JP4435985B2 - TcRγδT細胞の生産方法 - Google Patents
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Description
【発明の分野】
本発明はex vivoでTcRγδ+T細胞を増すための新規な培養方法に関する。
【0002】
【発明の背景】
TcRγδ+T細胞は循環性Tリンパ球中の小サブセットであって、古典的クラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)拘束的に、異物ペプチド抗原を精密な特異性で認識する従来のTcRαβ+T細胞とは異なる。TcRγδ+T細胞は、ウィルスによる感染やトランスフォーメーションなどのストレスによって誘発される内因性細胞生成物に由来するか、または外来微生物に由来する、ペプチド性抗原と非ペプチド性抗原の双方を認識することができる。その上、TcRαβ+T細胞による抗原認識と異なり、TcRγδ+T細胞による抗原認識はMHCによって拘束されない。
【0003】
TcRαβ+ およびTcRγδ+T細胞のT細胞受容体は、それらをコードする異なる遺伝子エレメントによって識別される。大部分のTcRγδ+T細胞は、そのδ鎖をコードする遺伝子に基いて、2種の主要なサブセット、Vδ1+およびVδ2+に分類される。ヒト末梢血中のTcRγδ+T細胞の主要サブセットはVγ9と共にVδ2を発現するが、その他の多くのものはVγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5またはVγ8と共にVδ1を発現する(Salerno,A.とDieli,F.,1998年)。
【0004】
TcRγδ+T細胞はTcRαβ+T細胞が有する精密な特異性を欠いていることから、これらが感染や腫瘍に対する最前線の監視機能をになっている、より原始的な免疫機構であるという考えが出されている(Boismenu,R.等、1997年)。幾つかの研究で、様々なウィルス、細菌および寄生体に対するTcRγδ+T細胞の反応(Bukowski,J.F.等、1994年;Wallace,M.等、1995年;Lang,F.等、1995年;Elloso,M.M.等、1996年)および、これらの細胞が様々な起源の腫瘍細胞の溶解を引き起こす能力を持つこと(Zocchi,M.R.等、1990年;Kitayama,J.等;1993年;Choudhary,A.等、1995年)が記録されている。Vγ1.1トランスジーンを発現するトランスジェニックマウスは注入されたT細胞白血病に対し自発的な抵抗性を示し、これらのマウスから誘導されたTcRγδ+T細胞ハイブリドーマは非造血性腫瘍細胞より造血性悪性細胞に選択的に反応する(Penninger,J.等、1995)ことから、造血性腫瘍はTcRγδ+T細胞による溶解作用を特に受け易いようである。加えて、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄白血病の患者の末梢血および骨髄に由来するヒトTcRγδ+T細胞クローンは、自家白血病細胞をそれぞれ溶解することが示された(Bensussan,A.等、1989;Jahn,B.等、1995年)。更に、同種骨髄移植後の白血病患者の無病生存期間の伸長は、末梢血中のTcRγδ+T細胞の数や割合の増加と関連があることが示されている(Lamb,L.S.等、1996年)。まとめると、これらの結果からTcRγδ+T細胞が癌や感染症の治療において潜在的な治療能力を有することが示唆される。
【0005】
ヒトTcRγδ+T細胞のex vivoでの拡大増殖について報告されている方法の多くは、抗原の存在を必要としている。確立された腫瘍細胞系と同様に、ウィルス感染細胞やトランスフォーム細胞や細胞系、細菌、寄生体がTcRγδ+T細胞のex vivoでの増殖を刺激することが示されている。例えば、herpes simplexウィルス(HSV)感染細胞がVδ2+細胞の増殖を刺激するために使用されており(Bukowski,J.F.等、1994年)、またEpstein−Barrウィルス(EBV)でトランスフォームされたBリンパ芽球様細胞系がVδ1+細胞の拡大増殖を刺激するために使用されている(Orsini,D.L.M.等、1993年)。結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の抽出物および血中期のPlasmodium falciparumのマラリア抗原が、TcRγδ+T細胞の増殖を刺激することが示されている(Constant,P.等、1994年;Elloso,M.M.等、1996年)。不死化ヒトバーキットリンパ腫細胞系であるDaudiもTcRγδ+T細胞の増殖を刺激することができる(Kaur,I.等、1993年)。その上、性質のよくわかっているプレニルリン酸系の非ペプチド性抗原、例えばイソペンテニリルピロリン酸が、TcRγδ+T細胞のex vivoでの拡大増殖を刺激することが示された(Garcia,V.E.等、1998年)。これらの系のいくつかでは、TcRγδ+T細胞の抗原刺激培養にIL−2、IL−4または他のサイトカインが添加されている。
【0006】
TcRγδ+T細胞は次のような方法で腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)の集団からもex vivoで拡大増殖されている。IL−2と一緒に培養する(Zocchi,M.R.等、1990年);固定化抗CD3抗体とIL−2を併用する(Kitayama,J.等、1993年);抗TcRγδ抗体と一緒に培養する(Yu,S.等、1999年);などである。これらの系では、癌組織からT細胞を単離する前にすでに、腫瘍抗原によるTcRγδ+T細胞の選択的刺激がin vivoで起こっていると推定される。
【0007】
別の系では、グリオブラストーマ患者の末梢血からTcRγδ+T細胞を拡大増殖させるのに、まず固相の固定化抗CD3抗体とIL−2とを組み合わせて用いた後、IL−2だけで培養している(Yamaguchi,T.等、1997年)。この著者等は、それから精製されたTcRγδ+T細胞はIL−2だけが存在する条件下で1週間以上増殖を続けることができなかったと報告し、したがってこの方法は短期の研究にしか適用できないだろうと結論している。彼等は更に、その方法ではTcRγδ+T細胞とTcRαβ+T細胞双方の拡大増殖と富化が起こり、TcRγδ+T細胞の純度は28%程度であることを示した。その後の報告で、同じ著者等は、この方法が選択的にVδ2+サブセットを拡大増殖させることを示した(Suzuki,Y.等、1999年)。
【0008】
したがって、TcRγδ+T細胞をex vivoで培養し拡大増殖させるための現行の方法では、細胞増殖に限界があり、および/または抗原刺激が必要である。更に、多くの報文がVδ2+サブセットの増殖を報告しているが、Vδ1+サブセットの増殖を報告している報文はほとんどなく、単一の培養でVδ1+およびVδ2+T細胞サブセット双方の増殖を報告している報文は全くない。
【0009】
以上を考えると、TcRγδ+細胞を多量にin vitroで選択的に培養する方法が当分野で必要とされている。
【0010】
【発明の概要】
本発明は、外因性抗原の不在下の培養でTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる新規な方法を提供する。したがって、本発明は
(1)T細胞マイトジェンおよび少なくとも2種のサイトカインを含む第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
(2)TcRγδ+T細胞を拡大増殖させるために、少なくとも2種のサイトカインを含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養すること、とを特徴とする、出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0011】
実施形態の1つでは、本発明は
(1)(a)T細胞マイトジェン、(b)インターロイキン−2および(c)インターロイキン−4を含む第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養し、
(2)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、(1)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を拡大増殖させること
を特徴とする、出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0012】
他の実施形態では、本発明は
(1)出発試料から低密度単核細胞(LDMNC)を得て、
(2)(a)T細胞マイトジェン、(b)インターロイキン−2および(c)インターロイキン−4を含む第1の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養し、
(3)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、ステップ(2)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を拡大増殖させる、
事を特徴とする、出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0013】
好ましい実施形態では、第1の培地中で細胞を培養する前に、細胞から非CD4+細胞または非TcRγδ+細胞を除去しておく。
【0014】
他の実施形態では、本発明は
(1)白血球馴らし培地(コンディションドメディウム)からなる第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
(2)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を拡大増殖させること、
を特徴とする出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0015】
更に他の実施形態では、本発明は
(1)出発試料から低密度単核細胞(LDMNC)を得ることと、
(2)白血球馴らし培地からなる第1の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養することと、
(3)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、ステップ(2)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を拡大増殖させること、
を特徴とする出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0016】
本方法により得られるTcRγδ+T細胞を実験的、治療的および商業的な様々な用途に使用することができる。
【0017】
本発明のその他の特徴および利点は、次の詳細な説明から明らかとなろう。しかし、本発明の精神および範囲の中での様々な変更や改変は、当分野の技術者には詳細な記述から明らかになると思われるので、この詳細な記述および本発明の好ましい実施形態を示す個々の実施例は例示だけのために提示されていると理解すべきである。
【0018】
図を参照しながら本発明を以下に説明する。
本発明は、培養中にTcRγδ+T細胞を選択的に拡大増殖させる新規な方法を提供する。本法は未分画出発試料またはT細胞の富化された出発試料のいずれをも使用することができる。本発明の方法の利点は、他の方法のほとんどが必要とする抗原刺激の使用を必要としないことである。
【0019】
したがって、本発明は
(1)T細胞マイトジェンおよび少なくとも2種のサイトカインを含む第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
(2)少なくとも2種のサイトカインを含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を拡大増殖させること、
を特徴とする、出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0020】
第1および第2の培地中の2種のサイトカインは、同一であつても異なっていてもよい。2種のサイトカインは培地間で同一であることが好ましく、2種のサイトカインがインターロイキン−2およびインターロイキン−4であることがより好ましい。
【0021】
本発明は、一態様として、
(1)(a)T細胞マイトジェン、(b)インターロイキン−2および(c)インターロイキン−4を含む第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
(2)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を拡大増殖させること
を特徴とする、出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0022】
出発試料はTcRγδ+T細胞またはその前駆体を含有する任意の試料であってよく、血液、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、ひ臓、癌組織、リンパ節組織、感染組織、胎児組織およびそれらの分画物または富化部分などがあるが、特に限定されない。好ましくは出発試料は、軟膜(buffy coat)細胞、単核細胞および低密度単核細胞(LDMNC)を含んでいる末梢血または臍帯血などの血液またはその分画物などである。細胞は、密度勾配遠心分離などの当分野で公知の技術を用いて、出発血液試料から得られる。例えば、全血を等体積のFicoll−HypaqueTM上に重層後、室温で30分間400×gで遠心分離する。界面にくるものには低密度単核細胞が含れると予想され、この細胞を集めて、培地で洗浄し、室温で10分間100×gで遠心分離することができる。TcRγδ+T細胞を得るために培養する前は、細胞はAIM−VTM、RPMI1640またはIMDMなどの任意の適当な哺乳類用培地中に維持することができる。
【0023】
出発試料またはその分画物(LDMNCなど)を第1の培地中で培養する前に、出発試料またはその分画物を一定の細胞型について富化し、および/または他の細胞型を除去してもよい。特に、出発試料またはその分画物をCD4+細胞について富化してもよいし、またはTcRαβ+T細胞を除去してT細胞を富化してもよい。試料は当分野で公知の技術を用いて、ある細胞型を富化または除去することができる。一実施形態では、出発試料またはその分画物を、除去する細胞上のマーカーに特異的な抗体を含有する抗体カクテルと共に培養することによつて、特定の表現型の細胞を除去してもよい。カクテル中の抗体は、Landsdorpに与えられた米国特許第4868109号に記載のような四量体抗体複合体であることが好ましい。
【0024】
必要に応じて出発試料中の細胞を分画し、富化したならば、T細胞マイトジェンおよび少なくとも2種のサイトカイン、好ましくはインターロイキン−2(IL−2)およびインターロイキン−4(IL−4)を含む第1の培地中で細胞を培養する。T細胞マイトジェンは約0.01から約100μg/mlの量で存在し、IL−2は約0.1から約1000ng/mlの量で存在し、IL−4は約0.1から約1000ng/mlの量で存在することが好ましい。T細胞マイトジェンが約0.1から約50μg/mlの量で存在し、IL−2が約1から約100ng/mlの量で存在し、IL−4が約1から約100ng/mlの量で存在することがより好ましい。T細胞マイトジェンが約0.5から約10μg/mlの量で存在し、IL−2が約2から約50ng/mlの量で存在し、IL−4が約2から約50ng/mlの量で存在することがより一層好ましい。第1培地がT細胞マイトジェンを1μg/ml、IL−2を10ng/mlおよびIL−4を10ng/ml含むことが最も好ましい。
【0025】
細胞は第1培地中で約3日から21日間培養することが好ましく、約5日から14日間培養することがより好ましい。
【0026】
T細胞マイトジェンは、植物起源および非植物起源のレクチン、T細胞を活性化させるモノクローナル抗体、および他の非レクチン/非抗体マイトジェンを含むがそれに限定されずに、T細胞を刺激することのできる任意の物質であってよい。好ましいレクチンはコンカナバリンA(ConA)であるが、フィトヘマグルチニン(PHA)などの他の植物レクチンが使用されてもよい。好ましい抗体はOKT3などの抗CD3抗体である。他のマイトジェンは、ホルボール12−ミリステート−13−アセテート(TPA)とその関連化合物、メゼレイン、スタフィロコッカスのエンテロトキシンA(SEA)およびストレプトコッカスのプロテインAを含む。T細胞マイトジェンは、可溶形態で、例えば、培地に溶かしてから添加するのが好ましい。
【0027】
第1の培地中で培養した後、細胞を遠心によって洗浄し、少なくとも2種のサイトカイン、好ましくはインターロイキン−2(IL−2)およびインターロイキン−4(IL−4)を含む第2の培地中で二次培養する。第2の培地中では、IL−2とIL−4の両物質が細胞を最大限に拡大増殖させるのに必要である。細胞をIL−2だけで二次培養すると、拡大増殖は2〜3日間連続するが、その後速やかに衰える。また、細胞をIL−4だけで二次培養すると、連続的な拡大増殖はさらに少ない。したがって、マイトジェンを除去した後連続的に細胞増殖させるためには、第2の培地中にIL−2とIL−4が共に存在することが必須である。
【0028】
二次培養のステップは、出発試料またはLDMNCが第1の培地中での培養前に分画されていない場合には特に、本発明の方法によるTcRγδ+T細胞の拡大増殖にとって重要である。LDMNCを分画した場合は二次培養のステップは任意選択となる。LDMNCを(IL−2/IL−4中で二次培養せずに)conA/IL−2/IL−4中で連続的に培養した場合は、TcRαβ+T細胞だけが拡大増殖するであろう(実施例4参照)。IL−2/IL−4中で(即ち、T細胞マイトジェンのconAを除去して)二次培養すると、TcRγδ+T細胞の拡大増殖が起こる。逆にconAを第1の培地から除いた場合、細胞の拡大増殖は全く起こらない。残存コンカナバリンAが患者に投与されることは望ましくないので、二次培養によってconAを除去することには、TcRγδ+T細胞が治療用途に一層ふさわしくなるというさらなる利点がある。TcRγδ+T細胞が実験、診断または他の非治療の用途向けならば、二次培養の段階でのT細胞マイトジェンの除去は不要かもしれない。
【0029】
第2の培地中に、IL−2が約0.1から約1000ng/mlの量で存在し、IL−4が約0.1から約1000ng/mlの量で存在することが好ましい。IL−2が約1から約100ng/mlの量で存在し、IL−4が約1から約100ng/mlの量で存在することがより好ましい。IL−2が約2から約50ng/mlの量で存在し、IL−4が約2から約50ng/mlの量で存在することがより一層好ましい。第2の培地がIL−2を10ng/mlおよびIL−4を10ng/ml含むことが最も好ましい。
【0030】
LDMNCを第2の培地中で約3日から約21日にわたり培養することが好ましく、約9日から約13日にわたり培養することがより好ましい。
【0031】
第1および第2の培地は、TcRγδ+T細胞の生育と拡大増殖を補助し得る他の成分を追加として含んでもよい。添加してもよい他の成分の例は、血清または血漿、IL−12、IL−15、腫瘍壊死因子(TNF)およびインターフェロン(IFN)、アルブミンなどの精製蛋白質、低密度リポ蛋白質(LDL)などの脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイドおよび成長および/または生存を支持、促進する任意の他の補助物質を含むが、このようなものに限定されるわけではない。
【0032】
第1および第2の培地には、共に血清または血漿(P)を添加しておくことが好ましい。第1および第2培地中のP量は、約1%から約25%であることが好ましい。第1および第2培地中のP量は、約2%から約20%であることがより好ましい。第1および第2培地中のP量は、約2.5%から約10%であることがより一層好ましい。第1および第2培地中のP量は、5%であることが最も好ましい。血清または血漿(P)は、ヒト末梢血、臍帯血、または他の哺乳動物種由来の血液などの、任意の供給源から得ることができるが、これらに限定されない。血漿は1人のドナーから得たものでも、数人のドナーからまとめたものでもよい。自家TcRγδ+T細胞を臨床的に使用する、即ち、出発試料を得た同じ患者に再注入しようとする場合、異物(例えばウィルス)がその患者に導入されることを避けるために、Pも自家性の(即ち、同じ患者由来の)Pを使用することが好ましい。TcRγδ+T細胞を同種間で使用しようとする(即ち、出発試料を得た人と異なる人に注入する)場合、異物がその患者に導入されるのを最小限に抑えるために、どちらか一方から得た血漿を使用することが好ましい。動物生成物の患者への投与を避けるために、最低でもその血漿はヒト由来のものとすべきである。
【0033】
本発明の他の態様では、第1の培地中のT細胞マイトジェンおよび少なくとも2種のサイトカインは、XLCMなどの白血球馴らし培地から由来するものであってもよい。XLCMTMは、実施例1に記載されるような、臍帯血から調製される馴らし培地であり、T細胞マイトジェン(ConA)および数種のサイトカインを含有する。XLCMはごく僅かのIL−2およびほとんど検出できないIL−4を含有する。
【0034】
したがって、本発明は、
(1)白血球馴らし培地を含む第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
(2)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、(1)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を拡大増殖させること、
とを特徴とする、出発試料中のTcRγδ+T細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【0035】
ステップ(1)で出発試料中の細胞群を培養する前に、前記のようにT細胞を富化しておくことが好ましい。
好ましい実施形態では、白血球馴らし培地はXLCMである。XLCMは、約1%から約25%の量で第1の培地中に存在するのが好ましい。XLCMは、約2%から約20%の量で第1の培地中に存在するのがより好ましい。XLCMは、約2.5%から約10%の量で第1の培地中に存在するのがより一層好ましい。第1の培地が5%のXLCMを含有するのが最も好ましい。第2の培地中のIL−2およびIL−4は、前記の通りであることが好ましい。第1および第2の培地は、前記のように血清または血漿を含有することが好ましい。
【0036】
本発明の方法はTcRγδ+T細胞の拡大増殖細胞集団を生じる。「拡大増殖」とは、最終調製品中の所望または標的の細胞型(即ち、TcRγδ+T細胞)の数が、開始時の、すなわち出発細胞集団中の数より多いことを意味する。
【0037】
本発明の方法により得られるTcRγδ+T細胞を、蛍光活性化細胞選別、免疫磁気分離、アフィニティーカラムクロマトグラフィ、密度勾配遠心分離および細胞パニング(panning)を含む当分野で公知の技術を用いて、最終培養物中に存在する他の細胞から分離することができる。
【0038】
本発明には、本発明の方法によって得られるTcRγδ+T細胞が含まれる。したがって、本発明はTcRγδ+T細胞の細胞調製品を提供する。TcRγδ+T細胞は、富化した集団中の全細胞の好ましくは60%超、より好ましくは80%超、最も好ましくは90%超を含む。
【0039】
従来技術の方法とは異なり、Vδ1+とVδ2+ の両方のTcRγδ+T細胞が本発明の方法によって増大する。したがって、本発明はVδ1+TcRγδ+T細胞とVδ2+ TcRγδ+T細胞を含むTcRγδ+T細胞の細胞調製品を提供する。細胞調製品は、調製品中の全TcRγδ+T細胞の内、約50〜90%のVδ1+ TcRγδ+T細胞および約10〜50%のVδ2+ TcRγδ+T細胞を含むことが好ましい。細胞調製品は、調製品中の全TcRγδ+T細胞の内、約70%のVδ1+ TcRγδ+T細胞および約30%のVδ2+ TcRγδ+T細胞を含むことがより好ましい。本発明のTcRγδ+T細胞調製品は、T細胞マイトジェンを含まないか、実質的に含まないという利点がある。
【0040】
本発明は、本発明の方法によって得られるTcRγδ+T細胞の、任意のあらゆる用途における使用も含む。TcRγδ+T細胞は、感染性病原体に対する防御における第一線と考えられている。その上、TcRγδ+T細胞は、B細胞リンパ腫、肉腫および癌腫を含む様々な起源のトランスフォーム細胞に対して、固有の細胞溶解活性を有する。その結果、本発明の方法により得られ、ex vivoで培養されたTcRγδ+T細胞は、感染症、癌または免疫抑制から生じる疾患の治療や予防のために、患者に注入することができる。本発明のTcRγδ+T細胞にはConAやウシ胎児血清が含まれないので、ヒトの治療用途に有用であることは利点である。したがって、本発明は、本発明の方法によって調製した有効量のTcRγδ+T細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、免疫反応を調節する方法を提供する。
【0041】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、所望の結果を得るのに必要な投与量と期間において効果のある量を意味する。
【0042】
本明細書で使用する「動物」という用語は、動物界の全ての種を含む。好ましくは、動物は哺乳類、もっと好ましくはヒトである。
【0043】
本発明は、実施形態の1つとして、本発明の方法で調製した有効量のTcRγδ+T細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、感染症を治療する方法を提供する。
【0044】
治療される感染症の例は、Mycobacteriaによって起こされるもの(例えば結核)などの細菌感染症、herpes simplexウィルス(HSV)、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)、または肝炎ウィルスによって起こされるものなどのウィルス感染症、およびPlasmodiumによって起こされるもの(例えばマラリア)などの寄生体感染症を含むが、これらに限定されない。
【0045】
本発明は、別の実施形態として、本発明の方法で調製した有効量のTcRγδ+T細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【0046】
本発明によって治療される癌の例は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、およびT細胞白血病とB細胞白血病を含む白血病、リンパ腫(ホジキン病および非ホジキン病)、リンパ増殖性疾患、プラズマ細胞腫、組織球腫、黒色腫、アデノーマ、肉腫、充実組織の癌腫、低酸素性腫瘍、扁平上皮癌、子宮頚部癌や膀胱癌などの泌尿生殖器癌、造血癌、頭部癌と頚部癌、および神経系癌を含むが、これらに限定されない。
【0047】
好ましい実施形態の1つで本発明は、本発明の方法によって調製した有効量のTcRγδ+T細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、慢性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。このような実施形態では、慢性骨髄性白血病(CML)患者からLDMNCを得ることができる。TcRγδ+T細胞を得るために培養し増大させた後は、単離される細胞はCML癌細胞を含まないので、その患者に再輸血するのに好適である。
【0048】
本発明には、前記のように免疫反応を調節し、感染症を治療し、または癌を治療するために、本発明の方法によって得られるTcRγδ+T細胞を使用することも含まれる。本発明は更に、前記のように免疫反応を調節し、感染症を治療し、または癌を治療するための医薬または製剤組成物を調製するための、本発明の方法によって得られるTcRγδ+T細胞の使用も含む。
【0049】
本発明に従って単離されるTcRγδ+T細胞を、例えばその細胞の機能を更に研究し、解明するために、実験モデルにおいて使用することもできる。その上、これらの細胞を、TcRγδ+T細胞によって認識される抗原/エピトープの同定を目標とした研究、およびワクチンの設計と開発のために使用してもよい。
【0050】
本発明に従って単離されるTcRγδ+T細胞を、上記の治療、実験または商業の用途に直ちに使用してもよいし、あるいは、後日使用するためにその細胞を凍結保存してもよい。
【0051】
以下の非限定的実施例は、本発明を例示するものである。
【0052】
【実施例】
以下の方法は、抗原や補助細胞の不在下、液体培養中でのTcRγδ+T細胞の大規模なex vivoでの拡大増殖に関する。出発材料はヒト末梢血から採取した低密度単核細胞(LDMNC)からなる。LDMNCは、
(1)CD4+T細胞の富化、または
(2)TcRαβ+T細胞の除去を伴ったT細胞の富化、によって更に分画してもよいし、あるいは
(3)それ以上分画しなくてもよい。その細胞を、XLCM、ヒト血清または血漿(P)、コンカナバリンA(conA)、インターロイキン−2(IL−2)およびインターロイキン−4(IL−4)の組合せを含有する培地中で培養するのが好ましい。頻繁に細胞をカウントし、新鮮培地、およびXLCM、P、conA、IL−2およびIL−4の組合せと共に再植種する。特定の表面マーカーを発現する細胞のパーセントを、特異抗体およびフローサイトメトリーを用いて決定する。
【0053】
実施例1
CD4e:XLCM/P⇒TcRγδ+T細胞
低密度単核細胞(LDMNC)を成人末梢血からFicoll−Hypaque(密度=1.077g/ml)を用いた密度勾配遠心分離によって単離した。体積15mlの全血を、50mlの組織培養コニカルチューブ中で等体積のFicoll−Hypaque上に重層し、次いで室温で30分間400×gで遠心分離した。単核細胞が含まれる界面物質を集め、細胞を室温で10分間100×gで遠心分離することにより、培地(20単位/mlのヘパリンおよび50μMの2−メルカプトエタノールを含有するAIM−V;無血清培地=HCBM−2)中で2回洗浄した。細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)含有HCBM−2で希釈し、37℃、5%CO2で一晩、ポリスチレン製組織培養フラスコ中でインキュベートした。翌朝、細胞を遠心分離によって2回洗浄し、HCBM−2中に再懸濁した。細胞懸濁液からとったサンプルを2%酢酸で1:20に希釈し、有核細胞の全数を血球計数器を用いて決定した。
【0054】
CD4+T細胞(CD4e)を、系統特異抗体および免疫磁気アフィニティークロマトグラフィ(StemSEP,Stem Cell Technologies,Vancouver,BC)を用いた負の選択によってLDMNCから富化した。合計1.7×107個のLDMNCを遠心分離によってペレット化し、2%FBSを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS/FBS)中で2回洗浄した。その細胞を1mlのPBS/FBS中に再懸濁し、系統特異性モノクローナル抗体のカクテルを添加した。このカクテルはCD8(細胞傷害性T細胞)、CD14(単球)、CD16(NK細胞)、CD19(B細胞)、CD56(NK細胞)およびグリコホリンA(赤血球)に対して特異的な抗体を含有している。これらは、挙げられた系統特異マーカーに対する特異性およびデキストランに対する特異性とを有する両特異性抗体である。LDMNCを氷上で30分間、二重特異性抗体とインキュベートし、その後鉄デキストランコロイドを添加し、インキュベーションを更に30分間継続した。次いで、抗体が結合した細胞および鉄デキストラン粒子を除去するため懸濁液の免疫磁気クロマトグラフィを行った。したがって、回収された細胞は、CD4+T細胞(CD3+、TcRαβ+)ならびにTcRγδ+T細胞を含む標的抗原欠損細胞の富化集団であった。得られたCD4eの収量は2×106個であった。
【0055】
CD4e細胞を、5%(体積で)XLCMおよび5%ヒト臍帯血漿(P)を含有するHCBM−2中で拡大増殖させた。XLCMは、ヒト臍帯血細胞をメゼレインとコンカナバリンAで刺激することによって調製された馴らし培地である(J.Immunotherapy 8:129,1999;J.Immunotherapy and Stem Cell Research 8:525,1999;および国際公開第9833891号)。XLCMは刺激因子および阻害因子の複雑な混合物であり、それらの因子中少なくとも23種が測定されている(J.Hematotherapy and Stem Cell Research 8:525,1999)。
【0056】
CD4e細胞を5%XLCMおよび5%Pを含有するHCBM−2中で、1×105細胞/mlに希釈し、37℃、5%CO2で数日間インキュベートした。その間に細胞は8倍に拡大増殖した。細胞数および生存率は、細胞再懸濁液から取ったサンプルを等体積の0.4%トリパンブルーと混合し、血球計数器を用いて非染色細胞(生存している)および青色細胞(生存していない)を計数することによって、決定した。細胞を継代するには、少量の培養物を新鮮培地で1×105細胞/mlに再希釈し、新鮮XLCMおよびPを各々5%の最終濃度になるよう加えた。培養物の残りはフローサイトメトリー分析のために使用するか、または廃棄した。その後、同じように細胞を5%XLCMおよび5%Pで補給した新鮮培地の中で2〜3日毎に継代した。総増殖倍率を各継代で測定した拡大増殖倍率の積として計算し、細胞が全て連続培養中に保持されていると仮定して、全生存細胞の理論収量を初期播種濃度と量、および各継代における拡大増殖倍率に基いて計算した。約3から4週後には、細胞は10万倍以上拡大増殖した(図1)。
【0057】
各継代において、TcRγδを発現するパーセントおよびVδ1を発現するパーセントを決定するために、拡大増殖細胞の一部をフローサイトメトリーによって分析した。培養して21日後、培養細胞の65%超がTcRγδ+であり、これらのTcRγδ+T細胞の大部分(>70%)がVδ1+であった(図1)。TcRγδ+T細胞の割合は27日までに更に増加し、その時点で培養細胞の70%超がTcRγδ+であり、これらの約90%がVδ1+であった。
【0058】
これらのTcRγδ+T細胞は、CD4eの中に存在する、この条件下で選択的に拡大増殖する小集団に由来すると考えられている。
【0059】
これは予想外で新規な知見であった。その理由は以下の通りである。
(a)XLCMまたはXLCM+Pの中で連続的に拡大増殖する未分画LDMNCは、ほぼ完全にTcRαβ+であって、TcRγδ+T細胞は存在する場合でもごく僅かである(J.Hematotherapy and Stem Cell Research 8:525,1999)。
(b)(血漿なしの)XLCMだけでは、TcRγδ+T細胞サブセットの拡大増殖は起こらない(J.Hematotherapy and Stem Cell Research,1999)。
(c)XLCMなしでは細胞拡大増殖は全く起こらない。
【0060】
実施例2
TeABd:XLCM/P⇒TcRγδ+T細胞
実施例1に記載したように、LDMNCを成人末梢血から単離した。抗体カクテルがTcRαβ+細胞除去抗体(ABd)とT細胞富化カクテル(Te)からできていること以外は、実施例1に記載の方法と同じ方法の負の選択によって、TcRγδ+T細胞をLDMNCから富化した。T細胞富化カクテルは、CD14(単球)、CD16(NK細胞)、CD19(B細胞)、CD56(NK細胞)およびグリコホリンA(赤血球)に対して特異的な抗体からなっている。1.7×107個の開始時LDMNC数から、合計1.3×105個のTeABd細胞を得た。
【0061】
TeABd細胞を、実施例1に記載するように、5%XLCMおよび5%Pを含有するHCBM−2中で培養した。
【0062】
約4週の期間を経て、細胞は10万倍を超えるまでに拡大増殖した(図2)。培養8日目から、拡大増殖細胞は50%超がTcRγδ+であり、12日目後に80%超の純度に達した。やはりTcRγδ+T細胞の大多数はVδ1+であった(>70%)。
【0063】
実施例2の方法は、論理的に実施例1の方法から導かれる。即ち、CD4e中に存在する細胞の小亜集団から、TcRγδ+T細胞を増大させることができるならば、TeABd中に存在する相対的により富化された集団からも、それらの細胞を増大させることができるはずである。
【0064】
−実施例2に記載する方法の利点−
実施例2の方法では、実施例1の方法を用いて得られるものに比較して、TcRγδ+T細胞がより速やかに、より高い水準にまで拡大増殖し、かつより純粋であった。
【0065】
実施例3
LDMNC:XLCM/P→IL−2/IL−4/PまたはIL−2/PまたはIL−4/PまたはP
実施例1に記載したように、LDMNCを成人末梢血から単離し、更なる分画や富化をすることなく培養した。
LDMNCを、5%XLCMを含有するHCBM−2の中で4日間拡大増殖させ、その後遠心分離によってペレット化し、洗浄し、5等分した。5%XLCMおよび5%Pを含有するHCBM−2の中で、1部分を二次培養した。別の1部分は10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で二次培養した。別の1部分は10ng/mlIL−2+5%Pを含有するHCBM−2の中で二次培養した。別の1部分は10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で二次培養した。最後の1部分は5%Pだけを含有するHCBM−2の中で二次培養した。
【0066】
IL−2+IL−4+Pで二次培養した細胞は、XLCMの存在下で連続培養したものと同等か、それより良好に拡大増殖したが、Pだけで二次培養した細胞は速やかに死滅した(図3)。IL−2+Pで二次培養した細胞は、短期間は低速で拡大増殖し、その後完全に増殖が止まった。IL−4+Pで二次培養した細胞の拡大増殖は、IL−2+Pで二次培養した細胞よりさらに悪かった。
【0067】
これらの結果は、最大の細胞拡大増殖を実現するためには、IL−2とIL−4が共に必要であることを示す。
【0068】
実施例4
LDMNC:XLCM/P→IL−2/IL−4/P⇒TcRγδ+T細胞
実施例1に記載したように、LDMNCを成人末梢血から単離し、更なる分画や富化をすることなく培養した。
LDMNCを、5%XLCM+5%Pを含有するHCBM−2の中で5日間拡大増殖させから、その後2分して、一方は5%XLCM+5%Pを含有するHCBM−2の中で連続培養し、もう一方は洗浄し、10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で二次培養した。いずれの場合にも、細胞は4週間で10万倍を超えて拡大増殖した(図4)。しかし、フローサイトメトリーによる分析で、条件が異なると生じる細胞の種類が異なることが判明した。即ち、XLCM/P中で連続培養した細胞のうちTcRγδ+は5%未満であったが、XLCM/P中で培養された後、IL−2/IL−4/P中で二次培養された細胞の50%超がTcRγδ+であった。この実験ではフローサイトメトリー分析は22日目のみ行った。
【0069】
これらの条件下でのTcRγδ+T細胞の拡大増殖の知見は全く予想外であった。限定されたサイトカイン中での二次培養を行ったのは、培養細胞からXLCMを、より具体的には残存するメゼレインおよびコンカナバリンAを除去するためであった。この技法はXLCM中の連続培養で実現する水準と同等の拡大増殖水準を維持するが、異なるサブセット、即ちTcRγδ+T細胞サブセットが選択的に拡大増殖することが判明した。
【0070】
−利点−
実施例1および2に記載した方法と比較して、実施例4に記載した方法は開始時細胞集団の初期分画または富化を必要とせず、したがって開始時の細胞数は極めて少なくてもよい(例えば1×105)。その上、二次培養法は、XLCMおよびその成分、例えばコンカナバリンA、メゼレインおよび他の既知や未知の因子を培養細胞から除去する。
【0071】
実施例5
LDMNC:ConA/IL−2/IL−4/P→IL−2/IL−4/P⇒TcRγδ+T細胞
実施例1に記載したように、LDMNCを成人末梢血から単離し、分画や富化をすることなく培養した。
LDMNCを、1μg/mlコンカナバリンA+10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で5日間拡大増殖させた後、2分し、一方を1μg/mlコンカナバリンA+10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で連続培養し、残りの半分は洗浄し、10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で二次培養した。いずれの場合にも、細胞は4週間で10万倍超拡大増殖した(図5)。しかし、フローサイトメトリーによる分析で、条件が異なると生じる細胞の種類も異なることが判明した。即ち、コンカナバリンA+IL−2+IL−4+Pの中で連続培養された細胞の5%未満がTcRγδ+であったが、コンカナバリンA+IL−2+IL−4+Pの中で培養された後、IL−2+IL−4+P中で二次培養された細胞の50%超がTcRγδ+であった。この実験ではフローサイトメトリー分析は22日目だけ行った。
【0072】
これらの条件下でのTcRγδ+T細胞の拡大増殖の知見は、実施例4に述べた理由により予想外であった。即ち、限定されたサイトカイン中での二次培養は、培養細胞からXLCMを、より詳しくは残存するメゼレインおよびコンカナバリンAを除去するために行ったのである。この方法は、XLCM中またはコンカナバリンA+IL−2+IL−4+P中での連続培養が達成する水準と同等の拡大増殖水準を維持するが、異なるサブセット、即ちTcRγδ+T細胞サブセットが選択的に拡大増殖されることが判明した。
【0073】
−利点−
実施例4に記載した方法と同様に、LDMNCの初期分画や富化が不要で、細胞が非常に効果的に拡大増殖するので、開始時の細胞数は極めて少なくてもよい。その上、培養条件が完全に確定され、XLCMは本法のいかなる段階でも使用されず、かつ培養細胞はメゼレインに曝されない。
【0074】
実施例6
TeABd:ConA/IL−2/IL−4/P→IL−2/IL−4/P⇒TcRγδ+T細胞
LDMNCを、実施例1に記載のように成人末梢血から単離し、実施例2に記載のようにTeABdを富化した。実施例5に記載のようにTeABdを拡大増殖させた。即ち、1μg/mlコンカナバリンA+10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中でそれを培養し、その後、10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で二次培養した。一方で、培養物のあまりを廃棄しながら少量の培養物をサイトカインおよび血漿を加えた新鮮培地中に希釈することによって細胞を継代する代わりに、全量の培養物を増殖させ、連続培養の量をふやしながら全細胞を維持した。
【0075】
全血の開始時体積は50mlであった。開始時のLDMNC数は3.6×107であった。TeABdの収量は1×105であった。TeABdをコンカナバリンA+IL−2+IL−4+Pの中で計12日間培養した結果、その時点までに1.4mlの全体積中に合計3×106の細胞数に増殖した。この時点で培養細胞を遠心分離によってペレット化し、HCBM−2で1回洗浄した。洗浄細胞を全量30mlの培地に1×105細胞/mlとなるよう接種し、10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを添加した。この培養では同種臍帯血漿ではなく、自家血漿を使用した。10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で更に9日間、細胞をさらに増殖させた。全培養期間は21日であった。この時点で、細胞は300mlの全体積中に合計4.5×108にまで増殖した(図6a)。
【0076】
フローサイトメトリーによる分析の結果、培養21日の細胞の85%超がTcRγδ+であり、かつこれらの大部分(>70%)がVδ1+である一方、小さいが有意の割合(約10%)がVδ2+であった。その上、細胞の約10%がCD56を発現したが、3%未満しかCD16を発現せず、この方法がナチュラルキラー(NK)細胞の有意な拡大増殖を生じないことを示した。
【0077】
拡大増殖TcRγδ+T細胞の細胞傷害活性は、カルセイン放出試験を用いて示された。標的細胞を蛍光基質カルセインAMで標識し、TcRγδ+エフェクター細胞と共に様々なエフェクター:標的(E:T)比でインキュベートした。標的細胞の溶解を、カルセインの上清液中への放出を測定することによって検定した。エフェクターによる標的の特異的殺細胞率(パーセント)を、次式による相対蛍光単位(rfu)から計算した(式中「実験的rfu」とは、エフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞から放出されるカルセインによる蛍光測定量であり、「最大rfu」とは、洗剤(Triton X−100)で溶解される同数の標的細胞から得られる蛍光であり、「自発的rfu」とは、エフェクター細胞や洗剤のない状態でインキュベートした同数の標的細胞から得られる蛍光である)。即ち、
特異的溶解パーセント=(実験的rfu−自発的rfu)/(最大rfu−自発的rfu)×100
【0078】
P815は、表面にIgGのFc領域に対する受容体を有する、マウスの肥満細胞腫細胞系である。P815標的をOKT3(抗ヒトCD3モノクローナル抗体)で被覆することによって、標的細胞のエフェクターT細胞への結合が、T細胞特異性に関係なく、CD3発現によって実現される。したがって、OKT3被覆P815標的細胞の死滅は、特異性とは独立のエフェクター細胞の細胞溶解能を示す。EM−2およびK562はCML由来の細胞系であるが、DaudiはB細胞系でJurkatはT細胞系である。これらの全ての標的細胞は、殺されるには、エフェクター細胞によって認識される必要がある。図6b〜fは、実施例6の方法によって拡大増殖したTcRγδ+T細胞が細胞溶解能を有し、その上CML由来および非CML由来双方の標的細胞を認識し、死滅させることができたことを示す。
【0079】
TcRγδ+T細胞の一部を液体窒素中、10%自家Pおよび10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含有するHCBM−2中2×107細胞/mlの濃度で凍結保存した。融解後、凍結細胞の約71%が生存したまま回収され、融解細胞の全生存率は90%であった。融解細胞の約70%はTcRγδ+であり、その>70%はVδ1+であった。エフェクターとして融解細胞を用いたカルセイン放出試験は、融解細胞が凍結保存および融解の後で細胞溶解活性を保持しているが、その活性は試験された標的細胞の一部に対してある程度減少することを示した(図6g〜k)。これらの結果は、TcRγδ+T細胞を後日使用するために凍結保存することができることを示す。
【0080】
実施例7
TeABd33d:ConA/IL−2/IL−4/P→IL−2/IL−4/P⇒TcRγδ+T細胞
実施例1に記載したように、LDMNCを慢性骨髄性白血病患者の末梢血から単離し、実施例2に記載したように、TeABdを富化した。全血の開始時体積は43mlであった。LDMNCの開始時細胞数は8.6×107であり、TeABdの収量は2.5×107であって、開始時LDMNCの29%であった。この収量は、健常成人末梢血LDMNCから得られる収量(n=3、平均LDMNC=5.2×107、平均TeABd=3.4×105=<1%)に比較して極めて高かった。CML患者由来TeABdのフローサイトメトリーによるその後の分析から、CD33+骨髄前駆細胞の主要な非T細胞集団がCML−TeABdの約78%を占めることが明らかとなった。TcRγδ+T細胞を得るための培養の前にこの細胞サブセットを除去するために、CML患者細胞を用いる以後の実験では、抗CD33抗体をTeABdカクテルに添加した。できた抗体カクテルであるTeABd33dは、CD14、CD16、CD19、CD33、CD56およびグリコホリンAに対して特異的な抗体を含んでいる。
【0081】
次の実験で、実施例1に記載したように、LDMNCを(別の)CML患者の末梢血から単離し、前記の改良抗体カクテルを用いて、実施例2に記載したようにTeABd33dを富化した。全血の開始時体積は40mlであった。LDMNCの開始時細胞数は8.65×107であり、TeABd33dの収量は1.3×106(1.5%)であった。実施例6に記載したようにTeABd33dを拡大増殖させた。すなわち1μg/mlコンカナバリンA+10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中に、その細胞を1×105細胞/mlの密度で接種した。その細胞を全体積5ml中、14日間にわたりコンカナバリンA+IL−2+IL−4+Pの存在下で増殖させ、その時点で細胞を遠心分離によってペレット化し、洗浄した後、10ng/mlIL−2+10ng/mlIL−4+5%Pを含有するHCBM−2の中で二次培養した。次の13日間(全培養期間は27日であった)で細胞は全部で1600mlの培養体積まで殖え、その時点で細胞収量は1.2×109であった。細胞は尚も増殖中であったが、細胞を収穫し、この時点で使用した。増殖速度のグラフを図7aに示す。
【0082】
フローサイトメトリーによる分析の結果、細胞の72%がTcRγδ+であり、かつこれらの大部分(>60%)がVδ1+であって、一方33%がVδ2+であった。やはり、3%未満の細胞しかCD16を発現せず、NK細胞はこの培養中拡大増殖しなかった。
【0083】
標準的なGバンド法を用いた細胞遺伝学的分析によれば、拡大増殖細胞は非白血病性で、クローンの細胞遺伝学的異常は、CMLの特徴であるフィラデルフィア染色体を含めて検出されなかった。IL−2およびIL−4のない状態でHCBM−2+5%Pの中で細胞を引き続き培養すると、細胞死が起こり、細胞拡大増殖がサイトカイン依存性であって、かつ培養細胞は培養工程によってトランスフォームされていないことを示した。
【0084】
拡大増殖した細胞の表面にコンカナバリンAが結合しているかどうかを調べた。その細胞をウサギ抗コンカナバリンA IgG抗体(RaConA)または等価量の健常ウサギIgGで処理した。その後に細胞を洗浄し、FITCヤギ抗ウサギIgG(NRIgG)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。陽性対照として、コンカナバリンA+IL−2+IL−4+P(K)の中で新鮮培養をしたLDMNCを同様に染色した。ウサギ抗コンカナバリンA抗体で染色された陽性対照細胞(K)の平均蛍光強度(MFI)は、同一細胞を健常ウサギIgGで染色したときに得られるMFIよりずっと大きく(表1)、細胞表面上にコンカナバリンAがあることを示した。それとは対照的に、TcRγδ+T細胞のMFIは、ウサギ抗コンカナバリンA抗体および健常ウサギIgGのどちらに対しても同じようであった。これらのデータは、IL−2+IL−4+Pの中(コンカナバリンAの不在下)で細胞の二次培養することにより、恐らくインターナリゼーションや異化によるか、または細胞表面から剥げ落ちることによって、検出し得るコンカナバリンAは培養細胞から消えたことを示している。
【0085】
CML患者由来のTcRγδ+T細胞の細胞傷害活性は、実施例6に記述したカルセイン放出試験を用いて確認された(図7c〜g)。
CML患者由来のTcRγδ+T細胞は、10%自家Pおよび10%DMSOを含有するHCBM−2中、4.4×107細胞/mlの濃度で液体窒素の中に凍結保存された。凍結融解後の生存細胞の回収率は76%で、凍結融解細胞の全生存率は84%であった。細胞傷害活性は保持されたが、やや減少した(図7h〜l)。
【0086】
これらの結果は、治療上有用な数の機能的に細胞傷害性のTcRγδ+T細胞を、CML患者から採取した比較的少量の末梢血試料から、ex vivoで拡大増殖することができることを実証している。その上、これらの細胞は非白血病性でかつトランスフォームしておらず、表面に検出し得るコンカナバリンAがなく、後日使用するために凍結保存も可能である。
【0087】
好ましいと現在考えられている実施例を参照しながら本発明を記述したが、本発明は開示された実施例に限定されるものではないと理解されたい。それどころか、本発明は、付随する請求項の精神および範囲の中に含まれる様々な改変および同等のとり合せを包含することを意図されている。
全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参考として完全な形で挿入されるように特異に、かつ個別に指示された場合と同程度に、参考として完全な形で本明細書に挿入されている。
【表1】
* 1以下の比は、ウサギ抗conA抗体(RaConA)による染色が、健常ウサギIgG(NRIgG)によるバックグランド染色より少ないことを示す。これらの結果は、培養されたTcRγδ+T細胞の表面上で、conAを検出することができないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1はXLCM/PによるCD4富化細胞の培養中の様々な時間における全細胞収量およびTcRγδ+とVδ1+のT細胞のパーセンテージを示す図である。
【図2】 図2はT細胞富化/TcRαβ細胞除去を行った細胞をXLCM/Pとともに培養中の様々な時間における全細胞収量およびTcRγδ+とVδ1+のT細胞のパーセンテージを示す図である。
【図3】 図3はXLCMによるLDMNCの培養と、その後のXLCM/P、IL−2/IL−4/P、IL−2/P、IL−4/PまたはP単独による二次培養中の様々な時間における全細胞収量を示す図である。
【図4】 図4はXLCM/PによるLDMNCの培養中、またはXLCM/PによるLDMNCの培養とその後のIL−2/IL−4/Pによる二次培養中の、様々な時間における全細胞収量およびTcRγδ+T細胞のパーセンテージを示す図である。
【図5】 図5はconA/IL−2/IL−4/PによるLDMNCの培養中、またはconA/IL−2/IL−4/PによるLDMNCの培養とその後のIL−2/IL−4/Pによる二次培養中の、様々な時間における全細胞収量およびTcRγδ+T細胞のパーセンテージを示す図である。
【図6】 図6aはT細胞富化/TcRαβ細胞除去を行った細胞の、conA/IL−2/IL−4/Pによる培養中とその後のIL−2/IL−4/Pによる二次培養中の経時的な全生細胞数を示す図である。
図6b−6fは様々なエフェクター対標的比でのTcRγδ+エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。
図6g−6kはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比でのTcRγδ+エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。
【図7】 図7aはCML患者由来のT細胞富化/TcRαβ細胞除去/CD33細胞除去を行った細胞の、conA/IL−2/IL−4/Pによる培養中とその後のIL−2/IL−4/Pによる二次培養中の経時的な全生細胞数を示す図である。
図7bはサイトカイン除去後の経時的な生存パーセントを示す。
図7c−7gは様々なエフェクター対標的比でのTcRγδ+エフェクターによる様々な標的の死滅パーセンテージを示す図である。
図7h−7lはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比でのTcRγδ+エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。
Claims (31)
- (1)(a)T細胞マイトジェン、(b)インターロイキン−2および(c)インターロイキン−4を含む第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
(2)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、上記(1)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を増殖させること
を特徴とする出発試料中のTcRγδ+T細胞を増殖させる方法。 - (1)XLCM(商標名)を含む第1の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
(2)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、上記(1)で得られた細胞を培養することによって、TcRγδ+T細胞を増殖させること
を特徴とする出発試料中のTcRγδ+T細胞を増殖させる方法。 - 第1および第2の培地が血清または血漿を含有する請求項1または2に記載の方法。
- ステップ(1)の前に、出発試料中の細胞をT細胞について富化する請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(1)の前に、出発試料中の細胞をCD4+細胞について富化する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(1)の前に、出発試料中の細胞からCD14+、CD16+、CD19+、CD56+およびグリコホリンA+細胞を除去する請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(1)の前に、出発試料中の細胞からTcRαβ+ T細胞を除去する請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(1)の前に、出発試料中の細胞から非TcRγδ + T細胞を除去する請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 出発試料が末梢血、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、ひ臓、癌組織、感染組織、リンパ節組織またはそれらの分画物から選択される請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 出発試料がヒト末梢血またはその分画物である請求項9に記載の方法。
- 出発試料が低密度単核細胞である請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の培地中にT細胞マイトジェンが0.01から100μg/mlの量で存在し、IL−2が0.1から1000ng/mlの量で存在し、IL−4が0.1から1000ng/mlの量で存在する請求項1または3から10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の培地中にT細胞マイトジェンが0.1から50μg/mlの量で存在し、IL−2が1から100ng/mlの量で存在し、IL−4が1から100ng/mlの量で存在する請求項1または3から10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の培地中にT細胞マイトジェンが0.5から10μg/mlの量で存在し、IL−2が2から50ng/mlの量で存在し、IL−4が2から50ng/mlの量で存在する請求項1または3から10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の培地がT細胞マイトジェンを1μg/ml、IL−2を10ng/mlおよびIL−4を10ng/ml含む請求項1または3から10のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞マイトジェンがコンカナバリンAである請求項1または3から10のいずれか一項に記載の方法。
- 血清または血漿が1から25体積%の量で存在する請求項3に記載の方法。
- 血清または血漿が2から20体積%の量で存在する請求項3に記載の方法。
- 血清または血漿が2.5から10体積%の量で存在する請求項3に記載の方法。
- 血清または血漿が5体積%の量で存在する請求項3に記載の方法。
- 第2の培地中にIL−2が0.1から1000ng/mlの量で存在し、IL−4が0.1から1000ng/mlの量で存在する請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の培地中にIL−2が1から100ng/mlの量で存在し、IL−4が1から100ng/mlの量で存在する請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の培地中にIL−2が2から50ng/mlの量で存在し、IL−4が2から50ng/mlの量で存在する請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の培地がIL−2を10ng/mlおよびIL−4を10ng/ml含む請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- XLCM(商標名)が1から25%の量で存在する請求項2に記載の方法。
- XLCM(商標名)が2から20%の量で存在する請求項2に記載の方法。
- XLCM(商標名)が2.5から10%の量で存在する請求項2に記載の方法。
- XLCM(商標名)が5%の量で存在する請求項2に記載の方法。
- 慢性骨髄性白血病患者から採取した試料からTcRγδ + T細胞を得る方法であって、
(1)試料から低密度単核細胞(LDMNC)を得ることと、
(2)ステップ(1)で得られた細胞からCD33+細胞を除去することと、
(3)(a)T細胞マイトジェン、(b)インターロイキン−2および(c)インターロイキン−4を含む第1の培地中で、ステップ(2)で得られた細胞を培養することと、
(4)(i)インターロイキン−2および(ii)インターロイキン−4を含む第2の培地中で、ステップ(3)で得られた細胞を培養することにより、TcRγδT+細胞を増殖させること
を含む方法。 - ステップ(2)がその細胞から更にCD14+、CD16+、CD19+、CD56+およびグリコホスホリンA+の各細胞を除去することを含む請求項29に記載の方法。
- ステップ(2)がその細胞から更にTcRαβ+T細胞を除去することを含む請求項29に記載の方法。
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