JP2008109866A - 培地添加剤、この培地添加剤を含む培地、及びこの培地を用いた細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトの細胞を培養する培地に使用される培地添加剤であって、ヒト由来の血漿と、細胞増殖因子と、を含有した。
【選択図】なし
Description
このため、近年では、患者へ移植することを目的とする細胞培養においては、ウシ胎児血清等の動物由来の血清を用いるよりも、ヒト由来、望ましくは患者本人の血清を用いる方が、安全性が高く、好ましいといわれている。
特許文献1には、血漿にカルシウム化合物等を添加して、凝固させたタンパク質性の血液凝固因子を除去した液体を、細胞培養に用いる方法が開示されている。特許文献1に開示されている方法によれば、血漿にカルシウム化合物等を添加することにより、血清に相当する液性成分が得られる。
また、細胞培養用の培地に、所定量の細胞増殖因子を直接添加する方法も開示されている(特許文献2参照)。
しかしながら、特許文献1に開示されている方法により得られた血清は、細胞増殖因子が含有されていないため、細胞の培養効率は低く、再生医療の現場では実用的ではない。
また、特許文献2に開示されている方法は、培地に細胞増殖因子のみを添加しており、細胞接着因子は含まれないため、特許文献1に開示されている血清と同様に、実用性に欠ける。
しかしながら、血漿は多血小板血漿と同様に、抗凝固剤を添加し、遠心分離して得られる以外に、成分献血において、血球成分をそのまま患者に戻しながら血漿のみを採取することができる。
そのため、成分献血により採取された血漿を用いれば、循環血液量が少ない患者からでも培地添加剤を製造することが可能となる。
また、細胞増殖因子を含有することによって、高い培養効率を付与することが可能となる。従って、安全性が高く、かつ、高い培養効率を有する培地添加剤を提供することが可能となる。
本発明に係る培地添加剤は、ヒト由来の血漿と、細胞増殖因子と、を含む。
本発明における「血漿」とは、血液から血球及び血小板等の細胞成分を分離操作により除去した液体成分であって、抗凝固剤として、クエン酸ナトリウム、ヘパリン等を用いた常法の分離操作によって血液から分離された血漿分画をいう。
また、本発明において、使用する血漿は、上記の分離操作によって細胞成分が完全に除去されているものが好ましいが、分離操作により若干の血小板等の細胞成分が残存している血漿であっても使用可能な血漿に含まれるものとする。
具体的には、日本赤十字社において全血献血又は成分献血された血液由来のもの(新鮮凍結血漿等)が挙げられる。血漿は、採取後の血漿をすぐに用いることも可能であるが、凍結血漿も使用可能である。なお、凍結血漿を使用する場合には、使用時に凍結血漿を解凍(例えば、36℃で急速解凍)してから使用することができる。
なお、採血には通常の血液バックの他に、例えば採血管のように、血液を無菌的に採取することが可能な容器を用いてもよい。
上記細胞増殖因子は、培養対象の細胞の増殖が促進されるように、培養対象の細胞によって適宜選択される。中でも、塩基性線維芽細胞増殖因子を用いることが好ましい。これらは単独又は2種以上を組み合わせて用いることが可能である。
なお、細胞増殖因子の製造方法としては、遺伝子組換技術による製造方法や、動物の体液(血液を含む)より、精製して、回収する方法等が挙げられる。ここで、遺伝子組換技術による製造方法とは、目的蛋白質をコードしている遺伝子を発現し得るベクターを大腸菌等のホスト細胞に導入してホスト細胞を形質転換し、これを増殖させながら、ホスト細胞に目的蛋白質を産生させ、目的蛋白質を回収する方法をいう。
本発明に係る培地は、上記の培地添加剤を含有する。
培地添加剤が添加される前の基礎培地としては、通常用いられている市販の基礎培地を用いることが好ましい。
基礎培地は、培養する細胞種によって異なり、どのようなものであってもよい。例えば、通常動物細胞の培養に用いられるイスコフ培地、RPMI培地、ダルベッコMEM培地等の血清を含まない培地を用いることができる。また、基礎培地は、細胞の増殖及び維持に有効であることが知られている血清以外の公知又は新規の物質、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質、コレステロール、ピルビン酸、グルココルチコイド、DNA及びRNA合成用ヌクレオシド、増殖因子(例えば、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、及びインシュリン)、並びに細胞外マトリックス(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニン)等を添加したものであってもよい。
また、本発明に係る培地の製造は、上記の培地添加剤を調製した後に、基礎培地と混合しても、基礎培地と血漿と細胞増殖因子とを一度に調整してもよい。
培養対象となるヒト細胞は、間葉系細胞を含む中胚葉組織細胞、内胚葉組織細胞、外胚葉組織細胞あるいは受精卵からこれらの細胞へ分化する過程に含まれるあらゆる細胞、及び胚性幹細胞等の幹細胞のいずれでもよい。
培養されたヒト細胞は、皮膚、骨、軟骨、筋肉、腱、脂肪組織、毛乳頭、歯髄等に用いられる。
まず、3名のドナーにより、ヘパリン存在下で10mlの採血を行い、直ちに遠心分離(2,330gで10分間)を行った。遠心分離後、透明な液性成分である上層のみを、バフィーコートを含まないよう留意しながら吸引し、別の容器に移し替え、実験に供するまで−80℃にて保存した。
次いで、10vol%ヒト血漿に、細胞増殖因子として、bFGF(Pepro Tech EC社製)をそれぞれ10ng/ml、100ng/mlとなるように添加し、それぞれ培地添加剤(A)、培地添加剤(B)として調製した。
(1)10vol%ヒト血漿(比較例1)
(2)10vol%培地添加剤(A):(最終bFGF濃度:1ng/mlbFGF)(実施例1)
(3)10vol%培地添加剤(B):(最終bFGF濃度:10ng/mlbFGF)(実施例2)
(4)1ng/mlbFGF(比較例2)
(5)10ng/mlbFGF(比較例3)
(6)添加物なし(比較例4)
(7)10vol%ヒト血清(比較例5)
(8)10vol%ウシ胎児血清(比較例6)
市販のヒト間葉系幹細胞(Cambrex社)を、10%のウシ胎児血清を含むα−MEM培地にてコンフルエントに達するまで培養した。
コンフルエントに達した細胞を、トリプシン/EDTA溶液(Gibco社製)により剥離させ、遠心して細胞を回収した。ウシ胎児血清の成分を除くために、血清を含まないα−MEMで懸濁させ、遠心して回収する工程を、更に2回行った後に、血清を含まないα−MEMに懸濁させた。血球計算盤(サンリード硝子社製)を用いて、懸濁液中の細胞数を測定した。
培養開始後7日目に、培地を抜き取り、PBS(−)で洗浄した後に、1ウェルあたり100μlのトリプシン/EDTA溶液(Gibco社)を添加し、37℃で10分間インキュベートして細胞を剥離し、アイソトン液9.9mlに懸濁してコールターカウンタ(ベックマンコールター社製)により細胞数を測定した。
また図2より、実施例2の培地で培養した場合は、比較例5の血清を用いた場合と比べ、若干劣るものの、血清を使用した場合と同程度の増殖が確認された。
以上の結果より、本発明に係る培地添加剤又は培地が、ヒト細胞の培養に有効であることが確認された。更には本発明に係る培地添加剤は、血清を用いた場合と同程度若しくはそれ以上の高い培養効率を付与することが可能であることが示された。
Claims (5)
- ヒトの細胞を培養する培地に使用される培地添加剤であって、ヒト由来の血漿と、細胞増殖因子と、を含有する培地添加剤。
- 前記細胞増殖因子は、血小板以外の細胞由来の増殖因子である請求項1に記載の培地添加剤。
- 前記細胞増殖因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する請求項1又は2に記載の培地添加剤。
- 請求項1から3いずれかに記載の培地添加剤を含む培地。
- 請求項4に記載の培地を用いた細胞の培養方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014521629A (ja) * | 2011-07-29 | 2014-08-28 | アルデコア、エドアルド アニトウア | 血小板由来の増殖因子含有組成物のためのプロセス |
JP2020501522A (ja) * | 2016-11-11 | 2020-01-23 | ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | ヒト血漿様培地 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05502385A (ja) * | 1990-10-05 | 1993-04-28 | システミックス,インコーポレイティド | 巨核球及び血小板の増殖、生成及び組成 |
JP2001149069A (ja) * | 1999-11-26 | 2001-06-05 | Inst Of Physical & Chemical Res | ナチュラルキラー細胞の増殖方法 |
JP2002515756A (ja) * | 1997-01-31 | 2002-05-28 | ヘモソル インク. | 選択されたリンパ球の生産方法 |
JP2003052365A (ja) * | 2001-08-20 | 2003-02-25 | Japan Science & Technology Corp | 哺乳動物からの間葉系幹細胞の分離及びその利用方法 |
WO2005012090A2 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-10 | Tilia International, Inc. | Removable drip trays and bag clamps for vacuum packaging appliances |
JP2006515173A (ja) * | 2002-12-16 | 2006-05-25 | テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド | 支持細胞非含有、異種非含有のヒト胚性幹細胞の調製方法およびこれらを使用して調製された幹細胞培養物 |
WO2006054448A1 (ja) * | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Jms Co., Ltd. | 細胞培養用ヒト血清 |
JP2009512450A (ja) * | 2005-10-21 | 2009-03-26 | インターナショナル ステム セル コーポレイション | ヒト胚性幹細胞を作製するためのヒト卵母細胞の単為生殖的活性化 |
JP2009526534A (ja) * | 2006-02-16 | 2009-07-23 | ユニヴェルシテ リブル ドゥ ブリュッセル | 骨髄幹細胞(bmsc)を骨分化させる方法およびその使用 |
-
2006
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Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05502385A (ja) * | 1990-10-05 | 1993-04-28 | システミックス,インコーポレイティド | 巨核球及び血小板の増殖、生成及び組成 |
JP2002515756A (ja) * | 1997-01-31 | 2002-05-28 | ヘモソル インク. | 選択されたリンパ球の生産方法 |
JP2001149069A (ja) * | 1999-11-26 | 2001-06-05 | Inst Of Physical & Chemical Res | ナチュラルキラー細胞の増殖方法 |
JP2003052365A (ja) * | 2001-08-20 | 2003-02-25 | Japan Science & Technology Corp | 哺乳動物からの間葉系幹細胞の分離及びその利用方法 |
JP2006515173A (ja) * | 2002-12-16 | 2006-05-25 | テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド | 支持細胞非含有、異種非含有のヒト胚性幹細胞の調製方法およびこれらを使用して調製された幹細胞培養物 |
WO2005012090A2 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-10 | Tilia International, Inc. | Removable drip trays and bag clamps for vacuum packaging appliances |
WO2006054448A1 (ja) * | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Jms Co., Ltd. | 細胞培養用ヒト血清 |
JP2009512450A (ja) * | 2005-10-21 | 2009-03-26 | インターナショナル ステム セル コーポレイション | ヒト胚性幹細胞を作製するためのヒト卵母細胞の単為生殖的活性化 |
JP2009526534A (ja) * | 2006-02-16 | 2009-07-23 | ユニヴェルシテ リブル ドゥ ブリュッセル | 骨髄幹細胞(bmsc)を骨分化させる方法およびその使用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"聖マリアンナ医科大学雑誌", 2006.8.1, VOL.34, PP.277-284, JPN6012012798, ISSN: 0002171824 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014521629A (ja) * | 2011-07-29 | 2014-08-28 | アルデコア、エドアルド アニトウア | 血小板由来の増殖因子含有組成物のためのプロセス |
JP2020501522A (ja) * | 2016-11-11 | 2020-01-23 | ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | ヒト血漿様培地 |
JP7406990B2 (ja) | 2016-11-11 | 2023-12-28 | ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | ヒト血漿様培地 |
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