JP2002515756A

JP2002515756A - 選択されたリンパ球の生産方法

Info

Publication number: JP2002515756A
Application number: JP53240298A
Authority: JP
Inventors: ベル，デビッド，エヌ．; ワング，トルーマン
Original assignee: ヘモソルインク．
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2002-05-28
Also published as: AU738538B2; WO1998033891A1; AU5744798A; US6194207B1; EP0966523A1; CA2278847A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、リンパ球の選択された集団の生成方法を目的とする。生成されたリンパ球は、よく知られている確立された手順を使用して単離および精製され安定したリンパ球の供給源として得ることができる。これは、所望のリンパ球の適切なタイプまたは最適なレベルを得るために当業者が改変し得る。そのような細胞集団が得られることによって、患者において枯渇、不完全または喪失しているリンパ球集団が完全に再構成されるだけでなく、複数回または周期的な治療をできる十分な細胞をもてるという融通性が得られる。標的細胞集団を増殖させるための本発明の方法は、いくつかのタイプのリンパ球の選択的な増殖に広く適用することができ、表現型ならびに抗原特異性を維持することが明らかにされている。

Description

【発明の詳細な説明】選択されたリンパ球の生産方法発明の背景１．発明の分野本発明は、ならし培地を用いて細胞の混合集団を培養することによるリンパ造血系細胞の選択的に生産する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法によって選択的に得られた細胞およびこのような細胞の利用方法に関する。２．背景の説明ヒトの免疫系は、外来生物による感染を防ぐためにいくつかの方法を使用している。例えば、皮膚は、侵入に対する物理的な障壁を提供し、一方、血液は、外来病原体を認識して破壊する機能を有する分化した白血球を含有する。好中球およびマクロファージは、感染部位に引き寄せられる白血球であり、そこで外来生物を飲み込んで消化し（食食する）、典型的な免疫応答を開始する。血液はまた、様々な感染病原体に対する特異的で永続的な免疫を提供するリンパ球を含有する。Ｂ細胞は、血流内の外来病原体に結合してこれを不活性化する抗体を分泌するリンパ球である。一方、Ｔ細胞は、そのような外来病原体が感染している宿主細胞を認識してこれを殺傷するリンパ球である。Ｔ細胞はまた、ガン状態への悪性変換に関係していることが多い正常な細胞タンパク質の変化を認識する。ナチュラルキラー細胞と呼ばれる他のリンパ球は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊するために分化している。このように、リンパ球は、特異的な免疫応答を媒介し、ガンの予防において重要な役割を果たすと思われる。集合的に免疫系のすべての細胞は協調した様式で働き、そして外来病原体と闘うために、強力な非特異的および特異性の高い武器の多様なレパートリーを身体に提供する。例えば、マクロファージは、Ｔ細胞を活性化し、特異的な外来標的に対するＴ細胞の応答を指揮する因子を分泌し、またＢ細胞が産生した抗体で覆われた細菌を貪食する。分化したＴ細胞はまた、免疫応答が、主として、抗体の産生によって支配されるか、あるいはキラーＴ細胞の生成によって支配されるかを決定する因子を分泌する。免疫系のすべての細胞が協調的に作用することによって、感染病原体の進入に対する迅速な応答、ならびに同じ感染病原体への再度の暴露に対する永続的な免疫が得られる。リンパ球は骨髄幹細胞から産生される短寿命の細胞であり、骨髄幹細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成し、さらにはすべての他の血液細胞を生成する。幹細胞の重要な特徴は前駆細胞の一定した供給源を提供するその能力である。前駆細胞とは大きな増殖能を有するが、１つまたは複数の血液細胞系列の細胞を生成するように分化しているものである。免疫系の細胞は、まとめてリンパ系細胞と呼ばれ、共通のリンパ系前駆細胞を祖先とすると考えられる。リンパ系前駆細胞は、究極的には、分化または成熟化の過程で１つのタイプのリンパ系細胞の生成に限定される。リンパ系前駆細胞の大きな増殖能は、休止状態で分裂していない多数の成熟リンパ系細胞の生成を可能にする。Ｂ細胞は骨髄中で成熟化し、骨髄から血液中に連続的に放出され、機能的なＢ細胞の数が一定に維持される。未成熟Ｔ細胞は骨髄から胸腺に移動し、そこで成熟化して、末梢Ｔ細胞プールを維持するために放出される。実際には、大部分のＴ細胞は胸腺内で死滅する。胸腺において、未成熟Ｔ細胞は、外来抗原のみを認識し、自己由来抗原は認識しないように教育されるプロセスにおいて正および負の選択を受ける。成熟ＮＫ細胞は骨髄中で生成し、血流中に放出される。刺激されると、処女（ナイーブ）Ｂリンパ球およびＴリンパ球は、速やかに増殖して、迅速な免疫応答を媒介するエフェクター細胞、および免疫応答を媒介するために要求されるまでの長い年月の間生存し得る記憶細胞の両方に分化する。ＮＫ細胞はある種の増殖因子に曝露されることによって活性化し得るが、ＮＫ細胞はまた、ウイルス感染細胞および悪性細胞に対する自発的な自然免疫を提供する。Ｂ細胞は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の高分子（これらはすべて、まとめて、抗原と呼ばれる）において見出される非常に多数の化学的な決定基を認識し得る抗体を分泌する。抗体は、処女Ｂ細胞表面または記憶Ｂ細胞表面に抗原レセプターとして存在し得る。抗原レセプターは、合致する抗原が結合したときに、Ｂ細胞の増殖および誘導性抗原に特異的な可溶性抗体を大量に分泌する短寿命の形質細胞への分化を刺激する。抗体の結合は、毒性物質の除去および不活性化、宿主細胞内へのウイルス進入の防止、またはマクロファージによる感染病原体の食作用の増進を含む様々な効果を有し得る。Ｂ細胞による血液または他の体液への抗体放出は、体液性免疫応答の主要な源である。Ｂ細胞はまた、マクロファージと同様に、Ｔ細胞によって認識され得る様式で外来抗原を提示する機能を有する。Ｂ細胞はまた、他の免疫学的に重要な細胞の機能および活性化に影響する重要な増殖因子を放出する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプター（ＴｃＲ）と呼ばれる表面レセプターを通して抗原決定基を認識する。表面に結合した免疫グロブリンと機能において類似しているが、Ｔ細胞レセプターは分泌されない。Ｔ細胞は、感染した宿主細胞との直接的な接触を通じて、主要な免疫機能を取り次ぐ。感染細胞は、それらが感染しているＴ細胞へのシグナル伝達の手段として、外来タンパク質の抗原性フラグメントをその表面に示す（提示する）ことによって協力する。Ｔ細胞は宿主細胞のすべてにおいて提示される抗原を認識するが、Ｔ細胞がこれらの抗原を認識するためには、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージなどの分化した抗原提示細胞によってまず活性化される。抗原提示細胞はまた、Ｔ細胞の完全な活性化に必要な補助的刺激分子をその表面に発現する。マクロファージとともに、Ｔ細胞は、細胞性に免疫応答の主要な成員であり、そして可溶性因子の放出によって免疫応答の実際上すべての面において必要とされている。Ｔ細胞レセプターに加えて、Ｔ細胞は、２つの主要なＴ細胞に特異的な表面マーカーのＣＤ４およびＣＤ８によって特徴づけられる。これらのマーカーは、機能的に別個のＴ細胞集団を規定する。ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞と呼ばれ、抗原提示細胞との相互作用を通して活性化され、ＣＤ８Ｔ細胞（細胞傷害性またはキラ−Ｔ細胞（ＣＴＬ）としても知られている）を主に活性化する機能を有する。ＣＴＬは、感染した宿主細胞の破壊に係わる主要なエフェクターＴ細胞であり、事実上すべての細胞で見出される特定の分子に結合した外来抗原だけを認識する。従って、身体の感染細胞の大部分は、ＣＴＬの標的となりうる。標的細胞は、標的細胞の迅速な溶解を引き起こすＣＴＬから放出される因子によって、あるいは細胞死を導く高度に秩序立った事象のプログラムが誘導されて殺傷される。ＣＴＬの活性化に加えて、ＣＤ４ヘルパー細胞はまた、可溶性因子の放出によりＢ細胞の活性化を調節する。Ｂ細胞と同様に、大部分の休止処女Ｔ細胞は、活性化されて増殖し、エフェクター細胞および記憶細胞の両方を生成しない限り、短寿命である。Ｔヘルパー細胞は、特異抗原による活性化の後に分泌される可溶性増殖因子のタイプに従って分類される。Ｔヘルパー１（Ｔ_H１）細胞は、主要なＴ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ γ）ならびにインターロイキン１２を分泌する。増殖因子のこのような組合せは、主に細胞性免疫応答を導く細胞傷害性Ｔ細胞を選択的に活性化する。Ｔヘルパー２（Ｔ_H２）細胞は、Ｂ細胞を刺激して、主に体液性の（抗体に基づく）免疫応答を促進するＩＬ−４およびＩＬ−５を主に分泌する。ＩＦＮγなどのＴ_H１増殖因子はＴ_H２免疫応答を阻止し、一方、ＩＬ−４などのＴ_H２増殖因子はＴ_H １応答を阻止する。Ｔ_H１／Ｔ_H２の選択方法は知られていないが、外来病原体に対する免疫応答のタイプの大部分は、Ｔ_H１またはＴ_H２のいずれかのヘルパーＴ細胞の活性化によって明らかにされている。ナチュラルキラー細胞は、その細胞傷害性作用を向けるのに、標的細胞における外来抗原または腫瘍由来抗原の提示を必要としない。ＮＫ細胞は一定範囲のウイルス感染細胞および腫瘍細胞に対する自発的な細胞傷害性を有するがこれはＩＬ−２に曝された後には拡大される。それ故、そのような細胞は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と呼ばれる。ＮＫ細胞はまた、抗体で覆われた細胞と結合し、抗体依存性の細胞媒介細胞傷害性と呼ばれるある型の細胞殺傷に係わる。ＮＫ細胞を刺激する細胞マーカーの性質についてはほとんど明らかにされていない。しかし、ＮＫ細胞傷害性は、大部分の正常な宿主細胞が有するマーカーによって特異的に阻害される。ＮＫ細胞はまた、広範囲の免疫学的活性および造血活性を有する多数の増殖因子を産生する。ウイルス、細菌、寄生虫、および身体内に進入する他の微生物などの外来病原体は細胞外に留まり得るが、多くは特定の組織または細胞のみに感染する。例えば、ウイルスは、その生活環を完結させるために特定の宿主細胞に依存している。ウイルス疾患の臨床的徴候を導くのは、その複製およびその子孫の放出の間におけるウイルスによる宿主細胞の破壊である。ウイルスに感染した細胞は防御機構を有し、それによってウイルスに特異的なタンパク質のフラグメント（ペプチド）がその表面に提示される。提示はＴ細胞を活性化して、ＣＤ８⁺細胞傷害性Ｔ細胞によるウイルス感染宿主細胞の破壊も含め免疫応答を高めるように設計されている。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、分化した抗原提示細胞によって活性化され、ウイルスに特異的なＣＴＬの完全な活性化に必須である。感染病原体に対する事前の暴露およびそれからの回復によって、長い年月の間持続することができ、同じウイルスに再度曝されたときに迅速かつ効果的な免疫応答を開始し得る記憶Ｔ細胞が得られる。患者のＴ細胞をｅｘｖｉｖｏ操作することによる活性化された記憶Ｔ細胞の作製または抗原に特異的なＴ細胞の作製は、効果的なワクチンが未開発であるまたは既存の薬物が効果的でないことがわかっているある種の感染性疾患の治療において非常に有望である。そのようなｅｘｖｉｖｏ操作は、感染疾患を治療する手段として、免疫防御能の低下した易感染性の個体または患者で内因性の記憶−免疫応答を高めることができる。ガンは、広く制御されない細胞増殖を特徴とする疾患である。正常な細胞の増殖および分化は、細胞の数を一定に維持して身体の個々の要求が満たされるように高度に調節されたプロセスである。多くの細胞は、組織または器官の機能的な一部として長期間存在し、そこではそれらは最終分化して、それ以上細胞分裂することができない。他の細胞（血液系、免疫系および胃腸系の細胞など）は、一般に寿命が短く、新しい細胞の一定した供給が必要である。増殖速度が速いそのような組織は、細胞の悪性変換およびガン状態に導き得る変化の蓄積を最も受けやすい。このような場合、細胞増殖の正常な制御は調節異常になり、細胞の過剰生成に至る。白血病は白血球のガンであり、そのような細胞の過剰生成によってこの疾患の随伴的な臨床的徴候が現れる。固形組織における細胞増殖は、良性または悪性であり得る腫瘍を形成する。最も攻撃的な形態の固形腫瘍である悪性腫瘍は、身体の他の部分への悪性細胞の流出または移動を特徴とし、これがガンの急速な転移を容易にし、最終的には患者の予後をより悪くする。ガン細胞が獲得した増殖および転移するその能力に係わる特性は、免疫系の細胞によって認識される変化した表面マーカーまたは新規の表面マーカーの発現と関連していることが多い。従って、細胞傷害性Ｔ細胞は、特定の腫瘍マーカー（抗原）によって活性化され、その結果ウイルス感染細胞の場合と同じように腫瘍細胞を殺傷し得る。ナチュラルキラー細胞はまた、強力な腫瘍殺傷能を有する。これは、特定の腫瘍由来マーカーの発現を必要としないようである。免疫監視機構システムによるｉｎｖｉｖｏでの腫瘍細胞の破壊におけるＴ細胞およびＮＫ細胞の両方の役割は完全に確立されてはいないが、ｉｎｖｉｖｏ研究により、腫瘍細胞を認識して破壊するその能力が明らかにされている。従って、免疫系をｅｘｖｉｖｏで活性化し、特異的な腫瘍抗原を認識するように免疫系を方向付ける能力は、従来の治療が効果的でないことが明らかにされたガンの治療における潜在的な治療利益を有する。自己免疫疾患は、自分自身の組織および細胞に対して向けられた不適切な免疫応答によって生じる。このような疾患は、慢性的な炎症および組織破壊および疾患徴候に至る免疫応答を媒介する活性化リンパ球による正常な組織の浸潤を含む様々な症状によって特徴づけられる。自己免疫疾患の例として、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病が挙げられる。いくつかの型の自己免疫疾患は、自己反応性Ｔ細胞により媒介される。自己反応性Ｔ細胞は、宿主細胞において通常発現している内因性抗原を、ウイルス抗原の認識と類似する様式で認識する。宿主組織に対する細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の基となる正確な機構は複雑であり、あまり理解されていないが、一般に、このような病原性の自己反応性Ｔ細胞を特異的に抑制する治療は、自己免疫疾患の治療において有益である。細胞療法は、疾患の治療として、患者から細胞を取り出すこと、体外（ｅｘｖｉｖｏ）でその細胞を改変すること、およびこの改変された細胞を再注入することを含む。養子免疫療法は、免疫系の細胞を取り出すことおよびこの細胞を活性化すること、培養して増やすことまたは再注入したときに特定の抗原を認識してこれを殺傷するようにこれらの細胞を方向付けることを含む。ヒトＴ細胞の操作は、細胞数を拡大すること、選択された増殖因子によって細胞を活性化すること、および感染細胞または腫瘍細胞に対する特異的な外来抗原または腫瘍抗原を細胞がそれぞれ認識するようにすることを含む。少数存在する記憶Ｔ細胞、あるいは一部の患者においてウイルス抗原または腫瘍抗原に対してあまり応答しない記憶Ｔ細胞をｅｘｖｉｖｏで増やし、活性化して、より強力な殺傷能を誘導することができる。あるいは、患者のＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞をｅｘｖｉｖｏで増やして、ｉｎｖｉｔｒｏ抗原提示システムを使用することによって、特異的なウイルス抗原または腫瘍抗原を発現する細胞を殺傷するようにすることができる。ＨＩＶ感染の結果として、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の選択的な減少のために免疫系が不十分なＡＩＤＳなどの疾患において、ｅｘｖｉｖｏで得られる特定のＣＤ８⁺ ＣＴＬは、ウイルスのさらなる広がりを防ぐ手段として、ウイルス感染細胞に対するより強力な殺傷能を有し得る。ＣＤ８⁺ＣＴＬは、ＡＩＤＳおよび他の感染疾患または悪性腫瘍の治療において使用することができる。一方、ＣＤ４⁺細胞はまた、ＡＩＤＳ患者における効果的な免疫系の再構築に適用することができる。あるいは、ある種自己免疫性を治療し、臓器移植を容易にするための手段として、特定のＴ細胞の活性を低下させることもできる。白血球は、前駆細胞と成熟細胞とを区別するための基礎となる様々な表面分子マーカーを発現している。分化クラスター（ＣＤ）の番号付けシステムが、様々なタイプの白血球を同定するための共通手段を提供するために考案されている。白血球表面上の表面マーカーは抗原性であり、モノクローナル抗体により結合することができる。合意によって、ＣＤ番号が、類似した特異性を有する抗体が結合するそのような表面マーカーに割り当てられている。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ２表面マーカーを介してヒツジの赤血球と結合するその能力によってＢ細胞と区別されることが見出された。従って、ＣＤ２はＴ細胞に対するマーカーである。当然、Ｔ細胞を区別する主要な表面マーカーはＴ細胞抗原レセプター（ＴｃＲ）であり、これは別のＴ細胞特異的表面マーカーＣＤ３との複合体を形成している。大部分のＴ細胞は、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖からなるＴ細胞レセプター（ＴｃＲαβ）を発現している。一方、小さな部分集団は、ガンマ（γ ）鎖およびデルタ（δ）鎖からなるＴｃＲ（ＴｃＲγδ）を発現している。特に、Ｔ細胞に関して、大多数のＴ細胞は、ＣＤ４⁺細胞またはＣＤ８⁺細胞のいずれか（すなわち、ＣＤ４マーカーまたはＣＤ８マーカーのいずれかを発現するＴ細胞）に分類することができる。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞としても知られており、Ｂ細胞および他のＴ細胞の免疫応答に正または負の影響を与えるように機能する。ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞またはキラーＴ細胞と呼ばれている。サプレッサーＴ細胞はＣＤ４⁺Ｔ細胞によって活性化され、これもまたＣＤ８⁺である。細胞傷害性機能を呈する他のリンパ球には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞（これらの細胞はＣＤ４^-でＣＤ８^-である）、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＴｃＲαβおよびＣＤ８を同時に発現するサイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）、ならびにＣＤ４^-／ＣＤ８^-またはＣＤ４^-／ＣＤ８⁺のいずれかであるＴｃＲγδ⁺細胞が含まれる。発明の概要本発明は、現在の戦略および計画に関連する問題および不都合な点を解決し、選択されたリンパ球群を生成し、使用するための新しい組成物および方法を提供する。本発明の１つの実施形態は、所望のリンパ球群を迅速に生成するための方法を対象とする。この方法を使用して、大きなリンパ球群を、非常に少量の細胞または組織のサンプルから容易かつ安価で迅速に生成することができる。リンパ球群は、培養で維持され、増やされ、その後の使用のために貯蔵することができ、分化するように刺激され、または活性化され、あるいは必要とされる特定の機能または標的に向けられる。本明細書中に記載される手順は、短くて直接的であり、任意の供給源に由来するリンパ球に適用することができる。本発明によって得られるリンパ球は、移植治療において有用であり、そのような細胞を得るための現行の手順よりも優れた多数の利点を提供する。本発明は、ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球またはＮＫリンパ球を大量に含む集団を得るために、ともに現在必要とされるドナー細胞のプールを多数使用したり、大規模な分離手順を用いる必要はない。さらに、本発明の方法は、自己移植治療または同種移植治療において使用するために、多数のＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球、ならびにＮＫ細胞、ＣＩＫ細胞、ＴｃＲαβＴ細胞およびＴｃＲγδＴ細胞の生成を可能にする。本発明の別の実施形態は、所望のリンパ球群を多く含む画分を含有するリンパ球増殖培養物を生成するための方法を対象とする。本発明の方法により、細胞培養物は、標的リンパ球集団の増殖に好都合な刺激因子および阻害因子のバランスが取れているならし培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ：ＣＭ）の存在下で培養することによってリンパ球画分が多くなる。この標的リンパ球集団は、ＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ＬＡＫ細胞、ＣＩＫ細胞、ＴＩＬ細胞（腫瘍浸潤細胞）、ＴｃＲαβおよびＴｃＲγδ、それらのサブ群、前駆細胞および分化の中間段階の細胞、最終的に分化した細胞またはそれらの混合物を含む。従って、標的細胞は移植治療において有用である。本発明の別の実施形態は、上記の方法によって得られた細胞を対象とする。細胞は、培養で維持または増やされ、その後の使用のために単離および精製され、あるいは精製の前またはその後のいずれかで凍結保存することができる。細胞は１つの個体群から増やされるため、均質性は容易に決定することができる。本発明の別の実施形態は、所望の細胞集団の増殖に好都合な刺激作用および阻害作用のバランスが取れている細胞因子の混合物を含むＣＭ組成物を対象とする。ＣＭ組成物は、マイトジェンを含むことが好ましい誘導剤で細胞集団を処理することによって得られる。有用なマイトジェンには、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）やフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの植物レクチン、メゼレイン（Ｍｚｎ）またはテトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）のようなＴ細胞マイトジェン、またはＴ細胞抗体（ＣＤ３抗原またはＣＤ２８抗原に対する抗体など）が含まれる。ＣＭは、異なる標的細胞集団の増殖に好都合な特定の因子を取り除いたり、あるいは添加することによって選択的に改変することができる。あるいは、ＣＭは、様々な異なる出発細胞集団から調製することができ、それによってそれぞれが１つまたは複数の異なる標的細胞集団に特異的なＣＭ−１、ＣＭ −２などを作製することができる。本発明の別の実施形態は、（例えば、血液、他の体液または組織から得られる）初代哺乳動物リンパ球をＣＭとともにｉｎｖｉｔｒｏで培養する移植治療の方法を対象とする。得られる増幅されたリンパ球はその後の使用のために維持または凍結保存されるか、あるいは移植治療または他の治療的使用もしくは予防的使用のために患者に直ちに導入することができる。標的リンパ球を使用して、関連する疾患を治療する手段として、不完全な免疫系を補ったり、損傷した免疫系を修復したり、過剰反応し得る免疫系を抑制することができる。あるいは、標的細胞を用いて、有用な細胞産生物（サイトカイン類、リンホカイン類およびケモカイン類、ならびに他の刺激性または阻害性の細胞因子など）を産生することができる。本発明の別の実施形態は、遺伝子治療の方法を対象とする。標的リンパ球を、本発明の方法によって作製し、ある遺伝子配列を直接導入するか、または遺伝子配列を含有する組換えウイルスベクターを用いて感染させる。目的の遺伝子配列を正しく発現する細胞を、選択し、単離して、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖させる。次いで、目的の遺伝子を発現する増幅細胞を患者に投与する。遺伝子治療に有用な遺伝子には、患者においてその発現産物が存在していないかまたは不完全な遺伝子、ならびに発現することによって患者に好都合な効果をもたらす遺伝子および他の遺伝子配列が含まれる。本発明の他の実施形態および利点は、部分的には以下の説明において示され、部分的にはこの説明から明らかであり、あるいは本発明の実施から理解することができる。図面の説明Ｆｉｇ．１は、ＣＭで増やした臍帯血液細胞の累積細胞発生量（ａ）、ＣＭ／Ｐで増やした臍帯血液（ｂ）、ＣＭで増やした成人血液細胞（ｃ）、ＣＭ／Ｐで増やした成人血液細胞（ｄ）、および最適平均（ｅ）。Ｆｉｇ．２は、ＣｏｎＡ、Ｍｚｎ、ＣＭ、およびＰの各種組み合わせにより処理された細胞培養物。Ｆｉｇ．３は、ＣＭ、ＣＭ（Ｃ）、ＣＭ（Ｍ）、およびＩＬ−２の各種組み合わせにより処理された細胞培養物。Ｆｉｇ．４は、ＣＭ／Ｐと一緒に培養した時のＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺臍帯血液細胞の平均パーセント。Ｆｉｇ．５は、ＣＭと一緒に培養した時のＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺ 臍帯血液細胞の平均パーセント。Ｆｉｇ．６は、ＣＭおよびCＭ／Ｐによる臍帯血液T細胞サブセットの増大。Ｆｉｇ．７は、（ａ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした、ＣＤ４が多くなった臍帯Ｔ細胞、（ｂ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした、ＣＤ８が多くなった臍帯Ｔ細胞、（ｃ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした未分画臍帯ＬＤＭＮＣ、および（ｄ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした、ＣＤ４およびＣＤ８が多くなった臍帯Ｔ細胞。Ｆｉｇ．８は、ＣＭおよびCＭ／Ｐによる成人末梢血液Ｔ細胞サブセットの増大。Ｆｉｇ．９は、（ａ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした、ＣＤ４が多くなった成人Ｔ細胞、（ｂ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした、ＣＤ８が多くなった成人Ｔ細胞、（ｃ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした未分画成人ＬＤＭＮＣ、および（ｄ）ＣＭおよびＣＭ／Ｐで増やした、ＣＤ４およびＣＤ８が多くなった成人Ｔ細胞。Ｆｉｇ．１０は、ＣＭ／Ｐで増やした臍帯血液リンパ球におけるＴｃＲαβおよびＴｃＲγδの発現。Ｆｉｇ．１１は、ＣＭによるＣＤ４⁺Ｔ細胞のポリクローン性増大。Ｆｉｇ．１２は、ＣＭ／ＰによるＣＤ８⁺Ｔ細胞のポリクローン性増大。Ｆｉｇ．１３は、（ａ）ＣＭ／Ｐおよび（ｂ）ＩＬ−２／Ｐで増やした臍帯血液リンパ球におけるＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現。Ｆｉｇ．１４は、ＣＭ／Ｐで増やした臍帯血液リンパ球における（ａ）ＨＬＡ −ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲの発現、および（ｂ）ＩＬ−２／Ｐで増やした臍帯血液リンパ球におけるＨＬＡ−ＤＲの発現。Ｆｉｇ．１５は、ＣＭ／Ｐで増やした臍帯血液リンパ球におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の発現。Ｆｉｇ．１６は、ＣＭ／Ｐで増やした臍帯血液リンパ球におけるＣＤ５６およびＣＤ１６の（ａ）発現および（ｂ）共発現。Ｆｉｇ．１７は、ＣＭ／Ｐで増やした臍帯血液リンパ球におけるＣＤ３、ＣＤ８、ＴｃＲαβ、ＣＤ５６、およびＣＤ１６の発現。Ｆｉｇ．１８は、ＣＭとともに培養した時のＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺、ＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺、およびＣＤ４^-／ＣＤ８^-成人血液細胞の平均パーセント。Ｆｉｇ．１９は、ＣＭ／Ｐとともに培養した時のＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺、ＣＤ４⁺ ／ＣＤ８⁺、およびＣＤ４^-／ＣＤ８^-成人血液細胞の平均パーセント。Ｆｉｇ．２０は、（ａ）Ｍ−ＬＮＣおよび（ｂ）ＣＭで増やした後のＭ−ＬＮＣの抗原特異性。発明の説明本明細書中に例示され、そして広範に記載されているように、本発明は、リンパ球の生成方法、このような方法に使用される組成物、得られる生成リンパ球、および生成リンパ球の使用方法を対象とする。現在のリンパ球治療の方法では、ｉｎｖｉｔｒｏの増殖で１つの未濃縮リンパ球細胞群からＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球の精製集団を作製することはできない。患者由来の所望のリンパ球細胞群を増やすことができないことがしばしばあり、患者の細胞に必要な治療的ｉｎｖｉｔｒｏ操作をすることが妨げられている。ところが多くのリンパ球が、体液の微量サンプルから、比較的安価で、非常に短い時間で生成できることが発見された。このようなリンパ球は、一旦得られると、よく知られている確立された手順を使用して、単離および精製することができる。この利点は、従来の分離−濃縮技術に通常かかる時間および費用を省き、安定したリンパ球の供給源を提供するがこれは所望のリンパ球の適する細胞タイプまたは最適なレベルを得るために当業者が改変し得るものである。そのような細胞集団が利用できると、患者において涸渇した、不完全である、または失われているリンパ球を完全に再構成できるだけでなく、患者を複数回または周期的に治療するのに十分な細胞を持つという弾力性も提供する。本発明の方法は、いくつかのタイプのリンパ球の選択的な増殖に広く適用することができる。本発明の方法の実施において、細胞サンプル中に存在する１つまたは複数のリンパ球を優先的に増やして、特定のリンパ球画分を富化することができる。増やせる標的リンパ球集団は、任意の哺乳動物リンパ球集団から、好ましくは初代哺乳動物リンパ球集団から、より好ましくは初代ヒトリンパ球集団から選択することができる。例えば、出発細胞集団は、患者の血液（例えば、末梢血）、骨髄、リンパまたはリンパ節、あるいはリンパ造血系の他の細胞または組織のサンプルであることができる（これらの細胞および細胞集団の組合せも含まれる）。従って、増殖させ富化することができる出発集団中の細胞集団には、例えば、幹細胞、前駆(progenltor)細胞、プレカーサー(precursor)細胞および完全に分化した細胞（すなわち、分化のすべての段階の細胞）、ならびにこれらの細胞の組合せが含まれる。例えば、いくつかの細胞サンプルにおいて非常に低いレベルで存在しているリンパ球を選択的に増殖させて、増殖集団中における割合を増大させることができる。選択的な増殖および富化を行っている間に、非リンパ球は、死滅して除かれるか、または増えられないままである（すなわち、増殖培養物中の数または割合あるいはその両方が低下し得る）。さらに、この増殖は従来の手順では典型的に必要とされる間質細胞またはアクセサリーフィーダー細胞の使用を必要としない。本発明の方法の重要な臨床的利点の１つは、選択されたリンパ球画分を含有する細胞集団を簡便に、そして多くの場合、分離ステップまたは精製ステップを必要とすることなく、あるいは別の高価なサイトカイン類を添加することなく生成することができることである。この方法は、例えば、１つの未濃縮血液または他の組織サンプルからＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞およびＣＤ５６⁺ナチュラルキラー細胞を選択的かつ連続的に生成することを可能にし、次いでこれらは、培養時間または条件を適切に調節することによって必要とされるときに利用することができる。出発細胞集団を選択および誘導してＣＭを得る。ＣＭは、出発細胞集団によって分泌される細胞因子、またはそうでなければそれらから得られる細胞因子の混合物を含み、所望の標的細胞集団の増大および富化に特に好都合な刺激効果および阻害効果が所定のバランスを保っている。出発細胞集団は、例えば、血液、骨髄、体組織または樹立された細胞株の初代細胞、あるいは従来または他の手段によって以前に増やされている細胞（例えば、濃縮ＣＤ４⁺細胞など）を含む。出発細胞集団は、下記の細胞を含むことができる。所望の標的細胞と同じ細胞タイプの細胞、異なる分化段階にある所望の標的細胞タイプの細胞、および所望の標的細胞タイプの細胞に分化し得る細胞、または所望の標的細胞タイプと完全に異なるタイプの細胞。本発明はまた、出発細胞集団が最終的に増やされる標的細胞集団である場合を含む。リンパ球を増やすのに必要な特定のＣＭを得るために有用な出発細胞集団は、好ましくは、末梢血液細胞、臍帯血液細胞または骨髄細胞から選択される。臨床的利点のために、末梢血液細胞は、出発細胞集団として使用するのに好ましい。出発細胞集団として有用な末梢血液細胞集団は、全末梢血液ならびにその画分（例えば、白血球泳動法（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）細胞、バフィーコート細胞、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＣ）、および低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）など）を含む。本発明において有用なＣＭは、因子の特定の混合物を産生するために出発細胞集団を誘導することによって得られる。出発細胞集団は、好ましくは、誘導剤を添加し、その後培養を行うことによって誘導される。ＣＭ誘導プロセスは、培養中の細胞によって産生される因子および培養条件（使用される培地、温度、培養時間、ｐＨ、外因性の組換え増殖因子、栄養分など）によって影響を受けることがある。この点に関して、使用される培地は無血清であることもできる。ＣＭの生成のために添加される誘導剤は、一般に、出発細胞集団の細胞タイプに関してマイトジェン作用を有する化学的または生物学的な物質を含む。このような薬剤は培地に添加される。添加は、定期的に、あるいは１回または数回の添加で行うことができる。添加は１回または複数回の予備インキュベーションの終わるごとに定期的に行てもよい。出発細胞集団を誘導するのに有用なマイトジェンの種類は、植物レクチン、Ｔ細胞マイトジェンおよびモノクローナル抗体、ならびにこれらの薬剤の組合せである。所望のマイトジェン活性を有する特定の植物レクチンには、下記の供給源から得られるレクチンが含まれる：ファゼオルス・ブルガリス（Phaseolus vulgaris）（ＰＨＡ、フィトヘマグルチニン）ドリコス・ビフロルス（Dollchos biflorus）ソラナム・ツベロスム（Solanum tuberosum）ソホラ・ジャポニカ（Sophora Japonica）マクルラ・ポミフェラ（Maclura pomifera）ピスム・サチブム（Pisum sativum）ウレックス・エウロパウエス（Ulex europaues）（ＵＥＡ−Ｉ、U.europaues アグルチニンＩ）ウレックス・エウロパウエス（Ulex europaues）（ＵＥＡ−II、U.europaues アグルチニンＩＩ）アラキス・ヒポガエア（Arachis hypogaea）グリシン・マックス（Glycine max）カナバリア・エンシフォルミス（Canavalia ensiformis）（ＣｏｎＡ、コンカナバリンＡ）トリチクム・ブルガリス（Triticum vulgaris）（ＷＧＡ、小麦胚芽アグルチニン）リシヌス・コムニス（Rchinus communis）（ＲＣＡ−Ｉ、Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニン）リコペルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon esculentum）フィトラッカ・アメリカナ（Phytolacca americana）（ＰＷＭ、アメリカヤマゴボウマイトジェン）リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（ＬＰＳ、リポ多糖）。植物由来マイトジェンの特に有用な群には、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、メゼレイン（Ｍｚｎ）およびＴＰＡ（ならびに関連のジテルペンエステル）が含まれる。ＴＰＡおよびその関連化合物のいくつかを下記に示す：ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）ホルボール（４−Ｏ−メチル）１２−ミリステート−１３−アセテートホルボール（１０−オキソ−２０−デオキシ）１２−ミリステート−１３−アセテートホルボール１２−モノミリステートホルボール１２，１３−ジデカノエートホルボール１２，１３−ジブチレートホルボール１２，１３−ジベンゾエートホルボール１２，１３−ジアセテート下記の非植物起源のマイトジェンもまた使用することができる。ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、連鎖球菌プロテインＡ、ガラクターゼオキシダーゼ、およびT細胞抗体（抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）または抗ＣＤ２８抗体など）など。インターフェロン−α（ＩＦＮα）、ＩＦＮβ、およびＩＦＮγ もまた、一部の状況においては誘導剤として使用することができる。サイトカインおよびケモカインはＣＭ中で産生され、従って、ＣＭはこれらの分子の生産源になる。少なくとも１４個のそのような因子がこれまでに同定されているが、これらの既知の組換えサイトカイン類およびケモカイン類を組合せても、本明細書中に記載される実施形態におけるＣＭ活性を再現することはできない。本発明の特徴は、ＣＭを使用する標的細胞の増大である。最初のステップは、好ましくは、適当な基本培地中で行われるが、この基本培地には最適または適切な細胞生育のために、望みに応じて１つまたは複数の所定のサイトカインを補ってもよい。培養条件はここの細胞タイプにより変わるが、標準的な組織培養条件は、培養処理の基礎をなす。細胞は、典型的には、３７℃の５％ＣＯ₂インキュベータで、培地中で培養される。特定の化学物質、タンパク質、培地成分（インスリンまたは血漿など）、およびいくつかの増殖因子またはコロニー刺激因子（ＣＳＦ）が、ある種の細胞タイプの維持には必要なこともある。ＣＭは、標的細胞を望むように増大させるのに十分な量で培地に添加することができる。添加量は、ＣＭの性質、培養された細胞集団の組成および培養条件に依存して変化する。実際上、ＣＭのこのような添加は、通常、約１％から約１０％までまたはそれ以上である。さらに、プールされたヒトのＣＭまたは血漿（例えば、自己または同種の血漿）はまた、約０％から約１０％までまたはそれ以上の範囲で添加できる。ＣＭおよびＰ（臍帯血漿）は、同じ細胞、同じ個体またはＨＬＡが一致する細胞から調製することができ、同じ個体からの細胞（例えば、臍帯血液、Ｔ細胞など）またはＨＬＡが一致する細胞を増大させるために使用することができる。従って、増やされた細胞は、処置細胞が採取された個体、またはその細胞からＣＭが調製されたかまたはＰが得られた細胞を治療するために予防的にまたは治療的に投与することができ、あるいはＨＬＡが一致する個体に投与するためにプールしておくことができる。培養ステップの長さは、標的細胞群の選択的な増殖をさらに助けるために変えることができる。細胞集団が、分化の途上にある細胞を含んだり、あるいは分化経路に入るように誘導される場合、最終的な標的細胞の富化は、培養の終了時期よって変わる可能性がある。Ｔ細胞を増やすには、典型的には、少なくとも３日間の培養期間を要するが、より通常的には、少なくとも１４日から約２１日の培養期間を要する。いくつかの標的細胞（サイトカイン誘導キラー細胞およびＴｃＲγδＴ細胞など）を得るためには、培養期間を延長することが好都合なことがある。本発明のさらなる利点は、細胞の増殖中における腫瘍細胞（例えば、リンパ性または骨髄性の白血病、リンパ腫）の本来的な排除である。いくつかの慢性骨髄性白血病細胞の数は長期間の培養中に急速に減少することが報告されている。本発明の方法による増殖中における腫瘍細胞の排除は、例えば、ＩＦＮγまたは腫瘍壊死因子類（ＴＮＦ）などのサイトカイン、および例えば、腫瘍細胞に対して抗増殖性作用または細胞傷害作用を有する活性化されたマクロファージなどの細胞の存在によって容易に行うことができる。増やされた細胞集団は、血液学的悪性腫瘍または固形腫瘍が除去された患者を治療するために使用することもできる。培養中に腫瘍細胞が除去された増殖培養細胞は、治療薬として、あるいは化学療法または放射線療法などの従来の治療の補助として患者に投与することができる。所望の抗原特異性を有するＴ細胞を調製することができ、ウイルス特異的または腫瘍特異的疾患治療において予防または治療に使用することができる。増やされた細胞はまた、遺伝子形質導入に使用されて患者に欠損しているかまたは機能不全の遺伝子エレメント（例えば、ＡＤＡ遺伝子）を送達することができる。さらに、疾患または障害によって損傷を受けた免疫系を再構築又は強化するために、あるいは正常な免疫系を強化するために、増殖細胞群（これは抗原特異的であることもできる）を投与することができる。増やされた細胞集団は、最終的な集団において、最初の集団と比較して、多数の標的細胞を有する（増殖）か、または標的細胞の割合が多い（富化）か、又はその両方である。例えば、非常に少数および非常に低い割合で存在する細胞が増殖および富化されて、標的細胞を約５％より多く、好ましくは約２０％よりも多く、より好ましくは約５０％よりも多く含む集団を得ることができる。標的細胞は、少なくとも約１００倍に、通常は少なくとも約１０，０００倍以上に増やすことができる。下記の実施例は本発明の実施形態を示すが、本発明の範囲を限定するものとして見てはならない。実施例実施例１ＣＭによる臍帯血の低密度単核細胞の増殖Ａ．ＣＭの調製１ｍｌ当たり２０ユニットのヘパリンを含むヒト臍帯血をＣＭを調製するための出発材料として使用した。血液のサンプルは、２％酢酸で１：２０に希釈し、有核細胞の総数を血球計を使って決定した。ヒトの臍帯血１ｍｌ当たりの有核細胞の平均数は、１．２×１０⁷で、臍帯当たりの有核細胞の平均数は、６．０× １０⁸であった。２０ユニット／ｍｌのヘパリンと、５０μｍの２−メルカプトエタノールを含むＡＩＭ−Ｖ^TM培地（無血清培地：ＨＣＢＭ−２）で血液を希釈し、有核細胞の最終濃度を１ｍｌあたり４×１０⁶個とした。１０ｎｇ／ｍｌの濃度となるようメゼレインを加え、混合物を３７℃で、二酸化炭素濃度５％で維持した加湿培養器中で２時間培養した。２０μｇ／ｍｌの濃度となるようコンカナバリンＡを加え、その培養液を４日間同一条件下で持続した。混合物を４℃３０分間、５００ｘｇで遠心分離し、上清（ＣＭ）を採取し、−２０℃で保存した。使用する前にＣＭを室温で溶かし、４℃１５分間５００ｘｇで遠心分離して清澄化し、その後シリンジをつけた０．２２μｍフィルターを使用してろ過を行った。Ｂ．ＣＭの組成ＣＭ中のいくつかの特異的なサイトカインとケモカインの濃度を、酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。各因子の中央値を、表１に示す。因子は、ＣＭ中の濃度に基づき４つの範疇（ａ−ｄ）に該当する。（a）>10ng/ml: IL-2，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β，RANTES （b）1-10ng/ml: IL-1β，IFN-γ，IL-16 （c）<1ng/ml: IL-12，TNF-α （d）<<1ng/mlまたは検出不可 IL-10，IL-4，IL-7,IL-15 表１ＣＭの組成 ^* ｎ＝８−１８の独立ロットの中央値Ｃ．ＣＭ添加レベルの最適化臍帯血液低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）の増殖を起こすＣＭの最適濃度は、実施例１Ａに記載されるように調製したＣＭを使用して決定した。臍帯血液ＬＤＭＮＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ^TM（密度：１．０７７ｇ／ｍｌ）を使用して、臍帯血液全体を密度勾配分画して調製した。１５ｍｌの血液を５０ｍｌの円錐状の組織培養試験管中の同量のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ^TMの上に積層し、室温で３０分間４００ｘｇで遠心分離した。境界の低密度単核細胞を集め、この細胞を室温で１０分間、ＨＣＢＭ−２の中で１００ｘｇで遠心分離することににより２回洗浄した。ＬＤＭＮＣは、１０％のウシ胎児血清を含むＨＣＢＭ− ２で希釈し、３７℃、二酸化炭素濃度５％で一晩、ポリスチレン製組織培養フラスコの中で培養した。この密度勾配分画法を繰り返し、上記細胞をＨＣＢＭ−２の中で２回洗浄した。ＬＤＭＮＣの収量は、上記の通り２％の酢酸を使用して決定した。臍帯血液１ｍl当たりのＬＤＭＮＣの平均数は、３．２×１０⁶で、臍帯当たりのＬＤＭＮＣの平均数は、１．１×１０⁸であった。臍帯ＬＤＭＮＣは、０〜１０％のＣＭを含むＨＣＢＭ−２中、１ｍｌ当たり１ ×１０⁵個の細胞密度となるよう希釈した。細胞懸濁液は、３７℃、二酸化炭素濃度５％で３日間２４穴の組織培養プレート（１ウェル当たり１．５ｍｌ）の中で培養した。各条件における細胞数と生存率は、培養物のサンプルをそれと同等の量の０．４％のトリパン・ブルーと混合し、血球計を使って、無染色の細胞（生存）と青の細胞（非生存）の数を計数することにより決定した。表２に示す通り、細胞増殖の最大レベルは、５％および１０％のＣＭを使用した場合に得られた。表２ＣＭ添加レベルの最適化Ｄ．ＣＭで培養した臍帯血液低密度単核細胞の増幅臍帯血液ＬＤＭＮＣは、実施例１Ｃに記載される通り調製した。この細胞は、５％のＣＭを含む無血清ＨＣＢＭ−２培地の中で１×１０⁵の最終密度に希釈した。この細胞懸濁液は、２４穴の組織培養プレート（ウェル当たり１．５ｍｌ）の中で培養した。４日から７日毎に、この細胞数と生存率を、上述したトリパン・ブルーを使用して決定した。各時点で、適切な量の培養細胞を５％のＣＭを含む新鮮なＨＣＢＭ−２中で１×１０⁵個／ｍｌの細胞密度となるよう希釈することにより、細胞を継代した。細胞増殖率は、各継代毎で決定し、生存細胞の理論上の総数は、細胞の全てが継続的に培地に維持されていることを前提に計算した。５０を越す培養のデータを、Ｆｉｇ．１ａに示す。これらの培地の平均累積細胞収量の最適線をＦｉｇ．１ｅに示す。これらの条件で培養された平均的な臍帯ＬＤＭＮＣは、５日間で約１０倍に増殖し、１カ月以内に１０，０００倍を超える増殖を達成する可能性がある。５％のＣＭ中の臍帯血ＬＤＭＮＣの培養物にさらに５％の臍帯血漿（Ｐ）を添加すると（ＣＭ／Ｐ）、培養の寿命は一般に増加し、結果的には更に１０倍増殖が増加する（Ｆｉｇ．１ｂおよびＦｉｇ．１ｅ）。Ｅ．臍帯血低密度単核細胞へのＣｏｎＡ、Ｍｚｎ、およびＩＬ−２の直接添加臍帯血ＬＤＭＮＣは、実施例１Ｃに記載される通り調製し、実施例１Ｄに記載される通り培養した。５％のＣＭまたは、２０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＭｚｎ、および１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２の組み合わせ物を培地に直接加え、更に５％の臍帯血漿（Ｐ）を補った。ＣｏｎＡ、Ｍｚｎ、およびＩＬ−２の直接添加により得られた最大増殖率（３１５倍）は、ＣＭを使用して得られる増殖率（１０８，０００倍）より数桁低く、ＣＭのＴ細胞増殖活性は、ＣＭを調製するのに使用されて残存しているＭｚｎまたはＣｏｎＡによる細胞の直接刺激にはよるものではないことを示した（Ｆｉｇ．２）。Ｆ．ＣＭ活性の相補性実施例１Ａに記載されるＭｚｎとＣｏｎＡの両方を使用して調製されたＣＭを、ＣｏｎＡのみまたはＭｚｎのみで調製されたならし培地（ＣＭ（Ｍ）、ＣＭ（Ｃ））と比較した。かなりのレベルでＩＬ−２を含むことが示された（実施例１Ｂ、表１参照）完全ＣＭと異なり、コンポーネントＣＭであるＣＭ（Ｃ）、ＣＭ（Ｍ）は、検出可能なＩＬ−２は含まなかった、。従って、コンポーネントＣＭには、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を補足した。臍帯ＬＤＭＮＣは、実施例１Ｃに記載される通り調製し、５％のＣＭ、５％のＣＭ（Ｍ）、５％のＣＭ（Ｍ）とＩＬ −２、５％のＣＭ（Ｃ）、５％のＣＭ（Ｃ）とＩＬ−２、５％ＣＭ（Ｍ）と５％のＣＭ（Ｃ）、または５％のＣＭ（Ｍ）と５％のＣＭ（Ｃ）とＩＬ−２、の存在下で実施例１Ｄに記載される通り培養した。ＣＭ（Ｍ）とＣＭ（Ｃ）とＩＬ−２の組み合わせだけが、完全ＣＭに相当する細胞増殖レベルが得られた（Ｆｉｇ．３）。他の組み合わせを使用しても一定の生育は得られたが、総増殖率はずっと低く、増殖のキネティクスは異なっていた。これらの結果により、ＣＭには少なくとも３つの活性成分があり、１つはＣｏｎＡ依存性であり、もう１つはＭｚｎ依存性であり、更にもう１つは、ＣｏｎＡおよびＭｚｎ両方に依存性のＩＬ−２であることが示された。Ｇ．既知のマイトジェンと共に培養した臍帯低密度単核細胞の増殖ＣＭまたはＣＭ／Ｐと臍帯血ＬＤＭＮＣを培養することにより得られた最大増殖倍率に対して、同じ細胞を他のマイトジェン（表３）またはその組み合わせの存在下で培養したときに得られる最大増殖倍率は非常に低い（表４）。増殖因子は組換え体であり、抗ＣＤ３モノクローン性抗体のＯＫＴ３は、５０％飽和の硫酸アンモニア沈殿により細胞培養上清から精製された。これら増殖因子は、表３に示す通り生物学的に活性の濃度で使用した。５％濃度の臍帯血漿は、マイトジェン刺激を含むほとんどの培養で添加された。表３臍帯血低密度単核細胞を刺激するのに使用されたマイトジェンの濃度表４既知マイトジェンと培養した臍帯血低密度単核細胞の増殖実施例２ＣＭによる成人末梢血低密度単核細胞の増殖Ａ．ＣＭによる成人末梢血低密度単核細胞の増殖低密度単核細胞は、実施例１Ｃで臍帯血について記載したのと同一の技術を使って密度勾配遠心分離によりヒトの成人末梢血から単離した。成人末梢血１ｍｌ当たりの有核細胞の平均数は５．６×１０⁶であり、成人末梢血１ｍｌ当たりのＬＤＭＮＣの平均収量は、密度勾配分画後で１．２×１０⁶であった。成人末梢血ＬＤＭＮＣは、実施例１Ｄにおける臍帯血細胞についての記載通り、５％のＣＭを含むＨＣＮＢ−２の中で１×１０⁵個／ｍｌの細胞密度で培養した。１８回以上の成人ＬＤＭＮＣ培養からのデータをＦｉｇ．１ｃに示す。これらの培養の平均累積細胞収量の最適化曲線を、Ｆｉｇ．１ｅに示す。５％ＣＭ中における成人末梢血細胞の増殖は、同一条件下における臍帯血細胞の増殖よりも通常大きくなる。これらの条件下で培養された平均的な成人の末梢血細胞は、５日間で約１０倍に増殖し、１カ月間では１００，０００倍の増殖を超えることも珍しくない。５％の臍帯血漿を添加しても、５％のＣＭ中で培養された成人末梢血ＬＤＭＮＣの増殖倍率は増加しない（Ｆｉｇ．１ｄおよびＦｉｇ．１ｅ）。Ｂ．ＣＭおよびＣＭ／Ｐによる臍帯血および成人末梢血リンパ球の増殖倍率の比較表５に、臍帯血ＬＤＭＮＣおよび成人末梢血LＤＭＮＣの平均増殖倍率を比較する。ＣＭは再現性を持って、臍帯血細胞の非常に大きな増殖と、成人末梢血細胞のさらに大きい増殖とを誘導することができる。臍帯血漿（Ｐ）の添加は、臍帯細胞の増殖を増大させ、培養の寿命を伸ばす傾向がある。成人末梢血細胞は、臍帯血漿に依存する割合が少ない（Ｆｉｇ．６）。この細胞増殖の平均倍率は、他のいかなるマイトジェンによって得られた最大細胞増殖倍率よりも明らかに大きい（表４）。表５ＣＭおよびＣＭ／Ｐによる臍帯血および成人末梢血リンパ球の増殖倍率の比較実施例３バフィーコートＣＭ、血液全体のＣＭ、臍帯血ＣＭおよび成人血液ＣＭの比較実施例１Ａに記載したように未分画の臍帯血全体から調製されたＣＭを、バフィーコート細胞から調製したＣＭと比較した。臍帯血は、室温で１５分間４００ｘｇで遠心分離した。上清血漿と共に、主に白血球からなるバフィーコート層を採取し、実施例１Ａに記載される通り、２％の酢酸を使用して有核細胞の総数を決定した。バフィーコート白血球は、細胞密度が１ｍｌ当たり４×１０⁶個となるようＨＣＢＭ−２で希釈した。バフィーコートＣＭは、実施例１Ａで全血について記載した通り、メゼレインとコンカナバリンＡを添加することにより調製した。バフィー・コートＣＭおよび全血ＣＭは、５％濃度で培養に使用した場合、同様な臍帯血細胞の増殖倍率をもたらした（Ｆｉｇ．６）。表６各ＣＭの比較臍帯血ＣＭを、成人末梢血ＣＭと比較した。ＥＬＩＳＡ分析では、成人末梢血ＣＭは、ＩＮＦ−γのレベルがより高いことを除いて（中央値＝１０２ｎｇ／ｍｌ、範囲＝４７−３０２ｎｇ／ｍｌ）、臍帯血ＣＭ（実施例１Ｂ、表１）のそれと非常に類似するサイトカイン・プロフィールを有することが示された。成人末梢血ＣＭと臍帯血ＣＭは、５％濃度で培養に使用された場合、臍帯血細胞の同様な増殖倍率をもたらした（表６）。実施例４臍帯血細胞および成人血液低密度単核細胞上でのＴ細胞抗原の発現ＣＭまたはＣＭ／Ｐとともに増殖させた臍帯血Ｔ細胞の表現形は、表７に記載されるＴ細胞マーカーに特有の蛍光ラベル抗体の組み合わせを使用して、１色、２色、または３色のフローサイトメトリーにより広く特徴付けられる。これらの抗原の各々を発現している、新鮮な臍帯血ＬＤＭＮＣの割合と、新鮮な成人末梢血ＬＤＭＮＣの割合を表８に示す。ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８を共発現する割合は、表９に示す。表７フローサイトメトリーで使用される抗体組み合わせ表８新鮮な臍帯および成人血液ＬＤＭＮＣにおける抗原発現（％）表９新鮮な臍帯および成人血液低密度単核細胞におけるＣＤ３，ＣＤ４、およびＣＤ８の共発現（％）実施例５ＣＭ／Ｐと培養した時の臍帯血ＬＤＭＮＣにおけるＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の発現臍帯血ＬＤＭＮＣは、実施例１Ｃに記載される通り調製し、実施例１Ｄに記載される通り５％のＣＭおよび５％のＰを含むＨＣＢＭ−２の中で培養した。継代ごとに、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に特異的な蛍光標識抗体により染色し（表７）、ＣｏｕｌｔｅｒＥｐｉｃｓＥｌｉｔｅ^TM蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使用して分析した。表８に示す通り、出発細胞群の約４６％はＣＤ３⁺で、３９％はＣＤ４⁺、２０％はＣＤ８⁺であった。Ｆｉｇ．４に、ＣＭ／Ｐ中で培養した臍帯血ＬＤＭＮＣを時間に関して示す。開始時のＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、およびＣＤ８⁺細胞の割合は、表８の割合と同様である。５％のＣＭと５％のＰを含むＨＣＢＭ−２中での培養では５日以内に、９０％を超える細胞がＣＤ３⁺となり、ＣＤ３⁺細胞の割合は、その後の培養で高いままであった。ＣＤ４⁺Ｔ細胞のパーセントは、培養５日間以内に８０％に上昇したが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞のパーセントは上昇しなかった（〜１８％）。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、約１４日目までは培養中の主要細胞表現形であったが、その時点でＣＤ８⁺細胞の割合が上昇し始め、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の割合が減少し始めた。その後、ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、主要細胞表現形のままであった。これらの細胞の殆どは、ＣＤ３を共発現し続けた。実施例６ＣＭと培養した時の成人血液低密度単細胞におけるＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８の発現成人末梢血ＬＤＭＮＣは、実施例２Ａに記載される通り調製し、５％のＣＭを含むＨＣＢＭ−２の中で培養した。継代ごとに細胞は、上述した通り蛍光ラベル抗体で染色した。表８に示す通り、開始時の細胞群の約５７％はＣＤ３⁺で、４５％はＣＤ４⁺、３０％はＣＤ８⁺であった。Ｆｉｇ．５に、ＣＭ中で培養した成人細胞ＬＤＭＮＣを時間に関して示す。開始時のＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺の細胞の割合は、表８の割合と同様である。５％のＣＭを含むＨＣＢＭ−２中での培養５日間以内に８０％を超える成人細胞がＣＤ３⁺であり、ＣＤ３⁺の割合は残りの培養の間も高いままであった。ＣＤ４⁺Ｔ細胞のパーセントは、５日間以内に６７％まで上昇したが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞のパーセントの増加は僅かであった（〜３４％）。臍帯ＬＤＭＮＣで見出されたパターンと同様に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、約１４日目まで成人細胞培養の主要細胞表現形であり続け、この時点でＣＤ８⁺細胞の割合が実質的に上昇し始めＣＤ４⁺Ｔ細胞の割合が減少した。その後、ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、主要細胞表現形のままであった。これらの細胞の殆どは、ＣＤ３を共発現し続けた。実施例７ＣＭおよびＣＭ／Ｐ中で培養された濃縮Ｔ細胞サブセットの発現と表現形臍帯血ＬＤＭＮＣは、実施例１Ｃに記載される通り調製され、その後、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞サブセットを陰性選択である免疫磁性アフィニティ技法（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ）を使用して濃縮した。ＣＤ４濃縮群は＞９０％のＣＤ４⁺Ｔ細胞を通常含み、ＣＤ８濃縮群は、８０％を超えるＣＤ８⁺Ｔ細胞を通常含む。濃縮されたサブセットは、濃縮されたＴ細胞サブセットを再度一緒にする前と後に、実施例１Ｄに記載される通りＣＭまたはＣＭ／Ｐ中で増殖させた。細胞全体としての増殖は、開始群が分画されていないＬＤＭＮＣ，ＣＤ４濃縮細胞、ＣＤ８濃縮細胞、または一緒にしたＣＤ４濃縮およびＣＤ８濃縮細胞のどれであるかに関係なく、同じ様であった（Ｆｉｇ．９）。増殖した細胞の表現形は、実施例５に記載される通りに決定した。一般に、そして期待通りに、ＣＭとともに培養したＣＤ４濃縮Ｔ細胞は、ＣＤ４⁺細胞を生じた。ＣＭ／Ｐとともに培養したＣＤ４濃縮細胞も主にＣＤ４⁺細胞を生じたが、ＴｃＲγδ細胞とＣＤ５６⁺／ＣＤ３⁺細胞も培養の後期で生じた（Ｆｉｇ．７ａ）。同様に、ＣＭの中で培養したＣＤ８濃縮細胞は主にＣＤ８⁺細胞を生じたが、ＣＭ／Ｐと培養したＣＤ８濃縮細胞は主にＣＤ８⁺細胞を生じたほか、これら付随的細胞も生じた（Ｆｉｇ．７ｂ）。未分画ＬＤＭＮＣ（Ｆｉｇ．７ｃ）と、ＣＤ４濃縮およびＣＤ８濃縮細胞を一緒にしたもの（Ｆｉｇ．７ｄ）は、培養の初期段階ではＣＤ４⁺細胞が主で、培養の後期段階ではＣＤ８⁺細胞が主である予想されたパターンを与えた。臍帯血漿の添加により、ＣＤ４表現形からＣＤ８表現形への切り替えを促進し、ＴｃＲγδ⁺細胞とＣＤ５６⁺／ＣＤ３⁺細胞の増殖が増大した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞を成人末梢血から濃縮し、上述したように増殖させたが、非常に似通った結果となった。Ｆｉｇ．８に増殖を示し、Ｆｉｇ．９ａからＦｉｇ．９ｄに、ＣＭおよびＣＭ／Ｐと培養した成人末梢血Ｔ細胞サブセットの表現形を示す。その結果、濃縮サブセットをＣＭと培養することにより非常に多くの比較的純粋なＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞が、非常に短い期間で、臍帯血または成人末梢血から得られ、付随の細胞群も培養条件の操作により得られることを示した。実施例８ＣＭ／ＰによるＴｃＲαβ⁺細胞とＴｃＲγδ⁺細胞の増殖臍帯血ＬＤＭＮＣを、実施例１Ｃに記載される通り調製し、５％のＣＭおよび５％のＰを使用して実施例１Ｄに記載される通り増殖させた。各時点で、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）の増大は、アルファ−ベータＴｃＲ（ＴｃＲαβ）またはガンマーデルタＴｃＲ（ＴｃＲγδ）に特異的な蛍光標識モノクローン性抗体を使用して実施例４に記載される通りＦＡＣＳ分析によって検査した。大部分のＴ細胞は、培養を通じてＴｃＲαβを発現したが、Ｔ細胞の相当部分（約１８％）が、培養の後期にＴｃＲγδを発現した（Ｆｉｇ．１０）。ＴｃＲγδ⁺Ｔ細胞の存在と割合とは、未分画ＬＤＭＮＣを増やした場合は実験ごとに異なる。しかし、ＣＤ４濃縮Ｔ細胞（実施例７、Ｆｉｇ．７ａ、Ｆｉｇ．９ａ）がＣＭ／Ｐの中で培養された場合、ＴｃＲγδ⁺Ｔ細胞の割合は、再現性をもって増加した（２８ −６４％）（表１０）。表１０ＴｃＲγδの発現実施例９ＣＭおよびＣＭ／Ｐとともに増殖させたＴ細胞によるＴ細胞受容体Ｖ β遺伝子の使用成人末梢血ＬＤＭＮＣを実施例２に記載される通りに調製し、５％のＣＭと８日間培養した。この時点は、ＣＤ４が優占的である段階である（実施例６、Ｆｉｇ．５）。細胞を溶解し、ｍＲＮＡを単離してｃＤＮＡを調製するために使用した。ｃＤＮＡは、Ｔ細胞受容体Ｖβ鎖の２４ファミリーの各々に特有のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分析により、２４全てのＶβ遺伝子が存在することが示された（Ｆｉｇ．１１）。これらの結果により、ＣＭでＬＤＭＮＣから増殖したＣＤ４⁺Ｔ細胞がポリクローン性であることが示された。同様に、成人末梢血ＬＤＭＮＣを２５日間ＣＭ／Ｐと培養した。この時点は、ＣＤ８優占段階を表わす（実施例６、Ｆｉｇ．５）。Ｖβ分析により、２４のＶ β遺伝子全部の存在が明らかになった（Ｆｉｇ．１２）。これらの結果により、ＣＭ／ＰによりＬＤＭＮＣから増殖したＣＤ８⁺Ｔ細胞もポリクローン性であることが示された。実施例１０増殖したＴ細胞の特性Ｆｉｇ．１３ａに、ＣＭ／Ｐと培養した時の臍帯血リンパ球におけるＣＤ４５アイソフォームＲＡおよびＲＯの発現を示す。培養前、約２４％の細胞はナイーブＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡを発現し、３１％は記憶Ｔ細胞マーカーＣＤ４５ＲＯを発現した。培養６日間までに、殆ど全ての細胞（９０％を超える）がＲＯアイソフォームを発現し、この表現形は、培養中ずっと維持された。逆に、ＩＬ −２／Ｐで培養した臍帯血単核球の大部分（９０％を超える）は、ナイーブＲＡ表現形を発現した（Ｆｉｇ．１３ｂ）。Ｆｉｇ．１４ａに、ＣＭ／Ｐと培養した時の臍帯血リンパ球におけるクラスII 主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ− ＤＲの発現を示す。Ｔ細胞におけるクラスIIＭＨＣ分子の発現は、亢進した活性化状態を示す。従ってこれらの結果は、ＣＭ／Ｐと培養した時に活性化したＴ細胞の割合がだんだん増えていくことを示す。対照的に、ＩＬ−２／Ｐと培養された臍帯血細胞は、ＨＬＡ−ＤＲを発現しなかった（Ｆｉｇ．１４ｂ）。Ｆｉｇ．１５に、ＣＭ／Ｐと培養した時の臍帯血リンパ球におけるＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を示す。ＣＤ２５もＣＤ６９も、休止およびナイーブＴ細胞では発現されなかった。ＣＤ２５は、高親和性ＩＬ−２受容体の構成ポリペプチド鎖（ＩＬ−２Ｒα鎖）であり、そのＴ細胞における発現は、活性化と関連している。ＣＤ２５を発現した細胞の割合は、培養の初期で急速に上昇し、培養がＣＤ４優占培養からＣＤ８優占培養に切り替わる段階で減少した。ＣＤ２５はその後再び上昇した。また、活性化インデューサー分子として知られるＣＤ６９は、早期Ｔ細胞活性化と関連している。ＣＤ６９を発現した細胞の割合は、培養を通じてもっと徐々に上昇した。実施例１１異なるリンパ球サブセットのＣＭによる増殖Ａ．ＮＫ細胞の増殖Ｆｉｇ．１６ａに、ＣＭ／Ｐと培養した時の臍帯血リンパ球におけるＣＤ５６およびＣＤ１６の発現を示す。８日後、細胞の相当部分は、ＮＫ（天然キラー）細胞表現形ＣＤ５６⁺／ＣＤ１６⁺を発現した（Ｆｉｇ．１６ｂ）。このため、このＣＭによる血液細胞増殖技法は、ＮＫ細胞の増殖に有益である。Ｂ．ＣＤ８⁺、ＣＤ３⁺、ＴｃＲαβ⁺、ＣＤ５６⁺、およびＣＤ１６^-細胞の増殖Ｆｉｇ．１７に、ＣＭ／Ｐと培養したときの臍帯血リンパ球におけるＴ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ８、およびＴｃＲαβと、ＮＫ細胞マーカーであるＣＤ５６並びにＣＤ１６の発現を示す。培養の後期段階におけるＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合の増加は、ＣＤ５６の発現増加を伴うが、ＣＤ１６発現の上昇はない。このため、ＣＭによる血液細胞の増殖技法が、表現形ＣＤ８⁺、ＣＤ３⁺、ＴｃＲαβ⁺、ＣＤ５６⁺、およびＣＤ１６^-を有するＴ細胞のサブセットを増すのに有益である。Ｃ．二重陽性および二重陰性細胞の増殖Ｆｉｇ．１８およびＦｉｇ．１９に、それぞれＣＭおよびＣＭ／Ｐと培養した時の成人血液ＬＤＭＮＣにおけるＣＤ４およびＣＤ８の発現を示す。Ｆｉｇ．１８に示す通り、ＣＤ４⁺細胞のパーセントは、４５．２％から急速に増加し、５日目から１６日目にかけて６１．９％の加重パーセントを維持し、その後、このパーセントは、２１日目から３５日目にかけて加重平均で２７．３％に下落した。新鮮なＬＤＭＮＣにおけるＣＤ８⁺細胞の平均パーセントは、２９．６％であった。ＣＤ８⁺細胞のパーセントは、５日目から１６日目にかけて加重平均で３４．２％に維持され、その後このパーセントは、２１日目から３５日目にかけて加重平均で６５．５％に急速に上昇した。期間を通じてＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺の平均パーセントは、４．０％から８．７％までの範囲に維持され、一定の割合での成長を示した。Ｔ以外の細胞を含む、ＣＤ４^-／ＣＤ８^-細胞の初めのパーセントは、３５．３％であった。５日目から２６日目までの平均パーセントは、８．４％から１２．０％パーセントの範囲に維持された。２９日目と３５日目の平均値は、それぞれ１７．２％と、１６．４％であった。Ｆｉｇ．１９に示す通り、ＣＤ４⁺細胞のパーセントは、４５．２％から急速に上昇し、５日目から８日目にかけて７５．２％の加重パーセントを維持し、１４日目から１６日目にかけては５４．７％の加重平均パーセントに下落した。ＣＤ４⁺細胞の平均パーセントは、２１日目から３５日目にかけては１０．７％の加重平均に下落した。新鮮なＬＤＭＮＣ中のＣＤ８⁺細胞は、２９．６％であった。ＣＤ８⁺細胞のパーセントは、５日目から８日目にかけて２５．０％の加重平均で維持され、１４日目から１６日目にかけては４８．３％の加重平均パーセントにまで上昇した。ＣＤ８⁺細胞のパーセントは、２１日目から３５日目にかけて８９．１％の加重平均に急速に上昇した。時間を通じてＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺細胞の平均パーセントは、４．２％から７．８％の範囲で維持され、一定の割合での成長を示した。Ｔ以外の細胞を含むＣＤ４^-／ＣＤ８^-細胞の初めのパーセントは、３５．３％であった。５日目から３５日目の平均パーセントは、４．０％から７．５％の範囲内に維持された。どちらの培養でも、通常のＣＤ４⁺とＣＤ８⁺Ｔ細胞生育パターンが得られた。両方の培養を通じて、Ｔ細胞の相当割合がＣＤ３⁺でかつ、ＣＤ４およびＣＤ８共発現しているか、またはＣＤ４とＣＤ８のどちらも欠いていた。これらのＴ細胞は、それぞれ二重陽性および二重陰性Ｔ細胞と呼ばれ、胸腺内のみに通常存在する未成熟Ｔ細胞の特性である。細胞全体の顕著な増殖があるところで、二重陽性および二重陰性Ｔ細胞が維持されていることは、これらの未成熟Ｔ細胞サブセットも増殖することを示す。このため、ＣＭによる細胞増殖の増殖技法は、二重陽性および二重陰性Ｔ細胞の増殖に有益である。実施例１２ＣＭによる抗原特異的マウスＴ細胞の増殖ＳＪＬマウスをフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の中で乳化した５００ μｇのギニアピッグのミエリン塩基性プロテイン（ＭＢＰ）で免疫処理した。１０日後に５匹のマウスのドレインを入れたリンパ節から得られた細胞（ＬＮＣ）をプールし、５０μｇ／ｍｌのＭＢＰ抗原の存在下で５×１０⁶個／ｍｌの細胞濃度で１０日間培養した。ＬＮＣは、培地で２度洗浄し、抗原特性を調べるために試験を行った。１×１０⁵個のＬＮＣを、マイトマイシンＣ処理した１×１０⁶ 個の同系の抗原提示細胞に５０μｇ／ｍｌのＭＢＰ抗原存在下または非存在下で添加した。増殖は、ＤＮＡ内への³Ｈチミジンの取り込みにより５日後に測定した。有為な増殖は、ＭＢＰ抗原が含まれる場合のみ起こり（Ｆｉｇ．２０ａ）、ＭＢＰ特異的Ｔ細胞（Ｍ−ＬＮＣ）の存在を示した。Ｍ−ＬＮＣを１４日間５％のＣＭと培養し、その結果７３８倍の増殖が得られた。この時点で抗原特性を上述した通り、再試験した、今度も、増殖が起こったのはＭＢＰが存在する場合だけであった（Ｆｉｇ．２０ｂ）。これらの結果から、抗原特異的Ｔ細胞をＣＭで増やすことができ、この増殖した細胞は抗原特異性を維持していることが示された。本発明の他の実施様態および用途は、本明細書、および明細書に開示した発明の実施に鑑み、当業者に明らかとなる。仮出願連番６０／０３７，２４５と、その中で参照される他の全ての文書も含めて、全ての米国特許および特許出願文書は、いかなる理由を問わず、引用によって具体的に組み込まれる。本明細書および実施例は、以下の請求項により示される発明の範囲と精神を以って、例示目的のみと考慮されるのと意図される。

【手続補正書】【提出日】平成１３年１０月３０日（２００１．１０．３０）【補正内容】請求の範囲１．ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＴｃＲγδ⁺Ｔ細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＣＤ５６⁺ＴｃＲαβ⁺ＣＤ１６^-サイトカイン誘導キラー細胞、ＣＤ１６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ１６⁺ＣＤ５６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-Ｔ細胞、およびそのようなリンパ球の２種またはそれ以上の組み合わせから選ばれた標的リンパ球の集団を、血液またはリンパ球を含む組織からインビトロでの培養により選択的に拡大する方法であって、（１）少なくとも２種の植物由来マイトジェンを含む生育培地中で血液細胞サンプルをインキュベートすることにより、選んだ標的リンパ球の増殖を促進する効果のある因子の組み合わせを含むならし培地を調製し；（２）血液または組織から得た、標的とする細胞を含んでいるリンパ造血細胞の集団を、（１）で得られたならし培地の有効量とともに培養して、標的リンパ球を選択的に増殖させることにより培地中の標的リンパ球を富化する；工程を含む方法。２．血液細胞サンプルとは、末梢血細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、血液細胞のバフィコート画分、あるいはリンパ球を含んでいる組織である、請求項１に記載の方法。３．リンパ造血細胞の由来する血液または組織が、末梢血細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、血液細胞のバフィコート画分、あるいはリンパ球を含んでいる組織である、請求項１に記載の方法。４．植物由来のマイトジェンが、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、メゼレイン、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート、ホルボール（１ −Ｏ−メチル）−１２−ミリステート−１３−アセテート、ホルボール（１０− オキソ−２０−デオキシ）−１２−ミリステート−１３−アセテート、ホルボール１２−モノミリステート、ホルボール１２，１３−ジデカノエート、ホルボール１３，１３−ジブチレート、ホルボール１２，１３−ジベンゾエート、およびホルボール１２，１３−ジアセテートからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．植物由来のマイトジェンが、メゼレインとコンカナバリンＡである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．上記血液または組織と上記血液細胞サンプルとが、同一の血液細胞起源である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．上記血液または組織と上記血液細胞サンプルとが、どちらも臍帯血である、請求項６に記載の方法。８．リンパ造血細胞の培養がフィーダー細胞が存在しない状態で行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．ならし培地の調製には１〜１０日間かかる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。１０．標的リンパ球が、ＴｃＲγδ⁺Ｔ細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＣＤ５６⁺ＴｃＲα β⁺ＣＤ１６^-サイトカイン誘導キラー細胞、ＣＤ５６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ１６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ１６⁺ＣＤ５６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞、またはＣＤ３⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-Ｔ細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。１１．選択されたＴ細胞およびナチュラルキラー細胞集団の選択的培養に有用なならし培地、ここで選択されたＴ細胞およびナチュラルキラー細胞集団の増殖と生存に必須な因子の組み合わせを含む細胞分裂誘発組成物を含むこの培地は、血液サンプルを細胞培地中で少なくとも２種の植物由来マイトジェンで処理して細胞培地中での増殖を起こさせるとともに標的リンパ球の生育と生存に必須の因子の組み合わせを生産させることよって調製されたものである。１２．基本的に細胞を含まず、出発時の細胞集団を除去する工程を含む方法で調製されたものである、請求項１１に記載のならし培地。１３．植物由来のマイトジェンが、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、メゼレイン、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート、ホルボール（１−Ｏ−メチル）−１２−ミリステート−１３−アセテート、ホルボール（１０ −オキソ−２０−デオキシ）−１２−ミリステート−１３−アセテート、ホルボール１２−モノミリステート、ホルボール１２，１３−ジデカノエート、ホルボール１３，１３−ジブチレート、ホルボール１２，１３−ジベンゾエート、およびホルボール１２，１３−ジアセテートからなる群から選択されたものである、請求項１１または１２に記載のならし培地。１４．植物由来のマイトジェンが、メゼレインとコンカナバリンＡである、請求項１３に記載のならし培地。１５．１０ｎｇ／ｍｌより多いＩＬ−２；１０ｎｇ／ｍｌより多いＧＭ−ＣＳＦ；１０ｎｇ／ｍｌより多いＭＩＰ−１α；１０ｎｇ／ｍｌより多いＭＩＰ−１β；１０ｎｇ／ｍｌより多いＲＡＮＴＥＳ１−１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β １−１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ １−１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１６１ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ−１２；１ｎｇ／ｍｌ未満のＴＮＦ−α；０．１ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ−１０；０．１ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ−４；０．１ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ−７；０．１ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ−１５；を含むマイトジェン組成物。１６．基本的にＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５を含まない、請求項１５に記載のマイトジェン組成物。１７．血液サンプルを少なくとも２種の植物由来マイトジェンで処理して標的リンパ球の増殖を促進する効果を有する因子の組み合わせを生産させ；上記因子の組み合わせの有効量の存在下で血液または組織由来で標的細胞を含有しているリンパ造血細胞集団を培養して集団中の標的リンパ球を多くする工程によりインビトロで作製された標的リンパ球からなる組成物。１８．標的リンパ球が、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＴｃＲγδ⁺Ｔ細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＣＤ５６⁺ＴｃＲαβ⁺ＣＤ１６^-サイトカイン誘導キラー細胞、ＣＤ１６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ５６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ１６⁺ ＣＤ５６⁺ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-Ｔ細胞、およびそれらの混合物と組み合わせからなる群から選ばれるたものである、請求項１７に記載の組成物。１９．標的リンパ球が腫瘍特異的キラー細胞である、請求項１７または１８に記載の組成物。２０．上記血液サンプルが末梢血、臍帯血細胞、骨髄細胞、血液細胞のバフィコート画分、あるいはリンパ球を含んでいる組織からなる群から選択される、請求項１７から１９のいずれかに記載の組成物。２１．上記血液または組織が末梢血、臍帯血細胞、骨髄細胞、血液細胞のバフィコート画分、あるいはリンパ球を含んでいる組織からなる群から選択される、請求項１７から２０のいずれかに記載の組成物。２２．植物由来のマイトジェンがコンカナバリンＡとメゼレインである、請求項１７から２０のいずれかに記載の組成物。２３．上記血液サンプル、および上記血液または組織が同一のドナーまたは組織から得られるものである、請求項１７−２２のいずれかに記載の組成物。２４．上記血液サンプル、および上記血液または組織が別々のドナーまたは組織から得られるものである、請求項１７−２２のいずれかに記載の組成物。２５．標的リンパ球の集団が物理的濃縮工程により富化される、請求項１７から２４のいずれかに記載の組成物。２６．標的リンパ球の集団が組換え核酸でトランスフェクトされる、請求項１７から２５のいずれかに記載の組成物。２７．請求項１７から２６のいずれかに記載の組成物からなる、細胞性ワクチン。２８．リンパ球細胞治療を行うための治療用物質を生産するための請求項１７から２６のいずれかに記載の組成物の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｎ 5/10 Ｂ 15/09 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．標的リンパ球の富化された画分を含有する、リンパ球の増殖培養物をつくるための方法であって、（ａ）末梢血細胞、臍帯血細胞、および骨髄細胞からなる群から選択される出発細胞集団を、少なくとも２つの植物由来マイトジェンを含有する増殖培地中で培養することにより誘導して、ならし培地を生成するステップ；および（ｂ）該標的リンパ球の増殖集団を得るのに十分な濃度の該ならし培地の存在下で十分な時間、リンパ造血細胞の集団を培養するステップからなる方法。２．該標的リンパ球がＣＤ４⁺Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。３．該標的リンパ球がＣＤ８⁺Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。４．該出発細胞集団が末梢血細胞であり、該植物由来マイトジェンが、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、メゼレイン、ホルボール１２−ミリステート −１３−アセテート、ホルボール（１−Ｏ−メチル）１２−ミリステート−１３ −アセテート、ホルボール（１０−オキソ−２０−デオキシ）１２−ミリステート−１３−アセテート、ホルボール１２−モノミリステート、ホルボール１２，１３−ジデカノエート、ホルボール１３，１３−ジブチレート、ホルボール１２，１３−ジベンゾエート、およびホルボール１２，１３−ジアセテートからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。５．該植物由来マイトジェンがメゼレインおよびコンカナバリンＡである、請求項１に記載の方法。６．該植物由来マイトジェンがメゼレインおよびコンカナバリンＡである、請求項４に記載の方法。７．該出発細胞集団が臍帯血細胞であり、該植物由来マイトジェンがメゼレインおよびコンカナバリンＡであり、培養が約４日間行われる、請求項１に記載の方法。８．該増殖培地が無血清培地である、請求項１に記載の方法。９．該ならし培地を得るために、該出発細胞集団を１日から１０日までの期間培養する、請求項１に記載の方法。１０．１容量％から１０容量％までの該ならし培地の存在下、無血清培地で該リンパ造血細胞を培養する、請求項１に記載の方法。１１．該無血清培地中において、該ならし培地が約５容量％の濃度を有する、請求項１０に記載の方法。１２．１容量％から１０容量％までの血漿および１容量％から１０容量％までの該ならし培地を含有する培地で該リンパ造血細胞を培養する、請求項１に記載の方法。１３．該血漿が臍帯血の血漿である、請求項１２に記載の方法。１４．該血漿および該ならし培地のそれぞれが約５容量％の濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。１５．該リンパ造血細胞が成人ヒト末梢血単核細胞であり、この細胞を、約５容量％のならし培地を含有する無血清培地で５日間から１４日間培養して、ＣＤ４⁺ リンパ球の増殖集団を得る、請求項１に記載の方法。１６．該リンパ造血細胞が成人ヒト末梢血単核細胞であり、この細胞を、約５容量％のならし培地を含有する無血清培地で１４日間から３５日間培養して、ＣＤ８⁺リンパ球の増殖集団を得る、請求項１に記載の方法。１７．該リンパ造血細胞が臍帯血細胞であり、この細胞を、臍帯血血漿およびならし培地のそれぞれを約５容量％で含有する無血清培地で５日間から１４日間培養して、ＣＤ４⁺リンパ球の増殖集団を得る、請求項１に記載の方法。１８．該リンパ造血細胞が臍帯血細胞であり、この細胞を、臍帯血血漿およびならし培地のそれぞれを約５容量％で含有する培地で１４日間から３５日間培養して、ＣＤ８⁺リンパ球の増殖集団を得る、請求項１に記載の方法。１９．該リンパ造血細胞が臍帯血細胞であり、この細胞を、臍帯血血漿およびならし培地のそれぞれを約５容量％で含有する培地で８日間から１３日間培養して、ＣＤ５６⁺ＣＤ１６⁺リンパ球の増殖集団を得る、請求項１に記載の方法。２０．該リンパ造血細胞が臍帯血細胞であり、この細胞を、臍帯血血漿およびならし培地のそれぞれを約５容量％で含有する培地で３０日間から４０日間培養して、ＣＤ８⁺ＣＤ３⁺ＴｃＲ⁺ＣＤ５６⁺ＣＤ１６^-リンパ球の増殖集団を得る、請求項１に記載の方法。２１．選択された天然（非組換え）のサイトカインおよび特にケモカインの供給源である培地。２２．メゼレインで刺激された単核細胞から得られ、Ｔ細胞促進活性を有する成分。２３．ＣｏｎＡで刺激された単核細胞から得られ、Ｔ細胞促進活性を有する成分。２４．複数のコンポーネントならし培地を含有するならし培地。２５．該コンポーネントならし培地がＣＭ（Ｍ）およびＣＭ（Ｃ）を含む、請求項２４に記載のならし培地。２６．ＩＬ−２をさらに含む、請求項２５に記載のならし培地。２７．臍帯血または成人血液から得られる、ＣｏｎＡ、メゼレイン、およびそれぞれ異なるものによって産生され、選択されたリンパ球集団の増殖における異なる適用を有するサイトカイン単核細胞。２８．Ｔヘルパー細胞サブセットのＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ３、ならびにＴ細胞傷害性サブセットのＴｃ１およびＴｃ２などの、選択されたサイトカインを分泌するＴリンパ球細胞サブセットを選択的に生産するＣＭの作製および組成。２９．所望の免疫応答を促進するか、そうでなければ所望の免疫応答を制御するためにｉｎｖｉｖｏで養子伝達を行った後に、免疫系を調節するために、選択されたサイトカインを分泌するＴ細胞の使用。３０．自己細胞または同種細胞に関して使用し得るＣＭ。３１．間質細胞またはアクセサリー細胞フィーダー層を必要としない、無血清培地中でのＣＤ４⁺細胞またはＣＤ８⁺細胞の増殖あるいは両者の増殖。３２．１つの未濃縮細胞集団からリンパ球の所望の組合せを得るための、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞、およびＣＤ８⁺Ｔ細胞、他のサブセットの順次増殖。３３．リンパ球サブセットの上流または下流の精製。３４．ＴｃＲγδ⁺Ｔ細胞の増殖。３５．サイトカイン誘導キラー細胞：ＣＤ３⁺、ＣＤ８⁺、ＣＤ５６⁺、ＴｃＲα β⁺、ＣＤ１６^-の増殖。３６．ナチュラルキラー細胞：ＣＤ５６⁺、ＣＤ１６⁺の増殖。３７．二重陽性Ｔ細胞：ＣＤ３⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺の増殖。３８．二重陰性Ｔ細胞：ＣＤ３⁺、ＣＤ４^-、ＣＤ８^-の増殖。３９．選択されたリンパ球の産生を制御するためのヒト血漿の使用。４０．疾患を予防または治療するために、細胞性ワクチンとして増殖リンパ球の予防的または治療的な使用。４１．増殖された細胞を自己治療または同種治療において使用し得ること。４２．軽減したＧｖＨＤなどの特殊な特性を有し得る、細胞治療に必要なＨＬＡ一致の同種臍帯血Ｔ細胞。４３．腫瘍特異的キラー細胞を富化して、腫瘍細胞を同時に枯渇／除去するための、ガン患者から得られる腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖。４４．ホジキン病を治療するための増殖されたＴ細胞の使用。４５．移植片対白血病または他の悪性腫瘍のための増殖されたＴ細胞の使用。４６．移植片対自己免疫疾患のための増殖されたＴ細胞の使用。４７．固形器官の移植を容易にするための増殖されたＴ細胞の使用。４８．骨髄または幹細胞の移植を容易にするための増殖されたＴ細胞の使用。４９．例えば、固形器官の移植を容易にするかまたは自己免疫疾患を治療するための寛容を誘導するために選択されたＴ細胞の使用。５０．抗ウイルス効果または他の感染性疾患に対する増殖されたＴ細胞の使用。５１．ＥＢＶで誘導された移植後リンパ増殖異常、ヒトパピローマウイルスで誘導された頚ガン、ＨＬＴＶ−１およびＨＬＴＶ−２、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎などのウイルス媒介ガンを治療するために増殖されたＴ細胞の使用。５２．アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスによって誘導される疾患を治療するために増殖されたＴ細胞の使用。５３．固形器官または骨髄の移植を容易にするための薬物治療によって、あるいはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２などの特定のウイルス感染の結果として抑制され得る機能的な免疫系を回復または増強するための増殖されたＴ細胞の使用。５４．ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に感染している患者のＴｃＲレパートリーを回復するための増殖されたＴ細胞の使用であって、細胞は自己または同種であり、好ましくは臍帯血Ｔ細胞であり得る使用。５５．選択されたリンパ球集団への遺伝子形質導入、および感染性疾患、ガンおよび自己免疫疾患を治療するためのその治療的使用。５６．Ｔ細胞をＨＩＶによる感染に対する抵抗性にするために、ＨＩＶ−１⁺およびＨＩＶ−２⁺の患者から得られた選択されたＴ細胞、特にＣＤ４⁺Ｔ細胞の遺伝子形質導入。