DE69014115T2

DE69014115T2 - Stabilisierte, starke grf-analoga.

Info

Publication number: DE69014115T2
Application number: DE69014115T
Authority: DE
Inventors: Alan Friedman; Teresa Kubiak
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2010-05-31
Also published as: RU2096416C1; JPH04506069A; DE69014115D1; CA2057895A1; EP0477217A1; JP2512638B2; DK0477217T3; AU5674390A; EP0477217B1; ES2063360T3; AU625787B2; ATE113965T1; WO1990015821A1; HU211346A9

Description

Einführung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid mit Einfluß auf die Funktion der Hirnanhangdrüse beim Menschen und weiteren Tieren, insbesondere Säugetieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Peptide, die die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hirnanhangdrüse fördern. Die erfindungsgemäßen Peptide sind in vivo wirksam und stabiler im Plasma, wobei ausgewählte Peptide in einer wäßrigen Umgebung bei einem neutralen pH-Wert stabiler als native GRF-Sequenzen sind.

Hintergrund der Erfindung

Physiologen haben seit langem erkannt, daß der Hypothalamus die Sekretfunktionen der Adenohypophyse steuert, wobei der Hypothalamus spezielle Substanzen bildet, die die Sekretion jedes Hirnanhangdrüsenhormons stimulieren oder hemmen. 1982 wurden aus Extrakten menschlicher Bauchspeicheldrüsentumoren Humanpankreas (Tumor) Freisetzungsfaktoren (hpGRF) isoliert, gereinigt, charakterisiert, synthetisiert und untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß sie die Freisetzung von Wachstumshormon (GH) durch die Hirnanhangdrüse fördern (vgl. R. Guillemin et al., Science 218, 585-585 (1982)). Seit dieser Zeit wurden auch aus anderen Spezies, einschließlich der Ratte, dem Schwein, dem Schaf, dem Rind und der Ziege, sowie aus dem Menschen entsprechende Hypothalamus-GH- Freisetzungsfaktoren charakterisiert und synthetisiert.
Es wurde festgestellt, daß menschlicher Hypothalamus-GRF (hGRF) dieselbe Formel wie hpGRF, nämlich:
aufweist.
Es wurde festgestellt, daß Ratten-GRF (rGRF) einen Ser-Rest in Stellung 8 und die Formel:
aufweist (vgl. beispielsweise US-PS 4 595 676).
Es wurde festgestellt, daß Rinder-GRF (bGFR) die Formel:
aufweist.
Es wurde festgestellt, daß Schweine-GRF einen Ser- Rest in Stellung 28 aufweist.
Es wurde berichtet, daß native GRF-Sequenzen einer raschen Inaktivierung durch Blutplasmaenzyme unterliegen. Der rasche Zusammenbruch umf aßt eine Spaltung der 2-3- Bindung des Peptids durch eine Dipeptidylpeptidase Typ IV (DPP-IV), die in der Vergangenheit auch als Dipeptidylaminopeptidase IV bezeichnet wurde (L.A. Frohman et al., J. Clin. Invest., 78, 906-913 (1986)).
Die metabolische Stabilität von GRF und verschiedene Verfahren zum Schutz von GRF-Peptiden gegen eine Dipeptidylpeptidasespaltung wurden vorgeschlagen. Beispielsweise berichteten Felix et al., Synthesis and biological activity of novel linear and cyclic GFR analogs, in Peptids, Chemistry and Biology, Proc. 10th Am. Peptide Symposium, Herausgeber G.R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, Niederlande, Seite 465-467 (1988) über mit desNH2-Tyr in Stellung 1 oder/und D-Ala in Position 2 substituierte GRF-Analoge, wodurch deren N-Termini eine erhöhte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau aufwiesen. Diese Information wurde jüngst durch Frohman et al., Dipeptidylpeptidase-IV und trypsin-like enzymatic degradation of human growth hormone-releasing hormone in plasma, J. Clin. Invest. 83, 1533-1540 (1989) bestätigt. Darüber hinaus zeigte die letztere Gruppe, daß eine N- Acetylierung und N-Methylierung des N-terminalen Tyrosin- Rests oder eine Substitution mit D-Tyr-1 in GRF eine Spaltung in 2-3-Stellung vollständig hemmt. Andererseits blokkierte eine alpha-Methylierung von Tyr-1 nur teilweise einen Abbau durch DPP-IV.
W.A. Murphy und D.H. Coy beschreiben in "Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor", Peptid Research 1, 36-41 (1988) Analoge von GRF, die als Ergebnis einer N-Alkylierung oder N-Arylalkylierung der N-terminalen Aminosäure mit oder ohne begleitende N-Alkylierung der Lysin-Seitengruppen in der Peptidkette eine erhöhte Beständigkeit gegenüber einem enzymatischen Abbau zeigen.
Native GRF-Sequenzen weisen in 15-Stellung einen Gly-Rest auf. Von Analogen mit Ala oder Leu in 15-Stellung ist bekannt, daß sie eine erhöhte GH-Freisetzungswirksamkeit aufweisen (vgl. beispielsweise US-PS-4 649 131 und 4 734 399 sowie N. Ling et al., Quo Vadis?, Symposium, Sanofi Group, 29.-30. Mai 1985, Toulouse-Labege, Frankreich, Seite 309-322). Substitutionen von Gly-15 durch Val oder alpha-Aminoisobuttersäure führten ferner zu einer erhöhten Wirksamkeit der GRF-Analoge (Felix et al., Synthesis and biological activity of novel growth hormone releasing factor analogs, in "Peptides" 1986, Walter de Gruyter & Co., Berlin-New York, Seite 481-484 (1987)).
A.M. Felix berichtete über ein Programm zur Synthetisierung von Analogen mit erhöhter und/oder verlängerter biologischer Aktivität, einsdhließlich der Herstellung und der Untersuchung von Ala¹&sup5; h-GRF(1-29)NH&sub2; und desNH&sub2;- Tyr¹, D-Ala², Ala¹&sup5; hGRF(1-29)NH&sub2; (vgl. beispielsweise US-PS-4 649 131 und 4 734 399 sowie A.M. Felix, E.P. Heimer, T.F. Mowles, H. Bisenbeis, P. Leung, T.J. Lambros, M. Anmad, C.-T. Wang & Paul Brazeau: Synthesis and biological activity of novel growth hormone releasing factor analogs, in "Peptides" 1986, Seite 481-484 (1987); A.M. Felix, C.T. Wang, E. Heimer, A. Fournier, D. Bolin, M. Ahmad, T. Lambros, T. Mowles und L. Miller: Synthesis and biological activity of novel linear and cyclic GRF analogs in "Peptides, Chemistry and Biology", Proceedings of the 10th American Peptide Symposium, Herausgeber G.R. Marshall, Escom Science Publishers, Leiden, Niederlande (1988), Seite 465-467, D. Peticlerc, H. Lapierre, G. Pelletier, P. Dubreuil, P. Gaudreau, T. Mowles, A. Felix und P. Brazeau: Effect of a potent analog of human growth hormone-releasing factor (hGRF) on growth hormone (GH) release and milk production of dairy cows, Meeting Abstract P223, 82nd Meeting American Dairy Sci. Assn., Columbia, MO, 21.-24. Juni 1987).
Ein neben acht weiteren Modifikationen in demselben Molekül mit Ser² modifiziertes GRF-Analog wird von Tou et al., Amphiphilic Growth Hormon-Releasing Factor (GRF) analogs: peptide design and biological activity in vivo, Biochem. Biophys. Res. Commun. 139, 763-770 (1986) beschrieben. Es wurde berichtet, daß dieses Analoge, verglichen mit bGRF(1-44)NH&sub2;, eine 165%ige in vivo Wirksamkeit bei Schafen aufweist.
Aus der US-PS-4 734 399 sind GRF-Analoge mit Ala, N- Methyl-D-Ala oder D-Ala in Stellung 2 und Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nval, β-Ala oder α-Ala in Stellung 15 bekannt (vgl. auch US-PS-4 649 131).
Aus der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 0 188 214, Anmeldenummer 86100127.9 von Coy und Murphy sind GRF-Analoge mit Leu oder Phe in Stellung 2 neben GRF-Peptiden mit verschiedenen nicht-natürlichen Aminosäuren der L- oder D-Konfiguration als Substituenten in 2-Stellung bekannt.
GRF-Analoge mit einer sehr niedrigen Bioaktivität mit Sar² oder Pro² werden von Coy et al., Strategies in the design of synthetic agonists and antagonists of growth hormone-releasing factor, Peptides, Band 7, Suppl. 49-52 (1986) beschrieben.
Ling et al., Growth hormone-releasing factor analogs with potent antagonists activity, in "Peptides, Chemistry and Biology", Proceedings of the 10th American Peptide Symposium, Herausgeber G.R. Marshall, Escom Science Publishers, Leiden, Niederlande (1988), Seite 484-486 berichten über eine Reihe von mit entweder Arg oder verschiedenen D-Aminosäuren in 2-Stellung substituierten GRF-Analogen. Alle GRF-Analoge sind weniger wirksam als das Mutterhormon, wobei einige von ihnen eine antagonistische Wirksamkeit zeigten.
Von G. Velicelebi et al., Proc. Natl. Aca. Sci USA, Band 83, 5397-5399 (1986) wurde ein 29-Aminosäure-Analoges von hGRF mit der Sequenz der ersten sechs Aminosäuren am Amino-Terminus, das sich von dem natürlichen Peptid durch 13 Aminosäuren im Rest der Sequenz, einschließlich eines Einbaus eines Ser-Rests in Stellung 8, unterscheidet. Die Amid- und freie Säureform des Analogen wies die folgende Formel:
auf. Bei einer Untersuchung der Fähigkeit zur Stimulierung einer Wachstumshormon (GH)-Sekretion in primären Kulturen von Vorderhyphophysenzellen der Ratte wies das Amid-Analoge eine 1,57fache Wirksamkeit von hGRF(1-40)OH auf, während berichtet wurde, daß die freie Säureform in derselben Untersuchung 1/6tel der Wirksamkeit aufwies.
Vale et al. (US-PS-053 233, eingereicht am 22. Mai 1987) beschreiben 31-Rest-hGRF-Analoge, die sich eines in 31-Stellung befindlichen Restes mit einer konjugierten funktionellen Seitenkettengruppe bedienen, die zu einem getrennten Protein konjugiert werden kann. Die 31-Rest- hGRF-Analoge können ferner Substitutionen für andere Reste, die in einer natürlichen GRF-Sequenz auftreten, beispielsweise Asn oder Ser in 8-Stellung, Phe in 10- Stellung oder Ala in 15-Stellung, aufweisen. Asn oder Ser können in 28-Stellung vorhanden sein.
Es wird berichtet, daß Asn-Reste in Polypeptiden unter bestimmten Umständen einer Desamidierung in Gegenwart von Wasser unterliegen. Die die Desamidierungsraten steuernden Regeln sind jedoch nicht klar. Beispielsweise werden in dem Polypeptid Trypsin nur einige der Asn-Reste mit der teilweisen Sequenz Asn-Ser desamidiert, während andere nicht desamidiert werden (vgl. A.A. Kpssiakoff, Science 240, 191-194 (1988)).
Die europäische Patentanmeldung Nr. 86 308 337.4, Veröffentlichungsnr. 0 220 958, offenbart eine Klasse von Verbindungen der Formel H-X-Pro-Peptid, worin X für den Rest einer natürlich vorkommenden Aminosäure steht, Pro die natürlich vorkommende Aminosäure Prolin bedeutet und Peptid für eine die Sequenz eines biologisch aktiven Peptids oder Proteins definierende Sequenz von Aminosäureresten steht. Beispiele für H-X-Pro-Peptid umfassen die Verbindung Met-Pro-(Wachstumshormonfreisetzungsfaktor), die chemisch in GRF umgewandelt werden kann.
Über N-terminal verlängerte Analoge an nicht-GRF- Peptiden zu verschiedenen Zwecken wurde berichtet. Beispiele dafür sind:
M.A. Tallon et al., Biochem., 26:7767-7774 (1987) stellten synthetisch eine Reihe von N-terminal verlängerten Analogen eines Hefe-α-Mating-Factors mit Ala, Glu- Ala, Ala-Glu-Ala oder Glu-Ala-Glu-Ala im Verlängerungsteil her. Diese Peptide wurden in Struktur/Wirksamkeitsbeziehungsuntersuchungen verwendet.
D. Andreu et al., 20th Eur. Peptide Symp., Tübingen, Deutschland, 4.-9. Sept. 1988, Symposium Abstracts, S. 33, synthetisierten die gesamte 64-Aminsäure lange Sequenz der Vorläuferform von Cecropin A zusammen mit mehreren potientiellen, Verarbeitungszwischenstufen entsprechenden, kürzeren Peptiden. Unter ihnen befand sich eine vollständige Cecropinsequenz, die mit Ala-Pro-Gly-Pro an ihrem N-Terminus verlängert war. Diese wurde dazu verwendet, um zu zeigen, daß der Verlängerungsteil tatsächlich durch eine aus der Cecropiaseidenspinnerpuppe erhaltene, teilweise gereinigte Dipeptidylpeptidase-artige enzymatische Zubereitung abgespalten wird (vgl. auch H. Boman et al., J. Biol. Chem. 264:5852-5860 (1989)).
G. Kreil et al. berichten in "Eur. J. Biochem.", 111:49-58 (1980) darüber, daß Melittin, der Hauptbestandteil von Honigbienengift, von Promelittin abgeleitet wird. Die Prosequenz von Promelittin besteht aus sechs X- Pro und fünf X-Ala Dipeptidylresten, die sich wiederholen. Die Ergebnisse von Kreil et al. legten die Vermutung nahe, daß die Vorläuferproduktumwandlung über eine stufenweise Spaltung der Dipeptideinheiten durch ein in Extrakten aus Giftdrüsen vorhandenes Enzym vom Dipeptidylpeptidase IV-Typ abläuft.
Aus C. Mollay et al., Eur. J. Biochem., 160:31-35 (1986) ist bekannt, daß es sich bei Caerulein und Xenopsin um zwei in der Hautabscheidung von Xenopus laevis festgestellte Peptide handelt. Das erstere weist eine Sequenz Phe-Ala-Asp-Gly und das letztere eine Sequenz Ser- Ala-Glu-Ala in dem N-terminalen Verlängerungen in ihren jeweiligen Vorläuferformen auf. Eine aus Froschhautabscheidung isolierte Dipeptidylpeptidase vom Typ IV weist die für die Spaltung dieser N-terminalen Verlängerungen unter Bildung der reifen Produkte erforderliche Spezifität auf.
Aus D. Julius et al., Cell, 32:839-852 (1983) ist bekannt, daß reifes alpha-Faktor Pheromon aus einem vom Saccharomyces cervisiae alpha Zellen abgeschiedenen Peptid aus 13 Aminosäuren besteht. Nicht-reife alpha-Zellmutanten, denen eine membrangebundene Dipeptidylpeptidase fehlt, bilden keinen normalen alpha-Faktor, sondern setzen eine Sammlung von unvollständig behandelten Formen mit Strukturen Glu-Ala-Glu-Ala-alpha-Faktor oder Asp-Ala- Glu-Ala-alpha-Faktor mit einer deutlich verringerten biologischen Wirksamkeit frei. Es wurde gezeigt, daß für eine normale alpha-Faktor-Vorläuferbehandlung die membrangebundene Dipeptidylpeptidase erforderlich ist, wobei dieses Verfahren in normalen Hefe-alpha-Zellen für eine alpha-Faktor-Reifung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt sein kann.
Aus C.L. Choy et al., Eur. J. Biochem., 160:267-272 (1986) ist bekannt, daß die Prosequenz des Antigefrierproteins aus der Neufundland-Winterflunder vier X-Pro und sieben X-Ala Sequenzen, die sich wiederholen, in ihrem N- terminalen Teil enthält. Obwohl die Behandlung dieses Vorläufers nicht untersucht wurde, mutmaßen die Autoren, daß eine derartige Umwandlung im Serum durch ein dipeptidylpeptidaseartiges Enzym, das die Dipeptidyleinheiten im Verlängerungsteil unter Freisetzung des reifen Antigefrierproteins sequenziell spalten würde, stattfinden dürfte.
Nach dem für die vorliegende Patentanmeldung maßgeblichen ersten Prioritätstag berichteten Suhr et al. in "Mol. Endocrinology" 3:1693-1700 (1989) von der Isolierung und Charakterisierung eines die volle Länge aufweisenden cDNA-Klons mit Codierung für Mäuse-GRF. Es wurde vorausgesagt, daß der reife Mäuse-GRF aus einem 42-Aminosäurereste langen Peptid mit einem freien Carboxylterminus besteht. Dieses Peptid weist einen Valinrest in 2- Stellung, der ihn einzigartig macht, auf. GRFen aus anderen Spezies weisen allesamt Ala in 2-Stellung auf.
Aus der EP-A-0 136 475 sind Peptide bekannt, die Wachstumshormonspiegel in Tieren freisetzen, in denen der aus menschlichen Pankreasinseltumoren gewinnbare, wachstumshormonfreisetzende Faktor durch Ersetzen der natürlichen Aminosäuren in 1, 2 und 3-Stellung und durch Derivatisieren des N-terminalen Aminosäurerestes modifiziert ist.
Aus der EP-A-0 136 475 sind GRF-Peptide, einschließlich beispielsweise [D-Ala²]-hpGRF(1-44)-NH&sub2;, bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung Eine neue Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung besteht aus einem synthetischen Polypeptid, das die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hirnanhangdrüse (GRF-Peptid) fördert und anstelle des normalerweise in 2- Stellung gefundenen Aminosäurerestes einen Thr-, Val- oder Ile-Rest in Kombination mit einer der folgenden Aminosäuren Ala, Val, Leu, Ile oder Gly in 15-Stellung aufweist. Gegebenenfalls kann das GRF-Peptid einen Ser-Rest anstelle des normalerweise in 8 und 28-Stellung des Polypeptids festgestellten Aminosäurerests aufweisen. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen GRF-Peptide wahlweise N-terminal mit C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, Benzyl, H-(Y-X)n oder H-(Y- X)m(Y'-X')p, wobei Y und Y', die gleich oder verschieden sind, aus einer natürlich vorkommenden Aminsäure, vorzugsweise Tyr oder Asp, bestehen, X und X', die gleich oder verschieden sind, aus Thr, Ser oder Ala, vorzugsweise Thr oder Ser, ausgewählt sind, n 1-10 bedeutet, m 1-5 bedeutet und p 1-5 entspricht, verlängert sein.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind in vivo wirksam und stabiler als native GRF-Sequenzen gegen ein Zerbrechen durch Blutplasmaenzyme. Darüber hinaus werden die mit Ser&sup8; und Ser²&sup8; substituierten Verbindungen gegen eine Desamidierung in wäßrigen Umgebungen geschützt und sind chemisch stabiler.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der in dieser Beschreibung und den Patentansprüchen verwendete Ausdruck "GRF-PEPTID" bedeutet ein Polypeptid, das eine Länge von 27-44 Resten umfaßt und die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hirnanhangdrüse fördert. Beispiele für GRF-Peptide sind die aus den folgenden Literaturstellen bekannten natürlichen oder synthetischen Polypeptide:
US-PS-4 517 181, 4 518 586, 4 528 190, 4 529 595, 4 563 352, 4 585 756, 4 595 676, 4 605 643, 4 610 976, 4 626 523, 4 628 043, 4 689 318 und die US-Patentanmeldung mit der fortlaufenden Eingangsnummer 89/00245, eingereicht am 27. Januar 1989 (auf die hierin bezug genommen wird), ferner A. Felix, C.T. Wang, E. Heimer, A. Fournier, D. Bolin, M. Ahmed, T. Lambros, T. Mowles und L. Miller in "Synthesis and Biolgical Activity of Novel Linear & Cyclic GRF Analogs", in Peptids, Chemistry and Biology, Proc. 10th Am. Peptide Symposium, Herausgeber G.R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, Niederlande, S. 465-467 (1988), J.S. Tou, L.A. Kaempfe, B.D. Vineyard, F.C. Buonomo, M.A. Della-Fera und C.A. Baile, "Amphiphilic Growth Hormone Releasing Factor Analogs". Peptide Design and Biological Acitivity in vivo", Biochem. Biophys. Res. Commun. 139 #2, S. 763-770 (1986), D.H. Coy, W.A. Murphy, J. Sueires-Diaz, E.J. Coy, V.A. Lance, "Structure Activity Studies on the N-Terminal Region of Growth Hormone Releasing Factor", J. Med. Chem. 28, S. 181-185 (1985), A.M. Felix, E.P. Heimer, T.F. Mowles, H. Eisenbeis, P. Leung, T.J. Lambros, M. Ahmed und C.T. Wang, "Synthesis and Biological Activity of Novel Growth Hormone Releasing Factor Analogs", in Peptides 1986, Walter de Gruyter & Co., Berlin-New York, S. 481- 484 (1987), G. Velicelebi, S. Patthi und E.T. Kaiser, "Design and Biological Activity of Analogs of Growth Hormone Releasing Factor with Potential Amphiphilic Helical Carboxyl Termini", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, S. 5397-5399 (1986), N. Ling, A. Baird, W.B. Wehrenberg, T. Munegumi und N. Ueno, "Synthesis GRF Analogs as Competitive Antagonists of GRF Therapeutic Agents Produced by Genetic Engineering", Quo Vadis Symposium, Sanofi Group, 29.-30. Mai 1985, Toulouse-Labege, Frankreich, S. 309- 329, W.A. Murphy und D.H. Coy, "Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor", Peptid Research 1, 36-41 (1988), J.C. Tou, L.A. Kaempfe, B.D. Vineyard, F.C. Buonomo, M.A. Della-Fera und C.A. Baile: "Amphiphilic Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) analogs: peptide design and biologicalactivity in vivo", Biochem. Biophys. Res. Commun. 139, 763-770 (1986). Der Ausdruck GRF-PEPTID umfaßt ihre nicht-toxischen Salze.
Die zur Definition der GRF-Peptide verwendete Nomenklatur besteht aus der von Schroder & Lubke in "The Peptides", Academic Press (1965) spezifizierten, nach der entsprechend herkömmlicher Darstellung die Aminosäure am N-terminalen Ende links und die Carboxylgruppe am C-terminalen Ende rechts erscheinen. Wenn der Aminosäurerest isomere Formen aufweist, ist sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, die L-Form der Aminosäure dargestellt.
Die vorliegende Erfindung liefert synthetische GRFPeptid-Analoge (GRF-PEPTIDE) der folgenden Formel:
worin R für H, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, Benzyl, H-(Y-X)n oder H- (Y-X)m(Y'-X')p, worin Y und Y', die gleich oder verschieden sind, aus einer natürlich vorkommenden Aminosäure, vorzugsweise Tyr oder Asp, bestehen, X und X', die gleich oder verschieden sind, aus Thr, Ser oder Ala, vorzugsweise Thr oder Ser, ausgewählt sind, n 1-10, m 1-5 und p 1-5 bedeuten, steht,
R&sub1; Tyr oder His, vorzugsweise Tyr, bedeutet,
R&sub2; Thr, Val oder Ile, vorzugsweise Val oder Ile, entspricht,
R&sub3; für Asp oder Cya, vorzugsweise Asp, steht,
R&sub8; Asn oder Ser, vorzugsweise Ser, darstellt,
R&sub1;&sub2; für Lys, N-&epsi;-Alkyl- oder N-&epsi;-Benzyl-Lys oder Arg, vorzugsweise Lys, oder N-&epsi;-Alkyl- oder N-&epsi;-Benzyl- Lys, wenn R C&sub1;-C&sub5;-Alkyl oder Benzyl bedeutet, steht,
R&sub1;&sub3; Val oder Ile, vorzugsweise Val, entspricht,
R&sub1;&sub5; Ala, Val, Leu, Ile oder Gly (vorzugsweise Ala, Val, Leu oder Ile, insbesondere AIa) darstellt,
R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr, vorzugsweise Ser, bedeutet,
R&sub2;&sub1; Lys, N-&epsi;-Alkyl- oder N-&epsi;-Benzyl-Lys oder Arg, vorzugsweise Lys oder N-&epsi;-Alkyl- oder N-&epsi;-Benzyl-Lys, wenn R für C&sub1;-C&sub5;-Alkyl oder Benzyl steht, entspricht,
R&sub2;&sub2; Ala oder Leu, vorzugsweise teu, bedeutet,
R&sub2;&sub5; Asp oder Glu, vorzugsweise Asp, entspricht,
R&sub2;&sub7; Met, Ile oder Leu, vorzugsweise Leu oder Ile, darstellt,
R&sub2;&sub8; Asn oder Ser, vorzugsweise Ser, bedeutet,
R&sub3;&sub4; Ser oder Arg, vorzugsweise-Arg, darstellt,
R&sub3;&sub5; für Asn oder Ser, vorzugsweise Asn, steht,
R&sub3;&sub8; Arg oder Gln, vorzugsweise Gln, bedeutet,
R&sub3;&sub9; Gly oder Arg, vorzugsweise Gly, entspricht,
R&sub4;&sub0; für Ala oder Ser, vorzugsweise Ala, steht,
R&sub4;&sub2; Ala, Val oder Phe, vorzugsweise Val, bedeutet und
Z die Carboxyleinheit des Aminsäurerestes am C-terminalen Ende kennzeichnet und aus dem Rest -COORa, -CRaO, -CONHNHRa, -CON(Ra) (Rb) oder -CH&sub2;ORa mit Ra und Rb gleich C&sub1;-C&sub8;-Alkyl oder Wasserstoff besteht,
oder ein biologisch aktives Fragment derselben, das sich von R am N-Terminus bis zu einem Rest in einer der Stellungen 27 bis 44 als seinem C-Terminus erstreckt, oder ein Hse(Lacton), HseOH oder HseN(Ra)(Rb) der oben genannten und/oder ein nicht-toxisches salz der oben genannten.
R steht vorzugsweise für Wasserstoff.
Beispiele für C&sub1;-C&sub8;-Alkyl sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl und ihre isomeren Formen.
Der Ausdruck iPr bezeichnet Isopropyl.
Der Ausdruck Bzl bezeichnet Benzyl.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid Thr² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2; der folgenden Formel:
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist das Peptid Val² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2; der folgenden Formel:
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid Ile² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2; der folgenden Formel:
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid Thr² Ser&sup8; Ala¹&sup5; Leu²&sup7; Ser²&sup8; bGRF(1- 44)NH&sub2; der folgenden Formel:
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Peptide
oder ein nicht-toxisches Salz derselben.
Noch stärker bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Peptide
oder ein nicht-toxisches Salz derselben.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid
der folgenden Formel: (Ethyl).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind N-terminal verlängerte Peptide, einschließlich beispielsweise
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine der oben genannten Ausführungsformen, bei der Asp durch Cya in 3-Stellung und/oder 25-Stellung, vorzugsweise in 3-Stellung, ersetzt ist.
Der Beweis der verbesserten metabolischen Stabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen im Vergleich zu nativem GRF ist in Tabelle 1 anhand der angegebenen in vitro Stabilitätsdaten dargestellt. Es ist erwähnenswert, daß die Analogen mit Thr², Val², Ile² oder Leu² in Rinderplasma in vitro durch DPP-IV unter den in der Untersuchung verwendeten experimentellen Bedingungen (eine Stunde Plasmainkubation) nach dem Rest 2 nicht gespalten wurden. Nach einer verlängerten Plasmainkubation zeigte Thr² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2; jedoch eine schwache durch DPP-IV bedingte Spaltung.
Darüber hinaus ist in Tabelle 1 die erhöhte in vivo Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen dargestellt. Beispielsweise würde ein Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet aus der relativen in vivo Wirksamkeit (bei einer Dosis von 0,01 nmol/kg) erkennen, daß aus der Bestimmung und dem Vergleich der jeweiligen ED50 zu Serwarten ist, daß das Ile² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2;- Trifluoracetatsalz eine 10-20fach höhere Wirksamkeit als sein Isomer, das Leu² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2;-Trifluoracetatsalz, aufweist.
Hinsichtlich einer kommerziellen Herstellungsmethodik besteht der carboxyterminale Rest vorzugsweise aus Homoserin, Homoserinlacton, Homoserinamid oder C1-C8- Alkyl (vorzugsweise C1-C4-Alkyl), Sekundär- oder Tertiäramiden von Homoserin.
Die synthetischen GRF-Peptidanaloge werden durch ein geeignetes Verfahren, einschließlich beispielsweise den aus der US-PS-4 529 595 (Spalte 2, Zeile 35 bis Spalte 5, Zeile 64) und der US-PS-4 689 318 (Spalte 2, Zeile 23 bis Spalte 9, Zeile 13), auf die hierin Bezug genommen wird, bekannten Verfahren, synthetisiert.
Vorgehen A stellt ein Verfahren zur Herstellung von GRF-Peptid-Analogen der vorliegenden Erfindung dar.

Vorgehen A

Die Peptide werden nach einer Festphasenmethodik unter Verwendung einer Applied Biosystems 430A Peptidsynthesevorrichtung (Applied Biosystems, Foster City, Californien) und von von Applied Biosystems bezogenen Synthesezyklen hergestellt. Boc-Aminosäuren und andere Reagentien werden von Applied Biosystems und anderen Handelsquellen bezogen. Sich einer sequenziellen Boc-Chemie bedienende Doppelkuppelprotokolle werden auf das das Ausgangsmaterial darstellende p-Methylbenzhydrylaminharz zur Herstellung von C-terminalen Carboxyamiden appliziert.
Zur Herstellung der C-terminalen Säuren wird das entsprechende PAM-Harz verwendet. Asparagin, Gutamin und Arginin werden unter Verwendung vorgeformter Hydroxybenztriazolester gekuppelt. Alle weiteren Aminosäuren werden unter Verwendung der vorgebildeten symmetrischen Boc-Aminosäureanhydride gekuppelt.
Der folgende Seitenkettenschutz wird verwendet:
Arg: Tosyl
Asp: Benzyl
Cys: 4-Methylbenzyl
Glu: Benzyl
Ser: Benzyl
Thr: Benzyl
Tyr: 4-Brom-carbobenzoxy
Lys: 2-Chlorcarbobenzoxy
Eine Boc-Entschützung erfolgt mit Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid. Wenn Hse enthaltende Analoge angestrebt werden, sollte Met durch eine feste Phase einverleibt und anschließend mit Bromcyan nach HF-Spaltung nach auf dem einschlägigen Fachgebiet wohlbekannten Verfahren modifiziert werden. Diese Bromcyanspaltung wandelt das Met in das C-terminale Hse-Lactonpeptid um. Dies kann durch Behandlung mit einem geeigneten Amin in einem Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Dimethylformamid, in das Hse-Amidpeptid umgewandelt werden. Nach beendeter Synthese werden die Peptide entschützt und mit wasserfreiem Fluorwasserstoff mit 10% p-Kresol vom Harz abgespalten. Eine Spaltung der Seitenkettenschutzgruppe(n) und des Peptids vom Harz erfolgt bei 0ºC oder darunter, vorzugsweise bei -20ºC 30 min lang und anschließend 30 min bei 0ºC. Nach Entfernung der HF wird das Peptid/Harz mit Ether gewaschen, das Peptid mit Eisessig extrahiert und lyophilisiert. Vor einer Reinigung werden die rohen, Cystein enthaltenden Peptide anschließend mit Hilfe von Perameisensäure bei -10ºC bis 10ºC, vorzugsweise bei 0ºC, entsprechend der Beschreibung von Stewart et al. in "Solid Phase Peptide Synthesis", Seite 113, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984 zu der entsprechenden cysteinsäurehaltigen Verbindung oxidiert. Eine Umwandlung in die terminalen Hse-Lactone und Hse-Amide erfolgt wie oben beschrieben.
Eine Reinigung erfolgt durch Ionenaustauschchromatographie auf einer Synchroprep S-300 (SynChrom Inc., Linden, Indiana)-Kationenaustauschsäule. Das Peptid wird mit Hilfe eines Puffers von 20 mmol Tris (pH-Wert 6,8) in 20% Acetonitril appliziert und unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 0,3 Mol Natriumchlorid im selben Lösungsmittel eluiert. Die Verbindungen werden desweiteren durch Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie auf einer Vydac C-18 (Seperations Group, Hesperia, California)-Säule unter Verwendung von Wasser/Acetonitril-Gradienten, wobei jede Phase 0,1% TFA enthält, gereinigt und entsalzt. Die gewünschten Fraktionen werden gesammelt und lyophylisiert, wobei das gewünschte GRF-PEPTID als Trifluoracetatsalz erhalten wird. Das Trifluoracetatsalz kann gewünschtenfalls in andere geeignete Salze nach wohlbekannten Ionenaustauschverfahren umgewandelt werden.
Die Peptide werden näch einem Dampfphasenverfahren in einer Pico-Tag Work Station (Waters) unter Verwendung von konstant siedendem HCl (Pierce) in Gegenwart von Phenol als Radikalfänger bei 110ºC während 24 h unter Vakuum hydrolisiert. Die Hydrolysate werden auf einer Beckman Amino Acid Analysiervorrichtung Modell 6300 analysiert. Der Peptidgehalt wird unter Verwendung von Norleucin bei einer bekannten Konzentration als internem Standard berechnet.

Beispiele

Beispiel 1:

Herstellung von Thr² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2;- Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 1)

Die Herstellung des GRF-Analogpeptids der Formel
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 3,96 (4); Thr 1,84 (2); Ser 1,79 (2); Glu 2,01 (2); Ala 3,04 (3); Val 0,99 (1); Ile 1,93 (2); Leu 5,05 (5); Tyr 1,96 (2); Phe 0,96 (1); Lye 2,02 Arg 3,09 (3).

Beispiel 2:

Herstellung von Val² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2;- Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 2)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel
(in Form des CF3COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 4,11 (4); Thr 0,96 (1); Ser 1,79 (2); Glu 2,11 (2); Ala 3,04 (3); Val 2,1 (2); Ile 1,91 (2); Leu 5,17 (5); Tyr 2,00 (2); Phe 0,98 (1); Lys 1,99 (2); Arg 2.70 (3).

Beispiel 3:

Herstellung von Ile² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bäRF(1-29)NH&sub2;- Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 3)

Die Synthese der GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 4,12 (4); Thr 0,97 (1); Ser 1,75 (2); Glu 2,09 (2); Ala 3,00 (3); Val 1,05 (1); Ile 2,91 (3); Leu 5,16 (5); Tyr 2,00 (2); Phe 0,99 (1); Lys 1,98 (2); Arg 2,75 (3).

Beispiel 4:

Herstellung von N-α-(Tyr-Thr)Tyr¹ Thr² Ala Leu bGRF (1-29) NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 4)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A. Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern: Asp 4,05 (4); Thr 2,68 (3); Ser 1,77 (2); Glu 2,07 (2); Ala 2,90 (3); Val 1,08 (1); Ile 1,89 (2); Leu 5,20 (5); Tyr 2,87 (3); Phe 0,93 (1); Lys 2,01 (2); Arg 3,07 (3).

Beispiel 5:

Herstellung von N-α-(Tyr-Thr)&sub2; Tyr¹ Thr² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 5)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 4,06 (4); Thr 3,66 (4); Ser 1,85 (2); Glu 2,05 (2); Ala 2,93 (3); Val 1,09 (1); Ile 1,91 (2); Leu 5,15 (5); Tyr 3,91 (4); Phe 0,95 (1); Lys 2,00 (2); Arg 3,04 (3).

Beispiel 6:

Herstellung von N-α-(Tyr-Thr) Tyr¹ Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29) NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung 6)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 4,06 (4); Thr 1,86 (2); Ser 1,77 (2); Glu 2,07 (2); Ala 3,98 (4); Val 1,08 (1); Ile 1,89 (2); Leu 5,14 (5); Tyr 2,94 (3); Phe 0,96 (1); Lys 1,99 (2); Arg 3,04 (3).

Beispiel 7:

Herstellung von N-α-(Tyr-Thr)Tyr¹ Ile² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 7)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 4,07 (4); Thr 1,87 (2); Ser 1,75 (2); Glu 2,07 (2); Ala 2,94 (3); Val 1,09 (1); Ile 2,87 (3); Leu 5,12 (5); Tyr 2,92 (3);-Phe 0,96 (1); Lys 2,00 (2); Arg 3,05 (3).

Beispiel 8:

Herstellung von N-α-(Tyr-Ser)Tyr¹ Thr² Ala¹&sup5; Leu²&sup7; bGRF(1-29)NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 8)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 4,11 (4); Thr 1,82 (2); Ser 2,64 (3); Glu 2,05 (2); Ala 2,90 (3); Val 1,04 (1); Ile 1,87 (2); Leu 5,16 (5); Tyr 2,92 (3); Phe 0.94 (1); Lys 2,01 (2); Arg 3,04 (3).

Beispiel 9:

Herstellung von Val² Ser&sup8; Ala¹&sup5; Leu²&sup7; Ser²&sup8; Hse&sup4;&sup5; bGRF(1-45)NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 9)

Die Herstellung des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 3,05 (3); Thr 0,93 (1); Ser 3,20 (4); Glu 8,41 (8); Gly 2.04 (2); Ala 4,17 (4); Val 2,87 (3); Ile 1,79 (2); Leu 5,96 (6); Tyr 1,88 (2); Phe 0,83 (1); Lys 2,94 (3); Arg 4,93 (5). Massenspektrum (M+H)&spplus;:
Gefunden: 5179,3,
theoretischer Wert: 5179,9.

Beispiel 10:

Herstellung von Val² Ser&sup8; Ala¹&sup5; Leu²&sup7; Ser²&sup8; Hse³³ bGRF (1-33) NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 10)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 2,04 (2); Thr 0,93 (1); Ser 3,23 (4); Glu 4,19 (4); Gly 0,95 (1); Ala 3,21 (3); Val 1,93 (2); Ile 1,82 (2); Leu 4,96 (5); Tyr 1,91 (2); Phe 0,91 (1); Lys 1,99 (2); Arg 3,03 (3).
Massenspektrum (M+H)&spplus;:
Gefunden: 3770,1,
theoretischer Wert: 3770,4.

Beispiel 11:

Herstellung von Val² Ser&sup8; Ala¹&sup5; Leu²&sup7; Ser²&sup8; Hse³&sup0; bGRF (1-30) NH&sub2;-Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 11)

Die Synthese der GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 2,05 (2); Thr 0,96 (1); Ser 3,32 (4); Glu 2,04 (2); Ala 3,10 (3); Val 2,12 (2); Ile 1,86 (2); Leu 5,04 (5); Tyr 1,91 (2); Phe 0,89 (1); Lys 2,06 (2); Arg 3,05 (3).
Massenspektrum (M+H)&spplus;:
Gefunden: 3456,7,
theoretischer Wert: 3457,0.

Beispiel 12:

Herstellung von Val² Ser&sup8; Ala¹&sup5; Leu²&sup7; Hse²&sup8; bGRF(1- 28) NH&sub2;-Trifluroacetatsalz (Verbindung Nr. 12)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse (theoretische Werte): Asp 2,05 (2); Thr 0,99 (1); Ser 2,46 (3); Glu 2,06 (2); Ala 3,09 (3); Val 2,02 (2); Ile 1,86 (2); Leu 5,01 (5); Tyr 1,96 (2); Phe 0,96 (1); Lys 2,00 (2); Arg 2,01 (2).
Massenspektrum (M+H)&spplus;:
Gefunden: 3213,5,
theoretischer Wert: 3213,8.

Beispiel 13:

Herstellung von Val² Ser&sup8; Ala¹&sup5; Hse²&sup6; bGRF(1-26)NH&sub2;- Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 13)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH-Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 2,06 (2); Thr 0,92 (1); Ser 2,68 (3); Glu 2,10 (2); Ala 3,46 (3); Val 1,89 (2); Ile 0,86 (1); Leu 4,11 (4); Tyr 1,78 (2); Phe 0,82 (1); Lys 1,88 (2); Arg 1,94 (2).
Massenspektrum (M+H)&spplus;:
Gefunden: 2986,7,
theoretischer Wert: 2987,5.

Beispiel 14:

Herstellung von Val² Ser&sup8; Ala¹&sup5; Hse²¹ bGRF(1-21)NH&sub2;- Trifluoracetatsalz (Verbindung Nr. 14)

Die Synthese des GRF-Analogpeptids der Formel:
(in Form des CF&sub3;COOH- Salzes) erfolgt stufenweise gemäß Vorgehen A.
Aminosäureanalyse, theoretische Werte in Klammern:
Asp 1,03 (1); Thr 0,94 (1); Ser 2,77 (3); Glu 1,06 (1); Ala 3,38 (3); Val 1,86 (2); Ile 0,84 (1); Leu 2,04 (2); Tyr 1,84 (2); Phe 0,86 (1); Lys 0,93 (1); Arg 2,02 (2).
Massenspektrum (M+H)&spplus;:
Gefunden: 2389,3,
theoretischer Wert: 2389,0.
Gemäß dem stufenweisen Vorgehen entsprechend Vorgehen A können ferner die folgenden Peptide hergestellt werden:

Vorgehensweisen

Vorgehen B

Neben der Herstellung der GRF-Analogen durch Festphasenverfahren können die Analogen im Rahmen einer rekombinanten DNA Methodik durch das für Leu²&sup7; bGRF(1-44)OH (EP-A-0 212 531) beschriebene Vorgehen erhalten werden, wobei die folgenden Modifikationen durchgeführt wurden: in dem für bGRF(1-44)OH codierenden DNA-Segment wurden die Codons für Ala², Asn&sup8;, Gly¹&sup5; und Asn²&sup8; durch die folgenden Codons ersetzt: beispielsweise (ACT) Thr² oder (ATT) Ile² oder (GTT) Val², (AGT) Ser&sup8;, (GCT) Ala¹&sup5; bzw. (AGT) Ser²&sup8;.
Darüber hinaus wird bei den Cya³ enthaltenden GRF- Analogen das Codon GAT (Asp³) durch das Codon TGT für Cys³ ersetzt. Nach Expression des Proteins und Spaltung mit Bromcyan in Ameisensäure gemäß der Beschreibung in der obigen Europäischen Patentanmeldung wird der Lösung bei etwa 0ºC zur Herbeiführung einer Oxidation der Cys-Reste zu Cya Wasserstoffperoxid zugesetzt. Das Peptid wird anschließend nach den beschriebenen Verfahren gereinigt.
Darüber hinaus werden bei den N-terminal verlängerten GRF-Analogen die für die Verlängerung codierenden DNA-Segmente an den N-Terminus wie folgt angefügt: (TATACT) für Tyr-Thr, (TATACT)n für (Tyr-Thr)n oder (TATAGT) für Tyr-Ser, (TATAGT)n für (Tyr-Ser)n oder (TATAGTTATACT) für Tyr-Ser-Tyr-Thr oder (TATACTTATAGT) für Tyr-Thr-Tyr-Ser, (GATGCT) für Asp-Ala usw. Das Gen für das Vorläuferprotein wird in einen E.coli Expressionsvektor insertiert. Nach Expression der Proteinisolierung der Einschlußkörper und anschließender Spaltung derselben mit Bromcyan in Ameisensäure entsprechend der Beschreibung in der obigen Europäischen Patentanmeldung wird die Ameisensäure unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohpeptid wird anschließend nach den beschriebenen Verfahren gereinigt.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen im Rahmen einer bekannten rekombinanten DNA-Technologie ist möglich, da die beanspruchten Peptide vollständig aus natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen. Dies steht im Gegensatz zu bekannten Analogen, die nicht DNA-codierte Komponenten, beispielsweise D-Ala und/oder Desamino-Tyr, enthalten und für eine Produktion im großen Maßstab eine kostspielige chemische Synthese oder eine Kombination genetischer Konstruktionen mit chemischen Vorgehensweisen erfordern.
Erfindungsgemäß verwendete rekombinante Wirtsmikroorganismen werden nach dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet wohlbekannten und beispielsweise von T. Maniatis et al., in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) und B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons (1984), auf die hier bezug genommen wird, beschriebenen rekombinanten DNA- Techniken hergestellt.
C-terminale Hse(lacton)-, HseOH- und HseN(Ra)(Rb)- Analoge lassen sich nach den aus Kempe et al., BIO/TECHNOLOGY, Band 4, Seite 565-568 (1986) bekannten Verfahren herstellen.

Vorgehen C

Dieses Vorgehen betrifft die Herstellung von erfindungsgemäß beschriebenen N-alkylierten GRF-Analogen. Die Peptide werden entweder nach chemischen oder biotechnologischen Vorgehensweisen (Vorgehen A bzw. Vorgehen B) hergestellt. Eine N-Alkylierung erfolgt anschließend nach bekannten Verfahren (vgl. W.A. Murphy und D.H. Coy, Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor, Peptide Research 1, 36-41 (1988), V. Sythyamoorthy et al., Reductive methylation of botulinum neurotoxin types A and B, Mol. Cell. Biochem. 83, 65-72 (1988)).
Entsprechend Vorgehen C lassen sich die folgenden Peptide herstellen:
Alle synthetischen GRF-Peptide der vorliegenden Erfindung, einschließlich den in den Beispielen hergestellten Peptiden, sind als biologisch aktiv und zur Stimulierung der Freisetzung von GH durch die Hirnanhangdrüse geeignet anzusehen.
Dosen zwischen etwa 10 ng und etwa 5 ug dieser Peptide pro kg Körpergewicht sind als besonders wirksam zur Hervorrufung einer GH-Sekretion anzusehen.
Eine Stimulierung der GH-Sekretion durch derartige Peptide sollte zu einer damit einhergehenden Wachstumszunahme bei Menschen, Rindern und weiteren Tieren mit normalen GH-Spiegeln führen. Darüber hinaus sollte eine Verabreichung dem Gehalt an Körperfett verändern und weitere GH-abhängige metabolische, immunologische und die Entwicklung betreffende Prozesse beeinflussen. Beispielsweise können sich diese Analoge als Maßnahme zur Stimulierung anabolischer Verfahren beim Menschen unter Umständen, wie nach dem Zuziehen von Brandwunden, eignen. Als weiteres Beispiel können diese Analoge an im Handel erhältliche warmblütige Tiere, beispielsweise Hühner, Truthähne, Schweine, Ziegen, Rinder und Schafe, verabreicht und in der Landwirtschaft zur Vermehrung von Fisch und weiteren kaltblütigen Seetieren, beispielsweise Seeschildkröten und Aalen, sowie Amphibien verwendet werden, um als Folge der Verabreichung wirsamer Peptidmengen ein Wachstum zu beschleunigen und das Verhältnis Protein/Fett zu erhöhen. Diese Analoge können zur Stimulierung der Immunfunktionen bei Menschen und Tieren verwendet werden.
Tägliche Dosen zwischen 10 ng/kg und etwa 50 ug/kg Körpergewicht sind als besonders wirksam zur Erhöhung der Milchproduktion, des Wachstums und zur Stimulierung der Immunfunktionen anzusehen.
Zur Verabreichung an Menschen und Tiere sollten diese synthetischen Peptide eine Reinheit von mindestens etwa 93% und vorzugsweise mindestens 98% aufweisen.
Diese synthetischen Peptide oder ihre nicht-toxischen Salze können in Kombination mit einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch akzeptablen Träger unter Bildung einer pharmazeutischen Zubereitung, vorzugsweise Zubereitungen mit verzögerter Freigabe, an Tiere, einschließlich Menschen, entweder intravenös, subcutan, intramuskulär oder percutan, beispielsweise intranasal, verabreicht werden. Die Verabreichung kann durch einen Arzt zur Stimulierung der Freisetzung von GH, wenn der zu behandelnde Patient eine derartige therapeutische Behandlung erfordert, erfolgen. Die erforderliche Dosierung schwankt in Abhängigkeit von dem jeweiligen zu behandelnden Zustand, der Strenge des Zustandes und der Dauer der gewünschten Behandlung.
Derartige Peptide werden häufig in Form von nicht- toxischen Salzen, beispielsweise Säureadditionssalzen oder Metallkomplexen, wie mit Zink, Eisen oder dgl. (die als Salze für diese Applikationszwecke angesehen werden), verabreicht. Beispiele für derartige Säureadditionssalze sind das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Maleat, Ascorbat, Tartrat und dgl.. Soll der Wirkstoff durch intravenöse Verabreichung in isotonischer Kochsalzlösung verabreicht werden, können Phosphatpufferlösungen oder dgl. in wirksamer Weise einsetzt werden.
Die Peptide sollten unter Anleitung eines Arztes an Menschen verabreicht werden, wobei die pharmazeutischen Zubereitungen das Peptid üblicherweise in Verbindung mit einem herkömmlichen, festen oder flüssigen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Üblicherweise beträgt die Erwachsenendosis etwa 100 ng bis etwa 50 ug Peptid pro kg Körpergewicht des Patienten.
Obwohl die Erfindung anhand ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es selbstverständlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen, die durchgeführt werden können, für den Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet nahe liegen, ohne vom Umfang der in den beigefügten Patentansprüchen dargestellten Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können entsprechend der heute bekannten experimentellen Praxis zur Schaffung von Peptiden, die sehr wesentliche Teile der biologischen Wirksamkeit des Peptids beibehalten, Modifikationen in der Peptidkette, insbesondere Deletionen von einem oder zwei Resten beginnend am C-Terminus des Peptids durchgeführt werden. Derartige Peptide sollen auch unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Darüber hinaus können entsprechend dem Wissen auf dem Gesamtgebiet der Peptidchemie Zufügungen am C-Terminus und/oder am N-Terminus durchgeführt und/oder natürlich vorkommende Reste, durch im allgemeinen äquivalente Reste ersetit werden, um, ohne von dem Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, weitere Analoge mit beispielsweise erhöhter Proteolysebeständigkeit und ferner mit mindestens einem wesentlichen Teil der Wirksamkeit des beanspruchten Polypeptids herzustellen (vgl. beispielsweise Verbindungen 1- 14). In ähnlicher Weise führen bekannte Substitutionen in der Carboxyleinheit am C-Terminus, beispielsweise ein niedrigeres Alkylamid, auch zu äquivalenten Molekülen.
In der hier beschriebenen Weise lassen sich GRF-Peptide der Formel:
worin bedeuten:
R' H-(Y-X)n oder H-(Y-X)m(Y'-X')p, worin Y und Y', die gleich oder verschieden sind, für eine natürlich vorkommende Aminsäure stehen, X und X', die gleich oder verschieden sind, aus Thr oder Ser ausgewählt sind oder,
wenn Y oder Y' für Asp steht, Ala bedeuten, n 1-10, m 1-5 und p 1-5 bedeuten,
R&sub1; Tyr oder His,
R'2 Ala, D-Ala, Thr, Val oder Ile,
R&sub3; Asp oder Cya,
R&sub8; Asn oder Ser,
R'&sub1;&sub2; Lys oder Arg,
R&sub1;&sub3; Val oder Ile,
R&sub1;&sub5; Ala, Val, Leu, Ile oder Gly,
R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr,
R'&sub2;&sub1; Lys oder Arg,
R&sub2;&sub2; Ala oder Leu,
R&sub2;&sub5; Asp, Glu oder Cya,
R&sub2;&sub7; Met, Ile oder Leu,
R&sub2;&sub8; Asn oder Ser,
R&sub3;&sub4; Ser oder Arg,
R&sub3;&sub5; Asn oder Ser,
R&sub3;&sub8; Arg oder Gln,
R&sub3;&sub9; Gly oder Arg,
R&sub4;&sub0; Ala oder Ser,
R&sub4;&sub2; Ala, Val oder Phe und
Z die Carboxyleinheit des Aminosäurerestes am C-Terminus, wobei Z aus dem Rest -COORa, -CRaO, -CONHNHRa, -CON(Ra)(Rb) oder -CH&sub2;ORa mit Ra und Rb gleich C&sub1;-C&sub8;-Alkyl oder Wasserstoff besteht,
oder ein biologisch aktives Fragment derselben, das sich von R am N-Terminus zu einem Rest in einer der Stellungen 20-44 (vorzugsweise der Stellungen 27-44) als seinem C-Terminus erstreckt,
oder ein Hse(lacton), HseOH oder HseN(Ra)(Rb) der oben genannten und/oder ein nicht-toxisches Salz der oben genannten nach der heute allgemein bekannten experimentellen Praxis zur Erzeugung von Peptiden, die sehr wesentliche Teile der biologischen Wirksamkeit des Peptids beibehalten, wobei derartige Peptide auch als ein weiterer Aspekt der hier veröffentlichten Erfindung angesehen werden, herstellen.
Diese Peptide können unter Ersatz von Val, Ile oder Thr durch N-Methyl-D-Ala, D-Ala oder vorzugsweise Ala in 2-Stellung hergestellt und in derselben allgemeinen Weise benutzt werden. Tabelle 1 In vitro Stabilität in Rinderplasma und in vivo Bioaktivität bei jungen Stieren der in 2- und 15-Stellung substituierten GRF-Analoge. In vitro StabilitätI (% inaktives Peptid nach 1 h) Relative in vivo Wirksamkeit iv# sc§ Verbindung&spplus; STUDIE I Die Peptide wurden in einer Menge von 0,03 mM während einer Stunde bei 37ºC mit Rinderplasma inkubiert. 0,1 ml Aliquote wurden mit 2 ml 0,2%iger wäßriger Trifluoressigsäurelösung gequencht und entsprechend der Beschreibung bei T.M. Kubiak et al., Drug Met. Disp. 17, 393-397 (1989) einer Festphasenextraktion und HPLC-Analyse unterworfen. # Den jungen Stieren wurden die Peptide in einer Dosis von 0,01 nmol/kg iv injiziert, worauf das bei W.M. Moseley et al. J. Endocr. 117, 253-259 (1988) beschriebene Vorgehen durchgeführt wurde. Die relative Wirksamkeit wurde auf der Basis der Fläche unter der während 2 h nach Behandlung aufgenommenen Serumwachstumshormon (GH)-Kurve berechnet.§ Den jungen Stieren wurden die Peptide in einer Dosis von 0,75 nmol/kg subcutan injiziert. Die relative Wirksamkeit wurde auf der Basis der Fläche unter der während 6 h nach Behandlung aufgenommenen Serum-GH-Kurve berechnet. a,b,c Werte mit unterschiedlichen hochgestellten Indizes in jeder Spalte und/oder Untersuchung unterschieden sich statistisch mit p ( 0,05. nd = nicht bestimmt * Plasmapool 1 ** Plasmapool 2, der sich von 1 unterscheidet &spplus; in Form eines Trifluoracetatsalzes &spplus;&spplus; nach einer einstündigen in vitro Inkubation in Rinderplasma wurde keine Spaltung nach dem Rest 2 beobachtet.

Claims

1. GRF-PEPTID mit einem Thr-, Val- oder Ile-Rest anstelle des normalerweise in Stellung 2 gefundenen Aminosäurerests und mit einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Ala, Val, Leu, Ile oder Gly, in Stellung 15, gegebenenfalls am N'-Terminus substituiert durch H-(Y-X)n oder H-(Y-X)m(Y'-X')p mit Y und Y', die gleich oder verschieden sind, gleich einer natürlich vorkommenden Aminosäure, X und X', die gleich oder verschieden sind, gleich Thr, Ser oder Ala, n gleich 1-10, m gleich 1-5 und p gleich 1-5.

2. GRF-PEPTID nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure in Stellung 15 aus Ala besteht.

3. GRF-PEPTID nach Anspruch 1 der Formel

worin bedeuten:

R H, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, Benzyl, H-(Y-X)n oder H-(Y-X)m(Y'- X')p mit Y und Y', die gleich oder verschieden sind, gleich einer natürlich vorkommenden Aminosäure, X und X', die gleich oder verschieden sind, gleich Thr, Ser oder Ala, n gleich 1-10, m gleich 1-5 und p gleich 1-5;

R&sub1; Tyr oder His;

R&sub2; Thr, Val oder Ile;

R&sub3; Asp oder Cya;

R&sub8; Asn oder Ser;

R&sub1;&sub2; Lys oder Arg oder N-&epsi;-Alkyl- oder N-&epsi;-Benzyl- Lys, wenn R für C&sub1;-C&sub5;-Alkyl oder Benzyl steht;

R&sub1;&sub3; Val oder Ile;

R&sub1;&sub5; Ala, Val, Leu, Ile oder Gly;

R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr;

R&sub2;&sub1; Lys oder Arg oder N-&epsi;-Alkyl- oder N-&epsi;-Benzyl- Lys, wenn R für C&sub1;-C&sub5;-Alkyl oder Benzyl steht;

R&sub2;&sub2; Ala oder Leu;

R&sub2;&sub5; Asp oder Glu;

R&sub2;&sub7; Met, Ile oder Leu;

R&sub2;&sub8; Asn oder Ser;

R&sub3;&sub4; Ser oder Arg;

R&sub3;&sub5; Asn oder Ser;

R&sub3;&sub8; Arg oder Gln;

R&sub3;&sub9; Gly oder Arg;

R&sub4;&sub0; Ala oder Ser;

R&sub4;&sub2; Ala, Val oder Phe und

Z die Carboxyleinheit des Aminosäurerests am C-Terminus, nämlich -COORa, -CRaO, -CONHNHRa, -CON(Ra)(Rb) oder -CH&sub2;ORa mit Ra und Rb jeweils gleich C&sub1;-C&sub8;-Alkyl oder Wasserstoff;

oder ein biologisch aktives Fragment desselben, das sich von R am N-Terminus bis zu einem Rest in irgendeiner der Stellungen 27 bis 44 als seinem C-Terminus erstreckt;

oder Hse(Lacton), HseOH oder HseN(Ra)(Rb) hiervon;

oder ein nicht-toxisches Salz hiervon.

4. GRF-PEPTID nach Anspruch 3, worin R&sub2; für Val oder Ile steht.

5. GRF-PEPTID nach Anspruch 3, worin R&sub1; für His steht.

6. GRF-PEPTID nach Anspruch 3, worin R&sub1;&sub5; für Ala, Val, Leu oder Ile steht.

7. GRF-PEPTID nach Anspruch 6, worin R für H steht und R&sub1;&sub5; Ala darstellt.

8. GRF-PEPTID nach Anspruch 7, worin R&sub1; für Tyr steht.

9. GRF-PEPTID nach Anspruch 8, worin R&sub8; und R&sub2;&sub8; für Ser stehen.

10. GRF-PEPTID nach Anspruch 9, der Formel:

oder ein nicht-toxisches Salz desselben.

11. GRF-PEPTID nach Anspruch 6, worin R&sub2; für Thr steht.

12. GRF-PEPTID nach Anspruch 11, der Formel:

oder ein nicht-toxisches Salz desselben.

13. GRF-PEPTID nach Anspruch 6, worin R&sub2; für Ile steht.

14. GRF-PEPTID nach Anspruch 13, der Formel:

oder ein nicht-toxisches Salz desselben.

15. GRF-PEPTID nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe

oder ein nicht-toxisches Salz desselben.

16. GRF-PEPTID nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe

oder ein nicht-toxisches Salz desselben.

17. Ein GRF-PEPTID der Formel

worin bedeuten:

R' H-(Y-X)n oder H-(Y-X)m(Y'-X')p mit Y und Y', die gleich oder verschieden sind, jeweils gleich einer natürlich vorkommenden Aminosäure, X und X', die gleich oder verschieden sind, jeweils gleich Thr oder Ser oder im Falle, daß Y oder Y' für Asp steht, X und X' gleich Ala, n gleich 1-10, m gleich 1-5 und p gleich 1-5;

R'&sub2; Ala, D-Ala, Thr, Val oder Ile;

R'&sub1;&sub2; Lys oder Arg;

R'&sub2;&sub1; Lys oder Arg;

R'&sub2;&sub5; Asp, Glu oder Cya;

und worin R&sub1;, R&sub3;, R&sub8;, R&sub1;&sub3;, R&sub1;&sub5;, R&sub1;&sub8;, R&sub2;&sub2;, R&sub2;&sub7;, R&sub2;&sub8;, R&sub3;&sub4;, R&sub3;&sub5;, R&sub3;&sub8;, R&sub3;&sub9;, R&sub4;&sub0;, R&sub4;&sub2; und Z die in Anspruch 3 angegebene Bedeutung besitzen, oder ein Fragment, Derivat oder Salz desselben gemäß Anspruch 3.

18. Verfahren zur Stimulation der Freigabe von Wachstumshormon bei einem Tier, umfassend die Verabreichung eines GRF-PEPTIDS nach einem der vorhergehenden Ansprüche an das (betreffende) Tier.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das GRF-PEPTID der Definition nach Anspruch 11 genügt.

20. Mittel zur Stimulation der Freigabe von Wachstumshormon bei einem Tier, umfassend ein GRF-PEPTID gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

21. Mittel nach Anspruch 20, wobei das GRF-PEPTID der Definition nach Anspruch 11 genügt.