DE60102899T2

DE60102899T2 - Verfahren zur lösung von glucagon-ähnlichen peptid-1 (glp-1) verbindungen

Info

Publication number: DE60102899T2
Application number: DE60102899T
Authority: DE
Inventors: Francis Walter PROUTY; Joseph Vincent Junior Rinella
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2005-03-31
Anticipated expiration: 2021-01-17
Also published as: US8268780B2; US20120101034A9; MXPA02007231A; US20120208980A1; US7598222B2; WO2001055213A2; EP1257577A2; ATE264870T1; HUP0204281A3; JP2003523366A; US20030060412A1; TR200401142T4; US8455433B2; PT1257577E; KR20020073184A; EP1257577B1; DE60102899D1; CA2396920A1; WO2001055213A3; HUP0204281A2

Description

Das Glucagon-ähnliche Peptid 1 (GLP-1) ist ein 37 Aminosäuren langes Peptid, das von den L-Zellen des Dünndarms in Reaktion auf die Nahrungsaufnahme sekretiert wird. Es wurde festgestellt, dass es die Insulinsekretion stimuliert (insulinotrope Wirkung), wobei es die Glucoseaufnahme durch Zellen und verringerte Serumglucosespiegel verursacht (siehe beispielsweise S. Mojsov, Int. J. Peptide Protein Research 40: 333–343 (1992)). Jedoch ist das GLP-1 (1-37) schwach aktiv. Eine weitere endogene Spaltung zwischen der Position 6 und 7 bildet ein stärkeres biologisch aktives GLP-1 (7-37)OH Peptid. Es sind auch mehrere biologisch wirksame GLP-1 Analoga und Derivate bekannt, die hierin als "GLP-1 Verbindungen" bezeichnet werden. Beispielsweise ist GLP-1 (7-36)NH₂ ein natürlich vorkommendes GLP-1 Analogon, worin Glycin am C-Terminus durch -NH₂ ersetzt wurde. Val⁸-GLP (7-37)OH ist ein synthetisches GLP-1 (7-37)OH Analogon, worin Alanin an der Position 8 durch Valin ersetzt wurde und Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1 (7-37)OH ist ein synthetisches GLP-1 (7-37)OH Analogon, worin Valin an der Position 16 und Serin an der Position 18 jeweils durch Threonin und Lysin ersetzt wurden. Aufgrund ihrer Fähigkeiten zur Stimulierung der Insulinsekretion zeigen die GLP Verbindungen ein großes Potential für die Behandlung von Diabetes, Fettsucht und verwandten Zuständen.
GLP-1 Verbindungen können in zumindest 2 verschiedenen Formen existieren. Die erste Form ist physiologisch aktiv und löst sich leicht in wässriger Lösung bei einem physiologischen pH (7,4). Im Gegensatz dazu weist die zweite Form eine geringe oder keine insulinotrope Aktivität auf und ist in Wasser bei einem pH von 7,4 im wesentlichen unlöslich. Unglücklicherweise wird die inaktive Form leicht gebildet, wenn wässrige GLP-1 Lösungen gerührt werden, hydrophoben Oberflächen ausgesetzt werden oder große Luft/Wasser Grenzflächen aufweisen. Dies verkompliziert beträchtlich die Bildung von kommerziellen Mengen an aktiven GLP-1 Verbindungen, da Mischvorgänge oder eine kontinuierliche Bewegung durch eine Pumpe gewöhnliche Arbeitsgänge bei Großmengenherstellungsprozessen sind und diese Arbeitsgänge die Rührung, Luft/Wasser-Grenzflächen und/oder den Kontakt mit hydrophoben Oberflächen verursachen, die zur unlöslichen Form führen.
Die EP 0 619 322 A beschreibt Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Diabetes mellitus. Insbesondere betrifft sie Zusammensetzungen, die die Verabreichung des Glucagon-ähnlichen Peptids-1 (GLP-1) und Derivate hiervon verlängern. Diese Zusammensetzungen sind zur Behandlung von Insulin-unabhängigem Diabetes mellitus brauchbar.
J. Pharm. Sci. 1994, Seiten 1175–1180 beschreibt Studien der Sekundärstruktur des Insulinotropins im festen Zustand. Es wurde festgestellt, dass die Löslichkeit zurückgeht, wenn die α-Helix in eine antiparallele β-Faltblattstruktur umgewandelt wird.
J. Pharm. Sci. 1998, Seiten 183–189 beschreibt die Wirkung von Konformationsumwandlungen und der Razemisierung während der Prozessentwicklung von rekombinantem Glucagon-ähnlichem Peptid 1.
Die Realisierung des pharmazeutischen Potenzials von GLP-1 Verbindungen hängt von der Bildung der aktiven Form von GLP-1 Verbindungen in kommerziellen Mengen ohne Kontamination mit signifikanten Mengen an Nebenprodukten der inaktiven Form ab. Daher besteht ein entscheidender Bedarf für Verfahren zur Umwandlung von großen Bulkmengen der inaktiven unlöslichen Form von GLP-1 Verbindungen in die lösliche aktive Form.
Es wurde jetzt festgestellt, dass die inaktive, unlösliche Form der GLP-1 Verbindungen in die physiologisch wirksame, lösliche Form durch Auflösung der inaktiven Form in wässriger Base (oder in wässriger Säure) umgewandelt werden kann. Eine weitere hierin berichtete Feststellung ist, dass die lösliche, physiologisch aktive Form von GLP-1 Verbindungen in hoher Ausbeute und ohne Aminosäurerazemisierung oder anderen Abbau isoliert werden kann, vorausgesetzt, dass die wässrig basische Lösung (oder wässrig saure Lösung) auf einen geeigneten, weniger basischen (oder weniger sauren) pH neutralisiert werden kann. Beispielsweise wird unlösliches Val⁸-GLP-1 (7-37)OH in lösliches Val⁸-GLP-1 (7-37)OH in hoher Ausbeute und ohne detektierbare Razemisierung durch die Auflösung in wässrigem Natriumhydroxid bei pH 12,3, Neutralisierung auf pH 7,0 und Isolierung des löslichen Produkts durch Filtration und Lyophilisierung (Beispiele 4 und 6) umgewandelt. Basierend auf diesen Entwicklungen wird ein Verfahren zur Herstellung einer löslichen, physiologisch aktiven GLP-1 Verbindung aus der entsprechenden inaktiven, unlöslichen Form beschrieben.
Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer GLP-1 Verbindung, die in wässriger Lösung bei pH 7,4 löslich ist, aus einer GLP-1 Verbindung, die im wesentlichen in wässriger Lösung bei pH 7,4 unlöslich ist. Die unlösliche GLP-1 Verbindung wird in wässriger Base oder in wässriger Säure unter Bildung einer GLP-1 Lösung gelöst. Die GLP-1 Lösung wird dann auf einen pH neutralisiert, bei dem im wesentlichen keine Aminosäurerazemisierung der GLP-1 Verbindung auftritt. Die lösliche GLP-1 Verbindung wird dann aus der neutralisierten Lösung isoliert.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer GLP-1 Verbindung, die in wässriger Lösung bei pH 7,4 löslich ist, wobei die Verbindung als "lösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, aus der entsprechenden GLP-1 Verbindung bereitgestellt, die in wässriger Lösung bei pH 7,4 im wesentlichen unlöslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "unlösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, das gekennzeichnet ist durch die folgenden Schritte:

a) Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung in einer wässrigen Base mit einem pH zwischen 10,5 und 12,5 unter Bildung einer GLP-1 Lösung,
b) Neutralisation der GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 6,5 und 9,0, und
c) Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung aus der neutralisierten Lösung von Schritt b). Der pH der wässrigen Base liegt vorzugsweise zwischen 12,1 und 12,5.

Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer GLP-1 Verbindung, die in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 löslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "lösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, aus der entsprechenden GLP-1 Verbindung bereitgestellt, die im wesentlichen in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 unlöslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "unlösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, das gekennzeichnet ist durch folgende Schritte:

a) Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung in einer wässrigen Base mit einem pH zwischen 10 und 10,5 unter Bildung einer GLP-1 Lösung,
b) Neutralisation der GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 6,5 und 9,0, und
c) Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung aus der neutralisierten Lösung von Schritt b).

Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer GLP-1 Verbindung, die in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 löslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "lösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, aus der entsprechenden GLP-1 Verbindung bereitgestellt, die im wesentlichen in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 unlöslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "unlösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, das gekennzeichnet ist durch folgende Schritte:

a) Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung in einer wässrigen Säure mit einem pH zwischen 1,5 und 2,0 unter Bildung einer GLP-1 Lösung,
b) Neutralisation der GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 6,5 und 9,0, und
c) Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung aus der neutralisierten Lösung von Schritt b). Vorzugsweise wird die GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 7,0 und 8,5 neutralisiert.

Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Val⁸-GLP1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 15], das in wässriger Lösung bei physiologischem pH löslich ist, wobei das Val⁸-GLP-1(7-37)OH als "lösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH" bezeichnet wird, aus Val⁸-GLP-1(7-37)OH bereitgestellt, das in wässriger Lösung bei physiologischem pH unlöslich ist, wobei das Val⁸-GLP-1(7-37)OH als "unlösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH" bezeichnet wird, das gekennzeichnet ist durch folgende Schritte:

a) Auflösung des unlöslichen Val⁸-GLP-1(7-37)OH in einer wässrigen Base mit einem pH zwischen 12,1 und 12,5 unter Bildung einer Val⁸-GLP-1(7-37)OH Lösung,
b) Neutralisation der Val⁸-GLP-1(7-37)OH Lösung innerhalb von 30 Minuten nach der Auflösung von Val⁸-GLP-1(7-37)OH auf einen pH zwischen 7,0 und 8,5, und
c) Filtration der neutralisierten Lösung von Schritt b) durch eine Filtermembran mit einer Porosität zwischen 0,20 μm und 0,25 μm, und
d) Isolierung des löslichen Val⁸-GLP-1(7-37)OH aus der filtrierten Lösung von Schritt c).

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zur Umwandlung von Bulkmengen der inaktiven Form der GLP-1 Verbindungen in die aktive Form ohne signifikante Aminosäurerazemisierung oder sonstigen Abbau verwendet werden. Daher kann es in kommerziellen Prozessen zur Herstellung von aktiven GLP-1 Verbindungen in hoher Ausbeute und hoher Reinheit verwendet werden.
Die Figur ist eine Darstellung, die die Umwandlung der löslichen Form von drei unterschiedlichen Ansätzen von Val⁸-GLP (7-37)OH in die unlösliche Form in Lösung (pH 7,4, kein Salz, 20 mM Phosphat, 1 mg/ml Protein) mit Rühren (mit "s" gekennzeichnet) und ohne Rühren zeigt.
Eine GLP-1 Verbindung ist ein Peptid mit etwa 25 bis etwa 35 natürlich vorkommenden oder modifizierten Aminosäuren und weist eine ausreichende Homologie zu GLP-1 (7-37)OH auf, so dass sie eine insulinotrope Aktivität zeigt. Eine "modifizierte Aminosäure" ist die Aminosäure, die nach einer oder mehreren chemischen Modifikationen an einer natürlich vorkommenden Aminosäure erhalten wird. Beispiele für modifizierte Aminosäuren werden im folgenden in der Definition des "GLP-1 Derivats" bereitgestellt. "Insulinotrope Aktivität" bezieht sich auf die Stimulierung der Insulinsekretion in Reaktion auf die Nahrungsaufnahme, wobei die Glucoseaufnahme durch die Zellen stimuliert wird und die Serumglucosespiegel verringert werden. Es ist eine große Vielzahl an GLP-1 Verbindungen in der Technik bekannt, einschließlich GLP Analoga, GLP Derivate, biosynthetische GLPs und Dipeptidylpeptidase IV geschützte GLPs. Die Bedeutung der Ausdrücke "GLP Analogon", "GLP Derivat", "biosynthetisches GLP" und "Dipeptidylpeptidase IV geschütztes GLP" wird hierin später bereitgestellt.
Die Löslichkeit einer GLP-1 Verbindung kann in Abhängigkeit davon, wie sie isoliert wurde und die Art und die Zeitdauer, für die sie gelagert wurde, variieren. Beispielsweise ist die Löslichkeit der GLP-1 Verbindungen, die aus der Lösung durch Kristallisation oder Lyophilisierung isoliert wurde, im allgemeinen sehr hoch. Im Gegensatz dazu ist die Löslichkeit einer GLP-1 Verbindung, die aus einer Lösung ausfällt, die hohe Salzkonzentrationen enthält, die hydrophoben Oberflächen ausgesetzt wurde (beispielsweise durch Tangentialflussfiltration gereinigt wurde) oder große Luft/Wasser Grenzflächen aufweist, die beispielsweise durch starkes Rühren entstehen, oft sehr gering (Beispiel 2). Zusätzlich zeigen sehr lösliche Kristalle und lyophilisierte Pulver einer GLP-1 Verbindung typischerweise eine abnehmende Löslichkeit über die Zeit. Die Lagerung der Verbindung bei niedrigen Temperaturen (beispielsweise bei 0°C) kann die Umwandlung zu weniger löslichen Formen verlangsamen.
Das Maß, in dem die GLP-1 Verbindung in Wasser bei einem physiologischen pH löslich ist, kann mit der insulinotropen Aktivität der Verbindung korreliert werden. Genauer gesagt nimmt die biologische Aktivität einer GLP-1 Verbindung zu, wenn sie löslicher wird und nimmt ab, wenn sie weniger löslich wird. Die insulinotrope Aktivität kann durch in der Technik bekannte Verfahren untersucht werden, einschließlich der Verwendung von in vivo Experimenten, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist und in vitro Tests, die Pankreasinselzellen oder Insulinomzellen verwenden, wie dies jeweils in EP 0 619 322 A von Gelfand et al., und in US 5 120 712 A beschrieben ist.
Das Ausmaß, in dem eine GLP-1 Verbindung in Wasser bei einem physiologischen pH löslich ist, kann auch mit Absorptionen im Infrarotspektrum korreliert werden. Genauer gesagt ist das Infrarotspektrum der GLP-1 Verbindung durch Absorptionen bei 1624 cm^–1, 1657 cm^–1 und 1696 cm^–1 charakterisiert. Die Löslichkeit der GLP-1 Verbindung nimmt mit der Intensität der Absorption bei 1657 cm^–1 zu und nimmt mit der Intensität der Absorption bei 1624 cm^–1 und 1696 cm^–1 ab. Daher verändert sich die Intensität dieser 3 Absorptionen dementsprechend, wenn eine GLP-1 Verbindung sich in eine löslichere oder weniger löslichere Form umwandelt (siehe Beispiel 3).
Eine GLP-1 Verbindung mit einer Löslichkeit in Wasser bei physiologischem pH (7,4) von mindestens etwa 1,0 Milligramm pro Milliliter Wasser bei pH 7,4 wird die "aktive Form" oder "lösliche Form" der Verbindung genannt. Eine GLP-1 Verbindung wird in ihrer aktiven oder löslichen Form hierin als "lösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet. Vorzugsweise weist eine lösliche GLP-1 Verbindung eine Löslichkeit in Wasser bei einem physiologischen pH von mindestens etwa 5,0 Milligramm pro Milliliter auf. Das Verhältnis A₁₆₅₇/(A₁₆₂₄ + A₁₆₅₇ + A₁₆₉₆) beträgt im allgemeinen mindestens etwa 0,60 für GLP-1 Verbindungen in der löslichen Form und vorzugsweise zumindest etwa 0,70. A_n ist die Absorptionsintensität bei einer Wellenlänge n in reziproken Zentimetern.
Eine GLP-1 Verbindung mit einer Löslichkeit in Wasser bei einem physiologischen pH von weniger als 0,5 Milligramm pro Milliliter Wasser wird als "inaktive Form" oder "unlösliche Form" der Verbindung bezeichnet. Eine GLP-1 Verbindung in ihrer inaktiven oder unlöslichen Form wird hierin als "unlösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet. Vorzugsweise weist eine unlösliche GLP-1 Verbindung eine Löslichkeit in Wasser bei einem physiologischen pH von weniger als etwa 0,1 Milligramm pro Milliliter auf. Das Verhältnis (A₁₆₂₄ + A₁₆₉₆)/(A₁₆₂₄ + A₁₆₅₇ + A₁₆₉₆) beträgt im allgemeinen zumindest etwa 0,60 für GLP-1 Verbindungen in der löslichen Form und vorzugsweise mindestens etwa 0,70. A_n ist die Absorptionsintensität bei der Wellenlänge n in reziproken Zentimetern.
Es wurde berichtet, dass die unlösliche Form der GLP-1 Verbindungen durch die Bildung von intramolekularen und intermolekularen β-Faltblättern gekennzeichnet ist, die zu einer Aggregation und Unlöslichkeit der Verbindung führen, während die sekundäre Struktur der löslichen Form durch das Vorkommen von α-Helices gekennzeichnet ist (siehe Senderoff et al., J. Pharm. Sci. 87: 183 (1998)). Das Infrarotspektrum der löslichen und unlöslichen Formen der GLP-1 Verbindungen stimmt mit dieser Interpretation überein. Genauer gesagt deuten die Absorptionsbanden bei 1624 und 1696 cm^–1 im allgemeinen das Vorkommen von β-Faltblättern an, während die Absorptionsbande bei 1657 cm^–1 mit dem Vorkommen von α-Helices übereinstimmt.
Die Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindungen in wässriger Base (oder wässriger Säure) geht mit der Abnahme der intramolekularen und intermolekularen Wechselwirkungen einher, die für die β-Faltblattbildung verantwortlich sind. Darüberhinaus stimmt die Isolierung der löslichen Form der GLP-1 Verbindungen aus diesen Lösungen mit der Neubildung der Sekundärstruktur der löslichen GLP-1 Verbindungen überein. Daher kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit Proteinen (beispielsweise GLP-1 Verbindungen) mit einer löslichen aktiven Form, die durch einen hohen α-Helixanteil gekennzeichnet ist, und einer inaktiven oder unlöslichen Form, die durch einen hohen Gehalt an β-Faltblättern gekennzeichnet ist, verwendet werden, um sie von der unlöslichen Form in die lösliche Form umzuwandeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Umwandlung von unlöslichen GLP-1 Verbindungen in lösliche GLP-1 Verbindungen in Zusammensetzungen verwendet werden, worin die unlösliche GLP-1 Verbindung die einzige Komponente ist oder alternativ dazu, worin die unlösliche GLP-1 Verbindung eine von mehreren Komponenten ist. Daher kann das Verfahren Gemische "reinigen", die sowohl die lösliche als auch die unlösliche Form einer GLP-1 Verbindung enthalten, indem die unlösliche Form in die lösliche Form umgewandelt wird. Das Verfahren ist daher Idealerweise zur Entfernung von kleinen Mengen oder sogar Spurenmengen der unlöslichen Form aus der Zusammensetzung oder zur Minimierung der Menge der unlöslichen Form in der Zusammensetzung geeignet, bevor beispielsweise eine Verabreichung als Arzneimittel oder eine Formulierung in einer Arzneimitteldosierungsform erfolgt.
In der Technik wurde der Aminoterminus von GLP-1 (7-37)OH mit dem Rest der Nummer 7 bezeichnet und der Carboxyterminus mit der Nummer 37. Diese Nomenklatur geht auf andere GLP Verbindungen über. Wenn nichts spezifisches erwähnt wird, wird der C-Terminus gewöhnlich so betrachtet, dass er in der herkömmlichen Carboxylform vorliegt. Die Aminosäuresequenz von GLP-1 (7-37)OH wird im folgenden bereitgestellt:
⁷His-Ala-Glu-¹⁰Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-¹⁵Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-²⁰Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-²⁵Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-³⁰Ala-Trp-Leu-Val-Lys-³⁵Gly-Arg-³⁷Gly-COOH (SEQ ID Nr. 1)
Eine "GLP-1 Verbindung" hat eine ausreichende Homologie zu GLP-1 (7-37)OH oder einem Fragment von GLP-1 (7-37)OH, so dass die Verbindung eine insulinotrope Aktivität aufweist. Vorzugsweise hat eine GLP-1 Verbindung die Aminosäuresequenz von GLP-1 (7-37)OH oder eines Fragments hiervon, die so modifiziert ist, das keine, eine, zwei, drei, vier oder fünf Aminosäuren sich von der Aminosäure in der entsprechenden Position von GLP-1 (7-37)OH oder dem Fragment von GLP-1 (7-37)OH unterscheiden. Bevorzugte GLP Verbindungen sind an der Position 8, an der Position 22 oder an der Position 8 und Position 22 modifiziert.
Vorzugsweise sind die Aminosäuren in der GLP Verbindung, die sich von der Aminosäure an der entsprechenden Position von GLP-1 (7-37)OH unterscheiden, konservative Substitutionen und bevorzugter hoch konservative Substitutionen.
Eine "konservative Substitution" ist der Austausch einer Aminosäure gegen eine andere Aminosäure, die dieselbe Nettoelektronenladung und etwa die gleiche Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten haben etwa dieselbe Größe, wenn sich die Gesamtzahl an Kohlenstoffen und Heteroatomen in ihren Seitenketten um nicht mehr als etwa vier unterscheidet. Sie haben etwa dieselbe Form, wenn die Anzahl an Verzweigungen in ihren Seitenketten sich um nicht mehr als eine unterscheidet. Aminosäuren mit Phenyl- oder substituierten Phenylgruppen in ihren Seitenketten haben etwa dieselbe Größe und Form. Unten werden fünf Gruppen an Aminosäuren aufgeführt. Der Austausch einer Aminosäure in einer GLP-1 Verbindung gegen eine andere Aminosäure aus derselben Gruppe führt zu einer konservativen Substitution:
Gruppe I: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein, Methionin und nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren mit aliphatischen C₁-C₄ Seitenketten oder mit Hydroxyl-substituierten aliphatischen C₁-C₄ Seitenketten (geradkettig oder monoverzweigt).
Gruppe II: Glutaminsäure, Asparaginsäure und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit Carbonsäure-substituierten aliphatischen C₁-C₄ Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe III: Lysin, Ornithin, Arginin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit Amin- oder Guanidino-substituierten aliphatischen C₁-C₄ Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe IV: Glutamin, Asparagin und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren mit Amid-substituierten aliphatischen C₁-C₄ Seitenketten (unverzweigt oder ein Verzweigungspunkt).
Gruppe V: Phenylalanin, Phenylglycin, Tyrosin und Tryptophan.
Eine "hoch konservative Substitution" ist der Austausch einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die dieselbe funktionelle Gruppe in der Seitenkette und nahezu dieselbe Größe und Form aufweist. Aminosäuren mit aliphatischen oder substituierten aliphatischen Aminosäureseitenketten haben nahezu dieselbe Größe, wenn die Gesamtzahl an Kohlenstoff- und Heteroatomen in ihren Seitenketten sich um nicht mehr als 2 unterscheidet. Sie haben nahezu dieselbe Größe, wenn sie dieselbe Anzahl an Verzweigungen in ihren Seitenketten aufweisen. Beispiele für hochkonservative Substitutionen umfassen Valin für Leucin, Threonin für Serin, Asparaginsäure für Glutaminsäure und Phenylglycin für Phenylalanin. Beispiele für Substitutionen, die nicht hochkonservativ sind, umfassen Alanin für Valin, Alanin für Serin und Asparaginsäure für Serin.
"GLP-1 Analogon" ist als eine GLP-1 Verbindung mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Inversionen oder Anfügungen relativ zu GLP-1 (7-37)OH definiert. Zugelassene Aminosäuresubstitutionen umfassen den Austausch einer L-Aminosäure durch ihre entsprechende D-Form. In der hierin zur Bezeichnung der GLP-1 Analoga verwendeten Nomenklatur wird die substituierende Aminosäure und deren Position vor der Ausgangsstruktur angegeben. Beispielsweise bezeichnet Val⁸- GLP-1 (7-37)OH ein GLP-1 Analogon, worin das Alanin, das sich normalerweise an der Position 8 von GLP-1 (7-37)OH befindet, durch Valin ersetzt wurde.
Es sind mehrere GLP-1 Analoga in der Technik bekannt und umfassen unter anderem GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36)NH₂, Gln⁹-GLP-1(7-37), d-Gln⁹-GLP-1(7-37), Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1(7-37), Lys¹⁸-GLP-1(7-37), Gly⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Gly⁸-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Val⁸-GLP-1(7-37)OH, Met⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Met⁸-GLP-1(7-37)OH, Ile⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Ile⁸-GLP-1(7-37)OH, Thr⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Thr⁸-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Ser⁸-GLP-1(7-37)OH, Asp⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Asp⁸-GLP-1(7-37)OH, Cys⁸-GLP-1(7-36)NH₂, Cys⁸-GLP-1(7-37)OH, Thr⁹-GLP-1(7-37), D-Thr⁹-GLP-1(7-37), Asn⁹-GLP-1(7-37), D-Asn⁹-GLP-1(7-37), Ser²²-Arg²³-Arg²⁴-Gln²⁶-GLP-1(7-37), Arg²³-GLP-1(7-37), Arg²⁴-GLP-1(7-37) und Gly⁸-Gln²¹-GLP-1(7-37)OH und dergleichen.
Ein "GLP-1 Derivat" ist als Molekül mit der Aminosäuresequenz von GLP-1 (7-37) oder eines GLP-1 Analogons definiert, das aber zusätzlich chemische Modifikationen an einer oder mehrerer der Aminosäureseitenkettengruppen, α-Kohlenstoffatome, der terminalen Aminogruppe oder der terminalen Carboxylgruppe aufweist. Eine chemische Modifikation umfasst unter anderem die Anfügung von chemischen Resten, Erzeugung neuer Bindungen und die Entfernung chemischer Reste. Die Modifikationen an den Aminosäureseitengruppen umfassen ohne Beschränkung Acylierung der Lysin-ε-aminogruppen, N-Alkylierung von Arginin, Histidin oder Lysin, Alkylierung der Glutamin- oder Asparagincarbonsäuregruppen und die Desaminierung von Glutamin oder Asparagin. Die Modifikationen der terminalen Aminogruppe umfassen unter anderem Desamino-, N-Niederalkyl-, N-Diniederalkyl- und N-Acylmodifikationen (beispielsweise -CO-Niederalkyl). Die Modifikationen der terminalen Carboxygruppe umfassen unter anderem ohne Beschränkung die Amid-, Niederalkylamid-, Dialkylamid- und Niederalkylestermodifikationen. Niederalkyl umfasst gerades oder verzweigtkettiges C₁-C₄ Alkyl. Darüberhinaus können eine oder mehrere Seitengruppen oder terminale Gruppen durch dem chemischen Fachmann bekannte Schutzgruppen geschützt werden. Das α-Kohlenstoffatom einer Aminosäure kann mono- oder dimethyliert werden.
Andere GLP-1 Verbindungen sind in US 5 705 483 A beschrieben und haben die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz.
R¹-X-Glu-¹⁰Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-¹⁵Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-²⁰Leu-Y-Gly-Gln-Ala-²⁵Ala-Lys-Z-Phe-Ile-³⁰Ala-Trp-Leu-Val-Lys-³⁵Gly-Arg-R² (SEQ ID Nr. 2)
R₁ steht in SEQ ID Nr. 2 für: L-Histidin, D-Histidin, Desaminohistidin, 2-Aminohistidin, β-Hydroxyhistidin, Homohistidin, α-Fluormethylhistidin oder α-Methylhistidin.
X steht für Ala, Gly, Val, Thr, Met, Ile, Ser oder α-Methyl-Ala.
Y steht für Glu, Gln, Ala, Thr, Ser oder Gly.
Z steht für Glu, Gln, Ala, Thr, Ser oder Gly.
R₂ steht für NH₂ oder Gly-OH.
Noch andere GLP-1 Verbindungen sind in WO 91/11457 A beschrieben.
Diese GLP-1 Verbindungen umfassen GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36) oder GLP-1 (7-37) oder die Amidform hiervon und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon, die zumindest eine der folgenden Modifikationen aufweisen:

a) Substitution des Lysins an der Position 26 und/oder Position 34 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Arginin oder D-Lysin oder Substitution des Arginins an der Position 36 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Lysin oder D-Arginin,
b) Substitution des Tryptophans an der Position 31 durch eine oxidationsresistente Aminosäure,
c) Substitution von zumindest einem der Folgenden: Tyrosin anstelle des Valins an der Position 16, Lysin anstelle des Serins an der Position 18, Asparaginsäure anstelle von Glutaminsäure an der Position 21, Serin anstelle von Glycin an der Position 22, Arginin anstelle von Glutamin an der Position 23, Arginin anstelle von Alanin an der Position 24 und Glutamin anstelle von Lysin an der Position 26,
d) Substitution von zumindest einem aus: Glycin, Serin oder Cystein für Alanin an der Position 8, Asparaginsäure, Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin anstelle von Glutaminsäure an der Position 9, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin anstelle von Glycin an der Position 10 und Glutaminsäure anstelle von Asparaginsäure an der Position 15, oder
e) Substitution von Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin oder der D- oder N-acylierten oder N-alkylierten Form von Histidin anstelle von Histidin an der Position 7, worin bei den Substitutionen in a), b), d) und e) die substituierten Aminosäuren wahlweise in der D-Form vorliegen können und die an der Position 7 substituierten Aminosäuren wahlweise in N-acylierter oder N-alkylierter Form vorliegen können.

Es sind noch weitere GLP-1 Verbindungen in US 5 188 666 A beschrieben. Beispiele umfassen ein Peptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3:
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (SEQ ID Nr. 3)
und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
X steht in SEQ ID Nr. 3 für Lys-COOH und Lys-Gly-COOH.
Ebenfalls umfasst werden ein pharmazeutisch annehmbarer Niederalkylester dieses Peptids und ein pharmazeutisch annehmbares Amid dieses Peptids, beispielsweise Niederalkylamid und Niederdialkylamid. Im allgemeinen sind Niederalkylgruppen eine geradkettige oder verzweigte aliphatische C₁-C₂₀ Gruppe, mit keiner, einer oder mehreren Einheiten mit ungesättigten Bindungen.
Weitere GLP-1 Verbindungen sind in US 5 512 549 A beschrieben. Diese GLP-1 Verbindungen haben die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4:
R¹ steht für 4-Imidazopropionyl, 4-Imidazoacetyl oder 4-Imidazo-α,α-Dimethylacetyl.
R² steht für unverzweigtes C₆-C₁₀ Acyl oder fehlt.
R³ steht für Gly-OH oder NH₂.
Xaa steht für Lys oder Arg.
Weitere GLP-1 Verbindungen sind in WO 98/08871 A beschrieben. Diese GLP-1 Verbindungen umfassen einen lipophilen Substituenten, der an den N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurerest gebunden ist, worin der Substituent eine Alkylgruppe oder eine Gruppe ist, die eine omega-Carbonsäure aufweist.
"Biosynthetische GLP-1" sind als GLP-1 Analogon oder native Sequenz definiert, die nur natürlich auftretende Aminosäurereste enthalten und so zur Expression in lebenden Zellen fähig sind, einschließlich rekombinenten Zellen und Organismen.
"DPP-IV geschützte GLP's" bezieht sich auf GLP-1 Verbindungen, die gegenüber der Wirkung von DPP-IV resistent sind. Diese umfassen Analoga mit einem modifizierten D-Aminosäurerest an der Position 8. Diese umfassen auch biosynthetische GLP-1 mit Gly oder den L-Aminosäureresten Val, Thr, Met, Ser, Cys, Ile oder Asp an der Position 8. Andere DPP-IV geschützte GLP-1 Verbindungen umfassen Des-His⁷ und andere His⁷ Derivate.
Im verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine unlösliche GLP-1 Verbindung zu einer Lösung gegeben, die ausreichend basisch (oder sauer) ist, um die Verbindung aufzulösen. Die Lösung wird dann gemischt oder auf sonstige Arten gerührt, bis sich die Verbindung löst. GLP-1 Verbindungen lösen sich im allgemeinen schneller, wenn die Basizität oder Azidität der Lösung steigt. Jedoch steigt die Geschwindigkeit der Razemisierung and des sonstigen Abbaus auch, wenn die Lösung basischer (oder saurer) wird und je länger eine GLP-1 Verbindung in einer stark basischen oder sauren Lösung gelöst ist. Daher ist es bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung erwünscht, Lösungen zu verwenden, die ausreichend basisch (oder sauer) sind, um die Verbindung leicht zu lösen, aber nicht so basisch (oder sauer), dass sie zu einer Aminosäurerazemisierung oder zur Bildung von anderen Nebenprodukten führen. Der Fachmann ist in der Lage, routinemäßig geeignete pH Werte zu identifizieren, die diese zwei Ziele erreichen. Basische Lösungen mit einem pH zwischen etwa 10,5 und etwa 12,5 und saure Lösungen mit einem pH zwischen etwa 1,5 und etwa 2,0 werden typischerweise zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet. Jedoch können auch weniger basische Lösungen unter der Voraussetzung verwendet werden, dass eine ausreichende Zeitspanne zur Auflösung zugelassen wird. Lösungen mit einem pH zwischen etwa 10,0 und 10,5 werden mit Auflösezeiten von mindestens 30 Minuten verwendet. Bevorzugt sind pH Werte zwischen etwa 12,1 und etwa 12,5. In einem Aspekt ist es erwünscht, die Menge an wässriger Base oder wässriger Säure zu minimieren, die zum Lösen der GLP-1 Verbindung verwendet wird. Eine Minimummenge der wässrigen Base oder wässrigen Säure ist bevorzugt, wenn die schließliche GLP-1 Verbindung durch Lyophilisierung isoliert wird.
Nach dem Auflösen der GLP-1 Verbindung wird die hierin als "GLP-1 Lösung" bezeichnete Lösung auf einen pH neutralisiert, bei dem im wesentlichen keine Aminosäurerazemisieung auftritt, beispielsweise weniger als 1% der GLP-1 Verbindung pro Stunde razemisiert und vorzugsweise weniger als 0,1%. Die Aminosäurerazemisierung in GLP-1 Verbindungen kann durch in der Technik bekannte Verfahren detektiert und quantifiziert werden, wie HPLC Chromatographie (siehe beispielsweise Senderoff et al., J. Pharm. Sci. 87: 183 (1998)) und dem in Beispiel 6 beschriebenen Test. Daher können geeignete pH Werte für die neutralisierte Lösung vom Fachmann leicht bestimmt werden. Für die meisten Anwendungen können die pH Werte für die neutralisierte Lösung von etwa 6,5 bis etwa 9,0 reichen. Bevorzugte pH Werte liegen zwischen etwa 7,0 und etwa 8,5.
Um die Aminosäurerazemisierung zu minimieren ist es erwünscht, die basische oder saure GLP-1 Lösung so früh wie möglich nach der Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung zu neutralisieren. Vorzugsweise wird die GLP-1 Lösung innerhalb einer ausreichend kurzen Zeit neutralisiert, so dass im wesentlichen keine Razemisierung oder kein Abbau der Aminosäuren in der GLP-1 Verbindung auftritt, beispielsweise weniger als 1% der GLP-1 Verbindungen razemisierte Aminosäuren enthält und vorzugsweise weniger als 0,1%. Wie oben erwähnt steigt die Geschwindigkeit der Aminosäurerazemisierung und des sonstigen Abbaus mit der Zunahme der Basizität oder Azidität der Lösung. Daher variiert die Zeitdauer, die zwischen der Auflösung und der Neutralisierung ohne die wesentliche Bildung von Abbau- oder Razemisierungsnebenprodukten vergehen kann, gemäß dem pH der GLP-1 Lösung. Wenn der pH der GLP-1 Lösung zwischen etwa 10,5 und etwa 12,5 oder zwischen etwa 1,5 und etwa 2,0 liegt, tritt im wesentlichen keine Aminosäurerazemisierung oder kein Abbau auf, wenn die GLP-1 Lösung innerhalb von etwa 30 Minuten nach der Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung neutralisiert wird. Vorzugsweise wird die GLP-1 Lösung innerhalb von etwa 5 Minuten nach der Auflösung neutralisiert. Wahlweise kann die GLP-1 Lösung vor der vollständigen Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung unter der Voraussetzung neutralisiert werden, dass das nicht aufgelöste Material aus der Lösung vor der Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung entfernt wird. Ungelöstes Material kann durch jedes geeignete Mittel, einschließlich Filtration entfernt werden.
Es kann jede geeignete Säure oder Base zur Einstellung des pH einer Lösung im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Vorzugsweise ist die Säure oder Base zur Verwendung bei der Herstellung eines pharmazeutischen Produkts geeignet. Beispiele für geeignete Säuren umfassen Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Oxalsäure und dergleichen. Chlorwasserstoffsäure ist bevorzugt. Beispiele für geeignete Basen umfassen Hydroxidbasen und Carbonatbasen. Natriumhydroxid ist bevorzugt.
Es bleibt eine kleine Menge an festem Material, das hierin als "gelatineartiges Material" bezeichnet wird, typischerweise in der GLP-1 Lösung ungelöst. Es ist bevorzugt, dieses Material aus der GLP-1 Lösung oder der neutralisierten GLP-1 Lösung vor der Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung zu entfernen. In einem Beispiel wird der pH der GLP-1 Lösung auf etwa 8,0 eingestellt, bevor das gelatineartige Material entfernt wird. Die Entfernung des gelatineartigen Materials kann auf jede Art ausgeführt werden, einschließlich durch Filtration.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte isolierte lösliche GLP-1 Verbindung kann als Wirkstoff in einem pharmazeutischen Produkt zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, wie Typ II Diabetes oder Fettsucht. Daher ist es erwünscht, mikrobielles Material aus der GLP-1 Lösung und/oder der neutralisierten Lösung zu entfernen. Mikrobielles Material wird typischerweise mit einer geeigneten Filtermembran entfernt, vorzugsweise mit einer Filtermembran mit einer Porosität, die kleiner oder gleich 0,22 μm ist. Die Filtrationsschritte zur Entfernung von gelatineartigem Material und mirkobiellem Material können kombiniert werden oder alternativ dazu als getrennte Schritte ausgeführt werden. Zusätzlich ist es erwünscht, das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer sterilen Umgebung auszuführen, was mit der Good Manufacturing Practice übereinstimmt, wenn die schließliche GLP-1 Verbindung als Pharmazeutikum verwendet wird.
Eine lösliche GLP-1 Verbindung kann aus der neutralisierten Lösung durch jedes andere geeignete Verfahren isoliert werden, einschließlich Lyophilisierung, Sprühtrocknung oder Kristallisation. Beispiele für geeignete Kristallisationsverfahren sind in EP 0 619 322 A von Gelfand et al., und WO 99/30731 A von Hoffman et al. beschrieben.
Mit der hierin angegebenen Sequenzinformation und dem Stand der Technik in der Festphasenproteinsynthese können GLP Verbindungen durch chemische Synthese erhalten werden. Jedoch ist es auch möglich, einige GLP Verbindungen durch enzymatische Fragmentierung von Proglucagon mittels Techniken zu erhalten, die dem Fachmann bekannt sind. Darüberhinaus können gut bekannte rekombinante DNA Techniken verwendet werden, um erfindungsgemäße GLP Verbindungen zu exprimieren, und diese sind bevorzugt.
Die Prinzipien der chemischen Festphasensynthese von Polypeptiden sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Texten im Fachgebiet gefunden werden, wie H. Dugas und C. Penney, Bioorganic Chemistry (1981), Springer-Verlag, New York, Seiten 54–92, J. M. Merrifield, Chem. Soc., 85: 2149 (1962) und Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Seiten 24–66, Freeman (San Francisco, 1969).
Spezifische Beschreibungen für die Herstellung von GLP-1 Verbindung werden in US 5 705 483 A , US 5 188 666 A , US 5 512 549 A , WO 91/11457 A und WO 98/08871 A bereitgestellt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht beschränken sollen.
Beispiel 1 – Herstellung von Val⁸-GLP(7-37)OH
Val⁸-GLP-1(7-37)OH mit der Aminosäuresequenz H₂N-His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-COOH (SEQ ID Nr. 5) wird unter Verwendung der Festphasenpeptidsyntheseverfahren hergestellt und das Endprodukt wird durch präparative Umkehrphasenchromatographie auf einem C8 Slicium-basierten Harz mittels 0,1 % TFA und einem Acetonitrilelutionsgradienten gereinigt. Der entstehende Hauptstrom wird durch Lyophilisierung getrocknet. Val⁸-GLP(7-37) kann auch rekombinant gemäß den in US 5 705 483 A beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 2 – Umwandlung von löslichem GLP-1 und GLP-1 Analoga in die unlösliche Form
A. Umwandlung von löslichem Val⁸-GLP(7-37)OH in die unlösliche Form in wässriger Lösung
Val⁸-GLP-1(7-37)OH (1 Gramm) lyophilisiertes Pulver wird in 25 mM Ammoniumbicarbonat mit pH 8,0 (100 ml) gelöst. Die Lösung wird mit einem Teflonrührstab bei etwa 200 Umdrehungen pro Minute bei 21°C (Umgebungstemperatur) für 16 Stunden gerührt. Nach unterschiedlichen Zeiten, gewöhnlich innerhalb von 30 Minuten, wird die Lösung trüb. Bei fortgesetztem Rühren wird die Trübung sichtbar dichter. Die Kinetik der Trübung wird als Geschwindigkeit der Trübungsbildung gemessen, das heißt die Absorption bei 340 nm. Das ausgefallene Protein wird entweder durch Filtration geerntet, beispielsweise Whatman 1 Filterscheiben oder Zentrifugation. Der Überstand wird auf den Proteingehalt entweder durch den colorimetrischen Biurettest, der von Pierce (Rockford, IL) erhalten wird oder durch UV Absorption bei 280 nm getestet. Bei beiden Methoden besteht der Proteinniederschlag aus mehr als 90% des Ausgangsmaterials, das heißt weniger als 10% des Proteins verbleiben in der Überstandfraktion. Der gewonnene Niederschlag wird im Vakuum getrocknet, das heißt in einem Gefriertrockner. Das entstehende ausgefällte Material (0,96 g) ist in 20 mM Phosphat bei pH 7,2 zu weniger als 0,01 mg/ml löslich. Die Löslichkeit wird durch Suspension des Feststoffs im Puffer, erforderlichenfalls der Einstellung des pH und der Filtration durch ein 0,2 μm Filter getestet. Der Proteingehalt des Filtrats wird entweder durch den colorimetrischen Biurettest, die UV Absorption bei 280 nm oder durch Hochdruckflüssigkeitchromatographieanalyse (HPLC) getestet. Die HPLC Analyse wird mittels einer C-18 Silicasäule mit 5 μm und 300 Angström (Jupiter C-18 Säule, die von Phenomenex, Torrance, Calif. erhalten wird) und einem Elutionsgradienten mit Puffer A (10% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäurelösung) und Puffer B (90% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäurelösung), 25 bis 60% Puffer B über 30 Minuten ausgeführt. Die Säule wird bei 60°C mit einer Flussrate von 1,0 ml/min gefahren, die Detektion erfolgt bei einer Wellenlänge von 214 nm und das Injektionsvolumen beträgt 20 μl.
Die GLP Verbindungen (GLP-1(7-37)OH, Val⁸-GLP(7-37)OH und Isopropylimidazol⁷-Arginin²⁶-GLP-1(8-37)OH, die auf diese Weise hergestellt werden, haben eine Löslichkeit von weniger als 0,1 mg/ml und gewöhnlich weniger als 0,05 mg/ml. Salz, speziell Natriumchlorid, beschleunigt stark die Geschwindigkeit zur Bildung des unlöslichen Materials wenn es mit mehr als 25 mM vorkommt.
B. Effekt des Rührens auf die Umwandlung von löslichem Val⁸-GLP(7-37)OH in die unlösliche Form über die Zeit
Drei unterschiedliche Ansätze von Val⁸-GLP-1(7-37)OH (QIY 17, QIY 18 und 361EM7) werden mit 1 mg/ml in 20 mM Phosphat mit pH 7,4 gelöst und der schließliche pH wird mit 1 N Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt. 2 bis 10 Milliliter umfassende Proben jeder Lösung werden in zwei unterschiedliche Sätze an Gläschen überführt. Ein Satz der Proben wird gerührt, während der andere ohne Rühren stehen kann. Es wird die Trübung zu verschiedenen Zeiten durch die Bestimmung der Absorption bei 340 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in der Figur gezeigt. Die Zeitverläufe der gerührten Lösungen sind mit einem "s" versehen.
Wie es aus der Figur ersichtlich ist, nimmt die Trübung der gerührten Lösungen viel schneller zu als in Lösungen, die stehengelassen werden. Da die Trübung eine Proteinfällung anzeigt, stimmt das Ergebnis mit der Geschwindigkeit der Bildung der unlöslichen Form überein, die aufgrund der erhöhten Exposition gegenüber Sauerstoff durch das Rühren beschleunigt wird.
C. Umwandlung von löslichem Val⁸-GLP-1(7-37)OH in die unlösliche Form durch Tangentialfluss
Val⁸-GLP(7-37)OH wird durch Tangentialfluss einer Filtration unterzogen. Während der Filtration wird die Retentatlösung dicker und viskoser und Val⁸-GLP(7-37)OH bildet ein gelatineartiges Material auf den Filtermembranen. Die Bildung des gelatineartigen Materials tritt innerhalb von 30 Minuten nach Beginn der Filtration auf, wobei die Bildungsgeschwindigkeit in Gegenwart von Salz erhöht wird. Das "unlöslich gemachte" Protein wird durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen und in einem Vakuumofen oder einem Lyophilisiergerät getrocknet. Die Fällung in Gegenwart oder Abwesenheit eines Salzes bildet ein Produkt, das in einem neutralen Puffer zu weniger als 0,1 mg/ml löslich ist.
D. Umwandlung von löslichem Val⁸-GLP-1(7-37)OH in die unlösliche Form in Essigsäure/Acetonitril
Val⁸-GLP-1(7-37)OH wird zwischen 2°C und 6°C in einer Matrix aus 35 mM Essigsäure mit 25% Acetonitril und einem scheinbaren pH von 3,3 inkubiert. Ohne Rühren entwickeln die Präparationen bei einer Inkubation von über 1 Monat gelatineartige Einschlüsse. Das Rühren erhöht die Geschwindigkeit der Gelbildung. Das Gel wird durch Zentrifugation gewonnen und im Vakuum getrocknet und zeigt eine Löslichkeit von weniger als 0,1 mg/ml bei neutralem pH.
Beispiel 3 – Sekundärstruktur von löslichem und unlöslichem Val⁸-GLP-1(7-37)OH
Es werden vier verschiedene Ansätze an gereinigtem lyophilsiertem Val⁸-GLP-1(7-37)OH auf Sekundärstruktureigenschaften durch Fouriertransformationsinfrarotspektroskopie (FTIR) analysiert, den Gehalt an α-Helix und β-Faltblatt der Präparationen zu untersuchen. Die Entwindung wird in der Amid I Region (1750–1600 cm^–1) mittels BioRad Win-IR pro Software Version 2.5 ausgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt:
Tabelle 1
Die Daten in der Tabelle zeigen, dass das lyophilisierte Pulver einen hohen α-Helixgehalt (über 60%) und einen relativ geringen β-Faltblattgehalt (30% oder weniger) aufweist.
Beispiel 4 – Umwandlung von unlöslichem Val⁸-GLP-1(7-37)OH in lösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH durch einen Basenschwenk
Fünf Proben an Val⁸-GLP-1(7-37)OH werden wie im folgenden beschrieben hergestellt:
Probe 1
Lyophilisiertes Pulver an Val⁸-GLP-1(7-37)OH wird in 10 mM Essigsäure (pH 3) bei 1 mg/ml gelöst und einer isoelektrischen Fällung durch eine Einstellung des pH mit 1 N Natriumhydroxid auf 5,5 unterzogen. Der entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen und im Vakuum getrocknet.
Probe 2
Es wird eine isoeletrische Fällung durch die Annäherung von pH 5,5 von der alkalischen Seite durch Lösen von Val⁸-GLP-1(7-37)OH in 10 mM Ammoniumbicarbonat mit pH 8,0 ausgeführt und dann wird der pH mit 1 N Chlorwasserstoffsäure abgesenkt.
Probe 3
Eine gelierte Probe wird durch Zentrifugation aus einer Lösung an Val⁸-GLP-1(7-37)OH (2,7 mg/ml in 25 mM Essigsäure, pH 3,3, worin 25% Acetonitril enthalten sind) gewonnen, die bei 4°C für 3,1 Monate inkubiert wurde.
Proben 4 und 5
Val⁸-GLP-1(7-37)OH wird mit 1 mg/ml in 10 mM Phosphat (pH 7,2) gelöst und gerührt, bis sich ein Niederschlag bildet. Die Lösung wird durch Zentrifugation unter Bildung einer löslichen GLP-1 Fraktion (Probe 4) und einer gefällten Fraktion (Probe 5) fraktioniert. Beide Fraktionen werden im Vakuum getrocknet.
Jede der Proben 1–5 wird auf Sekundärstruktureigenschaften durch Fouriertransformationsinfrarotspektroskopie (FTIR) gemessen. Zusätzlich wird jede Probe 1–5 in 20 mM Phosphatlösung (pH 7,2) gegeben und der pH wird durch die Zugabe von 1 N Natriumhydroxid für nicht mehr als 3 Minuten erhöht. Alle Proben werden dann gelöst und die Lösungen werden klar. Der pH jeder Lösung wird dann durch die Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 eingestellt. Die Proben 1A–5A, die jeweils aus den Proben 1–5 erhalten werden, werden dann durch Lyophilisierung der Lösungen erhalten und im Vakuum getrocknet. Die Sekundärstrukturcharakteristiken der Proben 1A–5A werden durch FTIR untersucht. Die Ergebnisse der FTIR Analyse der Proben 1–5 und 1A–5A sind im folgenden in Tabelle 2 gezeigt:
Tabelle 2
Alle Proben werden durch Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist, und es zeigt sich, dass sie einen einzelnen Peak enthalten, der mit der Referenz des Standards Val⁸-GLP-1(7-37)OH co-eluiert. Dies legt nahe, dass keine Probe eine durch HPLC erkennbare chemische Veränderung durchmacht. In jedem Fall erhöht der Schwenk ins Basische den gemessenen α-Helixgehalt des Proteins und führt zu einem Produkt, das mit > 1 mg/ml in 20 mM Phosphatpuffer mit pH 7,2 löslich ist.
In einem weiteren Beispiel für die Wirkungen des Schwenks ins Basische auf die Sekundärstruktur wird eine gereinigte, lyophilisierte Probe an Val⁸-GLP-1(7-37)OH, die durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt wurde, entweder lyophilisiert (0,1 g) oder durch die Zugabe von ausreichend 3,0 M Natriumdihydrogenphoshat (pH 3,80) gefällt, was zu einer 0,6 M Phosphatlösung führt. Der entstehende Niederschlag wird mit 10 mM Natriumacetat bei pH 5,5 gewaschen und der gewaschene Niederschlag wird im Vakuum getrocknet. Ein zweiter Teil des gewaschenen Niederschlags wird durch Erhöhung des pH des Materials auf 10,5 für 30 Minuten bei Raumtemperatur durch die Zugabe von 1 N Natriumhydroxid aufgelöst. Der pH der Lösung wird dann durch die Zugabe von 1,0 N Chlorwasserstoffsäure auf 7,0 verringert und die Lösung wird lyophilisiert. Die Sekundärstruktur der 3 Proben wird durch FTIR bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben:
Tabelle 3
Die Ergebnisse zeigen, dass der Schwenk ins Basische den β-Faltblattgehalt verringert und den α-Helixgehalt der Probe erhöht.
Beispiel 5 – Lösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH zeigt eine erhöhte Bioverfügbarkeit im Vergleich zu unlöslichem Val⁸-GLP-1(7-37)OH
Val⁸-GLP-1(7-37)OH mit hohem β-Faltblattgehalt wird durch Auflösen des lyophilisierten Pulvers in 20 mM Phosphatpuffer bei pH 7,2 und dem Rühren der Lösung über Nacht bei 21°C hergestellt. Der entstehende Niederschlag wird gewonnen, mit entionisiertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das lyophilisierte Pulverausgangsmaterial und der getrocknete Niederschlag werden auf Bioverfügbarkeit durch die Injektion in Gruppen von 3 Ratten getestet. Um die Proben herzustellen wird das lyophilisierte Pulverausgangsmaterial (löslich) in eine Lösung mit 2 mg/ml in 15 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) formuliert. Der getrocknete Niederschlag wird dann in eine Aufschlämmung in 10 mM Phosphat (pH 7,2) überführt, wobei das unlösliche Material in eine Suspension mit 16,5 mg Feststoff pro ml in 15 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) überführt wird. Die formulierten Materialien werden subkutan mit 80 und 800 μg/kg Körpergewicht injiziert, während die Niederschlagsaufschlämmung mit dem Zehnfachen injiziert wird, das heißt 8000 μg/kg, Die maximale Konzentration in Serumproben, die aus den Ratten entnommen werden, wird durch einen Enzym-gebundenen Immunosorbenttest mit 11–15 ng/ml für das formulierte Material und mit 0,4 bis 0,6 ng/ml für die Aufschlämmung bestimmt. Die Fläche unter der Kurve beträgt etwa 1% oder weniger für die Aufschlämmung im Vergleich zum formulierten Material.
Beispiel 6 – HPLC Analyse von Val⁸-GLP-1(7-37)OH, das für kurze Zeiträume einem hohen pH ausgesetzt wird
Solubilisiertes Val⁸-GLP-1(7-37)OH wird für 10 Minuten bei Raumtemperatur gegenüber pH 12,3 exponiert. Es wird keine detektierbare Veränderung im HPLC Profil beobachtet. Jedoch wird eine HPLC Analyse, die wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt wird, an solubilisiertem Val⁸-GLP-1(7-37)OH gegenüber pH 12,3 für mehrere Stunden exponiert, was mehrere neue Peaks zeigt, die polarer sind, das heißt früher eluieren. Drei neue Peaks sind in diesem Profil dominant und wachsen mit 0,36, 0,06 und 0,64% pro Stunde. Eine Exposition von 5 Minuten würde gemäß diesen Daten zu einem Abbau von 0,09% führen. Die Fraktionierung dieser Peaks und die Analyse mittels Massenspektroskopie (ESI) und Ed manabbauanalyse zeigt 3 Peaks, die identische Massen (3384,4 ± 0,5 amu) und Sequenzen durch die 31 Zyklen dieser Peptide aufweisen. Das Ergebnis stimmt mit der Isomerisierung der Aminosäurereste von der L zur D Konformation über ein (siehe beispielsweise Senderoff et al., J. Pharm. Sci. 87: 183 (1998).
Diese Daten stimmen mit der Schlussfolgerung überein, dass die beobachteten Konformationseffekte des Schwenks ins basische auf Val⁸-GLP-1(7-37)OH, wie dies durch FTIR und Löslichkeit gemessen wird, nicht auf der L zu D Isomerisierung beruhen, die sich in neuen HPLC Peaks manifestiert.
Beispiel 7 – Umwandlung von unlöslichem Val⁸-GLP-1(7-37)OH in lösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH durch einen Säureschwenk
Unlösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH wird in entionisiertem Wasser mit 2 mg Feststoff pro ml suspendiert. Der pH des Aliquots wird durch die Zugabe von 12 μl einer 85% Phosphorsäurelösung pro ml Lösung auf 1,74 abgesenkt. Der pH eines zweiten Aliquots wird durch die Zugabe von 5,5 μl einer 10% Chlorwasserstoffsäurelösung pro ml Lösung auf pH 1,92 abgesenkt. Jede Probe wird für 15 Minuten sanft gerührt. Die Proben werden durch die Zugabe von 10% Natriumhydroxid auf pH 7,4 eingestellt und dann wird jede Probe durch eine Filtermembran mit 0,2 μm filtriert. Der lösliche Teil wird lyophilisiert und auf die Sekundärstruktur analysiert. Eine Infrarotanalyse der Produkte zeigt, dass die Hauptabsorption in der Amidregion bei 1657 cm^–1 auftritt, was mit der Bildung von löslichem Val⁸-GLP-1(7-37)OH übereinstimmt. Die HPLC Analyse, wie sie in Beispiel 6 beschrieben ist, zeigt keine detektierbare Razemisierung.
Die Ausbeute beträgt 77,5% für die mit Chlorwasserstoffsäure behandelte Probe und 6,4% für die mit Phosphorsäure behandelte Probe.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Herstellung einer GLP-1 Verbindung, die in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 löslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "lösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, aus der entsprechenden GLP-1 Verbindung, die im wesentlichen in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 unlöslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "unlösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung in einer wässrigen Base mit einem pH zwischen 10,5 und 12,5 unter Bildung einer GLP-1 Lösung, b) Neutralisation der GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 6,5 und 9,0, und c) Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung aus der neutralisierten Lösung von Schritt b).
Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH der wässrigen Base zwischen 12,1 und 12,5 liegt.
Verfahren zur Herstellung einer GLP-1 Verbindung, die in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 löslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "lösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, aus der entsprechenden GLP-1 Verbindung, die im wesentlichen in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 unlöslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "unlösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung in einer wässrigen Base mit einem pH zwischen 10 und 10,5 unter Bildung einer GLP-1 Lösung, b) Neutralisation der GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 6,5 und 9,0, und c) Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung aus der neutralisierten Lösung von Schritt b).
Verfahren zur Herstellung einer GLP-1 Verbindung, die in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 löslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "lösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, aus der entsprechenden GLP-1 Verbindung, die im wesentlichen in einer wässrigen Lösung bei pH 7,4 unlöslich ist, wobei die GLP-1 Verbindung als "unlösliche GLP-1 Verbindung" bezeichnet wird, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung in einer wässrigen Säure mit einem pH zwischen 1,5 und 2,0 unter Bildung einer GLP-1 Lösung, b) Neutralisation der GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 6,5 und 9,0, und c) Isolierung der löslichen GLP-1 Verbindung aus der neutralisierten Lösung von Schritt b).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die GLP-1 Lösung auf einen pH zwischen 7,0 und 8,5 neutralisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die GLP-1 Lösung mit einem ausreichend kurzen Zeitintervall nach der Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung neutralisiert wird, so daß keine wesentliche Razemisierung der gelösten GLP-1 Verbindung auftritt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die GLP-1 Lösung innerhalb von 30 Minuten nach der Auflösung der unlöslichen GLP-1 Verbindung neutralisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die GLP-1 Lösung durch eine Filtermembran mit einer ausreichend feinen Porosität filtriert wird, um gelatineartiges Material aus der Lösung zu entfernen.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Filtermembran eine ausreichend feine Porosität aufweist, mikrobielle Substanz aus der Lösung zu entfernen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die lösliche GLP-1 Verbindung durch Lyophilisierung, Kristallisation oder Sprühtrocknung isoliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die GLP-1 Verbindung die Aminosäuresequenz von GLP-1(7-37)OH oder ein Fragment hiervon umfaßt, die so modifiziert ist, daß 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren sich von der entsprechenden Position des GLP-1(7-37)OH oder dein Fragment hiervon unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die GLP-1 Verbindung an der Position 8 und an der Position 22 modifiziert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die GLP-1 Verbindung DDP-IV geschützt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die GLP-1 Verbindung GLP-1(7-34), GLP1(7-35), GLP-1(7-36) oder GLP-1(7-37) oder die Amidform hiervon und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon umfaßt, die mindestens eine der folgenden Modifikationen aufweisen: a) Substitution des Lysins an der Position 26 und/oder Position 34 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Arginin oder D-Lysin oder Substitution des Arginins an der Position 36 durch Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Lysin oder D-Arginin, b) Substitution des Tryptophans an der Position 31 durch eine oxidationsresistente Aminosäure, c) Substitution von zumindest einem der Folgenden: Tyrosin anstelle des Valins an der Position 16, Lysin anstelle des Serins an der Position 18, Asparaginsäure anstelle von Glutaminsäure an der Position 21, Serin anstelle von Glycin an der Position 22, Arginin anstelle von Glutamin an der Position 23, Arginin anstelle von Alanin an der Position 24 und Glutamin anstelle von Lysin an der Position 26, d) Substitution von zumindest einem aus: Glycin, Serin oder Cystein für Alanin an der Position 8, Asparaginsäure, Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin anstelle von Glutaminsäure an der Position 9, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin anstelle von Glycin an der Position 10 und Glutaminsäure anstelle von Asparaginsäure an der Position 15, oder e) Substitution von Glycin, Serin, Cystein, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin oder der D- oder N-acylierten oder N-alkylierten Form von Histidin anstelle von Histidin an der Position 7, worin bei den Substitutionen in a), b), d) und e) die substituierten Aminosäuren wahlweise in der D-Form vorliegen können und die an der Position 7 substituierten Aminosäuren wahlweise in N-acylierter oder N-alkylierter Form vorliegen können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die GLP-1 Verbindung GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 1], GLP-1(7-34) [SEQ ID Nr. 6], GLP-1(7-35) [SEQ ID Nr. 7], GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 36], Gln⁹-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 8], d-Gln⁹-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 9], Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 10], Lys¹⁸-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 11], Gly⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 12], Gly⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID, Nr. 13], Val⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 14], Val⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 15], Met⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 16], Met⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 17], Ile⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 18], Ile⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 19], Thr⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 20], Thr⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 21], Ser⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 22], Ser⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 23], Asp⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 24], Asp⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 25], Cys⁸-GLP-1(7-36)NH₂ [SEQ ID Nr. 26], Cys⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 27], Thr⁹-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 28], D-Thr⁹-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 29], Asn⁹-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 30], D-Asn⁹-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 31], Ser²²-Arg²³-Arg²⁴-Gln²⁶-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 32], Arg²³-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 33], Arg²⁴-GLP-1(7-37) [SEQ ID Nr. 34] und Gly⁸-Gln²¹-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 35] ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die GLP-1 Verbindung GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 1] oder Val⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 15] ist.
Verfahren zur Herstellung von Val⁸-GLP1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 15], das in wässriger Lösung bei physiologischem pH löslich ist, wobei das Val⁸-GLP-1(7-37)OH als "lösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH" bezeichnet wird, aus Val⁸-GLP-1(7-37)OH, das in wässriger Lösung bei physiologischem pH unlöslich ist, wobei das Val⁸-GLP-1(7-37)OH als "unlösliches Val⁸-GLP-1(7-37)OH" bezeichnet wird, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Auflösung des unlöslichen Val⁸-GLP-1(7-37)OH in einer wässrigen Base mit einem pH zwischen 12,1 und 12,5 unter Bildung einer Val⁸-GLP-1(7-37)OH Lösung, b) Neutralisation der Val⁸-GLP-1(7-37)OH Lösung innerhalb von 30 Minuten nach der Auflösung von Val⁸-GLP-1(7-37)OH auf einen pH zwischen 7,0 und 8,5, und c) Filtration der neutralisierten Lösung von Schritt b) durch eine Filtermembran mit einer Porosität zwischen 0,20 μm und 0,25 μm, und d) Isolierung des löslichen Val⁸-GLP-1(7-37)OH aus der neutralisierten Lösung von Schritt c).
Verfahren nach Anspruch 17, worin das lösliche Val⁸-GLP-1(7-37)OH [SEQ ID Nr. 15] aus der filtrierten Lösung von Schritt c) durch Sprühtrocknung, Lyophilisierung oder Kristallisation erhalten wird.