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Das
Kolostrum ist ein Bestandteil der Milch von Säugetieren während der ersten Tage nach
der Geburt. Das Kolostrum ist eine dicke, gelbliche Flüssigkeit
und ist die erste Milchsekretion nach der Niederkunft und enthält eine
hohe Konzentration an Immunglobulinen (IgG, IgM und IgA) sowie eine
Vielzahl nicht spezifischer Proteine. Das Kolostrum enthält außerdem verschiedene
Zellen, wie z. B. Granula- und Stromazellen, Neutrophile, Monozyten/Makrophagen
und Lymphozyten. Das Kolostrum beinhaltet ferner Wachstumsfaktoren,
Hormone und Zytokine. Anders als reife Muttermilch enthält Kolostrum
geringe Konzentrationen an Zucker, geringe Konzentration an Eisen,
ist jedoch reich an Lipiden, Proteinen, Mineralsalzen, Vitaminen
und Immunglobulinen.
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Das
Kolostrum umfasst oder enthält
außerdem
ein(en) Prolin-reiches/n Polypeptid-Aggregat oder -Komplex, das/der als
Colostrinin bezeichnet wird. Ein Peptidfragment von Colostrinin
ist Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro (SEQ ID NR:31), das in der
internationalen Veröffentlichung
Nr.
WO-A-98/14473 offenbart
ist. Colostrinin und dieses Fragment wurden als nützlich bei
der Behandlung von Störungen
des zentralen Nervensystems, neurologischen Störungen, mentalen Störungen,
Demenz, neurodegenerativen Erkrankungen, Alzheimer-Krankheit, Erkrankung
der Motoneurone, Psychose, Neurose, chronischen Störungen des
Immunsystems, Erkrankungen mit einer bakteriellen oder viralen Ätiologie
und erworbenen immunologischen Defizienzen, wie in der internationalen
Veröffentlichung
Nr.
WO-A-98/14473 dargelegt, identifiziert.
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Obwohl
bestimmte Verwendungsmöglichkeiten
für Colostrinin
ermittelt worden sind, würde
es einen Fortschritt auf dem Gebiet bedeuten, weitere Verwendungsmöglichkeiten
für Colostrinin
oder einen Bestandteil davon zu entdecken und zu offenbaren, die
nicht ohne Weiteres aus den derzeit über Colostrinin oder dessen Bestandteile
bekannten Informationen ermittelbar sind.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Colostrinin,
wenigstens einem Peptidbestandteil (d. h. einer Peptidkomponente)
davon, wenigstens einem aktiven Analogon davon (z. B. ein Peptid, das
eine N-terminale Sequenz hat, die einer N-terminalen Sequenz von
wenigstens einem der Colostrinin-Peptidbestandteile entspricht)
und Kombinationen davon, als Förderer
der neuronalen Zelldifferenzierung (promoters of neural cell differentiation).
Diese Agenzien können
in vitro oder in vivo verwendet werden, einschließlich der
innerlichen Verwendung in Patienten, insbesondere Tieren (einschließlich Säugetieren,
wie z. B. Menschen).
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In
einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Fördern
der In-vitro-Zelldifferenzierung zur Verfügung, wobei das Verfahren das
Inkontaktbringen der Zellen mit einem Regulator neuronaler Zellen
umfasst, der ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Colostrinin, einem Peptidbestandteil von
Colostrinin, einem aktiven Analogon eines Peptidbestandteils von
Colostrinin und Kombinationen davon, unter Bedingungen, die wirksam
sind, die Morphologie der Zellen zu verändern, um neuronale Zellen
zu bilden, worin der Peptidbestandteil von Colostrinin ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34 und worin
das aktive Analogon ein Peptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 15 % Prolin hat und das wenigstens 70 % Sequenzidentität mit einem
oder mehreren Peptidbestandteil(en) von Colostrinin aufweist, die
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34.
Die Zellen können
in einer Zellkultur, einem Organ, einem Gewebe oder einem Organismus
vorhanden sein. Vorzugsweise sind die Zellen Säugerzellen und bevorzugter
humane Zellen. Der Regulator neuronaler Zellen ist vorzugsweise
ein Peptidbestandteil von Colostrinin, wie z. B. den hierin beschriebenen
(SEQ ID NRn:1-34).
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In
einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung
eines Regulators neuronaler Zellen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Colostrinin, einem Peptidbestandteil von Colostrinin, einem
aktiven Analogon eines Peptidbestandteils von Colostrinin und Kombinationen
davon, worin der Peptidbestandteil von Colostrinin ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34; und worin
das aktive Analogon ein Peptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 15 % Prolin hat und das wenigstens 70 % Sequenzidentität mit einem
oder mehreren Peptidbestandteil(en) von Colostrinin aufweist, die
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34,
bei der Herstellung eines Medikamentes zum Fördern der neuronalen Zelldifferenzierung
in einem Patienten, zur Verfügung.
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In
einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein In-vitro-Verfahren
zum Behandeln geschädigter
neuronaler Zellen zur Verfügung,
wobei das Verfahren das Inkontaktbringen nicht-funktioneller neuronaler
Zellen mit einem Regulator neuronaler Zellen umfasst, der ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Colostrinin, einem Peptidbe standteil
von Colostrinin, einem aktiven Analogon eines Peptidbestandteils
von Colostrinin und Kombinationen davon, unter Bedingungen, die
wirksam sind, um die geschädigten
neuronalen Zellen in funktionelle neuronale Zellen umzuwandeln;
worin der Peptidbestandteil von Colostrinin ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34; worin
das aktive Analogon ein Peptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 15 % Prolin hat und das wenigstens 70 % Sequenzidentität mit einem
oder mehreren Peptidbestandteil(en) von Colostrinin aufweist, die
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34,
und worin die Nichtfunktion das Ergebnis einer Neurodegeneration
ist.
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Ein
In-Vitro-Verfahren zum Behandeln geschädigter (d. h. nicht-funktioneller)
neuronaler Zellen in einem Patienten umfasst das Verabreichen eines
Regulators neuronaler Zellen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Colostrinin, einem Peptidbestandteil davon, einem Analog davon
und Kombinationen davon, an den Patienten, unter Bedingungen, die
wirksam sind, um die geschädigten
neuronalen Zellen in funktionelle neuronale Zellen umzuwandeln.
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In
einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung
eines Regulators neuronaler Zellen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Colostrinin, einem Peptidbestandteil von Colostrinin, einem
aktiven Analogon eines Peptidbestandteils von Colostrinin und Kombinationen
davon; worin der Peptidbestandteil von Colostrinin ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34; worin
das aktive Analogon ein Peptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 15 % Prolin hat und das wenigstens 70 % Sequenzidentität mit einem
oder mehreren Peptidbestandteil(en) von Colostrinin aufweist, die
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34,
bei der Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln geschädigter neuronaler
Zellen in einem Patienten, zur Verfügung.
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In
einem fünften
Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Fördern der
In-Vitro-Differenzierung neuronaler Zellen zur Verfügung, wobei
das Verfahren das Inkontaktbringen pluripotenter Zellen des Nervensystems
mit einem Regulator neuronaler Zellen umfasst, der ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Colostrinin, einem Peptidbestandteil
von Colostrinin, einem aktiven Analogon eines Peptidbestandteils
von Colostrinin und Kombinationen davon, unter Bedingungen, die
wirksam sind, um die pluripotenten Zellen des Nervensystems in ihrer
Morphologie zu verändern,
um neuronale Zellen zu bilden; worin der Peptidbestandteil von Colostrinin
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34; und
worin das aktive Analogon ein Peptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 15 % Prolin hat und das wenigstens 70 % Sequenzidentität mit einem
oder mehreren Peptidbestandteil(en) von Colostrinin aufweist, die
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34.
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In
einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung
eines Regulators neuronaler Zellen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehen
aus Colostrinin, einem Peptidbestandteil von Colostrinin, einem
aktiven Analogon eines Peptidbestandteils von Colostrinin und Kombinationen
davon; worin der Peptidbestandteil von Colostrinin ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34; und worin
das aktive Analogon ein Peptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 15 % Prolin hat und das wenigstens 70 % Sequenzidentität mit einem
oder mehreren Peptidbestandteil(en) von Colostrinin aufweist, die
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehen aus SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:34, bei
der Herstellung eines Medikamentes zum Fördern der Differenzierung pluripotenter
Zellen des Nervensystems, um neuronale Zellen in einem Patienten
zu bilden, zur Verfügung.
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Wie
hierin verwendet, werden "neural/Nerven-" und "Nerven-ähnlich" hierin synonym verwendet.
Derartige Zellen weisen Morphologien auf, die Nervenzellen ähneln. Zum
Beispiel einen zentralen Zellkörper
mit einem Neuritenfortsatz. Wie hierin verwendet, sind nicht-funktionelle
neurale Zellen solche, die keine Information übertragen, z. B. durch Acetylcholin,
jedoch morphologisch Nervenzellen ähneln, und funktionelle neurale Zellen
sind solche, die Informationen unter Verwendung von Mediatoren,
wie z. B. Acetylcholin, übertragen
und morphologisch Nervenzellen ähneln.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet "ein" ein oder mehrere,
so dass Kombinationen der Wirkstoffe (d. h. aktive immunologische
Regulatoren oder Promotoren der Differenzierung von Blutzellen)
z. B. in den Zusammensetzungen und Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden
können.
Folglich bezieht sich eine Zusammensetzung, die "ein" Polypeptid
enthält,
auf eine Zusammensetzung, die ein oder mehrere Polypeptide enthält.
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"Aminosäure" wird hierin verwendet,
um eine chemische Verbindung mit der allgemeinen Formel: NH2---CRH---COOH zu bezeichnen, wobei R, die
Seitenkette, H oder eine organische Gruppe ist. Wenn R organisch
ist, kann R variieren und ist entweder polar oder nicht polar (d.
h. hydrophob). Die Aminosäuren
gemäß dieser
Erfindung können natürlich vorkommen
oder synthetisch sein (häufig
als nicht-proteinogen bezeichnet).
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Wie
hierin verwendet, ist eine organische Gruppe eine Kohlenwasserstoff-Gruppe,
die als aliphatische Gruppe, zyklische Gruppe oder Kombinationen
aliphatischer und zyklischer Gruppen klassifiziert wird. Der Begriff "aliphatische Gruppe" bezeichnet eine
gesättigte
oder ungesättigte
lineare oder verzweigte Kohlenwasserstoff-Gruppe. Dieser Begriff
wird so verwendet, dass er z. B. Alkyl-, Alkenyl- und Alkynyl-Gruppen
umfasst.
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Der
Begriff "zyklische
Gruppe" bezeichnet
eine Kohlenwasserstoff-Gruppe mit geschlossenem Ring, die als alizyklische
Gruppe, aromatische Gruppe oder heterozyklische Gruppe klassifiziert
wird. Der Begriff "alizyklische
Gruppe" bezeichnet
eine zyklische Kohlenwasserstoff-Gruppe, die Eigenschaften aufweist,
die denen aliphatischer Gruppen ähneln.
Der Begriff "aromatische
Gruppe" bezieht
sich auf mono- oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoff-Gruppen.
Wie hierin verwendet, kann eine organische Gruppe substituiert oder
nicht substituiert sein.
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Die
Begriffe "Polypeptid" und "Peptid" werden hierin synonym
verwendet, um ein Polymer von Aminosäuren zu bezeichnen. Diese Begriffe
beinhalten keine spezifische Länge
eine Polymers von Aminosäuren. Folglich
sind z. B. die Begriffe Oligopeptid, Protein und Enzym von der Definition
des Polypeptids oder Peptids umfasst, ob unter Verwendung rekombinanter
Methoden hergestellt, der chemischen oder enzymatischen Synthese,
oder natürlich
vorkommend. Dieser Begriff umfasst außerdem Polypeptide, die modifiziert
oder derivatisiert worden sind, wie z. B. durch Glycosylierung,
Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen.
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Die
folgenden Abkürzungen
werden in der gesamten Anmeldung verwendet:
| A
= Ala = Alanin | T
= Thr = Threonin |
| V
= Val = Valin | C
= Cys = Cystein |
| L
= Leu = Leucin | Y
= Tyr = Tyrosin |
| I
= Ile = Isoleucin | N
= Asn = Asparagin |
| P
= Pro = Prolin | Q
= Gln = Glutamin |
| F
= Phe = Phenylalanin | D
= Asp = Asparaginsäure |
| W
= Trp = Tryptophan | E
= Glu = Glutaminsäure |
| M
= Met = Methionin | K
= Lys = Lysin |
| G
= Gly = Glycin | R
= Arg = Arginin |
| S
= Ser = Serin | H
= His = Histidin |
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1.
Wirkung von NGF und Peptidbestandteilen von Colostrinin auf die
Morphologie von PC12-Zellen. 3 × 104-Zellen pro Vertiefung wurden in 24-Well-Platten
ausgesät,
und 24 Stunden (Std.) später
wurden die Zellen mit NGF oder Kolostrum, Colostrinin oder dessen
Peptidbestandteilen behandelt, wie in dem Abschnitt Beispiele beschrieben.
Sechs Tage nach der Behandlung wurden die Zellen in Formaldehyd
fixiert und gefärbt,
um die morphologischen Veränderungen
der Zellen sichtbar zu machen. Scheinbehandelte Zellen (A), mit
NGF behandelte Zellen (B). Die untere Abbildung zeigt die typischen
morphologischen Veränderungen
von PC12-Zellen nach der Exposition gegenüber SEQ ID NR:1 (C) oder SEQ
ID NR:2 (D, D1).
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Die
Erfinder haben festgestellt, dass Colostrinin, wenigstens ein Peptidbestandteil
davon und/oder wenigstens ein aktives Analogon davon (z. B. ein
Peptid, das eine N-terminale Sequenz aufweist, die einer N-terminalen
Sequenz von wenigstens einem Peptidbestandteil von Colostrinin entspricht),
als Regulatoren neuronaler Zellen verwendet werden können. Derartige
Regulatoren fördern
die Differenzierung von Zellen (z. B. von pluripotenten Zellen),
so dass es eine Veränderung
in der Morphologie gibt, so dass neurale Zellen gebildet werden
(die in Geweben und Organen, wie z. B. dem Gehirn oder dem Ganglion
vorhanden sind). Dieses kann in vitro oder in vivo auftreten, einschließlich des
innerlichen Auftretens in Tieren (einschließlich Säugetieren, wie z. B. Menschen).
Diese Regulatoren können
außerdem
geschädigte
(z. B. nicht-funktionelle) neurale Zellen in funktionelle neurale
Zellen umwandeln.
-
Derartige
Regulatoren neuraler Zellen werden hierin als "Wirkstoffe/aktive Agenzien (active agents)" bezeichnet. Bedeutsamerweise
können
derartige Agenzien allein oder in verschiedenen Kombinationen an
einen Patienten verabreicht werden (z. B. an Tiere, einschließlich Menschen),
als Medikation oder diätetisches (z.
B. Nahrungs-)Ergänzungsmittel,
in einer Dosis, die ausreicht, um eine Zunahme an Nervenzellen innerhalb des
Körpers
des Patienten zu bewirken, in einem spezifischen Gewebe oder in
einer Sammlung von Geweben (Organen).
-
Der
Vorgang der Differenzierung von Zellen im Nervensystem wird durch
den Vorgang der Differenzierung und durch Wachstumsfaktoren, einschließlich NGF,
reguliert. Zum Beispiel löst
die Bindung von NGF an seine Rezeptor-Tyrosin-Kinase, TrkA, verschiedene
molekulare Interaktionen aus, einschließlich der Tyrosin-Phosphorylierung
von Proteinen sowie die Aktivität
des Ras/Raf/MEK/MAPK-Stoffwechselweges (Chao et al., Cell, 68, 995-997(1992);
und Marshall et al., Cell, 80, 179-185 (1995)). NGF induziert die Produktion
von reaktivem Stickstoffoxid (nitric Oxid, NO), und NO wird für die NGF-induzierte Zytostase
und Differenzierung benötigt
(Peunova et al., Nature, 375, 68-73 (1995)), was nahe legt, dass
freie Radikal-Moleküle
eine regulatorische Rolle bei bestimmten Arten der Zelldifferenzierung
ausüben
könnten.
-
Es
ist wichtig, die Nervenzellen-Differenzierung zu fördern (d.
h. die Differenzierung von Zellen zu fördern, so dass sie neurale
Zellen bilden) und/oder die Umwandlung geschädigter Nervenzellen, soweit
ein signifikanter Schaden der Nervenzellen aufgetreten ist, der
in einer Vielzahl von Situationen auftreten kann. Die hierin beschriebenen
Wirkstoffe können
einzeln, in verschiedenen Kombinationen oder kombiniert mit anderen bereits
bekannten oder neu erfundenen pharmakologischen Agenzien verwendet
werden. Die Förderung
von Differenzierungsantworten von Nervenzellen kann man sich z.
B. bei der Regeneration, der Reparatur und dem Ersetzen von Zellen,
Geweben oder Organen zunutze machen.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Fördern der Differenzierung neuraler
Zellen (d. h. der Differenzierung von Zellen, so dass neurale Zellen
gebildet werden) und der Umwandlung nicht-funktioneller neuraler
Zellen in funktionelle neurale Zellen zur Verfügung. Ob in vivo oder in vitro,
umfassen diese Verfahren die Beobachtung, des Grads der Zunahme
von funktionellen Nervenzellen und/oder der Veränderungen in der Morphologie
der Zellen, die gebildet werden, unter Verwendung phänotypischer
Marker, wie durch Fillmore et al., J. Neurosci. Res., 31, 662-669
(1992) und Levi et al., Mol. Neurobiol., 2, 201-226 (1988) offenbart.
Spezifische In-Vitro-Verfahren sind in dem Abschnitt Beispiele beschrieben.
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Colostrinin
ist aus Peptiden zusammengesetzt, wobei das Aggregat ein Molekulargewicht
im Bereich von etwa 5,8 bis etwa 26 Kilodalton (kDa) hat, wie mittels
Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wurde. Es weist eine höhere Konzentration
an Prolin auf als irgendeine andere Aminosäure. Von Colostrinin des Schafes wurde
festgestellt, dass es ein Molekulargewicht von etwa 18 kDa hat und
drei nicht-kovalent verbundene Untereinheiten mit einem Molekulargewicht
von etwa 6 kDa umfasst und etwa 22 Gew.-% Prolin aufweist. Es wurde außerdem gezeigt,
dass Schafscolostrinin die folgende Anzahl von Resten pro Untereinheit
aufweist: Lysin – 2;
Histidin – 1;
Arginin – 0;
Asparaginsäure – 2; Threonin – 4; Serin – 3; Glutaminsäure – 6; Prolin – 11; Glycin – 2; Alanin – 0; Valin – 5; Methionin – 2; Isoleucin – 2; Leucin – 6; Tyrosin – 1; Phenylalanin – 3; und
Cystein – 0.
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Von
Colostrinin wurde festgestellt, dass es etliche Peptide im Bereich
von 3 Aminosäuren
bis 22 Aminosäuren
oder mehr umfasst. Diese können
durch verschiedene bekannte Methoden erhalten werden, einschließlich der
Isolation und Reinigung, welche die Elektrophorese und synthetische
Methoden umfassen. Das spezifische Verfahren zum Erhalten von Colostrinin
und SEQ ID NR:31 wird in der internationalen Veröffentlichung Nr.
WO-A-98/14473 beschrieben.
Unter Verwendung von HPLC und der Edelman-Degradation wurden über 30 Peptidbestandteile
von Colostrinin identifiziert, die in verschiedene Gruppen eingeteilt
werden können: (A),
solche mit unbekanntem Vorläufer
(precursor); (B), solche, die einen Vorläufer eines β-Casein-Homologen haben; (C),
solche, die einen β-Casein-Vorläufer haben;
und (D), solche, die einen Annexin-Vorläufer haben. Diese Peptide sind
in der internationalen Patentanmeldung
PCT/GB00/02128 , eingereicht am 2.
Juni 2000, die die Priorität
vom 2. Juni 1999 in Anspruch nimmt, beschrieben und können in Übereinstimmung
mit dem in dem Abschnitt Beispiele beschriebenen allgemeinen Verfahren
synthetisiert werden. Diese Peptide (d. h. Peptidbestandteile von
Colostrinin), die aus Colostrinin stammen können oder chemisch synthetisiert
werden können, schließen ein:
MQPPPLP (SEQ ID NR:1), LQTPQPLLQVMMEPQGD (SEQ ID NR:2), DQPPDVEKPDLQPFQVQS
(SEQ ID NR:3), LFFFLPVVNVLP (SEQ ID NR:4), DLEMPVLPVEPFPFV (SEQ
ID NR:5), MPQNFYKLPQM (SEQ ID NR:6), VLEMKFPPPPQETVT (SEQ ID NR:7),
LKPFPKLKVEVFPFP (SEQ ID NR:8), VVMEV (SEQ ID NR:9), SEQP (SEQ ID
NR:10), DKE (SEQ ID NR:11), FPPPK (SEQ ID NR:12), DSQPPV (SEQ ID NR:13),
DPPPPQS (SEQ ID NR:14), SEEMP (SEQ ID NR:15), KYKLQPE (SEQ ID NR:16),
VLPPNVG (SEQ ID NR:17), VYPFTGPIPN (SEQ ID NR:18), SLPQNILPL (SEQ
ID NR:19), TQTPWVPPF (SEQ ID NR:20), LQPEIMGVPKVKETMVPK (SEQ ID
NR:21), HKEMPFPKYPVEPFTESQ (SEQ ID NR:22), SLTLTDVEKLHLPLPLVQ (SEQ
ID NR:23), SWMHQPP (SEQ ID NR:24), QPLPPTVMFP (SEQ ID NR:25), PQSVLS
(SEQ ID NR:26), LSQPKVLPVQKAVPQRDMPIQ (SEQ ID NR:27), AFLLYQE (SEQ
ID NR:28), RGPFPILV (SEQ ID NR:29), ATFNRYQDDHGEEILKSL (SEQ ID NR:30),
VESYVPLFP (SEQ ID NR:31), FLLYQEPVLGPVR (SEQ ID NR:32), LNF (SEQ
ID NR:33) und MHQPPQPLPPTVMFP (SEQ ID NR:34). Diese können wie
folgt eingeteilt werden: (A) solche mit unbekanntem Vorläufer schließen SEQ
ID NRn: 2, 6, 7, 8, 10, 11, 14 und 33 ein; (B) solche, die einen
Vorläufer
eines Homologen von β-Casein
haben, schließen
SEQ ID NRn: 1, 3, 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17 und 31 ein; (C) solche,
die einen β-Casein-Vorläufer haben,
schließen
die SEQ ID NRn: 18 (Casein Aminosäuren 74-83), 19 (Casein Aminosäuren 84-92),
20 (Casein Aminosäuren
93-102), 21 (Casein Aminosäuren 103-120),
22 (Casein Aminosäuren
121-138), 23 (Casein Aminosäuren
139-156), 24 (Casein Aminosäuren
157-163), 25 (Casein Aminosäuren
164-173), 26 (Casein Aminosäuren
174-179), 27 (Casein Aminosäuren
180-201), 28 (Casein Aminosäuren
202-208), 29 (Casein Aminosäuren
214-222), 32 (Casein Aminosäuren
203-214), und 34 (Casein Aminosäuren
159-173) ein; und (D) solche, die einen Annexin-Vorläufer haben,
schließen
die SEQ ID NR:30 (Annexin Aminosäuren
203-220) ein.
-
Eine
bevorzugte Gruppe derartiger Peptide umfasst: MQPPPLP (SEQ ID NR:1),
LQTPQPLLQVMMEPQGD (SEQ ID NR:2), DQPPDVEKPDLQPFQVQS (SEQ ID NR:3),
LFFFLPVVNVLP (SEQ ID NR:4), DLEMPVLPVEPFPFV (SEQ ID NR:5), MPQNFYKLPQM
(SEQ ID NR:6), VLEMKFPPPPQETVT (SEQ ID NR:7), LKPFPKLKVEVFPFP (SEQ
ID NR:8), und Kombinationen davon.
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Die
Polypeptide der SEQ ID NRn:1-34 können als freie Säure vorhanden
sein oder sie können
an der C-terminalen Carboxylat-Gruppe amidiert sein. Die vorliegende
Erfindung umfasst ferner Analoga der Polypeptide der SEQ ID NRn:1-34,
die Polypeptide umfassen, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu den SEQ ID NRn:1-34
aufweisen. Diese Peptide können
außerdem
einen Teil eines größeren Peptids
bilden. Ein "Analogon" eines Polypeptids
umfasst wenigstens einen Teil des Polypeptids, wobei der Teil Deletionen
oder Additionen einer oder mehrerer zusammenhängender oder nicht-zusammenhängender
Aminosäuren
enthält
oder ein oder mehrere Aminosäuresubstitution(en)
enthält.
Ein "Analogon" kann folglich zusätzliche
Aminosäuren an
einem oder beiden Termini der oben angegebenen Polypeptide umfassen.
Substitute für
eine Aminosäure in
den Polypeptiden gemäß der Erfindung
sind vorzugsweise konservative Substitutionen, die ausgewählt sind aus
anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört. Zum
Beispielt ist es auf dem Gebiet der Proteinbiochemie wohlbekannt,
dass eine Aminosäure,
die zu einer Gruppe von Aminosäuren
gehört,
die eine bestimmte Größe oder
bestimmte Eigenschaft aufweisen (wie z. B. Ladung, Hydrophobizität und Hydrophilizität), im Allgemeinen
durch eine andere Aminosäure
ersetzt werden kann, ohne die Struktur eines Polypeptids wesentlich
zu ändern.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung werden konservative Aminosäureaustausche
als Ergebnis eines Austausches von Aminosäureresten innerhalb einer der
folgenden Klassen von Resten definiert: Klasse I: Ala, Gly, Ser,
Thr und Pro (die kleine aliphatische Seitenketten und Hydroxylgruppen-Seitenketten
darstellen); Kasse II: Cys, Ser, Thr und Tyr (die Seitenketten darstellen,
die eine -OH- oder -SH-Gruppe umfassen); Klasse III: Glu, Asp, Asn
und Gln (Carboxylgruppen-enthaltende Seitenketten): Klasse IV: His,
Arg und Lys (die basische Seitenketten darstellen); Klasse V: Ile,
Val, Leu, Phe und Met (die hydrophobe Seitenketten darstellen);
und Klasse VI: Phe, Trp, Tyr und His (die aromatische Seitenketten
darstellen). Die Klassen umfassen außerdem verwandte Aminosäuren, wie
z. B. 3Hyp und 4Hyp in Klasse I; Homocystein in Klasse II; 2-Aminoadipinsäure, 2-Aminopimelinsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, β-Carboxyasparaginsäure und
die entsprechenden Aminosäureamide
in Klasse III; Ornithin, Homoarginin, N-Methyllysin, Dimethyllysin,
Trimethyllysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,4-Diaminobuttersäure, Homoarginin,
Sarcosin und Hydroxylysin in Klasse IV; substituierte Phenylalanine,
Norleucin, Norvalin, 2-Aminooctansäure, 2-Aminoheptansäure, Statin
und β-Valin
in Klasse V; und Naphthylalanine, substituierte Phenylalanine, Tetrahydroisochinolin-3-carboxylsäure und
halogenierte Tyrosine in Klasse VI.
-
Vorzugsweise
umfassen die aktiven Analoga von Colostrinin und dessen Peptidbestandteilen
Polypeptide, die eine relativ große Anzahl von Prolinresten
aufweisen. Da Prolin keine häufige
Aminosäure
ist, bedeutet eine "große Anzahl" vorzugsweise, dass
ein Polypeptid wenigstens etwa 15 % Prolin (nach Anzahl) und bevorzugter
wenigstens etwa 20 % Prolin (nach Anzahl) umfasst. Am bevorzugtesten
umfassen die aktiven Analoga mehr Prolinreste als irgendeine andere
Aminosäure.
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Wie
oben angegeben, umfassen aktive Analoga von Colostrinin und dessen
Peptidbestandteilen Polypeptide, die strukturelle Ähnlichkeiten
aufweisen. Die strukturelle Ähnlichkeit
wird im Allgemeinen bestimmt, indem die Reste von zwei Aminosäurensequenzen
alignt werden, um die Anzahl identischer Aminosäuren über die Länge ihrer Sequenzen zu optimieren;
Lücken
in einer oder beiden Sequenzen sind bei der Herstellung des Alignments
erlaubt, um die Anzahl identischer Aminosäuren zu optimieren, obwohl
die Aminosäuren in
jeder Sequenz nichtsdestotrotz in ihrer richtigen Reihenfolge bleiben
müssen.
Vorzugsweise werden zwei Aminosäuresequenzen
unter Verwendung des Baste-Programms, Version 2.0.9, des BLAST 2-Suchalgorithmus
verwendet, das erhältlich
ist unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gort/bl2.html. Vorzugsweise
werden die Standardwerte für
sämtliche
BLAST 2-Suchparameter verwendet, einschließlich: matrix = BLOSUM62; open gap
penalty = 11, extension gap penalty = 1, gap x_dropoff = 50, expect
= 10, wordsize = 3 und angeschalteten Filter. Bei dem Vergleich
der beiden Aminosäuresequenzen
unter Verwendung des BLAST-Suchalgorithmus wird die strukturelle Ähnlichkeit
als "Identität" bezeichnet. Vorzugsweise
weist ein aktives Analogon von Colostrinin oder dessen Peptidbestandteilen
eine strukturelle Ähnlichkeit
mit Colostrinin oder einem oder mehreren seiner Peptidbestandteile
(vorzugsweise einem der SEQ ID NRn:1-34) von wenigstens etwa 70
% Identität
auf, bevorzugter von etwa 80 % Identität und am bevorzugtesten von
etwa 90 % Identität.
-
Colostrinin
oder jede Kombination seiner Peptidbestandteile oder aktiven Analoga
können
natürlicherweise
gewonnen (vorzugsweise isoliert und gereinigt) werden, wie z. B.
durch Extraktion aus Kolostrum, oder sie können unter Verwendung bekannter
Peptid-Polymerisierungsmethoden
synthetisch konstruiert werden. Zum Beispiel können die Peptide gemäß der Erfindung
durch das Feste-Phase-Verfahren unter Verwendung von Standardverfahren
auf Grundlage von t-Butyloxycarbonyl (BOC)- oder 9-Fluorenylmethoxy-carbonyl (FMOC)-Schutzgruppen
synthetisiert werden. Diese Methodik wird von G. B. Fields et al.
in Synthetic Peptides: A User's
Guide, W. M. Freeman & Company,
New York, NY, S. 77-183 (1992) beschrieben. Darüber hinaus können die
Gensequenzen, die für
die Colostrininpeptide oder Analoga davon kodieren, durch bekannte
Methoden konstruiert werden, wie z. B. Expressionsvektoren oder
Plasmide und in geeignete Mikroorganismen transfiziert werden, welche
die DNA-Sequenzen exprimieren, wobei das Peptid für die spätere Extraktion
aus dem Medium, in dem die Mikroorganismen wachsen, hergestellt
wird. Zum Beispiel beschreibt
US-Patent
Nr. 5,595,887 Verfahren zur Herstellen zahlreicher relativ
kleiner Peptide durch Expression eines rekombinanten Genkonstruktes,
das für
ein Fusionsprotein kodiert, das ein Bindungsprotein und eine oder
mehrere Kopien des gewünschten
Zielpeptids umfasst. Nach der Expression wird das Fusionsprotein
isoliert und unter Verwendung chemischer und/oder enzymatischer
Verfahren gespalten, um das gewünschte
Zielpeptid herzustellen.
-
Die
in dem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendeten Peptide können
in monovalentem Zustand verwendet werden (d. h. als freies Peptid
oder als einzelnes Peptid-Fragment, gekoppelt an ein Trägermolekül). Die
Peptide können
außerdem
als Konjugate verwendet werden, die mehr als ein Peptidfragment
(dasselbe oder verschiedene) an ein einziges Trägermolekül gebunden aufweisen. Der Träger kann
ein biologisches Trägermolekül sein (z.
B. ein Glycosaminoglycan, ein Proteoglycan, ein Albumin oder dergleichen)
oder ein synthetisches Polymer (z. B. ein Polyalkylenglycol oder
ein synthetischer Chromatografie-Träger). üblicherweise werden Ovalbumin,
humanes Serumalbumin, andere Proteine, Polyethylenglycol oder dergleichen
als Träger
verwendet. Derartige Modifikationen können die scheinbare Affinität erhöhen und/oder
die Stabilität
des Peptids verändern.
Die Anzahl der Peptidfragmente, die mit dem jeweiligen Träger assoziiert
sind oder an diesen gebunden sind, kann variieren, jedoch werden
unter den Standard-Kopplungsbedingungen üblicherweise zwischen etwa
4 bis 8 Peptide pro Trägermolekül erhalten.
-
Zum
Beispiel kann ein Peptid/Trägermolekül-Konjugat
hergestellt werden, indem eine Mischung von Peptiden und Trägermolekülen mit
einem Kopplungsagens, wie z. B. Carbodiimid, behandelt wird. Das
Kopplungsagens kann eine Carboxylgruppe, entweder auf dem Peptid
oder dem Trägermolekül, aktivieren,
so dass die Carboxylgruppe mit einem Nukleophil (z. B. einer Amino-
oder Hydroxyl-Gruppe) auf dem anderen Teil des Peptid/Trägermoleküls reagieren
kann, was zu der kovalenten Bindung des Peptids und des Trägermoleküls führt. Zum
Beispiel können
Konjugate eines Peptids, das an Ovalbumin gekoppelt ist, hergestellt
werden, indem gleiche Mengen eines lyophylisierten Peptids und Ovalbumins
in einem kleinen Volumen Wasser gelöst werden. In einem zweiten
Gefäß wird 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carboiimidhydrochloride
(EDC; die zehnfache Menge des Peptids) in einer kleinen Menge Wasser
aufgelöst.
Die EDC-Lösung
wurde zu der Peptid/Ovalbumin-Mischung dazugegeben und für einige
Stunden reagieren gelassen. Die Mischung kann anschließend dialysiert
werden (z. B. in Phosphat-gepufferter Salzlösung), um eine gereinigte Lösung des
Peptid/Ovalbumin-Konjugats zu erhalten. Peptid/Trägermolekül-Konjugate,
die mittels dieses Verfahrens hergestellt wurden, enthalten üblicherweise
etwa 4 bis 5 Peptide pro Ovalbuminmolekül.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung zur Verfügung, die
ein oder mehrere Wirkstoffe gemäß der Erfindung
(d. h. Colostrinin, wenigstens ein Peptidbestandteil davon oder
ein aktives Analogon davon) und ein oder mehrere Träger enthält, vorzugsweise
einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Verfahren gemäß der Erfindung
umfassen die Verabreichung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung
an einen Patienten, das Applizieren auf die Haut eines Patienten,
vorzugsweise eines Säugers
und bevorzugter eines Menschen, in einer Menge, die wirksam ist,
den gewünschten
Effekt zu erzielen. Die Wirkstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung
werden für
die enterale Verabreichung (oral, rektal, etc.) oder die parenterale
Verabreichung (Injektion, innerliche Pumpe, etc.) formuliert. Die
Verabreichung kann durch direkte Injektion in ein Gewebe, interarterielle
Injektion, intervenöse
Injektion oder andere innerliche Verabreichungsverfahren, wie z.
B. durch die Verwendung einer implantierten Pumpe oder über das
Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Schleimhaut in einem
Trägerstoff,
der so gestaltet ist, dass er die Transmission der Zusammensetzung
durch die Schleimhaut erleichtert, wie z. B. ein Suppositorium,
Augentropfen, inhalator oder weitere ähnliche Verabreichungsverfahren
oder über
die orale Verabreichung in Form eines Sirups, einer Flüssigkeit,
einer Pille, Kapsel, mit Gel beschichteten Tablette oder über andere ähnliche
orale Verabreichungsverfahren erfolgen. Die Wirkstoffe können in
ein Heftpflaster, ein Pflaster, ein Kaugummi und dergleichen eingeschlossen
werden oder sie können
in eine Kapsel oder in eine bio-erodierbare Matrix für die kontrollierte
Freisetzung eingeschlossen werden.
-
Die
Träger
für die
innerliche Verabreichung können
jegliche Träger
sein, die üblicherweise
verwendet werden, um die innerliche Verabreichung von Zusammensetzungen
wie z. B. Plasma, sterile Salzlösung, i.v.-Lösungen oder
dergleichen zu erleichtern. Träger
für die
Verabreichung über
Schleimhäute
können
jegliche auf dem Gebiet wohlbekannte Träger sein. Träger für die orale
Verabreichung können
jegliche Träger
sein, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind.
-
Die
Formulierungen können
in geeigneter Weise in Einheitsdosierungsformen dargeboten werden
und können
mit Hilfe jeglicher auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren
hergestellt werden. Sämtliche
Verfahren umfassen den Schritt des Zusammenbringens des Wirkstoffes
mit einem Träger,
der ein oder mehrere Zusatzbestandteile aufweist. Im Allgemeinen
werden die Formulierungen hergestellt, indem der Wirkstoff gleichmäßig und
eng mit einem flüssigen
Träger,
einem fein aufgeteilten festen Träger oder mit beiden zusammengebracht
wird und anschließend,
falls nötig,
das Produkt in die gewünschten
Formulierungen gebracht wird.
-
Geeignete
Formulierungen für
die parenterale Verabreichung umfassen zweckmäßigerweise eine sterile wässrige Herstellung
des Wirkstoffes oder Dispersionen des sterilen Pulvers des Wirkstoffes,
die vorzugsweise isotonisch in Bezug zum Blut des Empfängers sind.
Isotonische Mittel, die in die flüssigen Herstellungen eingeschlossen
werden können,
beinhalten Zucker, Puffer und Natriumchlorid. Lösungen des Wirkstoffes können in
Wasser hergestellt werden, optional mit einem nicht toxischen oberflächenaktiven
Stoff gemischt. Dispersionen des Wirkstoffes können in Wasser, Ethanol oder
Polyol (wie z. B. Glycerin, Propylenglycol, flüssigen Polyethylenglycolen
und dergleichen), pflanzlichen Ölen,
Glycerolestern und Mischungen davon hergestellt werden. Die endgültige Dosierungsform
ist steril, flüssig
und unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil. Die
notwendige Fluidität
kann z. B. erreicht werden, indem Liposomen verwendet werden, indem im
Falle von Dispersionen die geeignete Partikelgröße verwendet wird oder indem
oberflächenaktive
Stoffe verwendet werden. Die Sterilisierung einer flüssigen Herstellung
kann durch jedes geeignete Verfahren erreicht werden, das die Bioaktivität des Wirkstoffes
erhält,
vorzugsweise durch Filtersterilisierung. Bevorzugte Verfahren zur
Herstellung von Pudern schließen
die Vakuumtrocknung und die Gefriertrocknung der sterilen injizierbaren
Lösungen
ein. Eine spätere
mikrobielle Kontamination kann verhindert werden, indem verschiedene
antimikrobielle Mittel verwendet werden, z. B. antibakterielle,
antivirale und antifungale Mittel, einschließlich Parabenen, Chlorbutanol,
Phenol, Sorbinsäure,
Thimerosal und dergleichen. Eine Absorption der Wirkstoffe über eine
längere
Zeit kann erreicht werden, indem Mittel zur Verzögerung eingeschlossen werden,
z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
-
Die
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet
sind, können als
einzelne Einheiten dargeboten werden, wie z. B. als Tabletten, Pastillen,
Kapseln, Lutschtabletten, Oblaten, Kapseln aus Stärkemasse,
die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffes als Puder oder
Granulat enthalten, als Liposomen, welche den Wirkstoff enthalten
oder als Lösung
oder Suspension in einem flüssigen Liquor
oder als nicht-wässrige
Flüssigkeit,
wie z. B. ein Sirup, Elixier, Emulsion oder Trunk. Die Menge des Wirkstoffes
ist so gewählt,
dass die Dosierungsmenge wirksam ist, um das gewünschte Ergebnis in dem Individuum
zu erreichen.
-
Nasenspray-Formulierungen
umfassen gereinigte wässrige
Lösungen
des Wirkstoffes mit Konservierungsmitteln und isotonischen Mitteln.
Derartige Formulierungen werden vorzugsweise auf einen pH und eine isotonische
Beschaffenheit eingestellt, der/die mit den Nasenschleimhäuten kompatibel
ist. Formulierungen für die
rektale oder vaginale Verabreichung können als Suppositorium dargeboten
werden, mit einem geeigneten Träger,
wie z. B. Kakaobutter oder gehärteten
Fetten oder gehärteten
aliphatischen Carboxylsäuren.
Ophthalmische Formulierungen werden mit Hilfe eines ähnlichen
Verfahrens wie für
das Nasenspray hergestellt, außer dass
der pH und die isotonischen Faktoren vorzugsweise so eingestellt
werden, dass sie dem des Auges entsprechen. Topische Formulierungen
enthalten den Wirkstoff gelöst
oder suspendiert in einem oder mehreren Medien, wie z. B. Mineralöl, DMSO,
Polyhydroxyalkoholen oder anderen Grundbestandteilen für topische pharmazeutische
Formulierungen.
-
Geeignete
Dosierungen der Wirkstoffe können
bestimmt werden, indem ihre In-Vitro-Aktivität und die In-Vivo-Aktivitat
in Tiermodellen verglichen werden. Verfahren zur Extrapolierung
wirksamer Dosierungen in Mäusen
und anderen Tieren auf Menschen sind auf dem Gebiet bekannt; siehe
z. B.
US-Patent Nr. 4,938,949 .
-
Die
Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können außerdem ein
oder mehrere der folgenden Stoffe enthalten: ein Bindemittel, wie
z. B. das Gummi Tragacanth, Akazie, Maisstärke oder Gelatine; ein Exzipient,
wie z. B. Dicalciumphosphat; ein Aufschlussmittel, wie z. B. Maisstärke, Kartoffelstärke, Algininsäure und
dergleichen; ein Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat; ein Süßungsmittel,
wie z. B. Sucrose, Fructose, Lactose oder Aspartam; und einen natürlichen
oder künstlichen
Aromastoff. Wird die Einheitsdosierungsform als Kapsel verwendet,
kann sie weiterhin einen flüssigen
Träger
enthalten, wie z. B. pflanzliches Öl oder ein Polyethylenglycol.
Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungsmittel
vorhanden sein oder um die physische Form der festen Dosierungseinheitsform
zu verändern.
Zum Beispiel können
Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Gelatine, Wachs, Schellack oder
Zucker und dergleichen beschichtet werden. Ein Sirup oder Elixier
kann ein oder mehrere, ausgewählt
aus einem Süßungsmittel,
einem Konservierungsmittel, wie z. B. Methyl- oder Propyl-Paraben,
einem Mittel, um die Kristallisierung des Zuckers zu verzögern, einem
Mittel, um die Löslichkeit
eines anderen Inhaltsstoffes zu erhöhen, wie z. B. Polyalkohol,
z. B. Glycerin oder Sorbitol, einem Farbstoff und einem Aromastoff,
enthalten. Das bei der Herstellung jeglicher Dosierungseinheitsformen verwendete
Material ist in den verwendeten Mengen im Wesentlichen nicht toxisch.
Der Wirkstoff kann in Herstellungen und Geräten für die anhaltende Freisetzung
eingeschlossen werden.
-
Beispiele
-
Die
Erfindung wird weiterhin mit Bezug auf die folgenden detaillierten
Beispiele beschrieben. Die Beispiele sind als Veranschaulichung
gedacht und sollten nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung
beschränkend
aufgefasst werden.
-
MATERIAL UND METHODEN
-
Herstellung
der Peptide:
- 1. Wasche ein bereits beladenes
Harz mit DMF (Dimethylformamid), lasse es anschließend vollständig trocken
laufen.
- 2. Gib 10 ml 20 % Piperidin/DMF zu dem Harz. Schüttle für 5 Minuten,
lasse es anschließend
trocken laufen.
- 3. Gib weitere 10 ml 20 % Piperidin/DMF dazu. Schüttle für 30 Minuten.
- 4. Entleere das Reaktionsgefäß und wasche
das Harz viermal mit DMF. Wasche es anschließend einmal mit DCM (Dichlormethanol). Überprüfe die Kügelchen
unter Verwendung des Ninhydrin-Tests – die Kügelchen sollten blau sein.
- 5. Der Kopplungsschritt wurde wie folgt durchgeführt:
a.
Stelle die folgende Lösung
her: 1 mmol Fmoc (d. h. Fluorenylmethyloxycarbonyl)aminosäure, 2,1
ml von 0,45 M HBTU/HOBT (1 mmol) (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluroniumhexafluorphosphat(N-Hydroxybenzotriazol-2O), 348 μl
DIEA (2 mmol) (Diisopropylethanlamin); und
b. gib die Lösung zu
dem Harz, und schüttle
es für
wenigstens 30 Minuten.
- 6. Lasse das Reaktionsgefäß trocken
laufen und wasche das Harz erneut viermal mit DMF und einmal mit DCM.
- 7. Führe
den Ninhydrin-Test durch: falls positiv (keine Farbe) – fahre
fort mit Schritt 2 und führe
die Synthese fort; falls negativ (blaue Farbe) – gehe zurück zu Schritt 5 und kopple
dieselbe Fmoc-Aminosäure
erneut.
- 8. Nachdem die Synthese abgeschlossen war, wurde das Peptid
mit 5 % H2O, 5 % Phenol, 3 % Thionisol, 3
% EDT (Ethandithiol), 3 % Triisopropylsilan und 81 % TFA für 2 Stunden
von dem Harz gespalten.
- 9. Nach 2 Stunden filtere in kalten MTBE (Methyl-t-butylether).
Das präzipitierte
Peptid wurde anschließend zweimal
mit kaltem MTBE gewaschen und unter Stickstoff getrocknet.
- 10. Das Molekulargewicht der synthetisierten Peptide wurde mittels
Matrix-Assisted Laser Desorption Time-of-Flight Mass Spectroscopy
(LDMS) überprüft, und
die Reinheit wurde mittels HPLC unter Verwendung einer C-18, 300 Ångstrom,
5 μm Säule überprüft.
-
Zellen:
Die PC12-Zelllinie, die von medullären Phäochromozytom-Zellen abgeleitet
ist, wurde verwendet, um die unten beschriebenen Studien durchzuführen. PC12-Zellen
wurden von der American Type Culture Collection erhalten und in
RPMI-1640, dem 10 % fötales
bovines Serum (HYCLONE Inc), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin
(100 μg/ml)
zugesetzt wurde, gehalten.
-
Verfahren:
Um die Wirkung von Kolostrum, Colostrinin und dessen Peptidbestandteilen
auf die Zelldifferenzierung zu bestimmen, wurden 3 × 104 sich logarithmisch teilende PC12-Zellen
(70 % Konfluenz) in 24-Well-Platten ausgesät, und die Zellen wurden 24
Stunden anheften und wachsen gelassen. Das Serum-enthaltende Medium
wurde aspiriert und durch serumfreies RPMI, das die geeigneten Mengen
an Antibiotika enthält,
ersetzt. In vier parallelen, wurden zunehmende Konzentrationen (0,1,
1, 10 und 100 μg
pro ml) an Kolostrum, Colostrinin und dessen Peptidbestandteilen
direkt zu den Medien gegeben und bei 37°C inkubiert. Als positive Kontrolle
wurde der Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF) 7S (Gibco-BRL)
mit einer Konzentration von 100 ng pro ml verwendet (Chao et al.,
Cell, 68, 995-997 (1992); und Marshall et al., Cell, 80, 179-185 (1995)). Phorbol-12-myristat-13-acetat
(TPA: 10 ng pro ml) wurde als negative Kontrolle verwendet. Acht
Stunden später
wurde das Medium ausgewechselt, und RPMI-1640 wurde dazu gegeben, das 1 % oder
10 % fötales
bovines Serum enthält.
Die Kulturen wurden am 2., 4. und 6. Tag nach der Behandlung mikroskopisch
untersucht. Sechs Tage nach der Behandlung wurden die Zellen mit
Paraformaldehyd (4 %) fixiert und mit 0,01 % Kristallviolett-Lösung gefärbt. Überschüssiger Farbstoff
wurde durch Waschen mit Ethanol entfernt. Die endgültige Bewertung
wurde unter Verwendung eines Mikroskops (Axiophot2 Zeiss Inc., Deutschland)
durchgeführt.
-
ERGEBNISSE
-
Nicht
behandelte Kontrollzellen zeigten die gewöhnliche abgerundete Morphologie,
replizierten weiterhin und erreichten während der 7-tägigen Versuchsdauer
70 % bis 80 % Konfluenz. Die scheinbehandelten Kontrollzellen und
TPA-exponierten Zellen zeigten einen schwachen Hintergrund-Differenzierungslevel
(weniger als 0,01 %). In dem hierin verwendeten Assaysystem vermittelte
NGF (100 ng pro ml) wie zuvor beschrieben (Chao et al., Cell, 68,
995-997 (1992)) einen Zellzyklusarrest. In mehreren Experimenten
vermittelte NGF in der Gegenwart von 10 % fötalem bovinem Serum eine Induktion
der Zelldifferenzierung, die in 45 ± 11 % der Zellen beobachtet
wurde. Wurden die Zellen einer NGF-vermittelten Differenzierung
in Gegenwart von 1 % Serum unterzogen, zeigten 5 bis 10 % der Zellen
morphologische Veränderungen.
Die differenzierten Zellen zeigten eine typische Neuron-ähnliche
Morphologie. In parallelen Experimenten wurden neun Peptidbestandteile, Colostrinin
und Kolostrum getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
-
In
der Gegenwart von 1 % fötalem
bovinem Serum wurde keine Zelldifferenzierung beobachtet. Diese Daten
zeigen, dass einige der Serumfaktoren für die biologische Wirksamkeit
dieser Verbindungen benötigt werden.
Andererseits induzierten in der Gegenwart von 10 % Serum die Peptidbestandteile,
das Colostrinin und auch das Kolostrum die Zelldifferenzierung in
PC12-Zellen. Die morphologischen Veränderungen (Fibroblasten-ähnlich,
epitheloid, Neuron-ähnlich)
sind in
1 gezeigt. Diese Daten stimmen
mit der Zytokin-induzierenden Aktivität dieser Peptide überein.
Zum Beispiel wurde gezeigt, dass IFN-gamma und der Nervenwachstumsfaktor ähnliche
Signal-Transduktionskaskaden
induzieren (Peunova et al., Nature, 375, 68-73 (1995)). Tabelle 1. Wirkung von Kolostrum, Colostrinin
und dessen Peptidbestandteilen auf die Morphologie (Differenzierung)
medullärer
Phäochromozytom-Zellen
(PC12).
| Peptid | Konzentration | | | Zellenmorphologie |
| | μg/ml | 1
% FBS | 10
% FBS | |
| SEQ
ID NR:1 |
100
10
1,0
0,1 |
–
–
–
– |
+/–
++
+
+/– | epitheloid Neuron-ähnlich |
| SEQ
ID NR:7 |
100
10
1,0
0,1 |
–
–
–
– |
+/–
+
+
– | Fibroblasten-ähnlich Neuron-ähnlich |
| SEQ
ID NR:8 |
100
10
1,0
0,1 |
–
–
–
– |
–
+
++
– | Fibroblasten-ähnlich Neuron-ähnlich |
| SEQ
ID NR:3 |
100
10
1,0
0,1 |
–
–
–
– |
+
+
+/–
– | Fibroblasten-ähnlich Neuron-ähnlich |
| SEQ
ID NR:2 |
100
10
1,0
0,1 |
–
+
–
– |
+
++
++
+/– | Fibroblasten-ähnlich Neuron-ähnlich |
| SEQ
ID NR:4 |
100
10
1,0
0,1 |
–
–
–
– |
++
++
+
– | Fibroblasten-ähnlich epitheloid
Neuron-ähnlich |
| SEQ
ID NR:5 |
100
10
1,0
0,1 |
–
–
–
– |
+
+/–
–
– | Fibroblasten-ähnlich epitheloid
Neuron-ähnlich |
| SEQ
ID NR:6* |
100
10
1,0
0,1 |
–
–
–
– |
+
+
+/–
– | Fibroblasten-ähnlich epitheloid |
| SEQ ID NR:31 |
100
10
1,0
0,1 |
NT
–
– |
NT
+/–
– | Fibroblasten-ähnlich Neuron-ähnlich |
| |
| Colostrinin |
100
10
1,0
0,1 |
NT
+
– |
NT
++
++
– | Fibroblasten-ähnlich Neuron-ähnlich |
| |
| Kolostrum |
100
10
1,0
0,1 |
NT
–
–
– |
NT
++
++
+/– | Fibroblasten-ähnlich Neuron-ähnlich |
| NGF | 0,1 | ++++ | ++++ | Neuron-ähnlich |
| TPA
(negative Kontrolle) | 0,1 | | | abgerundet |
| Kontrolle | | | | abgerundet |
-
- NT = Nicht getestet (Not Tested); – = ≤ 0,01 % (Hintergrund); + = 1
%; ++ = 1-5 %; +++ = 6-15 %; ++++ = > 15%
- * Obwohl die Zellen, die mit SEQ ID NR:6 behandelt wurden, bei
der visuellen Untersuchung keine Neuron-ähnliche Zellmorphologie zeigten,
werden zusätzliche
Tests benötigt,
um definitiv zu beweisen, dass derartige morpholgoische Veränderungen
nicht auftraten.
-
Obwohl
die Erfindung unter Bezugnahme auf ihre bevorzugten Ausführungsformen
offenbart wurde, können
die Fachleute auf dem Gebiet beim Lesen dieser Beschreibung Änderungen
und Modifikationen erkennen, die durchgeführt werden können.
-
Sequenzprotokoll in freiem
Text
-
Die
folgenden Sequenzen sind allesamt synthetische Peptidsequenzen.
| SEQ
ID NR:1 | MQPPPLP |
| SEQ
ID NR:2 | LQTPQPLLQVMMEPQGD |
| SEQ
ID NR:3 | DQPPDVEKPDLQPFQVQS |
| SEQ
ID NR:4 | LFFFLPVVNVLP |
| SEQ
ID NR:5 | DLEMPVLPVEPFPFV |
| SEQ
ID NR:6 | MPQNFYKLPQM |
| SEQ
ID NR:7 | VLEMKFPPPPQETVT |
| SEQ
ID NR:8 | LKPFPKLKVEVFPFP |
| SEQ
ID NR:9 | VVMEV |
| SEQ
ID NR:10 | SEQP |
| SEQ
ID NR:11 | DKE |
| SEQ
ID NR:12 | FPPPK |
| SEQ
ID NR:13 | DSQPPV |
| SEQ
ID NR:14 | DPPPPQS |
| SEQ
ID NR:15 | SEEMP |
| SEQ
ID NR:16 | KYKLQPE |
| SEQ
ID NR:17 | VLPPNVG |
| SEQ
ID NR:18 | VYPFTGPIPN |
| SEQ
ID NR:19 | SLPQNILPL |
| SEQ
ID NR:20 | TQTPWVPPF |
| SEQ
ID NR:21 | LQPEIMGVPKVKETMVPK |
| SEQ
ID NR:22 | HKEMPFPKYPVEPFTESQ |
| SEQ
ID NR:23 | SLTLTDVEKLHLPLPLVQ |
| SEQ
ID NR:24 | SWMHQPP |
| SEQ
ID NR:25 | QPLPPTVMFP |
| SEQ
ID NR:26 | PQSVLS |
| SEQ
ID NR:27 | LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ |
| SEQ
ID NR:28 | AFLLYQE |
| SEQ
ID NR:29 | RGPFPILV |
| SEQ
ID NR:30 | ATFNRYQDDHGEEILKSL |
| SEQ
ID NR:31 | VESYVPLFP |
| SEQ
ID NR:32 | FLLYQEPVLGPVR |
| SEQ
ID NR:33 | LNF |
| SEQ
ID NR:34 | MHQPPQPLPPTVMFP |
-
-
-
-
-
-
-
-
-
