DE69133442T2

DE69133442T2 - Wachstumsfördernder wirkstoff

Info

Publication number: DE69133442T2
Application number: DE69133442T
Authority: DE
Inventors: John Francis BALLARD; Leonard Geoffrey FRANCIS; Owen Geoffrey REGESTER
Original assignee: Gropep Ltd
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-09
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2011-07-10
Also published as: NZ238890A; JP2007131630A; DK0545946T3; US5866418A; AU645589B2; JP2003204785A; AU8207291A; DE69133442D1; JP4573182B2; EP0545946A4; ATE287415T1; JPH05508542A; ES2236681T3; NZ248054A; CA2086681A1; WO1992000994A1; JP3962427B2; CA2086681C; EP0545946A1; EP0545946B1

Description

Diese Erfindung betrifft das Wachstum von Tierzellen in einer Zellkulturzusammensetzung. Insbesondere betrifft sie die Bereitstellung einer Zellkulturzusammensetzung, die eine Käsemolkeextraktzusammensetzung einschließt.
Tierzellen werden in der Kultur wachsen gelassen, damit sie eine Anzahl von pharmazeutischen, diagnostischen und veterinärmedizinischen Produkten hervorbringen, einschließlich humanen Vakzinen, Lymphokinen, Hormonen, monoklonalen Antikörpern, anderen pharmazeutisch aktiven Proteinprodukten, veterinärmedizinischen Hormonen und für den Einsatz für Forschungs-, Entwicklungs- und diagnostischen Zwecken.
Das Wachstum von Tierzellen benötigt ein definiertes isotones Medium, das Salze, Nährstoffe, Lipid-Vorläufer, Nukleinsäure-Vorläufer, Vitamine und Aminosäuren enthält, das so zusammengesetzt ist, dass es dem Medium ähnlich ist, das normalerweise solche Zellen in vivo aufnehmen würde. Beispiele zur üblichen Verwendung umfassen Eagle's Minimal Essential Medium, modifiziertes Dulbecco's-Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM), Medium-199, RPMI-1640-Medium und Ham's F12-Medium. Jedoch wird im Grunde keine Tierzelle in einem solchen Medium wachsen, da sie zusätzlich den Zusatz von Serum benötigt. Fötales Kälberserum wird häufig verwendet, da es wirksamer ist als Serum, das aus postnatalen Tieren gewonnen wurde und da es lediglich geringe Konzentrationen an Immunoglobulinen enthält, die ansonsten unerwünschte Wirkungen haben könnten.
Die Versorgung von fötalem Kälberserum wird durch die Anzahl von schwangeren geschlachteten Rindern limitiert. Sie besitzt auch unerwünschte Variationen von Charge zu Charge und kann Toxine einschließen. Besondere Bedenken bestehen hinsichtlich von dessen Verwendung für die mögliche Herstellung von rekombinanten Proteinen und anderen Pharmazeutika zur Verwendung in Menschen, da das Serum auch Viren enthalten kann, die für Menschen gefährlich sind und die über ein Aufreinigungsprotokoll, das das erwünschte Produkt hervorbringt, übertragen werden können. Im Prinzip wurden aus diesen Gründen besondere Anstren gungen unternommen, um das Serum durch reine Bestandteile zu ersetzen. Beispiele von solchen Bestandteilen sind Wachstumsfaktoren, Hormone und Zellanheftungsfaktoren. Unglücklicherweise sind die Anforderungen bei jedem wachsenden Zelltyp unterschiedlich und sind schwierig zu etablieren. Es hat sich häufig als nicht möglich herausgestellt äquivalente Wachstumseigenschaften oder äquivalente Mengen an Zellprodukten mit „serumfreien" Medien zu erreichen wie sie mit Medium mit fötalem Rinderserum erreicht werden können.
Die beschränkte Verfügbarkeit von fötalem Rinderserum, dessen Variabilität von Charge zu Charge, dessen daraus resultierenden beträchtlichen Kosten als auch die Mängel der oben beschriebenen „serumfreien"-Medien haben die Untersuchung für andere biologische Fluide als potentielle Ersatzmittel für Zellkulturmedien vorangetrieben. Im Stand der Technik wurde einiger Fortschritt mit Rindermilch und Rinder-Colostrum erzielt, was durch die folgenden ausgewählten Berichte dargelegt wird: M. Klagsbrun: „Human milk stimulates DNA synthesis and cell proliferation in cultured fibroblasts" (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5057, 1978); M. Klagsbrun and J. Neumann: „The serum-free growth of Balb/c 3T3 cells in medium supplemented with bovine colostrum" (J. Supramol. Struct. 11, 349, 1979).
Der Stand der Technik umfasst auch U.S. Patent Nr. 4,440,860 von M. Klagsbrun, das in einem Aspekt „Zusammensetzungen und Verfahren zur Förderung von Zellwachstum, Zellkulturmedien, die Milch oder Colostrum und Fibronectin enthalten, beschreibt; Fibronectin ist vorzugsweise auf den Kultursubstrat vorbeschichtet" und in dem japanischen Patent JP 59166879 von Morinaga: „Ein Kulturmedium zur Zellinkubation, enthaltend Milch oder Milchbestandteile" beschrieben. Es wurden auch Ultrafiltrate von Milchmolke verwendet, um das Wachstum von kultivierten Zellen zu unterstützen, wie beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 86401911.2 von G. Linden et al. „Fractions de lait, Procedee d'obtention de ces fractions et milleux de culturo cellulaires renfermant ces fractions" und O. Damerdji et al „Utilization of whey fractions as a substitute for fetal calf serum in culture media" (Biotech. Tech. 2, 235, 1988).
Trotz diesen Fortschrittes muss eine erfolgreiche Alternative zu fötalem Rinderserum noch gefunden werden.
Wir haben nun herausgefunden, dass es möglich ist, eine oder mehrere der Schwierigkeiten oder Mängel, die in dem Stand der Technik auftreten, zu überwinden oder zumindest zu mindern.
Demgemäß betrifft ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, im Wesentlichen bestehend aus einer Vielzahl von basischen Zellwachstums-stimulierenden Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, dass sie die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert, und aus Käsemolke in konzentrierter Form nach dem folgenden Verfahren extrahierbar ist: Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon, Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0, Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so dass die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden, Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer, Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz, Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für eine solche Elution geeignet ist, Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt, Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, der an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert.
Die Käsemolkeextraktzusammensetzung kann aus Käsemolke gebildet sein, deren Salz- und/oder Hauptproteinbestandteile davon reduziert sind oder fehlen.
Die Käsemolkeextraktzusammensetzung kann weniger als 1% w/w Salz, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung einschließen. Der Käsemolkeextrakt kann weniger als 0,5% w/w Casein, alpha-Lactalbumin, beta-Lactoglobulin, Immunoglobulin oder Albumin einschließen, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Die Käsemolkeextraktzusammensetzung gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann zur Förderung des Zellwachstums und -proliferation in vitro wie unten diskutiert eingesetzt werden. Die Käsemolkeextraktzusammensetzung kann zur Stimulation der Reparatur von Oberflächenwunden in vivo in Säugetieren wie unten diskutiert eingesetzt werden.
Überraschenderweise kann die Käsemolkeextraktzusammensetzung das Wachstum von Tierzellen bei geringeren Proteinkonzentrationen fördern als die, die mit fötalem Kälberserum erreicht werden, sogar mit einer Wirksamkeit, die vergleichbar mit fötalem Kälberserum für verschiedene Zelltypen ist.
Alternativ kann der Käsemolkeextrakt als eine Ergänzung zu Medien verwendet werden, die geringe Konzentrationen von fötalem Kälberserum enthalten, um bessere Wachstumsraten von kultivierten Zellen zu erreichen und um den Verbrauch von fötalem Kälberserum zu einzusparen.
Käsemolke ist ein Abfallprodukt der Käseindustrie, bei dem im Wesentlichen das gesamte Fett und Casein während der Käseherstellung entfernt worden ist. Bei dem gegenwärtigen Stand der Technik ist Käsemolke weitgehend wertlos und stellt insofern einen Kostenfaktor für die Industrie dar, da sie einen potentiellen Schadstoff darstellt.
Käsemolke zum Beispiel ist ein Hochsalz-Produkt mit geringem Proteinanteil, das tonnenweise bei der Käseherstellung anfällt. Die Hauptproteinbestandteile, die in der Käsemolke vorhanden sind, sind alpha-Lactalbumin (αLA) und beta-Lactoglobulin (βLG), die normalerweise mehr als 90% der vorliegenden Proteine ausmachen. Es können signifikante Mengen an Serumalbumin, Immunoglobuline und restlichem Casein vorhanden sein. Diese Proteine haben alle saure isoelektrische Punkte. Dagegen besitzen die Hauptproteinfaktoren, welche das Wachstum von Tierzellen stimulieren, basische isoelektrische Punkte. Beispiele hierfür umfassen die Wachstumsfaktoren basischer FGF, IGF-1, des (1-3)IGF-1 und PDGF. Es wird vermutet, dass die Extraktion dieser basischen Faktoren, die in Käsemolke vorhanden sind, in der bei der nahezu vollständigen Abwesenheit der ansonsten vorhandenen sauren Proteine für die überraschende Wirksamkeit der Käsemolkeextraktzusammensetzung verantwortlich ist.
Demzufolge ist es ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Käsemolkeextraktzusammensetzung bereitzustellen, die im Wesentlichen aus einer Vielzahl von basischen Zellwachstums-stimulierenden Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten besteht, wobei die Zu sammensetzung die Eigenschaft hat, dass sie die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert, und aus einem Milchprodukt in konzentrierter Form extrahiert wird, wobei dieses Verfahren einschließt: Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials, Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon, Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0, Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so dass die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden, Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer, Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz, Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für eine solche Elution geeignet ist, Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt, Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert.
Die Desorption der basischen Proteine von dem Ionenaustauscherharz führt zu einer Präparation, die an Zellwachstums-stimulierenden Faktoren angereichert ist. Das Eluat wird konzentriert und filtriert, indem eine beliebige geeignete Technik eingesetzt wird. Das Eluat kann zum Beispiel durch konventionelle Ultrafiltrationsverfahren oder anderen Prozeduren konzentriert werden, um ein Gemisch von Proteinen hervorzubringen, welche das Wachstum von Tierzellen fördern, wenn sie zu den proteinfreien Medien wie DMEM zugesetzt werden.
Die Herkunft von Käsemolke kann ein Käsemolkefiltrat sein, das im Wesentlichen kein unlösbares Material beinhaltet. Demgemäß umfasst das Präparationsverfahren den vorläufigen Schritt der Filtrierung der Käsemolke, um unlösliche Materialien davon zu entfernen.
Die Käsemolke kann über ein geeignetes Sieb filtriert werden. Die Käsemolke kann über eine Hohlfaserkassette oder mittels definierter Porengröße filtriert werden.
Der Kationenaustauscherharz ist ein auf Sepharose basierendes Kationenaustauscher-Gel. Der Schritt des In-Kontakt-Bringens kann bei neutralem bis basischem pH durchgeführt werden. Der Schritt des In-Kontakt-Bringens kann bei einem pH von 6,5 bis 8,0 durchgeführt werden.
Der Kationenaustauscherharz wird mit einem geeignetem Puffer bei einem pH von 6,5 bis 8,0 äquilibriert. Es kann ein wässriger Natriumcitratpuffer verwendet werden. Die Elutionsschritte können unter Verwendung eines geeigneten Eluats durchgeführt werden. Es kann eine Salzlösung verwendet werden. Es kann eine gepufferte Saline-Lösung verwendet werden.
Somit kann in einer bevorzugten Form von diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung das Verfahren zur Herstellung einer Käsemolkeextraktzusammensetzung die der Reihe nach durchgeführte Behandlung von Käsemolke einschließen: Aussetzen der Käsemolke gegenüber einer Filtrationsstufe, um unlösliche Materialien davon zu entfernen;
Anpassen des pHs des Filtrats zwischen 6,5 und 8,0;
In-Kontakt-Bringen des Filtrats mit einem auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes;
Eluieren von dem Kationenaustauscherharz bei hohen Ionenstärken und hohem pH mit einer geeigneten Pufferlösung und
Aussetzen des Eluats einer Konzentrierungsstufe und einer Zwischenfiltrationsstufe, um Salz davon zu entfernen.
Alternativ kann die Elution von dem Kationenaustauscherharz bei hoher Ionenstärke jedoch ohne Anpassung des pHs erreicht werden, so dass die Zellwachstumsstimulierenden Faktoren erhalten werden.
In dieser Ausführungsform werden die Zellwachstums-stimulierenden Faktoren mit weniger fremdem Protein eluiert.
Ein weiterer Aspekt betrifft die Isolierung eines geeigneten Extrakts von Käsemolke, wobei das Eluent bei einer hohen Temperatur behandelt und zentrifugiert werden kann. Diese Modifikation entfernt zusätzliches Protein. Daher kann das Verfahren weiter das Aussetzen des Eluenten gegenüber einer Hitzebehandlung einschließen, um die Menge an Fremdprotein zu verringern. Die Käsemolkeextraktzusammensetzung kann sterilisiert und gegebenenfalls zur Lagerung gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Material kann in steriler Saline für den Zusatz zu Zellen in Kultur gelöst werden.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher eine Zellkulturzusammensetzung bereitgestellt, die im Wesentlichen besteht aus

(a) einer wirksamen Menge einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, die eine Vielzahl von basischen Zellwachstums-stimulierenden Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten enthält, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten zu stimulieren, und die aus dem Milchprodukt in konzentrierter Form durch das folgende Verfahren extrahierbar ist: Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials; Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon; Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0; Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so dass die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert wird; Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer; Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz; Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für eine solche Elution geeignet ist; Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt; Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert und
(b) einem Kulturmedium.

Das Kulturmedium kann im Wesentlichen ein proteinfreies isotones Kulturmedium sein. Das im Wesentlichen proteinfreie isotone Kulturmedium kann modifiziertes Dulbecco's-Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM) sein.
Es wurde festgestellt, dass eine im Wesentlichen äquivalente Wachstumsrate von menschlichen Hautfibroblasten im Vergleich zu der, die mit 5% fötalem Rinderserum erreicht wird, mit ungefähr 20 μg Zellwachstums-stimulierenden Faktoren, die von Käsemolke gemäß dem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung pro 100 μl Medium extrahiert wurden, erreicht werden kann.
Alternativ kann eine kleine aber wirksame Menge von fötalem Rinderserum als Kulturmedium eingesetzt werden. Es wurde festgestellt, dass der Zusatz von ungefähr 25 μg Zellwachstums-stimulierenden Faktoren pro 100 μl Medium, das ungefähr 2% fötales Rinderserum enthält, die Wachstumsrate von Balb-C/3T3-Zellen zu einer Rate erhöht, die normalerweise mit 10% fötalem Rinderserum erreicht wird.
Andere Zusätze können zu dem Medium zugegeben werden, in Abhängigkeit von dem Zelltyp, einschließlich Wachstumsfaktoren, Anheftungsfaktoren oder geringen Mengen Serum.
In einer bevorzugten Form stellt die vorliegende Erfindung eine wie oben beschriebene Zellkulturzusammensetzung bereit, wobei der Milchproduktextrakt in den Medien mit einer Proteinkonzentration von 10 bis 20000 μg pro ml, vorzugsweise 100 bis 2000 μg pro ml vorhanden ist.
Demgemäß wird in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen bereitgestellt, wobei das Verfahren einschließt:
Entnahme einer Quelle von Tierzellen;
eine Zellkulturzusammensetzung einschließlich einer wirksamen Menge einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, die eine Vielzahl von basischen Zellwachstumsstimulierenden Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten einschließt, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten zu stimulieren, und die aus dem Milchprodukt in konzentrierter Form durch das folgende Verfahren extrahierbar ist:
Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials;
Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon;
Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0;
Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so dass die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden;
Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer;
Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz;
Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für eine solche Elution geeignet ist;
Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt;
Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert und
einem Kulturmedium
und
Kultivieren der Zellen in der Zellkulturzusammensetzung für einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichen, um eine vorbestimmte Zellkonzentration zu erreichen.
Das Zellkulturverfahren kann bei Raumtemperatur oder darüber durchgeführt werden. Eine Temperatur im Bereich von ungefähr 35°C bis 40°C kann verwendet wer den. Das Zellkulturverfahren kann in einem Inkubator, beispielsweise in einem Inkubator mit hoher Luftfeuchte, durchgeführt werden.
Das Zellkulturverfahren kann auf einer beliebigen geeigneten Oberfläche oder in Suspension durchgeführt werden. Es können Gewebekulturplatten verwendet werden.
Das Zellkulturverfahren kann für eine Zeitdauer von 1 bis 5 Tagen in Abhängigkeit von der gewünschten Zellkonzentration durchgeführt werden.
Obwohl das Verfahren insbesondere auf das Wachstum von Tierzellen in vitro gerichtet ist, kann es auch für Tiere, einschließlich Menschen mit Oberflächenwunden eingesetzt werden.
Demgemäß besteht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung darin, eine Zusammensetzung zur Behandlung von Oberflächenwunden, Gastrointestinalverletzungen, Erkrankungen oder Geschwüren bereitzustellen, wobei die Zusammensetzung umfasst

(a) eine wirksame Menge einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, die eine Vielzahl von basischen Zellwachstums-stimulierenden Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten enthält, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten zu stimulieren, und die aus einem Milchprodukt in konzentrierter Form durch das folgende Verfahren extrahierbar ist: Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials; Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon; Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0; Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so dass die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert wer den und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden; Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer; Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz; Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für eine solche Elution geeignet ist; Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt; Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert und
(b) einen Verdünnungsmittelträger oder einen Arzneistoffträger dafür.

Die pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung kann weiter eine wirksame Menge von mindestens einem Wirkstoff einschließen.
Der mindestens eine Wirkstoff kann ausgewählt sein aus Antibiotika, Antiseptika, anderen wachstumsfördernden Mitteln, Anästhetika und Gemischen davon.
Die pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung kann zur Verabreichung auf eine geeignete Art und Weise angepasst werden. Die Zusammensetzung kann für eine interne oder topische Verabreichung angepasst werden. Die Zusammensetzung kann in oraler, injizierbarer oder topischer Form vorliegen. Eine topische Verabreichung ist bevorzugt. Die Zusammensetzung kann die Form einer Spülung, Lotion, Creme, Salbe oder Gel haben.
Es gibt keine Beschränkung bezüglich der Art von Oberflächenwunden, die behandelt werden können und solche umfassen sind aber nicht beschränkt auf Verbrennungen, Geschwüre, Schnittverletzungen und Durchstiche.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen genauer beschrieben. Es soll jedoch so verstanden werden, dass die folgende Beschreibung lediglich illustrativen Zwecken dient und sie sollte in keiner Weise als eine Beschränkung hinsichtlich der Allgemeinheit der oben beschriebenen Erfindung aufgefasst werden.
BEISPIEL 1
Herstellung einer Fraktion von Käsemolke (GFE), die an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist.
Pasteurisierte Molke, die als Endprodukt der Käseherstellung erhalten wurde, wurde über einen 10 Mikron Schirm und über 0,2 Mikron Sartorium-Microsart-Sartocon II-Modul filtriert, um Feststoffe zu entfernen. Das Ultrafiltrat wurde auf einen pH von 6,5 eingestellt und auf eine Säule mit S-Sepharose-Schnellfluss-S-Kationenaustauscherharz (Pharmacia), die mit 50 mmol Natriumcitratpuffer bei einem pH von 6,5 äquilibriert worden ist, aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit dem selben Puffer wurde das adsorbierte Material durch eine Lösung von 1 mol NaCl, die 0,25 mol NH₄OH enthält, eluiert. Dieses Eluat wurde gegenüber Wasser zwischenfiltriert, bis die Leitfähigkeit 0 μS erreichte und wurde dann durch Ultrafiltration konzentriert; beide Prozesse verwendeten eine 3KDa-Ausschlussmembran Die entstehende Präparation wurde gefriergetrocknet, um das „GFE"-Produkt herzustellen.
Die Präparation aus 30 Litern Käsemolke, die 18 g Protein enthielt, brachte ein GFE-Extrakt mit 2,66 g Proteingehalt hervor.
BEISPIEL 2
Herstellung einer Fraktion aus Käsemolke, die an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und an Fremdprotein einschließlich Lactoferrin (GFE-2) depletiert ist
Pasteurisierte Molke wurde filtriert und auf eine Säule mit S-Sepharose aufgetragen und dann in wie in Beispiel 1 gewaschen. Die Elution wurde mit einer Lösung, die 0,4 mol NaCl, das zu 10 mmol Natriumcitrat, pH 6,5 zugegeben wurde, durchgeführt. Dieses GFE-2 wurde gegen Wasser zwischenfiltriert, konzentriert und wie in Beispiel 1 beschrieben gefriergetrocknet.
Eine Präparation von 30 Litern von Käsemolke, die 18 g Protein enthielt, ergab einen GFE-2-Extrakt mit 0,56 g Proteingehalt.
BEISPIEL 3
Herstellung einer modifizierten GFE-2-Fraktion, die auch an Fremdprotein depletiert war einschließlich Lactoperoxidase (GFE-3)
Das gefriergetrocknete GFE-2 (Beispiel 2) wurde bei einer Konzentration von 25 mg/ml gelöst und bei 80°C für 2,5 Minuten erhitzt. Die erhitzte Probe wurde schnell abgekühlt und zentrifugiert. Der klare Überstand wurde über einen 0,22 μm Filter vor dessen Verwendung durchgelassen. Diese Lösung enthielt 50% des Proteins, das in GFE-2 vorlag und ungefähr 10% Lactoperoxidase.
BEISPIEL 4
Stimulation des Wachstums von kultivierten Zellen durch Käsemolkeextrakte (Beispiele 1, 2) im Vergleich zu fötalem Kälberserum
Vor dem Zusatz von Kulturmedien wurden gefriergetrocknete Pulver (GFE, GFE-2) zuerst in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Saline suspendiert und durch einen Durchlauf über einen 0,22 μm Filter sterilisiert.
Dieses Beispiel verwendet die Zelllinien L6 (Rattenmyoblasten), Balb-C/3T3 (Mausfibroblasten) und SF1972 (menschliche diploide Hautfibroblasten).
Jede Zelllinie wurde auf Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen in modifizierten Dulbecco-Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM), das 5% fötales Kälberserum enthielt, subkultiviert und in einem Inkubator mit hoher Luftfeuchtigkeit, 5% CO₂, 37°C über Nacht stehen gelassen, um die Anheftung der Zellen sicherzustellen. Sterile Techniken wurden im gesamten Verfahren angewendet. Die Platten wurden gründlich in DMEM gewaschen, um jegliches restliches Serum zu entfernen und der Molkeextrakt (GFE oder GFE-2) oder das fötale Rinderserum (FBS) wurde zu den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung betrug 0,1 ml bei 37°C, 5% CO₂ und einer Luftfeuchtigkeit von 100%.
Nach weiteren zwei Tagen wurden die Platten gewaschen, fixiert und die Zellanzahl unter Verwendung eines automatisierten Methylenblau-Verfahrens quantifiziert (M. H. Oliver et al., J. Cell Sci. 92, 513, 1989). Das Wachstum wird als Prozentsatz des Anstiegs bei den Absorptionseinheiten relativ zu dem Anstieg bei der Absorption, die durch Wachstum der Zellen in DMEM mit 5% fötalem Kälberserum hervorgerufen wurde, ausgedrückt (1). Dieses Beispiel zeigt, dass in allen drei Zelllinien GFE und GFE-2 das Wachstum genauso stimulieren wie fötales Kälberserum. Darüber hinaus ist in Balb-C/3T3- und SF1972-Zellen GFE-2 bei ungefähr ein Zehntel des Proteingehalts von fötalem Rinderserum aktiv.
BEISPIEL 5
Stimulation des Wachstums von kultivierten Zellen durch Käsemolkeextrakte, die an Fremdprotein depletiert sind einschließlich Lactoperoxidase (GFE-3, Beispiel 3) im Vergleich zu GFE-2 (Beispiel 2)
Die experimentellen Details entsprachen exakt denen, die im Beispiel 4 beschrieben worden sind, außer dass die Daten als Proteingehalt ausgedrückt wurden (μg/100 μl Vertiefung), der die selbe Wachstumsantwort hervorrief, wie sie mit 5% fötalem Kälberserum erreicht wurde (siehe Tabelle 1).
TABELLE 1 Wachstum von Zellen in der Gegenwart von GFE-2 oder GFE-3
Es ist eindeutig weniger GFE-3 als GFE-2 erforderlich, um das Wachstum zu stimulieren. Da auch 5% fötales Kälberserum ein Proteingehalt von 250 μg/100 μl aufweist, sind sowohl GFE-2 als auch GFE-3 wesentlich wirksamer als 5%iges fötales Kälberserum, insbesondere bei Balb-C/3T3-Zellen und humanen Hautfibroblasten (SF1972).
BEISPIEL 6
Wachstumswirkungen von kultivierten Zellen, hervorgerufen durch das Ersetzen von Medium mit 2% fötalem Kälberserum mit GFE-2-Extrakten (Beispiel 2)
Die experimentellen Details entsprachen exakt denen, die in Beispiel 4 beschrieben worden sind, außer dass die menschliche Lungenfibroblastenlinie (HEL) durch die humane Hautfibroblastenlinie (SF1972) ersetzt worden ist. Die Daten sind als Absorptionen ausgedrückt, die nach Wachstum der Zellen für zwei Tage erreicht wurden (siehe Tabelle 2).
TABELLE 2 Wachstum von Zellen mit GEF-2, das in der Gegenwart von 2% fötalem Kälberserum zugesetzt wurde
Dieses Experiment zeigt, dass niedrige GFE-2-Mengen, die dem Medium zugesetzt werden, das lediglich 2% fötales Kälberserum enthält, die Wachstumsrate auf die, wie sie mit 10% fötalem Kälberserum erreicht wird, erhöhen kann. Die ungefähre Menge an erforderlichem GFE-2, um diese Wachstumsverstärkung zu erreichen, betrug 100 μg/100 μl in L6-Zellen, 25 μg/100 μl in Balb-C/3T3-Zellen und lediglich 5 μg/100 μl in HEL-Zellen. Eine solche Verstärkung stellt eine wesentliche Ersparnis an fötalem Kälberserum dar.

Claims

Käsemolkeextraktzusammensetzung, welche im wesentlichen aus mehreren basischen, das Zellwachstum stimulierenden Faktoren mit basischen bis neutralen isolelektrischen Punkten besteht, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, daß sie die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert, extrahierbar aus Käsemolke in konzentrierter Form nach dem folgenden Verfahren: Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon, Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0, Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so daß die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden, Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer, Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz, Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für solch ein Eluieren geeignet ist, Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt, Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert.
Käsemolkeextraktzusammensetzung nach Anspruch 1, welche in einer Salzlösung formuliert ist.
Käsemolkeextraktzusammensetzung nach Anspruch 1, welche eine Proteinkonzentration von 10 bis 20.000 Mikrogramm pro ml enthält.
Käsemolkeextraktzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Äquilibrierungspuffer 50 mM Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 6,5 ist.
Käsemolkeextraktzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Elutionspuffer 1 M NaCl mit 0,25 M NH₄OH oder 0,4 M NaCl zu 10 mM Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 6,5 zugesetzt enthält.
Käsemolkeextraktzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Konzentrieren Ultrafiltration unter Verwendung einer 3 kD ausschließenden Membran umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, die im wesentlichen aus mehreren basischen, das Zellwachstum stimulierenden Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten besteht, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, daß sie die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert, extrahiert aus einem Milchprodukt in konzentrierter Form, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials, Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon, Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0, Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so daß die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden, Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer, Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz, Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für solch ein Eluieren geeignet ist, Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt, Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Käsemolkeextraktzusammensetzung in einer Salzlösung formuliert ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Käsemolkeextraktzusammensetzung eine Proteinkonzentration von 10 bis 20.000 Mikrogramm pro ml enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Äquilibrierungspuffer 50 mM Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 6,5 ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Elutionspuffer 1 M NaCl mit 0,25 M NH₄OH oder 0,4 M NaCl zu 10 mM Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 6,5 zugesetzt enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Konzentrieren Ultrafiltration unter Verwendung einer 3 kD ausschließenden Membran umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 7, welches weiterhin umfaßt, daß das Eluat einer Hitzebehandlung zur Reduzierung fremder Proteine unterzogen wird.
Zellkulturzusammensetzung, im wesentlichen bestehend aus (a) einer wirksamen Menge einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, die mehrere basische, das Zellwachstum stimulierende Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten enthält, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten zu stimulieren, extrahierbar aus einem Milchprodukt in konzentrierter Form nach dem folgenden Verfahren: Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials, Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon, Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0, Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so daß die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden, Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer, Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz, Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für solch ein Eluieren geeignet ist, Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt, Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert und (b) einem Kulturmedium.
Zellkulturzusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Kulturmedium fötales Rinderserum enthält.
Zellkulturzusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Käsemolkeextraktzusammensetzung in einer Proteinkonzentration von 10 bis 20.000 Mikrogramm pro ml Kulturmedium vorhanden ist.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Verwenden einer Quelle für Tierzellen und einer Zellkulturzusammensetzung mit einer wirksamen Menge einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, die mehrere basische, das Zellwachstum stimulierende Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten enthält, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten zu stimulieren, extrahierbar aus einem Milchprodukt in konzentrierter Form nach dem folgenden Verfahren: Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials, Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon, Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0, Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so daß die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden, Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer, Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz, Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für solch ein Eluieren geeignet ist, Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt, Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert und einem Kulturmedium und Kultivieren der Zellen in der Zellkulturzusammensetzung für einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichen, eine vorbestimmte Zellkonzentration zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Zellen bei einer Temperatur im Bereich von 35°C bis 40°C für eine Zeitdauer von 1 bis 5 Tagen kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Käsemolkeextraktzusammensetzung mit einer Proteinkonzentration von 10 bis 20.000 Mikrogramm pro ml Kulturmedium vorliegt.
Zusammensetzung für die Behandlung von Oberflächenwunden, Gastrointestinalverletzungen, Erkrankungen oder Geschwüren, wobei die Zusammensetzung folgendes umfaßt: (a) eine wirksame Menge einer Käsemolkeextraktzusammensetzung, die mehrere basische, das Zellwachstum stimulierende Faktoren mit basischen bis neutralen isoelektrischen Punkten enthält, wobei die Zusammensetzung die Eigenschaft hat, die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten zu stimulieren, extrahierbar aus einem Milchprodukt in konzentrierter Form nach dem folgenden Verfahren: Bereitstellen eines Käsemolkeausgangsmaterials, Filtrieren der Käsemolke zum Entfernen von unlöslichem Material davon, Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,0, Bereitstellen eines auf Sepharose basierenden Kationenaustauscherharzes, das zum Adsorbieren einer Vielzahl von basischen Proteinen geeignet ist, so daß die basischeren Bestandteile des Milchproduktes daran adsorbiert werden und wobei der Großteil der Proteine mit sauren isoelektrischen Punkten in den Milchprodukten nicht adsorbiert werden, Äquilibrieren des Kationenaustauscherharzes mit einem Äquilibrierungspuffer, Aufbringen des Filtrates auf das äquilibrierte Kationenaustauscherharz, Eluieren des Kationenaustauscherharzes mit einer Pufferlösung mit hoher Ionenstärke, die für solch ein Eluieren geeignet ist, Filtrieren des Eluates zur Reduzierung von dessen Salzgehalt, Konzentrieren des filtrierten Eluates unter Erhalt eines Käsemolkeextraktes, welches an wachstumsfördernder Aktivität angereichert ist und die Proliferation von menschlichen Hautfibroblasten stimuliert und (b) einen Verdünnungsmittelträger oder einen Arzneistoffträger dafür.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die Zusammensetzung eine Proteinkonzentration von 10 bis 20.000 Mikrogramm pro ml enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, welche weiterhin eine wirksame Menge wenigstens eines aktiven Bestandteils enthält, der unter Antibiotika, Antiseptika, anderen das Wachstum fördernden Mitteln, Anästhetika und Gemischen davon ausgewählt ist.