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Beschreibung
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gekoppelten Produktion von
lnterferon-Gamma und von Interleukin 2.
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Periphere Lymphozyten synthetisieren in Zellkulturen nach Stimulation
mit geeigneten Substanzen eine Reihe von Stoffen, die regulatorische Wirkungen auf
zellulare Funktionen haben können, z. B. auf die interzellulare Kommunikation zwischen
immunkompetenten Zellen.
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Solche Stoffe bezeichnet man als Lymphokine.
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Zu Ihnen zählt das Interferon-Gamma (lFN-Gamma) und das Interleukin
2 (IL 2). IFN-Gamma kann unter anderem cytotoxisch auf Tumorzellen wirken.
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IL 2 regt periphere T-Lymphozyten, die sich normalerweise in einem
Ruhezustand befinden, zur Teilung und Vermehrung an.
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Beide Substanzen sind unter Umständen für die Therapie maligner Erkrankungen
von Interesse.
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Es gibt verschiedene Kultursysteme, um IFN-Gamma bzw. IL 2 (nachfolgend
"Lymphokine" genannt) unter Verwendung von Blutzellen zu erzeugen. Man kann z. B.
Lymphozyten durch Gradientenzentrifugation über eines der gängigen Dichtemedien
(z. B. Ficoll-Hypaque) aus Vollblut oder Buffy Coats separieren, in Kulturmediem
suspendieren und zur Lymphokin-Synthese stimulieren. Bei anderen Verfahren wird
auf die Zellfraktionierung verzichtet. Da Serum- bzw. Plasmabestandteile
aber
nicht essentiell sind, wäre es günstiger, mit serumfreier Kultur zu arbeiten, um
den nachfolgenden Reinigungsaufwand zu verkleinern.
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Die Zellen können mit verschiedenen Substanzen zur Lymphokin-Synthese
angeregt werden, z. B. mit Mitogenen (Concanavalin A, Phytohämagglutinin P, Staphylokokken,
Enterotoxin A usw.), Antilymphozytenserum oder mit T-zellspezifischen monoklonalen
Antikörpern. All diese Verfahren sind bekannt und liefern ähnliche Mengen an Lymphokinen.
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Ebenfalls bekannt ist, daß bestimmte Tumorpromotoren, so der Phorbolester
Beta-Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) die Synthese von Lymphokinen nach gleichzeitiger
Stimulierung mit den oben angegebenen Substanzen beträchtlich steigern kann.
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Eine der Substanzen, die ebenfalls mitogen auf Lymphozyten wirkt,
wenn auch nur schwach, ist das Kalzium-lonophor A 23 187.
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Von diesem ist es auch bekannt, daß es die Synthese von IFN-Gamma
durch Lymphozyten induziert, wenn auch nicht in besonderem Maße.
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Aufgabe der- vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren vorzuschlagen,
durch das man aus humanen Leukozyten, die aus Spenderblut oder aus Zellpherese stammen,
sowohl Interferon-Gamma (IFN-Gamma) als auch Interleukin 2 (IL 2) gewinnen kann,
und zwar in weit höheren Mengen als bisher nach bekannten Verfahren.
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Außerdem wird erfindungsgemäß ein Reinigungsverfahren vorgeschlagen,
das es erlaubt, die gemeinsame Aufreinigung beider Substanzen bis zu einer Stufe,
an der Interleukin 2 auf einfache Weise von Interferon-Gamma abgetrennt werden kann
und beide Substanzen dann separat nach an sich bekannten Verfahren endgereinigt
werden.
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Es wurde überraschenderweise gefunden, daß weit höhere Mengen an
Lymphokinen aus Kulturen humaner Lymphozyten ins Kulturmedium freigesetzt werden,
wenn man eine Kombination von A 23 187 mit PMA einsetzt.
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Es war ebenfalls völlig überraschend, daß IFN-Gamma und IL 2 in einer
Folge von Reinigungsschritten zunächst gemeinsam aufgereinigt werden können, um
dann in einem anschließenden Schritt voneinander getrennt zu werden. Danach können
beide Substanzen in an sich bekannter Weise separat bis zur Endstufe aufgereinigt
werden.
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Erfindungsgemäß werden also weiße Blutzellen aus Spenderblut unter
schonenden Bedingungen isoliert, die Zellen bei niedrigem Proteingehalt suspendiert
und mit Phorbolester und einer Menge an A 23 187 stimuliert.
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Als Induktor bzw. Stimulator zur Synthese von Interferon-Gamma und
Interleukin 2 wird eine Kombination der oben angegebenen Art verwendet, wobei die
Endkonzentration des Kalzium-lonophors zwischen 20 und 1000 ng/ml liegt, vorzugsweise
zwischen 10 und 200 ng/ml. Die Menge des Phorbolesters liegt im Bereiche einer Endkonzentration
von 10 bis 100 ng/ml, vorzugsweise aber bei 20 ng/ml.
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Die Proteinkonzentration während der Inkubation liegt zwischen 0
und 5 ng/ml und die Zellkonzentration zwischen 106 und 5 x 107 Zellen pro ml Suspensionsvolumen.
Die Inkubationstemperatur liegt vorzugsweise zwischen 35 und 400C.
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Das erfindungsgemäße Verfahren einschließlich des erfindungsgemäßen
Reinigungsverfahrens wird nun anhand eines Beispiels näher erläutert.
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Humane Lymphozyten werden aus bis zu 72 Stunden alten Blutkonserven
oder durch Zellpherese gewonnen und dann in einem Zellkulturmedium suspendiert,
vorzugsweise im Medium RPMI 1640 der Firma Gibco Europe, welches als Zusätze Hepes
(25 mM), Antibiotika (Neomycin und Streptomycin: je 10 ,ug/ml) sowie humanes Plasma-Protein
in einer Konzentration von 0,2 - 5 mg/ml, vorzugsweise aber 0,5 - 1 mg/ml, enthält.
Der pH-Wert der Zellsuspension soll zwischen 6,8 - 8,0, vorzugsweise zwischen 7,2
- 7,6 liegen. Die Zelldichte der Suspension kann 106 - 107, vorzugsweise aber 5
x 106 ml betragen. Die Zellsuspension wird mit einem Phorbolester, z. B. in einer
Endkonzentration von 10 -100 ng/ml, vorzugsweise aber 20 ng/ ml, versetzt. Gleichzeitig
wird der Zellsuspension das Kalzium-lonophor A 23 187 in einer Konzentra -tion von
20 - 1000 ng/ml, vorzugsweise von 10 - 200 ng/ml zugesetzt.
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Die Zellsuspension wird dann für 48 - 72 Stunden, zweckmäßigerweise
bei einer Temperatur zwischen 35 - 380C inkubiert. Die Zellen werden dann abgetrennt
beispielsweise durch Zentrifugation. Der lymphokinhaltige überstand wird folgenden
Reinigungsschritten unterzogen: a) Die lymphokinhaltige Lösung wird beispielsweise
an controlled Pore-Glass (CPC) oder an Silica Gel geeigneter Porengröße extrahiert
und die gebundenen Lymphokine mit einem geeigneten Elutionsmittel, z. B. 10 mM Phosphatpuffer
+ 1 M Kochsalz (PP) + 50 % Athylenglykol, pH 7.4, eluiert.
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b) Zur Entferung von Athylenglykol wird das Eluat über eine Gelfiltrationssäule
gegeben, beispielsweise eine Sephadex G 25-Säule, die mit PP, pH 7,4 äquilibriert
ist. Die lymphokinhaltige Lösung wird dann über eine Metall-Chelatsäule
gegeben,
beispielsweise der Firma Pharmacia Fine Chemicals. Die Säule ist vorzugsweise mit
Kupfer- oder Zinkionen beladen. Nach Durchlauf der lymphokinhaltigen Lösung wird
diese mit PP gewaschen, beispielsweise mit 5 - 10 Säulenvolumina. Anschließend werden
die Lymphokine mit einem Puffer niedrigeren pH-Wertes von der Chelat-Säule eluiert,
beispielsweise mit 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4.
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c) Das lymphokinhaltige Eluat wird mit PP + 1,5 m Kochsalz vermischt
und der pH zweckmäßigerweise auf 7, 0 - 7, 4 eingestellt. Die Lösung wird jetzt
über eine Affinitätssäule gegeben, beispielsweise Concanavalin A-Sepharose der Firma
Pharmacia Fine Chemicals. Die Säule ist zweckmäßigerweise mit PP äquilibriert. Bei
diesem Schritt werden beide Lymphokine voneinander getrennt: lL 2 findet sich im
Durchlauf der Affinitätssäule, lFN-Gamma wird gebunden. IFN-Gamma kann jetzt mit
einem geeigneten Puffer eluiert werden, beispielsweise PP + 0, 1 M oCMethyl-Mannopyranosid.
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d) IL 2 kann jetzt nach einem bekannten Verfahren bis zur Homogenität
gereinigt werden, beispielsweise durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter
Verwendung einer RP 18-Säule.
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e) IFN-Gamma kann ebenfalls weitergereinigt werden, beispielsweise
durch lonenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauschers.
Hierzu wird das Eluat der Concanavalin A Sepharose-Säule zweckmäßigerweise
gegen
einen Puffer geeigneter lonenstärke umgepuffert, beispielsweise durch Dialyse gegen
10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0 oder durch Gelfiltration über eine Sephadex G 25-Säule,
die mit demselben Puffer äquilibriert ist.
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Der Kationenaustauscher wird zweckmäßigerweise ebenfalls mit diesem
Puffer äquilibriert. Die IFN-Gamma-haltige Lösung wird über die lonenaustauscher-Säule
gegeben. Sie wird mit drei Bettvolumen an Phosphatpuffer gewaschen.
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Dann wird IFN-Camma mit einem Kochsalzgradienten von der Säule eluiert.
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Nachstehend wird die Erfindung anhand von Versuchsbeispielen erläutert.
Der Umfang der Erfindung soll hierdurch nicht eingeschränkt werden. Die Aktivitäten
von IFN-Gamma bzw. IL 2 werden in Einheiten/ ml oder Einheiten/mg Protein angegeben.
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Eine Einheit lFN-Gamma ist hierbei diejenige lFN-Men-ge, die einen
Rasen von Wish-Zellen zu 50 % vor der Lysis durch eine hohe Dosis von Vesicular
Stomatitis Virus schützt. Die lFN-Gamma Titer beziehen sich auf den Standard für
IFN-Gamma G- des National Institute of Health der USA.
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Eine Einheit IL 2 gibt diejenige Menge an IL 2 an, die im Proliferations-Assay
unter Verwendung von Phytohämagglutinin P-aktivierten humanen Lymphoblasten eine
halbmaximale Einbaurate von 3H-markiertem Thynictin bewirkt. Die IL 2-Titer beziehen
sich dabei auf einen laborinternen Standard.
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Beispiel 1 Aus bis zu 48 Stunden alten Blutkonserven wurden die Buffy
Coats gewonnen und mit physiologischer Kochsalzlösung 1 : 2 verdünnt.
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Die lymphozytenreiche Zellfraktion wurde durch Zentrifugation über
Ficoll-Paque der Firma Pharmacia Fine Chemicals GmbH, d = 1. 076 3 g/cm gewonnen.
Die Zellen wurden in einer Konzentration von 5 x 10 6/cm im Medium RPMI 1640, das
als Zusätze Hepes (25 mM) und Antibiotika (Neomycin und Streptomycin; je 10 pg/ml)
enthielt, suspendiert. Der Proteingehalt wurde rnit humanem Plasmaprotein auf 0>
5 - 1 mg/ml eingestellt. Das Volumen der Zellkultur betrug 500 ml in 2 L-Erlenmeyerkolben.
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Der Zellsuspension wurden zugefügt: PMA (20 ng/ml) sowie das Ionophor
A 23 187 in einer Konzentration von 100 ng/ml. Die Suspension wurde dann unter leichtem
Schütteln bei 370C für 48 - 72 h inkubiert.
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Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert und der Zellkulturüberstand
isoliert.
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Beispiel 2: Spenderblut wurde über Nacht bei 40C gelagert. Dann wurde
der Plasma-Überstand isoliert und die darin befindlichen Leukozyten durch Zentrifugation
gewonnen. Die Zellen wurden, wie im Beispiel 1 angegeben, im Zellkulturmedium suspendiert,
stimuliert und inkubiert. Anschließend wurde der Zellkulturüberstand isoliert.
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Vergleichsansatz 1 Wie bei Beispiel 1, nur wurden die Zellen mit Concanavalin
A (Con A) (25 pg/ml) sowie PMA (20 ng/ml) stimuliert.
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Vergleichsansatz 2 Wie bei Beispiel 2, nur wurden die Zellen mit Con
A (25 pg/ml) sowie PMA (20 ng/ml) stimuliert.
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Vergleichsansatz 3 Wie bei Beispiel 1; als Mitogen wurde aber Staphylokokken
Enterotoxin A (SEA) (20 ng/ml) verwendet.
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Vergleichs ans atz 4 Wie bei Beispiel 1; als Mitogen wurde aber Phytohämagglutinin
P (PHA-P) (10 lug/ml) verwendet.
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Vergleichsansatz 5 Wie bei Beispiel 1; als Mitogen wurde Lens Culinaris
Lectin (LC) (l0jug/ml) verwendet.
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Vergleichsansatz 6 Wie bei Beispiel 1; die Inkubation wurde aber in
Abwesenheit von PMA durchgeführt.
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Vergleichsansatz 7.
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Wie bei Beispiel 2; die Inkubation wurde aber in Abwesenheit von PMA
durchgeführt.
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Die Gehalte der Zellkulturüberstände an IL 2 sowie an IFN-Gamma sind
in Tabelle 1 angegeben.
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Es ergibt sich folgendes: Unabhängig von der Art der Zellgewinnungstechnik
werden die bei weiten höchsten Lymphokin-Titer erzielt, wenn man die Zellen mit
dem lonophor A 23 187 plus einem Phorbolester induziert. Verglichen mit anderem
Mitogen erhöht sich die Lymphokin-Ausbeute um das etwa 4- bis 10-fache.
| Verwendete Zellen Inducer PMA Interferon-Gamma Interleukin
2 |
| (Einheiten/ml) (Einheiten/ml) |
| Leukozyten aus Buffy- A 23 187 + 4.000 240 |
| Coats - 50 15 |
| Con A + 800-1.600 |
| - 50 |
| SEA + 80-1.600 120 |
| PHA + 1.600 240 |
| LC + 800 240 |
| Leukozyten aus Plasma- A 23 187 + 10.000-20.000 1.000 |
| Überständen - 200 15 |
| Con A + 1.600 240 |
| - 50 15 |
Tabelle: Syntbeseraten von Interferon-Gamma and Interleukin 2 bei Verwendung verschiedener
Induktoren.