포의 비율을 의미한다. 만일 세포가 예를 들어, 배양액 중 소정의 기간 예를 들어, 4∼20일 예를 들어, 8∼15일, 더욱 바람직하게는 10∼15일 예를 들어, 10, 11, 12, 13 또는 14일 동안 배양된 후 콜로니 형태로 존재하면, 이 세포는 계대 배양될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 콜로니 당 세포의 평균 수가 20개 이상, 또는 50개 이상, 또는 100개 이상, 또는 500개 이상일 때 1회 계대 배양될 수 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 성장 인자 특히, FGF-2와, 인간 혈청 또는 혈장과 세포의 총 접촉 시간이 바람직하게는 12∼16일인 경우, 1차 도말된 BMSC는 계대 배양될 필요가 없이, 직접 수집될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, BMSC와 성장 인자, 특히 FGF-2와, 인간 혈청 또는 혈장이 접촉하는 총 시간은 바람직하게는 약 18∼약 24일이며, 1차 배양에 있어서 1회 계대 배양은 바람직하게는 8∼17일, 더욱 바람직하게는 12∼16일 예를 들어, 가장 바람직하게는 14일 동안 수행될 수 있다.

관찰 결과, 본 발명의 발명자들은 세포가 조골세포와 매우 유사한 표현형을 나타내는 기간의 마지막에, BMSC와 성장 인자 특히, FGF-2와 인간 혈청 또는 혈장을 약 12∼16일 동안 접촉시키는 것이 바람직하다는 것을 알게 되었다. 이후, 상기 세포들은 적어도 부분적으로나마 탈 분화되는 것으로 파악된다[형태 변화, ALP 수준의 감소 및 분화 인자 수준의 증가로 확인됨]. 그러나, 상기 세포를 실질적으로 탈 분화시키지 않고서, 더욱 많은 골원성 계통의 세포를 생산하기 위해, 상기 기간을 약 18∼24일로 연장하는 것이 유리할 수 있다. 비록 계대 배양을 추가로 행할 경우 이 기간을 추가로 연장할 수도 있지만, 본 발명의 발명자들은 성장 인자 특히, FGF-2가 장기간 존재하면, 세포의 탈 분화와 같은 원치 않는 현상을 추가로 유도할 수 있는 것으로 추측한다. 그러므로, 상기 언급된 단기간이 바람직하다.

하나의 구체예에서, 세포 배양액 중 섬유아세포의 성장을 지지할 수 있는 임의의 배지를 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 섬유아세포의 성장을 지지할 배지 제형으로서는, 시판되고 있는(예를 들어, Invitrogen, Carlsbad, California) 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium; MEM), 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), 알파 개질 최소 필수 배지(alpha modified Minimum Essential Medium; 알파-MEM), 기초 필수 배지(Basal Medium Essential; BME), BGJb, F-12 영양 혼합물(Ham) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 사용하기 특히 적당한 배지는, 인비트로겐(Invitrogen) 또는 캠브렉스(Cambrex)(New Jersey)로부터 시판되고 있는 알파-MEM, IMDM, X-Vivo-10, X-Vivo 20 무 혈청 배지(임상 실험용)일 수 있다. 포유동물 세포 발생에 필요한 성분을 함유하는 이와 같은 액체 배양 배지는 그 자체로서 공지되어 있다. 예를 들어, 이와 같은 성분들은 무기 염(특히, Na, K, Mg, Ca로서, Cu, Fe 및 Zn도 가능함), 아미노산, 비타민, 그리고 탄소 공급원(예를 들어, 글루코스) 등을 포함한다. 통상적으로, 혈청 성분 예를 들어, 소 태아 혈청(FCS) 중 5∼20%는 섬유아세포의 성장을 지원하기 위해 상기 배지에 첨가될 필요가 있을 수 있다. 그러나, 섬유아세포 성장에 필요한 FCS 내 인자가 동정되어 성장 배지 내에 제공되면, 제한된 무 혈청 배지가 사용될 수 있다. 유리하게도, 본 발명의 방법에 있어서, 이와 같은 혈청 성분은 BMSC가 접촉한 인간의 혈장이나 혈청에 의해 대표될 수 있으므로, 상기 배지에는 추가의 혈청 성분이 첨가되지 않는다. 배지는 또한 하나 이상의 목적 화합물 예를 들어, 중탄산나트륨, 항생 성분 및/또는 항진균 성분 예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 및/또는 암포테리신 등을 함유할 수도 있다.

바람직한 구체예에서, BMSC는 인간 이외의 동물 특히, 인간 이외의 포유동물로부터 유래하는 임의의 성분과 접촉하지 않는다. BMSC로부터 유래하는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포가 인간인 개체에 투여될 것이라면, 인간 이외의 동물로부터 얻어진 성분들과 BMSC 사이의 접촉이 없을 경우 상기 개체는 상기 세포를 최적으로 수용하게 되며, 또한 이 개체에 감염성 제제가 우연히 감염되는 것도 막을 수 있다. 상기와 같은 감염에 대한 위험성은 프리온 질병 예를 들어, 동물로부터 인간으로 전이될 수 있는 BSE의 출연으로 말미암아, 그 중요성이 점점 증가하고 있다.

특정 구체예에서, BMSC는 인간 이외의 동물로부터 유래한 임의의 혈청 성분과 접촉하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 BMSC를 배양 및 분화하는데 사용된 배지는 인간 이외의 동물로부터 유래하는 임의의 혈청 성분을 함유할 수 없다. 전술한 바와 같이, 예를 들어, 세포 배양 배지에 FCS를 첨가하는 방식은 당 업계에서 세포 배양시 성장을 지원하는 수단으로서 관례로 여겨지는 것이다. 그러므로, 본 발명의 방법에서 BMSC를 배양 및 분화시키는데 사용된 배지는 임의의 FCS 또는 기타 인간 이외의 동물의 혈청 성분을 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 발명자들은, BMSC를 인간 이외의 동물로부터 유래하는 임의의 혈청 성분과 접촉시키지 않을 때, BMSC로부터 조골세포 및 조골세포 표현형 세포를 생산하는데 유리한 조건을 형성함을 알게 되었다.

다른 구체예에서, BMSC가 배양되는 배지는 임의의 항생 성분 또는 항진균 성분을 함유하지 않는다. 이와 같은 성분이 존재하지 않음으로 말미암아, 배양시 발생할 수 있는 오염에 대하여 더욱 용이하게 분별할 수 있다. 만일 BMSC로부터 생산된 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 인간 개체에 투여하면, 개체에 병원성 미생물이 침투하는 것을 막을 수 있다.

하나의 구체예에서, 배지는 골 분화를 유도하는데 당 업계에서 일반적으로 사용되는 성분들 예를 들어, 글루코코르티코이드(예를 들어, 덱사메타손), 아스코르브산 2-포스페이트 및/또는 베타-글리세롤포스페이트를 함유하지 않는다.

그러므로, 전술한 바람직한 특징들을 고려하였을 때, 대표적인 구체예에 있어서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이 세포들을 포함하는 세포군(그리고 임의로는 기타 세포류 예를 들어, 내피 세포 또는 전구세포를 추가로 포함하는 세포군)을 시험관 내 또는 생체 외에서 생산하는 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

(a) BMSC를 포함하는 인간 개체의 생물 시료, 바람직하게는 골수 시료로부터 세포를 회수하는 단계;

(b) 임의로, 예를 들어 적당한 밀도 구배 원심 분리법 또는 기타 방법을 사용하여, 상기 (a) 단계에서 회수된 세포로부터 단일 핵 세포를 분리하는 단계;

(c) 상기 (a) 단계 또는 바람직하게는 (b) 단계의 세포를, 인간 혈장 또는 혈청 및 FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 포함하는 배지에 첨가하고, 세포가 예를 들어 배양 용기의 기재 표면, 예컨대 유리 또는 플라스틱 표면에 부착되도록 하는 것과 같이 세포-배지 혼합물을 배양하는 단계;

(d) 비-부착성 물질을 제거하고, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 유사 세포, 또는 이 세포들을 포함하는 세포군을 얻도록 하는 것과 같이 상기 (c) 단계에서 정의되는 바와 같은 배지 중에서 부착성 세포를 추가로 배양하는 단계.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 12∼16일 예를 들어, 14일 경과시에, 상기 (d) 단계에서 생산된 세포 또는 세포군을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

기타 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 (d) 단계의 세포 또는 세포군을 약 12∼16일 경과시에 계대 배양하고, 이와 같이 배양된 세포 또는 세포군을 약 18∼24일 경과시에 수집하는 단계를 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 배양 용기는 세포가 부착될 수 있는 플라스틱 표면을 제공할 수 있다. 다른 구체예에서, 표면은 유리 표면일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표면은 세포의 성장을 유도하는 적당한 물질 예를 들어, 마트리겔(Matrigel(R)), 라민 또는 콜라겐으로 코팅될 수 있다.

특정 성분과 관련하여 "분리"라는 용어는, 분리될 하나의 성분을 포함하는 조성물의 하나 이상의 기타 성분으로부터 상기 분리될 성분을 분리하는 과정을 의미한다. 그러므로, BMSC를 분리하는 과정은, BMSC를 포함하는 조성물의 하나 이상의 기타 성분으로부터 BMSC를 분리하는 과정을 포함한다. BMSC를 분리하는 과정은 또한 기타 성분들, 특히 기타 세포 내 성분들에 대한 조성물 중 BMSC의 비율을, 기타 세포 내 성분들에 대한(BMSC가 분리될) 조성물 중 BMSC의 비율에 비하여 증가시키는 과정도 포함한다. 예를 들어, 생물 시료로부터 BMSC를 분리하는 것은 시료의 기타 성분들 특히, 시료의 특정 세포 내 성분들로부터 BMSC를 분리하는 것을 의미한다.

본원에 있어서 임의의 세포군과 관련하여 사용된 "분리된"이란 용어는, 이와 같은 세포군이 동물 또는 인간의 신체의 일부를 이루지 않는 경우를 의미한다.

하나의 구체예에서, 상기 (a) 단계 또는 (b) 단계의 세포는 배양을 위해 1∼1×10⁶ 세포/㎟ 예를 들어, 1∼5×10⁵ 세포/㎟, 1∼1.5×10⁵ 세포/㎟ 예를 들어, 1×10³∼5×10⁵ 세포/㎟, 바람직하게는 1×10⁴∼5×10⁵ 세포/㎟ 예를 들어, 1×10⁴∼1×10⁵ 세포/㎟, 또는 5×10⁴∼5×10⁵ 세포/㎟, 또는 5×10⁴∼1×10⁵ 세포/㎟ 예를 들어, 약 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴, 5×10⁴, 6×10⁴, 7×10⁴, 8×10⁴, 9×10⁴, 또는 1×10⁵ 세포/㎟로 도말될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 (d) 단계의 비-부착성 물질을 제거하는 과정은, 1∼8일 예를 들어, 2∼6일, 바람직하게는 1∼4일, 더욱 바람직하게는 약 4일 예를 들어, 4일, 그리고 더욱 바람직하게는 1, 2 또는 3일, 더욱 바람직하게는 1 또는 2일 이후에 수행된다.

또한, 바람직한 구체예에서, 상기 단계 (d)의 부착성 세포를 추가로 배양하는 과정은 5∼30일 예를 들어, 약 10∼25일, 더욱 바람직하게는 약 18∼22일, 더욱 바람직하게는 18∼24일 예를 들어, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일 동안 수행될 수 있다.

추가의 바람직한 구체예에서, 상기 (d) 단계의 부착성 세포를 추가로 배양하는 과정은 세포를 1회 또는 1회 이상 예를 들어, 2 또는 3회, 바람직하게는 1 또는 2회, 더욱 바람직하게는 1회 계대 배양하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 (c) 단계 이후 약 10∼18일 예를 들어, 약 12∼16일 예를 들어, 14일 경과시 계대 배양하는 것을 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 이와 같은 계대 배양은 배양 과정을 표준화하기 위하여, 일정한 기간 경과시 예를 들어, 배양한 지 약 14일 예를 들어, 배양한 지 14일에 행하여질 수 있다.

바람직하게, 계대 배양 후 상기 세포는 1∼1×10⁶ 세포/㎟ 예를 들어, 1×10²∼1×10⁵ 세포/㎟, 1×10³∼1×10⁵ 세포/㎟, 바람직하게는 5×10³∼5×10⁴ 세포/㎟ 예를 들어, 약 5×10³, 6×10³, 7×10³, 8×10³, 9×10³, 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴, 또는 5×10⁴ 세포/㎟, 더욱 바람직하게는 8×10³∼2×10⁴ 세포/㎟ 예를 들어, 약 1×10⁴ 세포/㎟로, 상기 (d) 단계에서 다시 도말되어 추가로 배양할 수 있다.

하나의 구체예에서, 상기 세포는 5% 이상, 또는 10% 이상 예를 들어, 30% 이상 및 90% 이하, 또는 80% 이하, 또는 50% 이하, 및 바람직하게는 30∼80%의 비율로 합류 상태가 될 때 다시 도말될 수 있다.

하나의 구체예에서, 계대 배양 단계는, 세포를 2가 이온 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 EGTA)로 처리하는 과정 및/또는 트립신으로 처리하는 과정을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 계대 배양 단계는, 세포를 2가 이온 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 EGTA)로 처리하되 트립신으로는 처리하지 않는 과정을 포함한다. 트립신은 동물 공급원으로부터 유래할 수 있어서, 병원성 제제를 도입할 위험성을 수반할 수 있기 때문에, 상기 과정은 유리하다.

상기 (a)∼(d) 단계로 이루어진 방법의 추가의 바람직한 구체예는 전술한 바와 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법과 이의 바람직한 구체예를 통하여, 우수한 특성 예를 들어, 빠른 증식성, 빠른 무기질화 특성, 그리고 지방 세포나 연골 세포로 분화될 가능성이 실질적으로 없는, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와, 이러한 세포들을 포함하는 세포군을 생산할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 또한 이와 같은 세포 및 세포군이 환자의 골 조직에 이식될 때, 그 효능이 더욱 우수할 수 있음을 알게 되었다. 만일 본 발명의 방법에 의해 생산된 세포 및 세포군의 이와 같이 놀라운 특성들이 제공되면, 상기 세포 및 세포군은 그 자체로서 당 업계에서 그 가치를 인정받게 될 것이다. 뿐만 아니라, 다음의 섹션에서 추가로 기술되고, 실험 데이터에 의해 확증되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 골원성 세포의 새로운 유형(상기 세포 상의 신규하고도 예상치 못했던 마커의 조합 발현에 의해 입증됨)과, 골 치료법에 특히 적당한 새로운 세포군을 제공한다.

그러므로, BMSC가 본 발명에 의하여 처리되어, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포로 생산되면, 이 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 주로 포함하는 세포의 군집이 생산된다는 것을 당 업자들은 알게 될 것이다. 그러나, 예를 들어, 세포 내 반응의 변동성으로 인하여, 상기 세포군은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포가 아닌 세포를 최소한의 비율로 포함할 수 있다.

그러므로, 관련 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법을 이용하여 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의하여 직접 생산된, 인간의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서, 상기 세포군은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법을 이용하여 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의하여 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 세포군은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 60% 이상 예를 들어, 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상 예를 들어, 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상 예를 들어, 85%, 더욱 바람직하게는 90% 이상 예를 들어, 95% 또는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 세포군은 상기 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포 이외의 세포 류를 하나 이상 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포군은 상기 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포 이외의 세포 류를 50% 미만 예를 들어, 40% 미만, 바람직하게는 30% 미만 예를 들어, 20% 미만, 더욱 바람직하게는 15% 미만 또는 10% 미만 예를 들어, 7% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만 포함할 수 있다.

세포 혼합물 중에 잔류하는 세포의 실제 표현형은 중요할 수 있는데, 그 이유는 세포가 상기 혼합물 내에 잔류함으로 인해서, 적어도 부분적으로나마 조골세포를 작용시키는 물질 예를 들어, 성장 인자 및/또는 분화 인자의 내부 생산에 의존적으로 조골세포가 신속하게 증식 및 분화될 수 있기 때문이다. 이러한 측면에서, 골 발생 및 리모델링 과정은, 최소한 부분적으로나마 골 형성 조골세포 및 골 미세 환경 내에 존재하는 기타 세포 특히, 골 내 복합 상호 소통 네트워크에 관여하는 중요한 일원일 수 있는 내피 세포 사이의 복합 상호 작용에 의존적인 것으로 알려진 것은 흥미로울 수 있다. 인간의 골전구세포와 내피 세포 간 세포의 합동 작용에 관하여는 이미 기술된바 있다[Guillotin외 다수 2004. Cell Physiol Biochem 14(4-6): 325-32]. 뿐만 아니라, 내피 세포가 존재하면, 새로이 형성된 골 조직을 자극할 혈관 또는 모세 혈관이 형성될 수 있다. 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 세포 혼합물 중에 잔류하는 이와 같은 세포들이 내피 세포와 유사할 수 있으며, 특이적인 마커의 관점에서는, 마커 CD133 및/또는 CD34에 양성일 수 있고, 잠재적으로는 마커 CD45에 음성일 수 있으며; 특히 바람직하게는, vWF, VEGF 및 CD133 중 적어도 임의의 하나, 둘 또는 이들 전부에 대해 양성일 수 있고; 임의로는 CD34에 양성일 수도 있다.

그러므로, 추가의 바람직한 구체예에서, 세포군은 내피 세포 또는 전구세포를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 세포군은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와 내피 세포 또는 전구세포를 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법을 이용하여 생산될 수 있는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포 또는 이 방법에 의하여 직접 생산된 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포에 관한 것으로서, 이 세포는 치료용 및/또는 골-관련 질환을 치료하기 위한 의약 제조용으로서 사용된다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 분리된 세포군에 관한 것으로서, 이 세포군은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법을 이용하여 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의해 직접 생산된 것이며, 또한 치료용 및/또는 골-관련 질환을 치료하기 위한 의약 제조용으로서 사용된다.

하나의 측면에서, 본 발명의 방법에 의하여 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의하여 직접 생산된 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 분리된 세포군(여기서, 이 세포군은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법에 의하여 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의하여 직접 생산된 것임)은 골 병변 부위 예를 들어, 수술 또는 골절 부위에 투여될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의해 직접 생산된 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 분리된 세포군(여기서, 이 세포군은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법에 의하여 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의하여 직접 생산된 것임)을, 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 골 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다:

(a) 치료를 필요로 하는 개체로부터 BMSC를 포함하는 생물 시료를 얻는 단계;

(b) 본 발명의 방법에 따라서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 분리된 세포군을 시험관 내 또는 생체 외에서 BMSC로부터 생산하는 단계; 및

(c) 이와 같이 생산된 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포 또는 이와 같은 세포들을 포함하는 상기 세포군을 개체에 투여하는 단계.

바람직한 구체예에서, 상기 (b) 단계는 자가성 인간 혈장 또는 혈청, 더욱 바람직하게는 인간 이외의 동물 성분 예를 들어, 혈청 성분을 포함하지 않는 인간 혈장 또는 혈청을 사용하는 본 발명의 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 조건을 본원에서는, 본 발명의 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 얻기 위한 "순수한 자가성" 조건이라 칭할 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의해 직접 생산된 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 분리된 세포군(여기서, 이 세포군은 전술한 바와 같은 본 발명의 방법에 의하여 생산될 수 있거나 또는 이 방법에 의하여 직접 생산된 것임)을 포함하며, 골 병변 발생 부위에 투여하기에 적당한 약학 조성물에 관한 것이다.

2. 본 발명의 세포 및 세포군

상기 "발명의 개요" 섹션에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의해 생산된 세포 및 세포군에 관하여 더욱 자세히 연구한 결과, 본 발명의 발명자들은 골 치료법에 사용할 경우 유리한 특성이 관찰되는, 신규의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와, 이러한 세포들을 포함하는 특이적 세포군을 정의할 수 있었다.

특히, 하나의 측면에서, 본 발명은, (1) 알칼리성 포스파타제(ALP), 더욱 구체적으로는 골-간-신장 타입의 ALP, 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP) 및 골 시알로단백질(BSP)로부터 선택된 하나 이상의 조골세포 마커와, (2) CD63 및 CD166으로부터 선택된 하나 이상의 줄기 세포/미성숙 골전구세포 마커를 함께 발현하는 것을 특징으로 하는, 바람직하게는 인간 기원인 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(본원에서는 "OOP-1 세포"라 칭함)를 제공한다.

그러므로, 대표적인 구체예 (a)∼(u)에 있어서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1)는 다음의 것들을 함께 발현한다: (a) 적어도 ALP 및 CD63, (b) 적어도 P1NP 및 CD63, (c) 적어도 BSP 및 CD63, (d) 적어도 ALP, P1NP 및 CD63, (e) 적어도 ALP, BSP 및 CD63, (f) 적어도 P1NP, BSP 및 CD63, (g) 적어도 ALP, P1NP, BSP 및 CD63, (h) 적어도 ALP 및 CD166, (i) 적어도 P1NP 및 CD166, j) 적어도 BSP 및 CD166, (k) 적어도 ALP, P1NP 및 CD166, (l) 적어도 ALP, BSP 및 CD166, (m) 적어도 P1NP, BSP 및 CD166, (n) 적어도 ALP, P1NP, BSP 및 CD166, (o) 적어도 ALP, CD63 및 CD166, (p) 적어도 P1NP, CD63 및 CD166, (q) 적어도 BSP, CD63 및 CD166, (r) 적어도 ALP, P1NP, CD63 및 CD166, (s) 적어도 ALP, BSP, CD63 및 CD166, (t) 적어도 P1NP, BSP, CD63 및 CD166, 또는 (u) 적어도 ALP, P1NP, BSP, CD63 및 CD166.

바람직한 구체예 (v)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(u) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 오스테오칼신(OCN)에 대해 음성이다.

추가의 바람직한 구체예 (w)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(v) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD34에 대해 양성이다.

추가의 바람직한 구체예 (x)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(v) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD34에 대해 음성이다.

추가의 바람직한 구체예 (y)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(x) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD90, CD73 및 CD105 중 임의의 하나, 2개 또는 3개 전부에 대해 양성이다.

추가의 바람직한 구체예 (z)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(y) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD45, CD19 및 CD14 중 임의의 하나, 2개 또는 3개 전부에 대해 음성이다.

추가의 바람직한 구체예 (ab)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(z) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD133에 대해 음성이다.

추가의 바람직한 구체예 (ac)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(ab) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는, 골원성 배지에 노출되었을 때, 외부 환경을 무기질화하거나 또는 칼슘-함유 세포 외 기질을 합성하는 능력을 갖게 되는 것이 입증되었다[Jaiswal외 다수 1997. J Cell Biochem 64: 295-312]. 1주 경과 후 무기질화된 양(당 업계에 알려진 바와 같이, 무기질화 배지 중 레드 알리자린(Red Alizarin) 염색된 표면의 총 비율로써 측정함)은 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 55% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 60% 이상 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상, 심지어는 100%일 수도 있다. 유리하게, 이와 같은 세포에 의한 무기질화는, 골원성 배지 중 3∼4주 후에 상기 수준으로 도달할 수 있을 경우, 통상의 BMSC에 의한 무기질화보다 더욱 신속하게 진행된다.

흥미롭게도, 본 발명의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포의 무기질화 배지 중에서 증식 시간(doubling time)은 1∼3일 예를 들어, 약 2일일 수 있다. 이는 상기와 같은 조건에서 통상의 조골세포가 증식하는 시간(약 6∼7일)보다 훨씬 빠르다.

또 다른 바람직한 구체예 (ad)에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-1), 특히, 상기 구체예 (a)∼(ac) 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 실질적으로, 지방 세포 계통의 세포(예를 들어, 지방 세포) 또는 연골 세포 계통의 세포(예를 들어, 연골 세포) 중 임의의 하나로 분화되지 않으며, 바람직하게는 어떠한 것으로도 분화되지 않는다. 이와 같은 세포 계통으로 분화되지 않는다는 사실은 당 업계에 확립된 표준적인 분화 유도 조건[예를 들어, Pittenger외 다수 1999. Science 284: 143-7] 및 검정 방법[예를 들어, 유도시, 지방 세포는 통상적으로 지질의 축적을 나타내는 오일 레드 O로 염색되며; 연골 세포는 통상적으로 알시안 블루(alcian blue) 또는 사프라닌 O(safranin O)로 염색됨]을 이용하여 테스트될 수 있다.

실질적으로 지방 세포 또는 연골 세포로 분화되는 성향이 없다는 의미는, 통상적으로, 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만 예를 들어, 30% 미만, 더욱 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 그리고 더욱 바람직하게는 5% 미만 예를 들어, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만 또는 0.1% 미만의 테스트 세포 예를 들어, 테스트 OOP-1 세포가 각각 테스트되었을 때, 이 테스트 세포가 지방 세포 또는 연골 세포로 분화되는 신호를 나타냄을 의미한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 (1) 알칼리성 포스파타제(ALP), 더욱 구체적으로는 골-간-신장 타입의 ALP, 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP) 및 골 시알로단백질(BSP)로부터 선택된 하나 이상의 조골세포 마커와, (2) 조혈/내피 전구세포 마커 CD34를 함께 발현하는 것을 특징으로 하는, 바람직하게는 인간 기원의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(본원에서는 "OOP-2"라고 칭함)를 제공한다.

그러므로, 대표적인 구체예 (a')∼(g')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2)는 다음의 것들을 함께 발현한다: (a') 적어도 ALP 및 CD34, (b') 적어도 P1NP 및 CD34, (c') 적어도 BSP 및 CD34, (d') 적어도 ALP, P1NP 및 CD34, (e') 적어도 ALP, BSP 및 CD34, (f') 적어도 P1NP, BSP 및 CD34, 또는 (g') 적어도 ALP, P1NP, BSP 및 CD34.

바람직한 구체예 (h')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(g') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 오스테오칼신(OCN)에 대해 음성이다.

추가의 바람직한 구체예 (i')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(g') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD63에 대해 양성이다.

추가의 바람직한 구체예 (j')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(i') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD166에 대해 양성이다.

추가의 바람직한 구체예 (k')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(j') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD90, CD73 및 CD105 중 임의의 하나, 2개 또는 3개 전부에 대해 양성이다.

추가의 바람직한 구체예 (l')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(k') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD45, CD19 및 CD14 중 임의의 하나, 2개 또는 3개 전부에 대해 음성이다.

추가의 바람직한 구체예 (m')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(l') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 CD133에 대해 음성이다.

추가의 바람직한 구체예 (n')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(m') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는, 골원성 배지에 노출되었을 때, 외부 환경을 무기질화하거나 또는 칼슘-함유 세포 외 기질을 합성하는 능력을 갖게 되는 것이 입증되었다[Jaiswal외 다수 1997]. 1주 경과 후 무기질화된 양(당 업계에 알려진 바와 같이, 무기질화 배지 중 레드 알리자린 염색된 표면의 총 비율로써 측정함)은 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 55% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 60% 이상 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상, 심지어는 100%일 수도 있다. 유리하게, 이와 같은 세포에 의한 무기질화는, 골원성 배지 중 3∼4주 후에 상기 수준으로 도달할 수 있을 경우, 통상의 BMSC에 의한 무기질화보다 더욱 신속하게 진행된다.

흥미롭게도, 본 발명의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포의 무기질화 배지 중 증식 시간은 1∼3일 예를 들어, 약 2일일 수 있다. 이는 상기와 같은 조건에서 통상의 조골세포가 증식하는 시간(약 6∼7일)보다 훨씬 빠르다.

또 다른 바람직한 구체예 (o')에서, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포(OOP-2), 특히, 상기 구체예 (a')∼(n') 중 임의의 항목에 정의된 것을 발현하는 세포는 실질적으로, 지방 세포 계통의 세포(예를 들어, 지방 세포) 또는 연골 세포 계통의 세포(예를 들어, 연골 세포) 중 임의의 하나로 분화되지 않으며, 바람직하게는 어떠한 것으로도 분화되지 않는다.

세포가 특정 마커에 대해 양성이라는 의미는, 적당한 측정법을 수행하였을 때, 당 업자가 이 마커에 대해, 적당한 대조구에 비하여 명확한 신호 예를 들어, 항체에 의해 검출 가능하거나 또는 역 전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 검출될 수 있는 신호가 존재한다는 결론을 내리거나 또는 이 신호가 발생한다는 결론을 내리게 될 것이라는 의미이다. 이 방법이 마커를 정량 측정할 수 있을 경우, 양성 세포는 평균적으로 대조군과 상당히 차이가 나는[예를 들어, 대조군 세포에 의해 발생하는 신호보다 1.5배 이상 예를 들어, 2배 이상, 4배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상 높은] 신호를 발생할 수 있다.

당 업계에 공지된 임의의 적당한 면역학적 기술 예를 들어, 유동성 혈구 계측법, 면역-세포 화학 기술 또는 친화성 흡착법, 웨스턴 블럿 분석법, ELISA 등, 또는 마커 mRNA의 양을 측정하는 임의의 적당한 기술 예를 들어, 노던 블럿, 준-정량적 또는 정량적 RT-PCR 등을 이용하여 세포-특이적 마커가 발현되었는지 여부를 확인할 수 있다.

하나의 구체예에서, ALP에 양성인 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포는 FACS에 의해서도 ALP 양성인 것으로 확인될 것이다. 하나의 구체예에서, 상기 ALP 양성 세포는 총 세포 단백질 1㎎ 당 ALP를 300mU 이상, 바람직하게는 총 세포 단백질 1㎎ 당 ALP를 400mU 이상, 더욱 바람직하게는 총 세포 단백질 1㎎ 당 ALP를 450mU 이상 예를 들어, 총 세포 단백질 1㎎ 당 ALP를 500mU 이상, 600mU 이상, 700mU 이상, 800mU 이상, 900mU 이상 또는 1U 이상 함유할 것이다. 예를 들어, ALP 활성은 총 세포 단백질 1㎎ 당 400∼1500mU 예를 들어, 총 세포 단백질 1㎎ 당 450∼1500mU, 500∼1500mU, 550∼1500mU, 또는 600∼1500mU일 수 있으며, 통상적으로는, 총 세포 단백질 1㎎ 당 400∼800mU 예를 들어, 약 500mU, 약 550mU, 약 600mU, 약 650mU, 약 700mU, 약 750mU 또는 약 800mU일 수 있다. 상기 ALP 활성은 상기 정의한 바와 같은 기타 특징들 (a)∼(h) 중 하나 이상의 특징과 함께 제공될 수도 있다.

하나의 구체예에서, P1NP에 양성인 본 발명의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포는 다음과 같은 양만큼, 배양 배지 중 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP)를 생산할 것이다[P1NP는 "ng/배지 1㎖/10⁶개 세포"로서 표현됨]: 0.4 이상, 바람직하게는 0.5 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 이상, 더욱 바람직하게는 1.2 이상, 및 가장 바람직하게는 1.5 이상 예를 들어, 1.6 이상, 1.7 이상, 1.8 이상 또는 2 이상. 예를 들어, P1NP는 0.4∼3.5 예를 들어, 0.5∼3.5, 0.8∼3.5, 1.0∼3.5, 1.2∼3.5, 1.5∼3.5, 1.8∼3.5, 2.0∼3.5, 2.2∼3.5, 2.5∼3.5, 2.8∼3.5 또는 3.0∼3.5 예를 들어, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2.0. 상기 정의한 바와 같은 기타 특징들 (a)∼(h) 중 하나 이상의 특징을 갖는 P1NP가 생산될 수 있다.

기타 구체예에서, BSP에 양성인 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포는 중급∼고급의 골 시알로단백질을 함유할 수 있다. 정량법(예를 들어, 정량적 RT-PCR)에 의해 측정하였을 때, 본 발명의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포에서 발생하는 신호는, 대조군 세포(예를 들어, 임의의 기타 비-골원성 세포)에 의해 발생하는 신호보다 2배 이상, 바람직하게는 4배 이상, 10배 이상, 및 더욱 바람직하게는 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상 또는 50배 이상일 수 있다. 상기 정의한 바와 같은 기타 특징들 (a)∼(h) 중 하나 이상의 특징을 갖는 골 시알로단백질이 생산될 수 있다.

일반적으로, 상기 언급한 CD 및 기타 마커들은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이것의 검출 방법과 검출용 시약은 당 업자가 쉽게 구할 수 있는 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 상기 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 세포군 예를 들어, 상기 OOP-1 및/또는 OOP-2 세포 류를 포함하는 세포군을 포함한다. 바람직하게, 이와 같은 세포군은 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 예를 들어, 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상 예를 들어, 80% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 90% 이상 예를 들어, 95% 이상, 또는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 OOP-1 및/또는 OOP-2 세포 류를 포함할 수 있다.

예를 들어, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포의 총 비율 중 OOP-1 세포가 차지하는 비율은 5% 이상, 또는 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 심지어 100%일 수 있는 반면에, OOP-2가 차지하는 비율은 실질적으로 상기 비율을 차지하는 세포 이외의 나머지 세포가 차지하는 비율일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 세포군은 상기 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포 특히, OOP-1 및/또는 OOP-2 세포 류 이외의 세포 류를 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 더욱 바람직하게는 30% 미만, 더욱 바람직하게는 20% 미만, 그리고 더욱 바람직하게는 10% 미만 예를 들어, 7% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만으로 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 세포군은 내피 세포 또는 이의 전구세포를 포함할 수 있다.

바람직하게, 이와 같은 내피 세포 또는 전구세포는 폰 빌레브란트 인자(vWF), VEGF 및 CD133을 하나 이상 예를 들어, 2개 이상, 또는 3개 즉, 전부 발현할 수 있다.

그러므로, 구체예 (a")∼(g")에서, 상기 내피 세포는 다음과 같은 것을 발현한다: (a") 적어도 vWF, (b") 적어도 VEGF, (c") 적어도 CD133, (d") 적어도 vWF 및 VEGF, (e") 적어도 vWF 및 CD133, (f") 적어도 VEGF 및 CD133, 또는 (g") 적어도 vWF, VEGF 및 CD133.

추가의 구체예 (h")에서, 상기 내피 세포 특히, 구체예 (a")∼(g")의 내피 세포는 추가로 CD34를 발현한다.

그러므로, 하나의 구체예에서, 세포군은 (A) 상기 정의한 바와 같은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포 특히, OOP-1 및/또는 OOP-2 세포를 포함하며, 또한 (B) 상기 정의한 바와 같은 내피 세포 또는 전구세포를 추가로 포함한다.

하나의 구체예에서, 상기 (A)의 골원성 세포와 상기 (B)의 내피 세포는 함께, 50% 이상 예를 들어, 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상 예를 들어, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 96% 이상 예를 들어, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상, 또는 심지어 100%의 세포군을 형성하는 세포를 구성한다.

상기 (A+B)의 비율 중 (A)의 골원성 세포는 바람직하게는 50% 이상 예를 들어, 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상 예를 들어, 80% 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 90% 이상 예를 들어, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상을 구성하며, 바람직한 예에서는 90∼99%, 90∼95% 또는 95∼99%를 구성한다.

결과적으로, 상기 (A+B)의 비율 중 (B)의 내피 세포는 바람직하게는 50% 미만, 예를 들어, 40% 미만, 더욱 바람직하게는 30% 미만 예를 들어, 20% 미만, 및 더욱 바람직하게는 10% 미만 예를 들어, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 심지어 1% 미만을 구성하며, 바람직한 예에서는 1∼10%, 5∼10% 또는 1∼5%를 구성한다.

본원에 개시된 세포 류와 세포군은 본 발명의 분화 방법을 사용하여 유리하게 생산할 수 있음을 알아야 할 것이다. 이러한 방법은 임의로는 특정 세포 류와, 원하는 군집을 형성하는 세포 류들을 임의로 조합한 것을 추가 분리 또는 구별하는 방법(예를 들어, 마커의 프로필을 바탕으로 하는 FACS 이용)에 의해 보강될 수 있다.

그러나, 본 발명은 세포 류와 세포군을 구조적 특징과 기능상의 특징을 바탕으로 하여 정의하고 있으며, 또한 상기 세포의 제조 방법을 어떠한 식으로든 제한하고 있지 않음을 이해해야할 것이다. 예를 들어, 상기 정의한 바와 같은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포는, 세포를 골원성 계통으로 분화시키는 기타 조건을 이용하여 예를 들어, FACS에 의해 본원에 정의된 특정 마커 프로필을 갖는 세포를 선별함으로써 생산될 수 있다. 이와 유사하게, 내피 세포는 또한 예를 들어, 조혈 세포로부터 유래하는 혈관 형성 인자를 첨가한 후, 원하는 마커 프로필을 가지는 세포를 선별함으로써 생산될 수도 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 또한 특정 마커 프로필을 보유하는 특정 군집에 관한 것이기도 하다.

예를 들어, 본 발명은 세포군("POP 1") 즉, 70∼100%, 바람직하게는 80∼100%, 더욱 바람직하게는 90∼100%, 더욱 바람직하게는 95∼100% 예를 들어, 90∼100% 또는 90∼98% 또는 95∼98%가 CD105 양성이고, 바람직하게는 CD45 음성, CD19 음성, CD14 음성, CD90 양성 및 CD73 양성인 세포군에 관한 것이다.

본 발명은 또한 POP1의 특징을 갖는 군집 2("POP 2")에 관한 것으로서, 70∼100%, 바람직하게는 80∼100%, 더욱 바람직하게는 90∼100%, 더욱 바람직하게는 95∼100%의 CD105 양성 세포는 또한 ALP 양성 및/또는 P1NP 양성 및/또는 BSP 양성이기도 하다.

본 발명은 또한 POP1의 특징을 갖는 군집 3("POP 3")에 관한 것으로서, 50∼100% 예를 들어, 60∼100%, 바람직하게는 70∼100% 예를 들어, 80∼100%, 더욱 바람직하게는 90∼100%, 더욱 바람직하게는 95∼100%의 CD105 양성 세포는 또한 CD63 양성 및/또는 CD166 양성이기도 하다.

본 발명은 또한 POP2의 특징을 갖는 군집 4("POP 4")에 관한 것으로서, 50∼100% 예를 들어, 60∼100%, 바람직하게는 70∼100% 예를 들어, 80∼100%, 더욱 바람직하게는 90∼100%, 더욱 바람직하게는 95∼100%의 ALP 양성 및/또는 P1NP 양성 및/또는 BSP 양성 세포는 또한 CD63 양성 및/또는 CD166 양성이기도 하다.

본 발명은 또한 POP1 또는 POP3 중 임의의 것의 특징을 갖는 군집 5("POP 5")에 관한 것으로서, 1∼20%, 바람직하게는 1∼10%, 더욱 바람직하게는 1∼5%의 세포는 vWF 양성 및/또는 VEGF 양성 및/또는 CD133 양성이기도 하다.

본 발명은 또한 약 50∼약 98%, 바람직하게는 약 70∼약 98%, 및 더욱 바람직하게는 약 80∼약 98% 예를 들어, 약 90∼약 98%의 세포가 ALP 양성이고; 약 30∼약 98%, 바람직하게는 약 40∼약 98%, 및 더욱 바람직하게는 약 50∼약 98% 예를 들어, 약 60∼약 98%, 약 70∼98%, 약 80∼98%, 또는 약 90∼98%의 세포가 CD166 양성이며; 약 30∼약 98%, 바람직하게는 약 40∼약 98%, 및 더욱 바람직하게는 약 50∼약 98% 예를 들어, 약 60∼약 98%, 약 70∼98%, 약 80∼98%, 또는 약 90∼98%의 세포가 CD63 양성이고; 약 0.5∼약 10%, 바람직하게는 약 1∼약 10%, 더욱 바람직하게는 약 1∼4%의 세포가 CD133 양성이며; 약 0.5∼약 10%, 바람직하게는 약 1∼10%, 더욱 바람직하게는 약 1∼4%의 세포가 VEGF 양성이고; 약 0.5∼약 10%, 바람직하게는 약 2∼10%, 더욱 바람직하게는 약 5∼10% 예를 들어, 약 8∼10%의 세포가 vWF 양성인 군집 6("POP 6")에 관한 것이다.

관련 측면에서, 본 발명은 골-관련 질환의 치료를 위한 치료법 및/또는 이를 위한 의약의 제조에 사용되는, 상기 정의한 세포 또는 세포군에 관한 것이다.

하나의 측면에서, 상기 정의된 세포 또는 세포군은 골의 병변 부위 예를 들어, 수술 또는 골절 부위에 투여될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은, 치료를 필요로 하는 개체에 상기 정의한 세포 또는 세포군을 투여하는 단계를 포함하는, 골 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 골 질환 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다:

(a) 상기 정의한 세포 또는 세포군을 생산하는 단계; 및

(b) 상기와 같이 생산된 세포 또는 세포군을 개체에 투여하는 단계.

바람직한 구체예에서, 상기 (a) 단계는 자가성 인간 혈장 또는 혈청, 더욱 바람직하게는 인간 이외의 동물 성분 예를 들어, 혈청 성분을 포함하지 않는 자가성 인간 혈장 또는 혈청을 사용하는 본 발명의 방법을 이용할 수 있다. 이와 같은 조건을 본원에서는, 본 발명의 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 생산하기 위한, "순수하게 자가성인" 조건이라고 부를 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 세포 및 세포군을 포함하며, 골 병변 부위에 투여하기 적당한 약학 조성물에 관한 것이다.

3. 본 발명의 세포 및 세포군과 관련된 추가의 측면

본 발명은 상기 섹션 1에 기술된 바와 같은 방법에 의해서 생산되었거나 또는 생산될 수 있는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와, 이 세포들을 포함하는 세포군; 그리고 상기 섹션 2에 기술된 바와 같은 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포와, 이 세포들을 포함하는 세포군에 관한 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 골 병변 부위에 조성물을 투여하는 외과용 기구와, 상기 정의된 본 발명의 세포 또는 세포군을 포함하는 약학 조성물을 추가로 포함하는 장치에 관한 것으로서, 상기 장치는 골 병변 부위에 약학 조성물을 투여하기 적당하다. 예를 들어, 적당한 외과용 기구는 본 발명의 세포를 포함하는 액체 조성물을 골 병변 부위에 주사할 수 있다.

상기 측면에 따르면, 본 발명의 세포 또는 세포군은 수술 또는 골절 부위에서 인간 개체의 골에 도입될 수 있다. 조골세포를 골에 도입하면 골의 골절과 골-관련 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 상기 조골세포는 분화된 조골세포가 도입될 수 있는 개체의 BMSC로부터 생산된다. 그러나, BMSC는 개체와 동일하거나 상이한 종의 유기체로부터 분리될 수도 있다. 개체는 골 조직을 가지는 임의의 유기체일 수 있다. 바람직하게, 상기 개체는 포유동물이며, 가장 바람직하게, 상기 개체는 인간이다.

본 발명의 BMSC 세포 또는 세포 또는 세포군은 목적으로 하는 핵산으로 안정하게 또는 일시적으로 형질 전환된 후, 개체의 골 병변 부위 예를 들어, 수술 또는 골절 부위에 도입될 수 있다. 목적으로 하는 핵산 서열로서는 조골세포의 성장, 분화 및/또는 무기질화를 증진하는 유전자 산물을 암호화하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, BMP-4용 발현 시스템은 난치성 골절 또는 골 다공증을 치료하기 위해, 안정적이거나 일시적인 방식으로 BMSC에 도입될 수 있다. BMSC와 조골세포를 형질 전환하는 방법으로서는, 당 업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 골 병변 부위 예를 들어, 수술 또는 골절 부위에 있는 골에 조골세포를 도입하는 방법이 있다.

본 발명의 세포 또는 세포군은 단독으로 또는 골의 상처 및 손상부를 수선하는데 유용한 추가의 성분과 함께 도입될 수 있다. 이와 같은 조성물은 골 형성 단백질, 수산화인회석/삼인산칼슘 입자(HA/TCP), 젤라틴, 폴리-락트산, 폴리-락트산-글리콜산, 히알루론산, 키토산, 폴리-L-리신 및 콜라겐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 지방 기질 세포로부터 분화된 조골세포는 탈염된 골 기질(Demineralized Bone Matrix; DBM) 또는 기타 기질과 함께 혼합되어, 골원성(그 자체로서 골을 형성하는)이고 골 유도성인 복합 물질을 생산할 수 있다. 동종 이계 DBM과 자가성 골수 세포를 사용하는 유사한 방법을 수행하면, 좋은 결과가 얻어진다[Connolly외 다수 1995. Clin Orthop 313: 8-18].

본 발명의 세포 또는 세포군이 단독으로 도입되거나 추가의 성분들과 함게 도입될 때, 조성물(예를 들어, 약학 조성물)은 이와 같은 세포 예를 들어, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 자생시키는 추가의 성분을 함유할 수 있다. 특히, 세포 또는 세포군은 인간 투여용으로서 충분히 멸균된 조건 하에서 제조된 등장성 부형제를 포함하는 약학 조성물의 형태로서 공급될 수 있다. 의료 제형화에 관한 일반적인 원리에 관하여는 문헌[Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000]을 참조하시오. 세포성 부형제(cellular excipient)와 이 조성물의 임의의 부가 성분으로서 무엇을 선택하느냐는 투여에 사용되는 장치에 따라서 달라질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 적당한 pH 예를 들어, 중성 pH에 가까운 pH로 맞추어 주는 적당한 완충 시스템(예를 들어, 인산염 또는 탄산염 완충 시스템)을 포함할 수 있으며, 세포 또는 세포군에 대해 등-삼투성인(iso-osmotic) 조건 즉, 삼투압에 의한 스트레스를 막아주는 조건을 유지하는데 충분한 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 목적으로 사용되기 적당한 용액은 당 업계에 공지된 바와 같은 인산염-완충 염수(PBS)일 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 조성물은 세포의 자생력을 증가시킬 수 있는 담체 단백질 예를 들어, 알부민을 포함할 수 있다. 바람직하게, 인간 이외의 동물성 물질을 확실히 배제하기 위해, 상기 알부민은 인간으로부터 유래된 것(예를 들어, 인간의 물질로부터 분리된 것 또는 재조합적으로 생산된 것)을 사용할 수 있다. 일반적으로, 알부민의 적당한 농도에 관하여는 공지되어 있다.

세포 또는 세포군은 이것들이 목적으로 하는 조직 부위에 이식 또는 이동될 수 있고, 또한 기능이 상실된 부위를 재구성하거나 재생할 수 있는 방식으로 투여될 수 있다. 상기 조성물의 투여 방법은 치료될 근골격 부위에 따라서 달라질 것이다. 예를 들어, 골 형성 과정은 조직을 리모델링하고 파열 조각을 끼워넣는 수술 방법, 또는 보철 장치 예를 들어, 고관절 치환 장치(hip replacement)에 의하여 촉진될 수 있다. 다른 환경에서, 침습 수술까지는 할 필요가 없을 것이며, 상기 조성물은 주사에 의해 투여되거나 또는 (척주 치료시) 인도형 내시경(guidable endoscope)을 사용하여 투여될 수 있다.

원한다면, 세포 제제는 상보적 생물 활성 인자 예를 들어, 골 형성 단백질 예를 들어, BMP-2 또는 BMP-4, 또는 기타 임의의 성장 인자를 추가로 포함할 수 있거나, 또는 이것과 함께 투여될 수 있다. 기타 유효한 추가의 성분으로서는 골 재생을 도와주는데 적당한 칼슘 또는 인산염의 무기 공급원을 포함한다[WO 00/07639]. 원한다면, 세포 제제는 조직의 재생을 개선하기 위해 제공되는 담체 매트릭스 또는 물질에 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 물질은 과립형 세라믹 또는 생중합체 예를 들어, 젤라틴, 콜라겐, 오스테오넥틴, 피브리노겐 또는 오스테오칼신일 수 있다. 다공성 매트릭스는 표준적인 기술에 따라서 합성될 수 있다[예를 들어, Mikos외 다수, Biomaterials 14:323, 1993; Mikos외 다수, Polymer 35:1068, 1994; Cook외 다수, J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997].

하나의 구체예에서, 상기 정의된 바와 같은 세포 제제는 액체 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 세포 또는 세포군은 임플란트용으로서 적당한 기재에 운반될 수 있으며/있거나 이 기재상에 배양될 수 있다. 세포가 도포되어 배양될 수 있는 기재는 금속 예를 들어, 티타늄, 코발트/크롬 합금 또는 스테인레스 강철, 생체 활성 표면 예를 들어, 인산칼슘, 중합체 표면 예를 들어, 폴리에틸렌 등일 수 있다. 비록 선호도는 떨어지지만, 규질 재료 예를 들어, 유리 세라믹도 기재로서 사용될 수 있다. 가장 바람직한 기재로서는 금속 예를 들어, 티타늄과 인산칼슘이 있으나, 여기서, 상기 인산칼슘은 상기 기재의 필수 성분은 아니다. 상기 기재는 다공성 또는 비 다공성일 수 있다.

예를 들어, 배양 접시 내에서 증식 또는 분화되는 세포는 3차원 고체 지지체 상에 운반될 수 있으며, 그 결과, 필요에 따라서, 본 발명의 액체 영양 배지 중에서 고체 지지체를 항온 처리함으로써 상기 세포를 증식시킬 수 있으며/있거나 분화 과정을 계속 진행시킬 수 있다. 상기 세포는, 예를 들어, 상기 세포를 함유하는 현탁액으로 상기 지지체를 포화(impregnating)시킴으로써, 3차원 고체 지지체 상으로 운반될 수 있다. 이러한 방식으로 얻어진 포화 지지체는 인간 개체에 이식될 수 있다. 이와 같이 포화된 지지체는 또한, 이 지지체를 액체 배양 배지 중에 침지시킨 다음, 마지막으로 이식함으로써, 다시 배양될 수도 있다.

3차원 고체 지지체는 생체 혼화성이므로, 인간의 체 내에 이식될 수 있어야 한다. 그러므로, 상기 지지체는 임의의 적당한 형태 예를 들어, 원통형, 구형, 평판형 또는 임의의 형태의 일부로서 존재할 수 있다. 생체 혼화성인 3차원 고체 지지체 재료로서는 특히, 탄산칼슘이 적당할 수 있으며, 특히 아라고나이트는 산호 껍질(coral skeleton), 알루미나, 지르코니아, 삼인산칼슘 및/또는 수산화인회석을 주성분으로 하는 다공성 세라믹, 탄산칼슘을 수산화인회석으로 운반할 수 있도록 만드는 열수 교환에 의해 얻어지는 산호 껍질 유사형, 또는 기타 인회석-규회석 유리 세라믹, 생체 활성 유리 세라믹 예를 들어, 바이오글래스(Bioglass)™ 유리의 형태를 가질 수 있다.

실시예 1: BMSC 를 조골세포로 분화시키는 방법

인간 개체의 장골 능으로부터 30㎖의 골수를 분리하고, 동일한 개체로부터 100㎖의 혈액을 채취하였다.

혈장은 당 업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 혈액으로부터 제조된다. 더욱 구체적으로, 항-응고제인 헤파린이 보충된 혈액을 2000rpm으로 원심 분리하여(20℃, 15분), 세포 성분을 제거하여 혈장을 회수한 다음, 이를 56℃에서 50분 동안 가열하여 불활성화시키고, 이를 3000rpm에서 15분 동안 원심 분리시켜 투명하게 만들어서, 0.22㎛의 멸균 필터를 통해 여과하여, 분취액으로 나누어서 -80℃에 보관하였다.

피콜(Ficoll) 구배 원심 분리법, 특히 피콜 파크 플러스(Ficoll Paque Plus)(Amersham Pharmacia) 및 원심 분리법(1400rpm, 450g, 30분, 20℃)을 통해서, 골수 시료로부터 단핵 세포를 분리하였다.

이 세포를 회수하여, PBS 중에서 세척하고, 이를 IMDM(임상용) 무혈청 배지(Canbrex), 상기와 같이 분리된 20% 자가 혈장 및 1ng/㎖ FGF-b(Peproteh)를 함 유하는 배지가 담긴 배양 플라스크(Corning)에 10×10⁶ 세포/175㎠ 배양 플라스크의 밀도로 넣었다. 배양한지 4일 경과시, 상기 배지를 전체적으로 바꾸어주어, 이 배지 중 비-부착성 물질을 제거하였다. 7일 및 11일 경과시, 배지의 절반을 바꾸었다. 12, 13 또는 14일 경과시, 상기 세포를 PBS로 세척하고, EDTA를 사용하여 탈착시켰으며, 동일한 배지 중에서 추가로 배양하여 계대 배양하였다(1×10⁶ 세포/175㎠ 배양 플라스크). 배양 후 21일 및 24일 경과시, 상기 세포를 전술한 바와 같이 회수하였다. 이식용으로서, 상기 세포를 5% 인간 알부민을 함유하는 멸균 PBS 중에 재현탁하였다. 상기 세포 중 일부를 표현형의 특성 규명을 위해 사용하였다(실시예 2).

실시예 2: 실시예 1의 방법에 의해 생산된 조골세포 및 조골세포-유사 세포의 표현형에 대한 특성 규명

세포 치료 유닛에서 배양한 지 21일 경과한 후, 세포를 환자 주사용으로서 그리고 특성 규명용으로서 회수하였다. 20×10⁶개의 세포를 주사용으로 준비하였다. 나머지 세포는 표현형의 특성 규명에 사용하였다.

1. RT - PCR 에 의한 골 시알로단백질의 준-정량적 측정 방법

1∼2×10⁶개의 세포를 RNA 추출 완충액(RLT 완충액, RNeasy kit, Qiagen) 중에서 동결 건조한 후, 처리할 때까지 -80℃에 보관하였다. RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 용해물로부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA 1㎍을 무작위 6량체 및 역 전 사 효소를 사용하여 역 전사시켰다. 골 시알로단백질(BSP)과 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) β-액틴에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여, 첫 번째 사슬인 cDNA 생성물을 역 전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)시켰다. 상기 RT-PCR 생성물을 2%의 아가로스 겔에서 전기 영동하여 분석하였으며, 이를 골 시알로단백질(BSP)의 준-정량적 측정법을 수행하기 위해 가시화하였다[0 = 발현되지 않음; + = 약하게 발현됨; ++ = 중간 정도로 발현됨; +++ = 다량으로 발현됨].

결과: 골 시알로단백질 발현(n = 6). BSP의 발현은 평균적으로 ++임[범위: +∼++].

배양 배지 중 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드( P1NP )의 총 투여량

P1NP의 투여를 위하여, 21일 경과시, 2㎖의 배양 배지를 -20℃에 보관하였다. P1NP의 수준은 전기 화학 발광 면역 검정법[Roche, Elecsys, 1010/2010 modular analytics]에 의해 측정된다.

결과: P1NP = 21∼90(범위) ng/배양 배지 1㎖(n = 6)

알칼리성 포스파타제 활성( APA )의 측정

5×10⁵∼10⁶개의 세포를 알칼리성 포스파타제 활성을 측정하는데 사용하였다.

세포를 2㎖의 PBS로 세척하고, 이를 증류수에서 초음파 처리하였다. 원심 분리시킨 후, 상청액을 알칼리성 포스파타제 활성과 단백질 함량을 측정하는데 사용하였다.

시약은 다음과 같이 제조하였다. 디에탄올아민 완충액의 제조: 1M, pH 9.8의 스톡 용액(D 8885- Sigma-Aldrich)을 물로 10배 희석시키고, HCl을 사용하여 이의 pH를 9.8로 맞추었다. 반응 용액의 제조: 1M, pH 9.8의 디에탄올아민 및 0,5 mM MgCl₂(M 8266 Sigma-Aldrich) 용액. pNPP 기질의 제조: 10mM의 4-니트로페닐포스페이트 이나트륨 염의 6수화물(N 4645, Sigma-Aldrich)의 반응 용액 중 용액.

APA는 다음과 같은 반응을 촉진하였다:

p-니트로페닐포스페이트 + H₂O → p-니트로페놀 + 포스페이트

상기 기질 용액을 37℃에서 항온 처리하였다: 20㎕의 상청액 + 100㎕의 기질을 분광계 튜브(37℃)에 넣은 후, 2분 경과시 405㎚에서 판독한 다음, 2분 더 항온 처리하고 다시 판독하였으며, 마지막으로 2분 더 판독하였다. Δ흡광도(흡광도 차)의 평균을 계산하고, 이를 Δ흡광도/분으로 표시하였다.

계산: 1U = 분당 p-니트로페놀 1μM을 생산하는데 필요한 효소의 양. p-니트로페놀의 몰 흡광도의 계수 = 18450, mmol = 18.45, μM = 0.01845. 20㎕의 시료: APA(U/L 또는 mU/㎖) = ΔA ×1020/0.01845×20.

단백질의 양

쿠마시 용액을 다음과 같이 준비하였다: 100㎎의 쿠마쉬 블루(Merck 1.15444) + 50㎖의 95% 에탄올 + 100㎖의 H₃PO₄(85%) + 1ℓ의 H₂O를 균질화한 후 여과함. 소 알부민 1㎎/㎖를 함유하는 용액은 다음과 같이 준비하였다: 10∼50㎕의 BSA(1㎎/㎖) + 1ℓ의 H₂O.

시료는 다음과 같이 제조하였다: 200㎕의 상청액 + 800㎕의 H₂O 또는 500㎕의 상청액 + 500㎕의 H₂O. 2㎖의 쿠마시 용액을 첨가한 후 와류시킴. 5분 경과 후, 595㎚에서의 OD를 측정함. 그 결과를 단백질(㎎)/㎖로 표시함.

각각의 시료에 대해서, APA 수준은 단백질의 총 농도(mU/㎎ 단백질)로서 나타내었다.

결과: 알칼리성 포스파타제(n = 10). APA:693 ± 126mU/㎎ 단백질(평균 ± SEM); 범위 = 274∼1472mU/㎎ 단백질.

무기질화 효능

배양한 지 14일 경과시, 6-웰 평판 하나에 세포를 접종하여 무기질화 능력에 관한 연구를 하였다.

21일 경과시, 이 평판 내에 있는 배지를 MEM + 15% FCS + 50㎍/㎖의 아스코르브산 + 10^-8M의 덱사메타손 + 10mM의 β-글리세로포스페이트(EMEM, BioWhittaker BE12-136F; FCS In Vitrogen; 아스코르브산, Sigma A-4403; 덱사메타손, Sigma D-4902; β-글리세로포스페이트, Sigma G-9891)로 바꾸었다.

28일 경과시, 알리자린 염색에 의해 무기질화 결과를 가시화하였다: 세포를 PBS 중 4% 포름알데히드 중에 고정하고, PBS로 헹군 다음, 알리자린 레드 2%(pH4.1)로 항온 처리하여 염색하였다.

무기질화는 총 세포 접시 표면(n = 10)의 비율로서 평가하였다.

환자의 체 내 상기 측정 결과에 대한 구체예

환자	골수 (㎖)	Ficoll 배양후 MNC× 106	배양액 중 MNC× 106	1차 배양시 수집량 (제7일) ×106	2차 배양시 수집량 (제21일) ×106	주사된 세포 (×106)	APA (mU/㎎ 단백질)	BSP	P1NP (ng/㎖)	무기질화 (전체 표면의 %)
1번	27	44.3	44.3	17.1	70.8	20	640	++	43	>65%
2번	32	60	50	12	28	20	773	++	82	>65%
3번	31	15.6	15.6	11.5	122	20	274	+	26	>65%

추가의 실험에서, 1주 경과시 무기질화 효능은 75% 이상이었다(도 2 참조).

마커의 프로파일링

마커는 전술한 바와 같이 발현시켰으며/발현시켰거나, 그 결과는 항체 염색 및 세포의 유동성 혈구 계측법을 통해 확인하였다. 이 실험을 통하여 수집된 세포 내에서 다음과 같이 마커가 발현되었다.

총 군집의 >95%(또는 >99%)는 CD45-, CD19-, CD14-, CD90+, CD73+, CD105+였다. 모든 세포 중 90∼95%는 골전구세포 또는 조골세포의 표현형을 나타내는 것으로 특성 규명되었다. 이들 전부는 ALP+였으며, 이들 중 50∼100%는 CD166+였고, 65∼100%는 CD63+였다. 이와 같은 세포들은 또한 P1NP 및 BSP에 양성이었다. 이들 세포 중 35∼65%는 CD34+였다[전체 군집 중, 80∼98%는 ALP+ 세포였으며, 40∼98%는 CD166+ 세포였고, 60∼98%는 CD63+ 세포였음].

뿐만 아니라, 전체 군집은 내피 세포 또는 이의 전구세포를 전체 세포의 약 5∼10%로 포함하였다. 이들 세포 중, 50∼75%는 vWF(폰 빌레브란트 인자)에 대해 양성이었으며, 25∼50%는 VEGF+였고, 25∼50%는 CD133+였다. 약 50%의 세포는 CD133과 VEGF를 함께 발현하였다. 이들 세포는 전부 CD34+였다[전체 군집에 있어 서, 1∼4%는 CD133 양성 세포였으며, 1∼4%는 VEGF 양성 세포였고, 약 5∼8%는 vWF 양성 세포였음].

추가의 마커 프로파일링 결과, 본 발명자들은 본 명세서에 상세히 기술되어 있는 본 발명의 세포 류를 정의할 수 있었다.

실시예 3: 실시예 2의 세포를 환자에게 이식함

하나의 예에서, 문헌[Gangji외 다수 2005, Expert Opin Biol Ther 5(4): 437-42; J Bone Joint Surg Am 87 Suppl 1 :106-12]에 개시된 방법에 따라서, 대퇴 두부에 2기 골 괴사가 진행중인 환자의 고관절 괴사 부위에 조골세포를 이식 처리하였다.

기준선에 있을 때, 환자의 통증 스코어(가시적 유사 스코어(Visual Analogous Score) - VAS)는 (전체 스코어 100에서) 38mm였으며, 고관절 활동 스코어(hip functional score; WOMAC)는 (전체 스코어 96에서) 43이었고, 레스퀘슨(Lesquesne) 스코어 (전체 스코어 24에서) 11이었다.

조골세포를 이식 처리한 환자의 경우, 3∼6개월 후 관절 통증은 눈에 띄게 호전되었다: VAS 스코어는 3개월과 6개월일 때 0으로 떨어졌으며(도 1의 A)), WOMAC도 3개월과 6개월일 때 0으로 떨어졌고(도 1의 B)), 또한 레스퀘슨 지수는 3개월과 6개월일 때 기준선에서의 11에서 0으로 떨어졌다.

다른 구체예에서, 동일한 방법에 따라서, 대퇴 두부에 2기 골 괴사가 진행중인 환자의 고관절 괴사 부위에 조골세포를 이식 처리하였다. 기준선에 있을 때, 환자의 가시적 유사 통증 스코어는 6mm이었으며, 레스퀘슨 활동 스코어는 3이었다.

조골세포를 이식 처리한 환자의 경우, 3∼6개월 후 관절 통증은 눈에 띄게 호전되었다: VAS 스코어는 3개월과 6개월일 때 0으로 떨어졌으며, 레스퀘슨 지수도 3개월과 6개월일 때 0으로 떨어졌다. 뿐만 아니라, 조골세포가 이식되지 않은 다른 고관절 부분은 골 괴사의 마지막 단계까지 진행되어, 결국에는 전체적으로 고관절 치환을 수행하여야 했다.

Claims (27)

1. 시험관 내 또는 생체 외에서 인간의 골수 줄기 세포로부터, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 얻거나, 또는 상기 세포들을 포함하는 세포군을 얻는 방법으로서, 상기 골수 줄기 세포를 인간 혈청 또는 혈장 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-b, FGF-2) 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 인간 혈장 또는 혈청은 골수 줄기 세포에 대해 자가성인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 골수 줄기 세포는 인간 이외의 동물로부터 얻어지는 혈청 성분과 같은 임의의 물질과 접촉하지 않는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 골수 줄기 세포는 인간 개체의 생물 시료, 바람직하게는 인간 개체의 골수 시료로부터 얻어지는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 인간 개체는 골 관련 질환 위험이 있거나 또는 골 관련 질환을 가지는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   (a) BMSC를 포함하는 인간 개체의 생물 시료, 바람직하게는 골수 시료로부터 세포를 회수하는 단계;

   (b) 임의로, 예를 들어 적당한 밀도 구배 원심 분리법 또는 기타 방법을 사용하여, 상기 (a) 단계에서 회수된 세포로부터 단일 핵 세포를 분리하는 단계;

   (c) 상기 (a) 단계 또는 바람직하게는 (b) 단계의 세포를, 인간 혈장 또는 혈청 및 FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체를 포함하는 배지에 첨가하고, 세포가 예를 들어 배양 용기의 기재 표면, 예컨대 유리 또는 플라스틱 표면에 부착되도록 하는 것과 같이 세포-배지 혼합물을 배양하는 단계;

   (d) 비-부착성 물질을 제거하고, 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 유사 세포, 또는 이 세포들을 포함하는 세포군을 얻도록 하는 것과 같이 상기 (c) 단계에서 정의되는 바와 같은 배지 중에서 부착성 세포를 추가로 배양하는 단계

   를 포함하는 방법.
7. 제6항에 있어서, (e) 배양 12∼16일, 바람직하게는 약 14일에 상기 (d) 단계에서 얻는 세포 또는 세포군을 수집하는 단계를 포함하는 방법.
8. 제6항에 있어서, (e) 배양 12∼16일, 바람직하게는 14일에 상기 (d) 단계에서 얻는 세포 또는 세포군을 계대 배양하고, 추가로 계대 배양된 세포 또는 세포군을 배양하고, 배양 18∼24일, 바람직하게는 약 21일에 상기 세포 또는 세포군을 수 집하는 단계를 포함하는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 FGF-2 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 유도체는 10 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 5 ng/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5 ng/㎖의 농도로 포함되는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의하여 얻을 수 있는, 인간의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포들을 포함하는 분리된 세포군.
11. 제10항에 있어서, 인간의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 포함하는 분리된 세포군.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 내피-유사 세포를 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만 포함하는 분리된 세포군.
13. (1) 알칼리성 포스파타제(ALP), 더욱 구체적으로는 골-간-신장 타입의 ALP, 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP) 및 골 시알로단백질(BSP)로부터 선택된 하나 이상의 조골세포 마커와, (2) CD63 및 CD166으로부터 선택된 하나 이 상의 줄기 세포/미성숙 골전구세포 마커를 함께 발현하는 것을 특징으로 하는, 인간의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포.
14. 제13항에 있어서, 세포가 오스테오칼신(OCN)에 대해 음성임; 세포가 CD34에 대해 양성임; 세포가 CD90, CD73 및 CD105 중 임의의 1개, 2개 또는 3개 전부에 대해 양성임; 세포가 CD45, CD19 및 CD14 중 임의의 1개, 2개 또는 3개 전부에 대해 음성임; 세포가 CD133에 대해 음성임 중 임의의 하나, 그 이상 또는 전부가 적용되는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 골원성 배지에 노출될 때, 세포가 외부 환경을 무기질화시킬 수 있거나, 칼슘-함유 세포외 기질을 합성할 수 있음; 세포가 실질적으로 지방 세포 계통 또는 연골 세포 계통의 세포 중 어느 하나로 분화되지 않거나, 바람직하게는 어느 것으로도 분화되지 않음 중 어느 하나, 또는 둘다가 적용되는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포.
16. (1) 알칼리성 포스파타제(ALP), 더욱 구체적으로 골-간-신장 타입의 ALP, 프로콜라겐 타입 1 아미노-말단 프로펩티드(P1NP) 및 골 시알로단백질(BSP)로부터 선택된 하나 이상의 조골세포 마커와, (2) 조혈/내피 전구세포 마커 CD34를 함께 발현하는 것을 특징으로 하는, 인간의 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포.
17. 제16항에 있어서, 세포가 오스테오칼신(OCN)에 대해 음성임; 세포가 CD63에 대해 양성임; 세포가 CD166에 대해 양성임; 세포가 CD90, CD73 및 CD105 중 임의의 1개, 2개 또는 3개 전부에 대해 양성임; 세포가 CD45, CD19 및 CD14 중 임의의 1개, 2개 또는 3개 전부에 대해 음성임; 세포가 CD133에 대해 음성임 중 임의의 하나, 그 이상 또는 전부가 적용되는 골전구세포 또는 조골세포 표현형 세포.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 골원성 배지에 노출될 때, 세포가 외부 환경을 무기질화시킬 수 있거나, 칼슘-함유 세포외 기질을 합성할 수 있음; 세포가 실질적으로 지방 세포 계통 또는 연골 세포 계통의 세포 중 어느 하나로 분화되지 않거나, 바람직하게는 어느 것으로도 분화되지 않음 중 어느 하나, 또는 둘다가 적용되는 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포.
19. 제13항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 의한 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 및/또는 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 의한 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하고, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의, 제13항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 의한 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포, 및/또는 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 의한 골전구세포, 조골세포 또는 조골세포 표현형 세포를 포함하는 세포군.
20. 제19항에 있어서, 내피 세포 또는 이의 전구세포를 추가로 포함하는 세포군.
21. 제20항에 있어서, 상기 내피 세포 또는 이의 전구세포는 폰 빌레브란트 인자(vWF), VEGF 및 CD133 중 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 모두를 발현하고, 바람직하게는 CD34 양성인 세포군.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 내피 세포 또는 이의 전구세포를 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만 또는 2% 미만 포함하는 세포군.
23. 치료법에 사용하기 위한, 제10항 또는 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 정의된 세포, 또는 제10항 내지 제12항 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 정의된 세포군.
24. 골 관련 질환 치료용 의약의 제조에 있어서의, 제10항 또는 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 정의된 세포, 또는 제10항 내지 제12항 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 정의된 세포군의 용도.
25. 제24항에 있어서, 제10항 또는 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 정의된 세포, 또는 제10항 내지 제12항 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 하나의 항 에 정의된 세포군은 골 병변 부위에 투여되는 용도.
26. 제10항 또는 제13항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 정의된 세포, 또는 제10항 내지 제12항 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 정의된 세포군을 포함하며, 상기 세포 또는 분리된 세포군을 골 병변 부위에 투여하기 적당한 약학 조성물.
27. 골 병변 부위에 조성물을 투여하기 위한 외과용 기구를 포함하고 제26항에 정의된 약학 조성물을 추가로 포함하는 장치(arrangement)로서, 상기 장치는 골 병변 부위에 약학 조성물을 투여하도록 되어 있는 장치.

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