DE60035502T2

DE60035502T2 - Neue peptide

Info

Publication number: DE60035502T2
Application number: DE60035502T
Authority: DE
Inventors: Kenji Minoo-shi KANGAWA; Masayasu Toyonaka-shi KOJIMA; Hiroshi Minoo-shi HOSODA; Hisayuki Kobe-shi MATSUO; Yoshiharu Chiyoda-machi Ohra-gun MINAMITAKE
Original assignee: Kangawa Kenji Minoo
Current assignee: Kangawa Kenji Minoo
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2020-07-25
Also published as: AU2006201580A1; JP3471780B2; CN101693736B; DE60043361D1; KR20020026543A; ATE449174T1; EP2119785A1; AU784035B2; EP1795598B1; CN1362968A; PT1197496E; EP1197496A1; KR100827973B1; US20090170763A1; WO2001007475A1; DK1795598T3; DE60035502D1; CN100506844C; BR0012688A; ATE366813T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Peptid, das die Wirkung einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration oder die Aktivität zum Induzieren der Sekretion von Wachstumshormon aufweist, wobei eine Aminosäure in dem Peptid modifiziert ist. Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Erhalt des neuen Peptids und ein Verfahren zu dessen Herstellung, und ein Verfahren zur Herstellung des Peptids oder eines Präkursors des Peptids durch die Verwendung eines Gens, das das Peptid oder einen Präkursor des Peptids kodiert. Ferner wird hierin ein Strukturanalogon des in der vorliegenden Erfindung offenbarten neuen modifizierten Peptids, das an einen Rezeptor für eine Wachstumshormonsekretions-induzierende Verbindung bindet, wodurch die Wirkung der Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration oder der Aktivität zum Induzieren der Sekretion von Wachstumshormon gezeigt wird, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung beschrieben. Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung oder einen Wachstumsförderer für Tiere, umfassend das Peptid oder das Peptidanalogon als einen aktiven Inhaltsstoff, sowie einen Antikörper gegen das Peptid oder ein Verfahren zu dessen Verwendung.
Stand der Technik
Ein Wachstumshormon (hierin nachstehend mit GH abgekürzt) ist ein proteinartiges Hormon, das in der Adenohypophyse synthetisiert wird, und fördert indirekt das Knochenwachstum und die Differenzierung von Adipozyten und Chondrozyten, und seine Sekretion wird durch den Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor (GHRH) gefördert und durch Somatostatin inhibiert [J. Kendrew, et al., Hrsg., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., London, 1994), S. 462]. GH weist nicht nur eine wachstumsfördernde Wirkung auf, sondern ebenso Wirkungen, wie Förderung der Proteinsynthese in verschiedenen Geweben, Stimulation der Übertragung von Depotfetten und Erhöhung des Glykogengehalts in Muskeln, und eine Reduktion der GH-Sekretion löst Zwergwuchs aus, während die übermäßige Sekretion davon Riesenwuchs oder Akromegalie auslöst [Iwanami's Dictionary of Biology, vierte Auflage, herausgegeben von Ryuichi Yasugi, et al. (Iwanami Syoten, Tokio, 1997), S. 757].
Seit menschliches GH durch Gentechnik hergestellt wird, wird GH nicht nur zur Behandlung von Zwergwuchs [J. O. Jorgensen, Endocr. Rev. 12, 189 (1991)], sondern auch zur Behandlung anderer Krankheiten verwendet, so daß seine unterschiedlichen Wirkungen erkannt wurden [J. O. Jorgensen, et al., Horm. Res. 42, 235 (1994)]. Beispielsweise umfassen diese Wirkungen gewöhnlich die Aktivierung der Rekonstitution von Osteoblasten und Knochen [K. Brixen, et al., Miner. Res. 5, 609 (1990)], die Erhöhung der Muskelkraft und der Muskelmasse bei Erwachsenen mit GH-Mangel [R. C. Cuneo, et al., J. Appl. Physiol. 70, 688 (1991)], die Verbesserung der Motilität bei Erwachsenen mit GH-Mangel [R. C. Cuneo, et al., J. Appl. Physiol. 70, 695 (1991)], Heilung schwerer Verbrennungen bei Kindern [D. N. Herndon, et al., Ann. Surg. 212, 424 (1990)], ihre kombinierte Verwendung mit Gonadotropinen bei der Induktion der Ovulation [R. Homburg, et al., Clin. Endocrinol. (Oxf). 32, 781 (1990)], die Vorbeugung einer Stoffwechselstörung durch Verabreichung von Prednison [F. F. Horber and M. W. Haymond, J. Clin. Invest. 86, 265 (1990)], die Förderung der T-Zell-„Bildung” bei einer schweren Immunstörung [W. J. Murphy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4481 (1992)] und die Wirkung einer Inhibierung der Verringerung des Körpergewichts bei alten Menschen und die Wirkung einer Vergrößerung von adipösen Fettgeweben und einer Vorbeugung von Hautatrophie [D. Rudman, et al., N. Engl. J. Med. 323, 1 (1990)].
Die Verabreichung von rekombinantem GH bewirkt eine Förderung des Wachstums bei Kindern und eine Normalisierung von Defekten im Stoffwechsel und von Funktionen, die den GH-Mangel bei Erwachsenen begleiten, aber es gibt Probleme dahingehend, daß GH Dosis-einschränkende Nebenwirkungen aufweist, nicht oral verabreicht werden kann und teuer ist [B. A. Lefker, et al., in Growth Hormone Secretagogues in Clinical Practice, B. B. Bercu und R. F. Walker, Hrsg. (Marcel Dekker, Inc., New York, 1998), S. 107-108]. Viele erwachsene Patienten leiden unter Nebenwirkungen, wie Arthralgie und einem Karpaltunnelsyndrom, von denen angenommen wird, das sie der Ansammlung von überschüssigem Natrium und Humor zuzuschreiben ist, so daß die GH-Verabreichung nicht fortgesetzt werden kann [E. Corpas, et al., Endocr. Rev. 14, 20 (1993)]. Diese Nebenwirkungen korrelieren mit einem nicht-physiologischen Muster der Hormonsekretion durch die GH-Verabreichung, und bei der GH-Verabreichung kann die Pulsatilität der normalen GH-Sekretion nicht imitiert werden [B. A. Lefker, et al., in Growth Hormone Secretagogues in Clinical Practoce, B. B. Bercu und R. F. Walker, Hrsg. (Marcel Dekker, Inc., New York, 1998), S. 107-108].
Die Pulsatilität der In-vivo-GH-Sekretion wird grundsätzlich durch die Interaktion zwischen zwei regulierenden Faktoren, die vom Hypothalamus stammen, erreicht; das heißt, GHRH und Somatostatin agieren auf der Hirnanhangdrüse zur Regulierung der GH-Sekretion [G. S. Tannenbaum und N. Ling, Endocrinology 115, 1952 (1984), R. G. Clark und I. C. Robinson, Endocrinology 122, 2675 (1988)]. Das normale Muster der GH-Sekretion ist am Tag anders als in der Nacht, und in der Nacht wird häufiger eine größere Menge an GH freigesetzt. Die Amplitude des GH-Freisetzungsimpulses wird ferner durch die Rückkopplung verschiedener Steroidhormone, Neurotransmitter, des GH- und insulinartigen Wachstumsfaktors, durch den Ernährungszustand, den Schlaf und die Motilität reguliert [J. S. Strobl und M. J. Thomas, Pharmacol. Rev. 46, 1 (1994)].
Um die Nebenwirkungen, die durch die GH-Verabreichung verursacht werden, zu überwinden, wurde eine große Anzahl von Verbindungen mit einer GH-Sekretion-induzierenden Wirkung synthetisiert und deren strukturelle Aktivitätskorrelation, deren Pharmakologie und deren klinische Anwendungen als Wachstumshormon-Secretagogu (GHS) gründlich untersucht wurden. Zuerst wurden Peptide, wie GHRP-6 (Wachstumshormon-freisetzendes Hexapeptid), synthetisiert und als Therapeutika zum Behandeln von Störungen, die dem Mangel oder der Reduktion in GH zuzuschreiben sind, entwickelt [C. Y. Bowers, et al., Endocrinology 114, 1537-1545 (1984)]. Jedoch wurden, da diese Peptidverbindungen ihre Wirkung nur bei intravenöser Injektion zeigen konnten, Nicht-Peptidverbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, entwickelt [R. G. Smith, et al., Science 260, 1640-1643 (1993)], und einige davon erreichten einen klinischen Test der Phase II [A. A. Patchett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7001-7005 (1995)].
Eine Informationstransferfolge vom Signalempfang des Rezeptors bis zur funktionellen Expression wird Signaltransduktion genannt, und das Signaltransduktionssystem, das mit dem G-Protein gekoppelt ist, verläuft in dem folgenden Mechanismus [Iwanami's Dictionary of Biology, vierte Auflage, Hrsg. von Ryuichi Yasugi, et al., S. 555-556 (Iwanami Syoten, Tokio, 1997)]. Dieses G-Protein-gekoppelte System weist einen Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen auf und ist in ein cAMP-System zur Herstellung von cAMP als ein zweiter Messenger und ein Inositol-1,4,5-triphosphorsäure-(IP3-) und Diacylglycerol-(DG-)-Inositolphospholipid-Informationstransduktionssystem unterteilt. Das cAMP aktiviert cAMP-abhängige Kinase (A-Kinase), um die Phosphorylierung von Serie- und Threoninresten in funktionellem Protein zum Modifizieren seiner Aktivität hervorzurufen. Andererseits bindet IP3 an den IP3-Rezeptor auf endoplasmatischem Retikulum, um die Freisetzung von Calciumionen zu beschleunigen, während DG die C-Kinase aktiviert, um die Wirkung von Hormonen usw. zu beschleunigen.
Der Mechanismus zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration in dem Signaltransduktionssystem mit IP3 oder DG als zweiten Messenger [J. Kendrew, et al., Hrsg., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., London, 1994), S. 136-137] ist folgender: Wenn ein Ligand an den Rezeptor bindet, wird Phospholipase C via G-Protein aktiviert, um PIP2 in IP3 umzuwandeln. Durch IP3 werden Calciumionen, die im endoplasmatischen Retikulum (ER) als intrazelluläres Granulum vereinigt sind, in Zytoplasma freigesetzt, wodurch die Calciumionenkonzentrationen in dem Zytoplasma erhöht werden. Wenn IP3 oder Calciumionen in dem Zytoplasma vorliegen, wird das Calcium erneut in das endoplasmatische Retikulum eingeführt, wodurch die Calciumionenkonzentrationen in dem Zytoplasma verringert werden. Das heißt, die Bindung des Liganden an den Rezeptor verursacht eine vorübergehende Erhöhung der Calciumionenkonzentrationen im Zytoplasma.
Da GHS synergistisch auf die GH-Sekretion und Erhöhung von intrazellulären cAMP-Konzentrationen durch GHRH wirkt [K. Cheng, et al., Endocrinology 124, 2791-2798 (1989)] und die Bindung von GHRH an den Rezeptor die Produktion von cAMP als zweiten Messenger induziert, während GHS eine Erhöhung in der intrazellulären Calciumionenkonzentration induziert, wurde angenommen, daß der Funktionsmechanismus von GHS ein anderer als der von GHRH ist [J. Herrington und B. Hille, Endocrinology 135, 1100-1108 (1994)] und vermutet, daß GHS an einen anderen Rezeptor als den GHRH-Rezeptor bindet. Tatsächlich wurde ein Gen für einen Rezeptor, an den GHS gebunden wird, geklont und aus dem Ergebnis der Northern-Analyse festgestellt, daß der GHS-Rezeptor (GHS-R) im Hypothalamus und der Hirnanhangdrüse exprimiert wird, und daß es 90% oder mehr Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen des vom Schwein und vom Menschen abgeleiteten GHS-Rezeptors gibt [A. D. Howard, et al., Science 273, 974-977 (1996)]. Jedoch wurde ein endogener Ligand, der an GHS-R bindet, nicht isoliert, und dieser GHS-R war ein Orphan-Rezeptor, dessen Ligand nicht offensichtlich war.
In einigen Fällen werden Fettsäuren, wie Myristinsäure, Geraniumsäure, Palmitoylsäure oder Farnesylsäure, an das Aminoende eines bestimmten Proteins oder an Seitenketten seiner Aminosäurereste gebunden, und die Rolle dieser Fettsäuren ist die Verankerung dieses Fettsäure-modifizierten Proteins an der Zellmembran [J. Kendrew, et al., Hrsg., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., London, 1994), S. 616]. Bei diesem Fettsäure-modifzierten Protein bindet die Fettsäure an einen Cysteinrest über eine S-Acyl-Verknüpfung, und weder eine Aminosäure mit einer Fettsäure, die über eine O-Acyl-Verknüpfung an einen Serinrest gebunden ist, wie das endogene GHS, das in der vorliegenden Erfindung offenbart wird, noch ein Protein oder Peptid, das diese Fettsäure-modifizierte Aminosäure enthält, sind bekannt. Ebenso wenig ist bekannt, ob das Peptid, das diese Fettsaüre-modifizierte Aminosäure enthält, als Ligand für irgendeinen Rezeptor fungiert.
Offenbarung der Erfindung
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, werden die Ausdrücke folgendermaßen definiert:
Der Ausdruck „Peptid" bezieht sich auf eine Verbindung, umfassend eine Vielzahl von Aminosäuren, die darin über Peptidverknüpfungen verbunden sind. Hierin umfaßt die Aminosäure (auch als Aminosäurerest bezeichnet) natürlich vorkommende Aminosäuren, dargestellt durch die Formel: NH₂-CH(R')-COOH, worin R' ein natürlich vorkommender Substituent ist, sowie ihre optischen D,L-Isomere usw.
Es gibt auch ein Peptid, in dem eine bestimmte natürlich vorkommende Aminosäure durch eine modifizierte Aminosäure ersetzt ist (auch als modifizierter Aminosäurerest bezeichnet). Die modifizierte Aminosäure umfaßt die Aminosäuren der obigen Formel, wobei der Substituent R' weiter modifiziert ist, ihre optischen D,L-Isomere und nicht-natürliche Aminosäuren, wobei z. B. verschiedene Substituenten an die Substituenten R' der obigen Formel über oder nicht über eine Ester-, Ether-, Thioester-, Thioether-, Amid-, Carbamid- oder Thiocarbamid-Bindung gebunden sind. Die modifizierte Aminosäure umfaßt ebenso nicht-natürliche Aminosäuren, deren Aminogruppen durch Niederalkylgruppen ersetzt sind.
Der Ausdruck „Peptidanalogon" bezieht sich auf eine Verbindung, in der mindestens eine Aminosäure in einem Peptid durch eine Nicht-Aminosäureverbindung ersetzt ist, und daher mindestens eine Verknüpfung der Substituentenverbindung zu dem Peptidanalogon keine Peptidverknüpfung ist.
Ferner werden die Verbindungen, die von diesen Peptiden und Peptidanaloga durch Modifizieren des Aminoendes und/oder Carboxylendes abgeleitet wurden, als Derivate bezeichnet. Und die Peptide, Peptidanaloga und Derivate davon werden gemeinsam als „peptidartige Verbindung" bezeichnet.
In der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 angegeben ist, bezieht sich eine Aminosäuresequenz der 1. bis 4. Aminosäure auf Gly Ser Ser Phe,
bezieht sich eine Aminosäuresequenz der 1. bis 5. Aminosäure auf
Gly Ser Ser Phe Leu,
bezieht sich eine Aminosäuresequenz der 1. bis 6. Aminosäure auf
Gly Ser Ser Phe Leu Ser,
bezieht sich eine Aminosäuresequenz der 1. bis 7. Aminosäure auf
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro,
bezieht sich eine Aminosäuresequenz der 1. bis 8. Aminosäure auf
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu,
bezieht sich eine Aminosäuresequenz der 1. bis 9. Aminosäure auf
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His, und
bezieht sich eine Aminosäuresequenz der 1. bis 10. Aminosäure auf
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln.
Die Entdeckung eines endogenen Liganden (endogenen GHS), der an den GHS-Rezeptor bindet, um so eine Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration oder zum Induzieren der GH-Sekretion zu zeigen, war zusammen mit einem Verfahren zu dessen Verwendung erwünscht. Ferner war eine Verbindung erwünscht, die ein Strukturanalogon des endogenen GHS ist und eine Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration oder zum Induzieren der GH-Sekretion aufweist. Ferner war eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine Zusammensetzung zur Förderung des Wachstums von Lebewesen, die das endogene GHS oder sein Strukturanalogon umfaßt, die die pulsierende GH-Sekretion induzieren, wodurch die Nebenwirkungen der GH-Verabreichung beseitigt werden, sowie eine therapeutische Anwendung unter Verwendung der Zusammensetzung erwünscht.
Die betreffenden Erfinder fokussierten ihre Aufmerksamkeit auf die Tatsache, daß die Bindung des Liganden an den GHS-Rezeptor (GHS-R) eine vorübergehende Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration mit Inositolphospholipid als zweiten Messenger hervorruft, und sie screenten Extrakte von verschiedenen Organen und Geweben unter Verwendung der Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration (Ca-freisetzende Aktivität) als Indikator in CHO-Zellen (CHO-GHSR62), die GHS-R exprimieren. Als Ergebnis fanden die Erfinder heraus, daß Magenextrakte von der Ratte eine starke Ca-freisetzende Aktivität aufweisen, und reinigten eine Substanz mit einer starken Ca-freisetzenden Aktivität aus den obigen Extrakten durch verschiedene Arten der Chromatographie erfolgreich und fanden heraus, daß die Substanz ein neues Peptid, das mit Fettsäure modifiziert ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 3.000 ist. Ferner bestätigten sie, daß das neue Peptid die spezifische Sekretion von GH aus Zellen des Hypophysenvorderlappenextrakts beschleunigt, und fanden heraus, daß das neue Peptid ein endogener Ligand für GHS-R ist, daß heißt, ein endogenes GH-Secretagogu (endogenes GHS). Das heißt, der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein endogenes GH-Sekretion-induzierendes Peptid mit der Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration oder der Aktivität zum Induzieren der GH-Sekretion, wobei ein bestimmter konstituierender Aminosäurerest mit Fettsäure modifiziert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Peptids gerichtet.
Die betreffenden Erfinder analysierten genau die Struktur des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids, und fanden heraus, daß das Peptid ein Peptid ist, das aus der Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID Nr.: 2 angegeben ist, wobei die Seitenketten-Hydroxylgruppe des dritten Serins am Aminoende mit Fettsäure acyliert wurde. Ferner wurde ein vom Menschen abgeleitetes GH-Sekretion-induzierendes Peptid ebenso aus menschlichem Magenextrakt mit einer starken Ca-freisetzenden Aktivität ähnlich der des Rattenmagenextrakts gereinigt und hinsichtlich seiner Struktur in derselben Weise wie für das von Ratten abgeleitete GH-Sekretion-induzierende Peptid analysiert, und die Erfinder fanden daher heraus, daß das vom Menschen abgeleitete endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid aus der Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID Nr.: 3 angegeben ist, wobei die Seitenketten-Hydroxylgruppe des dritten Serins am Aminoende mit Fettsäure acyliert wurde. Der Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen des von der Ratte und vom Menschen abgeleiteten endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids offenbarte eine hohe Homologie von 89% als Ganzes.
Speziell ist das von der Ratte und das vom Menschen abgeleitete Peptid in einer Aminosäuresequenz der 1. bis 10. Aminosäure am Aminoende und in einer Aminosäuresequenz der 13. bis 28. Aminosäure am Aminoende identisch, unterscheidet sich aber in der 11. bis 12. Aminosäure, die Lysin und Alanin in dem Rattenpeptid sind, die durch Arginin beziehungsweise Valin in dem menschlichen Peptid ersetzt sind. Das von Ratten abgeleitete endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid wurde mit verschiedenen Proteasen gespalten, und seine gereinigten Peptidfragmente wurden hinsichtlich der Ca-freisetzenden Aktivität gemessen, und infolgedessen war ein Peptid, bestehend aus der 1. bis 7. Aminosäure am Aminoende, das minimale Peptid mit der Ca-freisetzenden Aktivität.
Durch Messung der Ca-freisetzenden Aktivität von chemisch synthetisierten Peptiden fanden die Erfinder heraus, daß die Kernsequenz, die zum Auslösen der Ca-freisetzenden Aktivität wesentlich ist, eine Sequenz ist, die aus 4 Aminosäuren, die in SEQ ID Nr.: 8 angegeben ist, besteht. Ferner war die Sequenz, bestehend aus 10 Aminosäuren, die in SEQ ID Nr.: 9 angegeben ist, in nicht-Ratten-endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptiden (jeweils bestehend aus 28 Aminosäuren), abgetrennt aus Mensch, Schwein und Rind, sowie in endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptiden (jeweils bestehend aus 27 Aminosäuren) konserviert, wobei ein Glutamin aus den obigen Peptiden deletiert wurde.
Das heißt, der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Fettsäure-modifiziertes Peptid gerichtet, umfassend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 8 angegeben ist, bevorzugt die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 angegeben ist, und stärker bevorzugt die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 9 angegeben ist, als die Kernsequenz, die zum Auslösen der Ca-freisetzenden Aktivität wesentlich ist.
Endogene GH-Sekretion-induzierende Peptide wurden ebenso aus Hühnern, Aal und Frosch isoliert, und es wurde festgestellt, daß diese Peptide eine aus 4 Aminosäuren bestehende Kernsequenz aufweisen, die in SEQ ID Nr.: 8 angegeben ist.
Außerdem wurde ein endogenes GH-Sekretion-induzierendes Peptid, das dem Ratten-endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptid sehr ähnlich ist, auch aus dem Frosch isoliert.
Ferner wurden endogene GH-Sekretion-induzierende Peptide auch aus Xenopus laevis, Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) und Hund isoliert. Aus der Regenbogenforelle wurden Ghrelin-23, das aus 23 Aminosäuren besteht, beziehungsweise Ghrelin-20, das aus 20 Aminosäuren besteht, isoliert.
Die carboxylterminale Aminosäure von Aal-Ghrelin, Regenbogenforelle-Ghrelin-23 und -Ghrelin-20 war amidiert.
Da ein Aminosäurerest an der dritten Position am Aminoende in dem endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptid aus Xenopus laevis Threonin ist, bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Fettsäure-modifiziertes Peptid, das als die Kernsequenz, die zum Zeigen der Ca-freisetzenden Aktivität wesentlich ist, ein Peptid enthält, in dem der dritte Aminosäurerest Serin durch Threonin in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 8 angegeben ist, bevorzugt in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 angegeben ist, und stärker bevorzugt in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 9 angegeben ist, ersetzt wurde.
Das endogene Fettsäure-modifizierte Peptid mit GH-Sekretion-induzierender Aktivität oder das Fettsäuremodifizierte Peptid, das aus der Kernsequenz besteht, die in der vorliegenden Erfindung offenbart wird, stellt ebenso eine Richtlinie zur Gestaltung einer Verbindung mit Ca-freisetzender Aktivität bereit.
Das heißt, in dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine neue Verbindung mit Ca-freisetzender Aktivität durch Synthetisieren eines Strukturanalogons des Fettsäure-modifizierten Peptids durch Bestätigen der Ca-freisetzenden Aktivität des resultierenden Strukturanalogons erhalten. Folglich umfaßt die vorliegende Erfindung ebenso ein Peptid oder Peptidanalogon, wie in den Ansprüchen definiert, mit der Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration, wobei eine bestimmte konstituierende Aminosäure durch eine modifizierte Aminosäure oder eine Nicht-Aminosäureverbindung ersetzt ist.
Eine cDNA, die das endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid kodiert, wurde auf übliche Art und Weise erhalten. Sowohl die cDNA der Ratte als auch des Menschen besteht aus 117 Aminosäuren, wie in den Aminosäuresequenzen in SEQ ID Nr.: 4 und 5 gezeigt, und die Aminosäuresequenzen von endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptiden von Ratte und Mensch waren in einer Sequenz von 28 Aminosäuren von der 24. bis 51. Position am Aminoende identisch. Das heißt, es wurde offenbart, daß das endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid als ein Präkursorpeptid, bestehend aus 117 Aminosäuren, synthetisiert wird, dann ein Signalpeptid, bestehend aus 23 aminoterminalen Aminosäuren, abgespalten wird und ferner 56 carboxylterminale Aminosäuren abgespalten werden, wodurch das Fettsäure-modifizierte Peptid mit GH-Sekretion-induzierender Aktivität gebildet wird. Außerdem wurde eine cDNA, die einen Präkursor des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids, bestehend aus 28 Aminosäuren, kodiert, auch im Schwein gefunden.
Ferner wurde eine cDNA, die einen Präkursor für das endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid, bestehend aus 27 Aminosäuren, kodiert, im Schwein gefunden.
Ferner wurde eine Teil-cDNA, die einen Präkursor für das endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid, bestehend aus 27 Aminosäuren, kodiert, im Rind gefunden.
Ferner wurde eine cDNA, die einen Präkursor des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids kodiert, auch im Aal, Xenopus laevis und in der Regenbogenforelle gefunden. Aus der Regenbogenforelle wurden eine cDNA, die einen Präkursor von Ghrelin-23, bestehend aus 23 Aminosäuren, kodiert, beziehungsweise eine cDNA, die einen Präkursor von Ghrelin-20 mit 20 Aminosäuren kodiert, isoliert.
Folglich liegt der vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung eine Peptids als ein Ausgangsmaterial des Fettsäure-modifizierten Peptids oder Peptidanalogons mit Ca-freisetzender Aktivität, das die Verwendung einer cDNA, die einen Präkursor des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids kodiert, umfaßt.
Bei der Reinigung des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids (Ghrelin), bestehend aus 28 Aminosäuren, aus Rattenmagenextrakt, wurde ein Peptid, das als eine kleinere Fraktion gewonnen wurde, analysiert, und infolgedessen wurde ein Peptid, bestehend aus 27 Aminosäuren (Ghrelin-27), das ein Peptid von Ghrelin ist, von dem das 13. oder 14. Glutamin deletiert wurde, gefunden. Ghrelin-27 weist vollkommen dieselbe Ca-freisetzende Aktivität und GH-Sekretion-induzierende Aktivität wie die von Ghrelin, bestehend aus 28 Aminosäuren, auf, und Ghrelin-27 ist ein endogenes GH-Sekretion-induzierendes Peptid, und daher fällt Ghrelin-27 ebenso in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die Nukleotidesequenz, die das 13. und 14. Glutamin in Ghrelin kodiert, ist gca gca, die eine terminale Exonsequenz ist, die dem mRNA-Spleißen unterliegen soll, was die Möglichkeit zur Bildung einer cDNA, aus der eines der zwei Codone für Glutaminreste durch unterschiedliches Spleißen deletiert wurde, nahelegt. Tatsächlich wurde eine cDNA, die ein Präkursorpeptid von Ghrelin-27, bestehend aus 27 Aminosäuren, kodiert, beim Screenen von Ratten- und Menschen-cDNA-Bibliotheken gefunden.
Das heißt, es wurde offenbart, daß Ratten- und Menschen-Ghrelin-27-Peptid als ein Präkursorpeptid, bestehend aus 116 Aminosäuren, die in SEQ ID Nr.: 12 oder 13 angegeben ist, synthetisiert wird, dann ein Signalpeptid, bestehend aus 23 aminoterminalen Aminosäuren, abgespalten wird und außerdem 56 carboxylterminale Aminosäuren abgespalten werden, wodurch ein Fettsäure-modifiziertes Peptid, bestehend aus 27 Aminosäuren, mit GH-Sekretion-induzierender Aktivität (Ghrelin-27), gebildet wird.
Ferner wurde eine cDNA, die einen Präkursor von Ghrelin-27-Peptid kodiert, im Schwein und Rind gefunden, und die Gegenwart von Ghrelin-27 und seines Präkursors wurde in diesen Tieren bestätigt.
Das heißt, die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso Ghrelin-27-Peptid, wie in den Ansprüchen definiert, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 10, 11, 17 und 22 angegeben ist. Hierin beschrieben sind ein Ghrelin-27-Präkursorpeptid mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 12, 13, 19 und 23 angegeben ist, und eine cDNA, die das Präkursorpeptid kodiert, das eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID Nr.: 14, 15, 21 und 24 angegeben ist, umfaßt.
Das Fettsaüre-modifizierte Peptid mit Ca-freisetzender Aktivität und die peptidartige Verbindung, wie ein Peptidanalogon, mit Ca-freisetzender Aktivität, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, stellen ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln von Krankheiten, die einem Defekt oder einem Mangel von GH zuzuschreiben sind, bereit. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann verwendet werden, um jede Krankheit zu behandeln, gegen die die GH-Verabreichung wirksam ist, und verschiedene Nebenwirkungen, die durch die GH-Verabreichung hervorgerufen werden, können überwunden werden. Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung ebenso als Arzneimittel für Lebewesen, wie ein wachstumsförderndes Mittel für Tiere, verwendet werden.
Da die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung eine Appetit fördernde Wirkung bei Verabreichung in den Ventrikel und bei intravenöser Verabreichung aufweist, kann sie daher als ein Appetit förderndes Mittel zum Behandeln von Appetitverlust oder Sitophobie verwendet werden. Außerdem weist die vorliegende peptidartige Verbindung eine die Magenmotilität und Magensäuresekretion fördernde Wirkung auf, so daß sie auch als ein Mittel zum Behandeln von Magenfunktionskrankheiten, wie Nicht-Geschwür-Indigestion, plötzlicher leichter Magenatonie, Funktionsindigestion und Refluxösophagitis verwendet werden kann. Ferner zeigt die vorliegende peptidartige Verbindung bei intravenöse Verabreichung eine das Zellwachstum fördernde Wirkung im Knochenmark, im Zwölffingerdarm und im Leerdarm, so daß sie als ein Mittel zum Schutz der Schleimhaut im Darmtrakt, ein Mittel zur Verhütung einer Schädigung der Schleimhaut im Dünndarm während intravenöser Ernährung und ein Mittel zur Behandlung von Osteoporose verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso einen Antikörper, wie in den Ansprüchen definiert, hergestellt durch die Verwendung des Fettsäure-modifizierten Peptids mit Ca-freisetzender Aktivität, offenbart in der vorliegenden Erfindung als ein Antigen, ein Verfahren zum Messen des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids unter Verwendung des Antikörpers und einen Meßkit, der den Antikörper umfaßt.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Assay-Verfahren zum Trennen und Quantifizieren von Ghrelin, modifiziert mit einer Fettsäure, und Ghrelin, aus dem die Fettsäure entfernt wurde, umfassend die Verwendung zweier Antikörper, gebildet gegen N- und carboxylterminale Peptide von Ghrelin, wobei ersterer Antikörper Fettsäure-modifiziertes drittes Serin erkennen kann, sowie einen Assay-Kit, umfassend eine Kombination des Antikörpers gegen N- und carboxylterminale Peptide von Ghrelin.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein neues Peptidhormon mit einer neuen modifizierten Aminosäure, d. h. acyliertes Serin, bereit, und stellt ebenso eine Richtlinie für die neue Gestaltung einer Verbindung mit Ca-freisetzender Aktivität mit der Struktur des Peptids als ein Grundskelett bereit.
Ferner wird angenommen, daß die Aufklärung des Mechanismus der Induktion einer GH-Sekretion durch das Fettsäure-modifizierte Peptid, das in der vorliegenden Erfindung offenbart wird, oder durch den GH-Freisetzungsfaktor und Somatostatin sich nicht nur auf den Mechanismus der Induktion von GH-Sekretion, sondern ebenso auf den Mechanismus der Regulierung der Sekretion von anderen Hormonen erstreckt. Die vorliegende Erfindung offenbart verschiedene Funktionen des Fettsäure-modifizierten Peptids als einen Regulationsfaktor in dem Kreislaufsystem und dem Stoffwechselsystem, und die Wirkung der vorliegenden Erfindung erstreckt sich auf die Aufklärung eines neuen biologischen Regulationsmechanismus.
Speziell bezieht sich die vorliegende Erfindung auf:

(1) Eine peptidartige Verbindung, (a) in der der zweite oder dritte Aminosäurerest am Aminoende eine modifizierte Aminosäure ist, in der eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, die 1 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, am α-Kohlenstoffatom der Aminosäure über eine Ester-, Ether-, Thioether-, Thioester-, Amid-, Carbamid-, Thiocarbamid- oder Disulfidbindung und entweder über oder nicht über eine Alkylengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen eingeführt ist, oder bei der eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, am α-Kohlenstoffatom der Aminosäure eingeführt ist, wobei H an das α-Kohlenstoffatom der modifizierten Aminosäure gebunden ist, (b) die eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuresequenzen, wie in SEQ ID Nr.: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 angegeben, oder eine Aminosäuresequenz, bei der mindestens eine Aminosäure deletiert, ersetzt und/oder zugefügt sein kann, wobei die zweite oder dritte Aminosäure am Aminoende durch die modifizierte Aminosäure ersetzt ist, wobei die mindestens eine Aminosäure nicht deletiert, ersetzt und/oder zugefügt ist bei der ersten bis vierten Aminosäure am Aminoende in der Aminosäuresequenz außer, daß Aminosäure 2 oder 3 am Aminoende durch die modifizierte Aminosäure ersetzt ist, und (c) die eine Aktivität zur Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration hat als Ergebnis der Bindung an Wachstumshormon-Secretagogue-Rezeptor, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(2) eine peptidartige Verbindung, (a) in der der zweite oder dritte Aminosäurerest am Aminoende eine modifizierte Aminosäure ist, ausgewählt aus (i) Serin, Threonin, Tyrosin oder Oxyprolin, worin die Hydroxygruppe der Seitenkette in eine Gruppe umgewandelt ist, die dargestellt wird durch -OCO-Z₁, -OCS-Z₁ oder -O-Z₃, oder (ii) Cystein, wobei die Mercaptogruppe der Seitenkette in -SCO-Z₁, -SCS-Z₁, -S-Z₃ oder -S-S-Z₈ umgewandelt ist, oder (iii) Lysin oder Arginin, worin die Aminogruppe der Seitenkette umgewandelt ist in -NH-CO-Z₂, -NH-CS-Z₂, -N(Z₅)(Z₆), -NH-CO-NH-Z₇ oder -NH-CS-NH-Z₇, oder (iv) Histidin oder Tryptophan, worin die Iminogruppe der Seitenkette in eine Gruppe der folgenden Formel umgewandelt ist:
worin Z₁ Wasserstoff oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, Z₂, Z₄, Z₆, Z₇ und Z₈ gleich oder verschieden sind und H oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten, Z₃ eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, Z₅ eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, (b) die eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID Nr.: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 angegeben sind, oder eine Aminosäuresequenz, worin mindestens eine Aminosäure deletiert, ersetzt und/oder zugefügt sein kann, wobei die zweite oder dritte Aminosäure am Aminoende ersetzt ist durch die modifizierte Aminosäure, wobei die mindestens eine Aminosäure nicht deletiert, ersetzt und/oder zugefügt ist bei der ersten bis vierten Aminosäure am Aminoende dieser Aminosäuresequenz, außer, daß die Aminosäure 2 oder 3 am Aminoende durch die modifizierte Aminosäure ersetzt ist, und (c) die eine Aktivität hat zur Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration als Ergebnis der Bindung an einen Wachstumshormon-Secretagogue-Rezeptor, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(3) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1) oder Punkt (2), wobei die modifizierte Aminosäure (i) Serin ist, dessen Seitenketten-Hydroxygruppe in eine Gruppe umgewandelt ist, die dargestellt wird als -OCO-Z₁, -OCS-Z₁ oder -O-Z₃, oder (ii) Cystein, dessen Seitenketten-Mercaptogruppe umgewandelt ist in -SCO-Z₁, -SCS-Z₁, -S-Z₃ oder -S-S-Z₈, wobei Z₁, Z₃ und Z₈ die gleiche Bedeutung haben, wie in Punkt (2) definiert.
(4) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1) oder Punkt (2), wobei die modifizierte Aminosäure Serin, Threonin, Tyrosin oder Oxyprolin ist, wobei die Seitenketten-Hydroxygruppe in eine Gruppe umgewandelt ist, dargestellt durch -OCO-Z₁, wobei Z₁ H oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(5) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1) oder Punkt (2), wobei die modifizierte Aminosäure ein Aminosäurerest ist, bei dem eine Fettsäure an die Seitenketten-Hydroxygruppe über eine Esterbindung gebunden ist oder an die Seitenketten-Mercaptogruppe über eine Thioesterbindung, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(6) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (5), wobei die Fettsäure 2 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(7) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (6), wobei die Fettsäure ausgewählt ist aus Fettsäuren mit 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(8) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (7), wobei die Fettsäure ausgewählt ist aus Octansäure, einer Monoenfettsäure davon und einer Polyenfettsäure davon, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(9) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (7), wobei die Fettsäure ausgewählt ist aus Decansäure, einer Monoenfettsäure davon und einer Polyenfettsäure davon, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(10) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1), die eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuresequenzen, wie in SEQ ID Nr.: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 angegeben, worin die Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin oder Threonin an der dritten Position am Aminoende in der Aminosäuresequenz mit einer Acylgruppe acyliert ist, die 2 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(11) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1), die eine Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr.: 1, 8 oder 9 angegeben, oder eine Aminosäuresequenz, in der das Serin an der dritten Position am Aminoende in der Aminosäuresequenz in Threonin umgewandelt ist, wobei die Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin oder Threonin an der dritten Position am Aminoende mit einer Acylgruppe acyliert ist, die 2 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(12) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1), die eine Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr.: 3 oder 11 angegeben, worin die Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin an der dritten Position am Aminoende mit Octanoyl acyliert ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(13) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1), die eine Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr.: 3 angegeben, worin die Seitenketten-Hydroxygruppe des Serins an der dritten Position am Aminoende mit n-Octanoyl acyliert ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(14) Eine peptidartige Verbindung gemäß Punkt (1), worin die Verbindung zusätzlich eine Aktivität hat, um die Sekretion von Wachstumshormon zu induzieren.
(15) Eine peptidartige Verbindung gemäß einem der Punkte (1) bis (14), die eine basische Aminosäure, gebunden an das Carboxyende enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(16) Eine peptidartige Verbindung gemäß einem der Punkte (1) bis (15), wobei das Aminoende mit einer gesättigten oder ungesättigten Alkyl- oder Acylgruppe, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome enthält, modifiziert ist, und/oder bei der die Hydroxygruppe in der Carboxylgruppe am Carboxyende OZ ist oder durch NR2R3 ersetzt ist, worin Z ein pharmazeutisch annehmbares Kation oder eine niedrige verzweigte oder lineare Alkylgruppe ist und R2 und R3 gleich oder verschieden sind und H oder eine niedrige verzweigte oder lineare Alkylgruppe bedeuten, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
(17) Ein Antikörper gegen eine peptidartige Verbindung, wie in den Punkten (1) bis (16) beschrieben, der spezifisch das aminoterminale Teilpeptid mit der modifizierten Aminosäure, wie in einem der Punkte (1) bis (16) definiert, erkennt, wobei das aminoterminale Teilpeptid ein aminoterminales Teilpeptid der peptidartigen Verbindung ist, wie in den Punkten (1) bis (16) beschrieben.
(18) Ein Verfahren zum Nachweis einer peptidartigen Verbindung, wie in den Punkten (1) bis (16) beschrieben, das umfaßt, daß ein Antikörper verwendet wird, wie in Punkt (17) beschrieben, um die peptidartige Verbindung, die in den Punkten (1) bis (16) beschrieben ist, nachzuweisen.
(19) Ein Kit zum Nachweis einer peptidartigen Verbindung, wie in den Punkten (1) bis (16) beschrieben, was die Verwendung des in Punkt (17) beschriebenen Antikörpers zum Nachweis der peptidartigen Verbindung, wie in den Punkten (1) bis (16) beschrieben, umfaßt.
(20) Ein Mittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, das/die eine peptidartige Verbindung, wie in einem der Punkte (1) bis (16) beschrieben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als aktiven Inhaltsstoff enthält.
(21) Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Punkt (20) zur Behandlung von Krankheiten, die einem Defekt oder einem Mangel von Wachstumshormon zuzuschreiben sind.
(22) Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Punkt (20) zur Behandlung von Herzkrankheiten.
(23) Ein Mittel gemäß Punkt (20), das ein Appetit förderndes Mittel ist.
(24) Ein Mittel gemäß Punkt (20), das ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Magenfunktionskrankheiten ist.
(25) Ein Mittel gemäß Punkt (20) zum Schutz der das Intestinum auskleidenden Schleimhaut oder zur Verhütung einer Schädigung der den Dünndarm auskleidenden Schleimhaut während intravenöser Ernährung.
(26) Ein Mittel gemäß Punkt (20), das ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Osteoporose ist.
(27) Ein Mittel gemäß Punkt (20), um die durch chronische Krankheiten verursachte Kachexie zu verringern.
(28) Ein Mittel gemäß Punkt (20), das ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Pulmonalinsuffizienz ist.
(29) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, Mittel oder therapeutisches Mittel nach einem der Punkte (20) bis (28) zur Anwendung für andere Wesen als Menschen.
(30) Ein Verfahren zur Herstellung einer peptidartigen Verbindung, wie in den Punkten (1) bis (16) beschrieben, das umfaßt, daß ein aktivierter Ester des aminoterminalen Peptids, der durch chemische Synthese erhalten wurde, an ein carboxyterminales Peptid gebunden wird, das durch genetische Rekombinationstechnologie erhalten wurde.
(31) Ein Verfahren zur Herstellung einer peptidartigen Verbindung, wie in einem der Punkte (5) bis (14) beschrieben, durch genetische Rekombinationstechnologie, das umfaßt, daß Zellen verwendet werden mit einer Serinacylierungsaktivität zur Bindung von Octansäure über eine Esterbindung an eine Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 8 angegeben ist.

In der vorliegenden Erfindung umfaßt die Aminosäure jede Aminosäure, wie L-Aminosäure, D-Aminosäure, α-Aminosäure, β-Aminosäure, γ-Aminosäure, natürliche Aminosäure und synthetische Aminosäure oder dergleichen.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich die modifizierte Aminosäure auf eine Aminosäure, bei der eine beliebige Gruppe davon chemisch modifiziert ist. Insbesondere ist eine modifizierte Aminosäure, die an dem α-Kohlenstoffatom in einer α-Aminosäure chemisch modifiziert ist, bevorzugt. Das heißt, wenn die α-Aminosäure durch die Formel (1) dargestellt ist:
können R' und R'' in der chemisch modifizierten Aminosäure H oder eine Gruppe sein, wie in den Ansprüchen definiert; kurz, die modifizierte Aminosäure kann eine chemisch modifizierte natürliche Aminosäure sein. Entweder ist R' oder R'' H.
Eine Aminosäure, bei der ein in der natürlichen Aminosäure vorliegender Substituent als durch R' und R'' dargestellter Substituent durch einen Substituenten, der nicht in der natürlichen Aminosäure oder in ihrer entsprechenden D-Aminosäure vorliegt, ersetzt ist, wird als die modifizierte Aminosäure bezeichnet.
Wenn die natürlich vorkommende Aminosäure z. B -OH, -SH, -NH oder -NH₂ als einen Substituenten in einer Seitenkette davon enthält, wird eine Gruppe, die durch Acylieren eines solchen Substituenten gebildet wurde, als ein bevorzugtes Beispiel des obengenannten Substituenten genannt.
Die Acylgruppe umfaßt daher z. B. Gruppen, die durch Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einer organischen Carbonsäure, organischen Sulfonsäure und organischen Phosphorsäure gebildet wurde.
Die organische Carbonsäure umfaßt z. B. Fettsäuren, und die Anzahl an Kohlenstoffatomen davon beträgt bevorzugt 2 bis 35, stärker bevorzugt 6 bis 18 und am stärksten bevorzugt 8 bis 16. Diese Fettsäuren umfassen z. B. Octansäure (bevorzugt Caprylsäure), Decansäure (bevorzugt Caprinsäure) und Dodecansäure (bevorzugt Laurinsäure), sowie Monoen- oder Polyenfettsäuren davon.
In der organischen Sulfonsäure oder organischen Phosphorsäure beträgt die Anzahl an Kohlenstoffatomen bevorzugt 2 bis 35.
Ferner kann die modifizierte Aminosäure eine Aminosäure sein, in der die Gruppe, dargestellt durch R' und/oder R'', beispielsweise ersetzt ist durch: -(CH₂)_n-P-Q (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, P -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -CS-S-, -S-CO-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO- oder -CO-NH-CO- ist, Q H oder C_1-35-, bevorzugt C_1-20-Alkyl ist). Ferner kann P -CO- sein.
Außerdem kann P -S-S- oder -NH-CS- sein. In jedem oben beschriebenen -NH- kann H durch eine gesättigte oder ungesättigte C_1-35-Alkylgruppe, eine C_6-20-Arylgruppe oder eine C_7-13-Aralkylgruppe ersetzt sein.
In dem Fall, wo die α-Aminosäure durch die obige Formel (1) dargestellt ist, ist die modifizierte Aminosäure, worin R' oder R'' durch die obige Gruppe -(CH₂)_n-P-Q ersetzt ist, eine bevorzugte Ausführungsform. Insbe sondere ist die modifizierte Aminosäure bevorzugt modifiziertes Serin, wobei ein Substituent, dargestellt durch die obige Formel -(CH₂)_n-P-Q, an den α-Kohlenstoff von Serin gebunden ist, wie in der Formel gezeigt:
worin n, P und Q dieselben Bedeutungen, wie oben definiert, aufweisen.
Die Bindungsweise, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ester, Ether, Thioester, Thioether, Amid und Carbamid, über oder nicht über eine Alkylgruppe, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome, wird ausführlicher beschrieben.
Wenn beispielsweise die Aminosäure Serin, Threonin, Tyrosin oder Oxyprolin ist, weist die Aminosäure eine Hydroxylgruppe in der Seitenkette auf. Wenn die Aminosäure Cystein ist, weist die Aminosäure eine Mercaptogruppe in der Seitenkette auf. Wenn die Aminosäure Lysin, Arginin, Histidin, Tryptophan, Prolin oder Oxyprolin ist, weist sie eine Aminogruppe oder Iminogruppe in der Seitenkette auf.
Die oben beschriebene Hydroxylgruppe, Mercaptogruppe, Aminogruppe und Iminogruppe können chemisch modifiziert sein. Das heißt, die Hydroxylgruppe oder Mercaptogruppe kann verethert, verestert, thioverethert oder thioverestert sein. Die Iminogruppe kann iminoverethert, iminothioverethert oder alkyliert sein. Die Aminogruppe kann amidiert, thioamidiert oder carbamidiert sein.
Ferner kann die Mercaptogruppe disulfidiert sein, die Iminogruppe kann amidiert oder thioamidiert sein, und die Aminogruppe kann alkyliert oder thiocarbamidiert sein.
Die so chemisch modifizierte Hydroxylgruppe oder Mercaptogruppe kann beispielsweise durch:
dargestellt werden.
Die amidierte oder thioamidierte Aminogruppe oder Iminogruppe kann durch:
dargestellt werden.
Die veretherte Hydroxylgruppe oder Mercaptogruppe kann durch:
dargestellt werden.
Die iminoveretherte oder iminothioveretherte Iminogruppe kann durch:
dargestellt werden.
Die alkylierte Aminogruppe kann durch:
dargestellt werden.
Die alkylierte Iminogruppe kann durch:
dargestellt werden.
Die carbamidierte oder thiocarbamidierte Iminogruppe kann durch:
dargestellt werden.
Die disulfidierte Mercaptogruppe kann durch: -S-S-Z₈ dargestellt werden.
Bei den obigen Formeln können Z₁, Z₂, Z₃, Z₄, Z₅, Z₆, Z₇ und Z₈ irgendwelche Substituenten für die chemische Modifikation sein, insofern sie sich nicht gegen den Sinn der vorliegenden Erfindung richten, da aber Substituenten, die herkömmlicherweise auf einem pharmazeutischen Gebiet oder zur chemischen Modifikation von Peptiden verwendet werden, in der Patentliteratur oder wissenschaftlichen Literatur bekannt sind, können diese bekannten Substituenten zur Modifikation verwendet werden, und gemäß diesen bekannten Verfahren kann die chemische Modifikation in der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
In den obigen Formeln kann Z₁ ein Wasserstoffatom oder eine lineare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe sein, und diese Alkylgruppe kann gesättigt oder ungesättigt sein. Die Anzahl an Kohlenstoffatomen davon beträgt normalerweise C_1-50, bevorzugt C_6-20.
Z₂, Z₃, Z₄, Z₅, Z₆, Z₇ oder Z₈ kann ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe sein, und diese Alkylgruppe kann gesättigt oder ungesättigt sein. Die Anzahl an Kohlenstoffatomen davon beträgt normalerweise C_1-10, bevorzugt C_1-6.
Die Alkylgruppen, dargestellt durch Z₁, Z₂, Z₃, Z₄, Z₅, Z₆, Z₇ oder Z₈, können mit Substituenten substituiert sein, wie einer Hydroxylgruppe, einer Aminogruppe, einem Halogen, einer Nitrogruppe und einer C_1-3-Alkoxygruppe, die herkömmlich zur chemischen Modifikation von Peptiden verwendet werden.
Wenn oben Z₁-CO- ein Rest der Fettsäure Z₁-COOH ist, ist dies ein Beispiel der Aminosäure, an die die Fettsäure gebunden ist. Die Fettsäure umfaßt in diesem Fall z. B. eine gesättigte Fettsäure wie Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Buttersäure, Hexansäure, Undecylsäure, Palmitinsäure, Decansäure, Nonadecansäure, Behensäure, Montansäure und Dotriacontansäure, und eine ungesättigte Fettsäure wie Acrylsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure und eine Stearolsäure („aatearolic acid"). Die ungesättigte Fettsäure kann ein Monoen oder Polyen sein.
Ferner kann die modifizierte Aminosäure ebenso eine α-Aminosäure sein, gebildet durch Ersetzen einer Gruppe (ausschließlich einer Carboxylgruppe und einer Aminogruppe, die eine Peptidbindung bilden), die an das α-Kohlenstoffatom der α-Aminosäure gebunden ist, durch ein Wasserstoffatom oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe.
In der vorliegenden Erfindung kann die modifizierte Aminosäure ebenso eine Aminosäure sein, die durch Einführen einer gesättigten oder ungesättigten C_1-6-Alkylgruppe in die Aminogruppe der Aminosäure gebildet wird.
Die nicht-natürliche Aminosäure in der vorliegenden Erfindung ist eine, die eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe in beiden Enden des Moleküls aufweist, und umfaßt z. B. NH₂-(CH₂)₃CH(CH₂OH)-COOH, NH₂-(CH₂)₄-COOH, NH₂-C(CH₃)₂-(CH₂)₃-COOH und NH₂-CH(CH₃)-(CH₂)₂-CH(CH₃)-COOH. Die Länge ihrer Molekülkette entspricht der Länge eines Dipeptids, aber die nicht-natürliche Aminosäure in der vorliegenden Erfindung umfaßt ebenso jene mit der Länge eines Peptids.
Ferner umfaßt die Nicht-Aminosäureverbindung in der vorliegenden Erfindung z. B. NH₂-CH(CH₂OH)-CH₃, CH₃-CH(R)-COOH, CH₃-CH(R)-CH₃, wobei die Länge ihres Moleküls der Länge eines Peptids entspricht, oder NH₂-(CH₂)₃CH(CH₂OH)-CH₃ und NH₂-(CH₂)₃CH(R)-CH₃, wobei die Länge ihres Moleküls der Länge eines Dipeptids entspricht.
Hier stellt R einen Substituenten an einer Seitenkette der natürlichen Aminosäure oder an dem α-Kohlenstoff in der zuvor genannten modifizierten Aminosäure dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Reinigung von Ghrelin aus Rattenmagenextrakt, und die Veränderung der Fluoreszenzintensität durch eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration in CHO-GHSR62-Zellen wird durch den schwarzen Balken gezeigt. 1a zeigt ein Profil in einer Gelfiltration mit Sephadex G-50 (fein) einer SP-III-Fraktion, hergestellt aus 40 g Rattenmagen, um zu zeigen, daß das Molekulargewicht der aktiven Fraktionen etwa 3.000 Dalton beträgt. 1b ist eine graphische Darstellung, die ein Profil in sekundärer CM-Ionenaustausch-HPLC zeigt, und die aktiven Fraktionen, eluiert bei Retentionszeiten von 55 bis 56 Minuten, wurden weiter durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
2 zeigt, daß die Modifikation von Ghrelin mit n-Octanoyl identifiziert wurde. 2a zeigt das Ergebnis der Analyse von jeweils 2 μg natürlichem Ghrelin (oben) und synthetischem Ghrelin und synthetischem de-acyliertem Ghrelin (unten) durch Umkehrphasen-HPLC. 2b ist eine graphische Darstellung, die Veränderungen der intrazellulären Calciumionenkonzentration in CHO-GHSR62-Zellen durch natürliches Ghrelin (durchgehende Linie), synthetisches Ghrelin (gering unterbrochene Linie) und synthetisches de-acyliertes Ghrelin (stark durchgehende Linie) zeigt.
3 ist eine graphische Darstellung, die die spezifische Interaktion von Ghrelin mit CHO-GHSR62-Zellen zeigt, und Ghrelin wurde an der mit einem Pfeil gekennzeichneten Stelle zugefügt. 3a ist eine graphische Darstellung, die die Veränderungen der intrazellulären Calciumionenkonzentration in CHO-GHSR62-Zellen durch Ghrelin, GHRP-6 beziehungsweise GRF (GHRH) zeit. Fig. b ist eine graphische Darstellung, die die Veränderungen in der intrazellularen Calciumionenkonzentration in CHO-GHSR62-Zellen durch Ghrelin in Gegenwart (O) oder Abwesenheit
von [D-Lys-31-GRP-6 zeigt, und eine Veränderung der intrazellulären Calciumionenkonzentration durch GRF (GHRH) (schwarzes Dreieck) wird ebenso gezeigt.
4 zeigt die Aminosäuresequenzen von Ratten- und Menschen-abgeleiteten Ghrelin-Präkursoren sowie das Analyseergebnis der Expression dieser Präkursoren in verschiedenen Geweben. 4a zeigt den Vergleich zwischen der Aminosäuresequenzen von Ratten- und Menschen-abgeleiteten Ghrelin-Präkursoren, wobei dieselbe Aminosäure schattiert ist, ein Signalpeptid durch die unterbrochene Linie gezeigt ist, eine Spaltungsstelle des Signalpeptids durch das gefärbte Dreieck gezeigt ist, eine Spaltungsstelle an der Seite des Carboxylendes durch das Dreieck gezeigt, eine gereifte Ghrelinkomponente eingerahmt ist und eine Modifikation mit n-Octansäure durch * angegeben ist. 4b zeigt das Analyseergebnis der Expression von Ghrelin in einer breiten Vielzahl von Rattengeweben durch Northern-Blut.
5 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Ghrelin in vitro und in vivo auf die Sekretion von Hypophysenhormonen zeigt. 5a ist eine graphische Darstellung, die eine Veränderung der Fluoreszenzin tensität durch eine Änderung der intrazellulären Calciumionenkonzentration in Rattenhypophysen-kultivierten Zellen in einem frühen Stadium zeigt, wobei die Veränderung bei der Zugabe von Ghrelin durch die durchgehende Linie und die Veränderung bei der Zugabe von de-acyliertem Ghrelin durch die unterbrochene Linie angegeben ist. 5b ist eine graphische Darstellung, die die Sekretion von Hypophysenhormonen zeigt, wobei der schwarze Balken und der weiße Balken die Konzentrationen von Hypophysenhormongehalten in Gegenwart beziehungsweise Abwesenheit von Ghrelin zeigen. 5c ist eine graphische Darstellung, die den Zeitverlauf der Hypophysenhormonkonzentration in Plasma zeigt, nachdem Ghrelin intravenös in männliche Ratten injiziert wurde. In 5b und 5c ist GH das Wachstumshormon, ACTH Adrenocorticotropin, FSH follikelstimulierendes Hormon, LH Luteinisierungshormon, PRL Prolactin und TSH Thyreotropin.
6 zeigt die Förderung des Appetits bei Verabreichung von Ghrelin in den Ventrikel, wobei die Menge an Nahrung (Mittel ± Standardfehler) für 2 Stunden nach der Verabreichung von Ghrelin gezeigt ist. 6a zeigt, daß der Fehlerbereich für die Wirkung von Ghrelin weniger als 0,0001 beträgt.
7 zeigt die Wirkung eines Arzneimittels, das an Ratten unter Urethananästhesie bei der Sekretion von Magensäure verabreicht wird, wobei A und B die Ergebnisse der Verabreichung von Ratten-Ghrelin (rGhrelin) beziehungsweise Histamin zeigen. Jedes Symbol gibt einen Durchschnittswert von 4 Ratten an, und der Standardfehler ist durch einen Fehlerbalken gezeigt. Als Kontrolle wurde physiologische Kochsalzlösung verabreicht. An dem mit Pfeil gekennzeichneten Punkt wurde das Arzneimittel verabreicht.
8 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Ratten-Ghrelin auf die Magenmotilität bei Ratten unter Urethananästhesie zeigt. 8A zeigt typische Wellen der Magenmotilität bei der Verabreichung von physiologischer Kochsalzlösung und Ratten-Ghrelin (rGhrelin), und Fig. B ist eine graphische Darstellung, die einen Durchschnittswert von 4 Ratten zusammen mit dem Standardfehler zeigt. An dem mit Pfeil gekennzeichnet Punkt wurde das Arzneimittel verabreicht.
9 ist eine graphische Darstellung, die eine Standardkurve in Radioimmunoassays und die Kreuzreaktivität mit einem Antikörper zeigt. 9a ist eine graphische Darstellung, die die Bindungsinhibierung durch verschiedene Ghreline von ¹²⁵I-markiertem Ratten-Ghrelin an einen Antikörper gegen ein aminoterminales Ghrelinfragment zeigt, und 9b ist eine graphische Darstellung, die die Bindungsinhibierung durch verschiedene Ghreline von ¹²⁵I-markiertem Ratten-Ghrelin an einen Antikörper gegen ein carboxylterminales Ghrelinfragment zeigt. Die Menge an verschiedenen Ghrelinen/Reaktionsröhrchen ist auf der Abszisse gezeigt, während das Verhältnis (%) der Menge (B) von Ratten-Ghrelin, gebunden in Gegenwart von verschiedenen Ghrelinen, zu der Menge davon (B₀) in Abwesenheit von verschiedenen Ghrelinen auf der Ordinate gezeigt ist. Die Symbole in den graphischen Darstellungen sind wie folgt: Ratten-Ghrelin (O); Menschen-Ghrelin
Ratten-Ghrelin-27 (☐); [Ser3(decanoyl)]-Ratten-Ghrelin (♢); [Ser3(hexanoyl)]-Ratten-Ghrelin (Δ) und de-Fettsäure-Ratten-Ghrelin
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Bei einem Peptid, das als ein endogener Ligand für GHS-Rezeptor (GHS-R) dient, kann die Verteilung des endogenen Liganden in Organen oder Geweben durch Zufügen eines Extrakts von verschiedenen Organen oder Geweben zu Zellen, die FHS-R exprimieren, und Messen der intrazellulären Calciumionenkonzentration, bekannt sein.
Die Zellen, die GHS-R exprimieren, umfassen vom Hypothalamus und der Hypophyse abgeleitete Stämme, die dafür bekannt sind, GHS-R konstant zu exprimieren, und deren Gewebe, aber die Zellen sind bevorzugt jene transformierte Zellen, die das GHS-R-Gen, das in geeignete Zellen wie CHO-Zellen eingeführt wird, aufweisen und das Gen exprimieren.
Die starke Ca-freisetzende Aktivität des endogenen GHS-Peptids der vorliegenden Erfindung wurde nicht im Hypothalamus und der Hypophyse, die das Peptid exprimieren, sondern in einem Extrakt aus dem Magen als ein Organ im Verdauungsorgansystem gefunden. Es ist daher notwendig, nicht nur Gewebe und Organe, die den Rezeptor exprimieren, sondern auch eine breite Vielzahl anderer Gewebe und Organe zu untersuchen, um den gewünschten endogenen Liganden für den Orphanrezeptor zu finden.
Die intrazelluläre Calciumionenkonzentration kann durch jedes in der Technik bekannte Verfahren gemessen werden, bevorzugt mittels FLIPR (Fluorometrischer Bildplattenleser, Molecular Devices Co., Ltd.) unter Verwendung der Veränderung der Fluoreszenzintensität von Fluo-4 AM (Molecular Probe Co., Ltd.), die durch eine Veränderung der Konzentration an Calciumionen hervorgerufen wurde.
Um das gewünschte endogene GHS-Peptid aus Geweben und Organen zu erhalten, von dem bestätigt wurde, daß es die Ca-freisetzende Aktivität zeigt, kann jedes in der Technik bekannte Reinigungsverfahren verwendet werden.
Gelfiltrations-, Ionenaustausch- und Umkehrphasen-Chromatographietechniken werden einzeln oder in Kombination nach einer breiten Vielzahl von Fraktionierungsverfahren effektiv als Verfahren zum Reinigen des Peptids verwendet, oder diese werden separat verwendet, aber es ist möglich, nicht nur diese Chromatographietechniken, sondern auch jegliche Mittel zu verwenden, die zur Reinigung des Peptids wirksam sind.
Zur Isolation und Reinigung des Peptids aus Geweben und Organen ist die Inaktivierung von Proteasen in den Geweben und Organen durch deren Wärmebehandlung in kochendem Wasser gewünscht, um den Abbau des gewünschten Peptids durch die Wirkung der Proteasen zu verhindern. Die Wärmebehandlung und Entfernung der Gewebe und Organe unter Kühlung auf Eis sind für die Extraktion und Reinigung des gewünschten Peptids ebenso wirksam.
Um zu bestätigen, daß das gereinigte Peptid mit der Ca-freisetzenden Aktivität eine GH-Sekretion-induzierende Aktivität in vitro und in vivo aufweist, kann ein bekanntes Verfahren genutzt werden.
Beispielsweise kann GH, das in ein Medium einer Hypophysenzellkultur, die nachgewiesenermaßen GH sekretiert und GHS-R exprimiert, sekretiert wird, in vitro in Radioimmunoassays durch Hinzufügen von Anti-GH-Antikörper zu den Zellen gemessen werden. Unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein anderes Hormon anstelle des Anti-GH-Antikörpers in Radioimmunoassays kann die Menge des sekretierten Hormons ebenso gemessen werden.
Ferner kann die GH-Sekretion-induzierende Aktivität in vivo durch Injizieren des Peptids mit der Ca-freisetzenden Aktivität in eine periphere Vene eines Wesens und darin Messen der Konzentration von GH in dem Serum bestätigt werden.
Zum Analysieren der Struktur des gereinigten Peptids kann ein bekanntes Verfahren verwendet werden.
Zur Bestimmung der Aminosäuresequenz des Peptids gibt es ein Verfahren, bei dem Aminosäurereste nacheinander von dem Carboxylende durch Edman-Abbau freigesetzt werden, gefolgt von der Identifikation der freigesetzten Aminosäuren durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) sowie eine automatisierte Version davon durch einen Aminosäuresequenzer.
Es gibt ebenso ein Verfahren zum Bestimmen der Aminosäuresequenz durch Messen der Molekulargewichte ionisierter Fragmenten davon durch GC-MASS.
Bei dem Peptid, das in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung modifizierte Aminosäuren enthält, wird die modifizierte Aminosäure als „unbekannte Aminosäure" bei der Bestimmung der Aminosäuresequenz identifiziert.
In diesem Fall wird das modifizierte Peptid zu Aminosäureeinheiten zersetzt, aus denen die modifizierte Aminosäure getrennt und gereinigt wird, und die Struktur der modifizierten Aminosäure wird in einer üblichen Weise zum Bestimmen der Struktur der Verbindung bestimmt, wobei die gesamte Struktur des Peptids bekannt sein kann. Alternativ gibt es ein Verfahren, bei dem das Peptid aus einer cDNA, die das modifizierte Peptid kodiert, erhalten wird, dann ein Peptid mit der Aminosäuresequenz des resultierenden Peptids chemisch synthetisiert wird, und das Molekulargewicht und die physikalischen Eigenschaften des synthetischen unmodifizierten Peptids mit denen des modifizierten Peptids verglichen werden, um die Struktur der modifizierten Gruppe zu bestimmen.
Eine Teilaminosäuresequenz (Kernsequenz), die in dem so strukturell bestimmten Peptid für die Ca-freisetzende Aktivität wesentlich ist, wird durch Messen der Ca-freisetzenden Aktivität von jedem Peptidfragment, das durch Spalten des Peptids mit einer Protease gebildet wird, offenbart.
Die verwendete Protease sollte eine Protease sein, die für die Aminosäuresequenz des zu spaltenden Peptids hochspezifisch ist, aber eine geringspezifische Protease kann ebenso unter Bedingungen für die partielle Verdauung verwendet werden, um verschiedene Peptidfragmente aus dem Peptid zu erzeugen.
Durch Messen der Ca-freisetzenden Aktivität von jedem so hergestellten Peptidfragment kann eine Kernsequenz, die für die Ca-freisetzende Aktivität wichtig ist, bekannt werden.
In dem endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptid wurde das dritte Serin am Aminoende mit einer Fettsäure acyliert, und es ist ebenso möglich, ein Peptidfragment mit einem Teil der Aminosäuresequenz des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids sowie ein Fettsäure-modifiziertes Peptid, umfassend eine Fettsäure, die durch eine Esterbindung an die Serinseitenkette in dem Peptidfragment gebunden ist, chemisch zu synthetisieren.
Unter Verwendung des Peptidfragments kann das endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid ausführlich analysiert werden. Gleichzeitig kann der Typ von Fettsäure, der für die Ca-freisetzende Aktivität notwendig ist, durch Vergleichen der Peptidfragmente, die mit verschiedenen Fettsäuren modifiziert sind, bestimmt werden.
Beispielsweise ist in dem endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptid, abgeleitet von einigen Spezies von Xenopus Laevis, ein Aminosäurerest an der dritten Stelle am Aminoende nicht Serin, sondern Threonin, und dieses Threonin wurde mit einer Fettsäure acyliert, und diese peptidartige Verbindung kann ebenso synthetisiert werden, und die Verbindung kann ausführlich analysiert werden.
Durch Vergleichen der Aminosäuresequenzen von diesen Peptiden mit einer GH-Sekretion-induzierenden Aktivität bei Wirbeltieren kann eine Region, die weitgehend in Wirbeltieren konserviert ist, gefunden werden, und aus der Aminosäuresequenz der Region kann eine Kernsequenz, die für die GH-Sekretion-induzierende Aktivität wichtig ist, gefunden werden.
Eine DNA mit einer Nukleotidsequenz, abgeleitet von der Aminosäuresequenz des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids, wird chemisch synthetisiert, und diese DNA wird als eine Sonde zum Screenen einer cDNA-Bibliothek, hergestellt aus mRNA in Zellen, die das Peptid exprimieren, verwendet, wodurch eine cDNA, die das Peptid kodiert, erhalten werden kann.
Jedoch wird ein Codon, das einer Aminosäure entspricht, degeneriert, wodurch die Anzahl an Nukleotidsequenzen, abgeleitet von der Aminosäuresequenz des Peptids, erhöht wird, so daß das Screenen durch die Verwen dung einer bestimmten synthetischen DNA, bestehend aus verschiedenen Typen dieser Nukleotidsequenzen, als eine Sonde schwierig werden kann.
Wenn eine Sequenz gemäß der Aminosäuresequenz des Peptids in Aminosäuresequenzen vorliegt, die von der Nukleotidsequenz einer exprimierten Sequenzmarkierung (EST), offenbart in einer Sequenzdatenbank, abgeleitet ist, kann in diesem Fall eine DNA, bestehend aus einem Teil der Nukleotidsequenz der EST, synthetisiert und zum Screenen der obigen cDNA-Bibliothek verwendet werden.
Ferner kann eine genomische DNA in einer üblichen Weise aus der cDNA erhalten werden.
Aus der Nukleotidsequenz der so erhaltenen cDNA wird die Aminosäuresequenz eines Präkursorpolypeptids des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids offenbart.
Durch Analysieren der Aminosäuresequenz werden ein Signalpeptid, das endogene GH-Sekretion-induzierende Peptid, andere Peptidkomponenten und Spaltungsstellen von diesen Peptiden offenbart, wodurch der Mechanismus der Bildung des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids offenbart wird.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung, das heißt, eine Teilaminosäuresequenz des endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids, die Aminosäuresequenz eines Präkursorpolypeptids des Peptids und die Nukleotidsequenz einer DNA, die das Polypeptid kodiert, sind in der Offenbarung der internationalen Anmeldung WO 98/42840 offenbart, aber das darin offenbarte Peptid ist ein Peptid, bestehend aus 14 Aminosäuren, mit einer Motilin-artigen Aktivität, und es gibt darin keine Beschreibung über die Aktivität zum Erhöhen der Ca-Konzentration und die Aktivität zum Induzieren der GH-Sekretion, offenbart in der vorliegenden Erfindung.
Die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Peptid mit der Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration, die durch die Formel (2) nachstehend dargestellt ist, wobei mindestens eine Aminosäure durch eine modifizierte Aminosäure ersetzt ist; ein Peptidanalogon davon, wobei mindestens eine Aminosäure durch eine Nicht-Aminosäure ersetzt ist; und ein Peptidderivat davon, wobei das Aminoende und/oder Carboxylende modifiziert ist.
In der vorliegenden Erfindung werden das oben beschriebene Peptid, Peptidanalogon und Peptidderivat gemeinsam als die peptidartige Verbindung bezeichnet.
In der peptidartigen Verbindung kann eine Vielzahl von Aminosäuren durch modifizierte Aminosäuren und/oder Nicht-Aminosäuren ersetzt sein. In der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 angegeben ist, ist es in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, daß üblicherweise eine oder mehrere Aminosäuren der 1. bis 10. Aminosäure am Aminoende, bevorzugt die 1. bis 4. Aminosäure oder die 1. bis 5. Aminosäure am Aminoende durch modifizierte Aminosäuren und/oder Nicht-Aminosäuren ersetzt sind.
In der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 angegeben ist, kann/können eine oder mehrere Aminosäuren außerhalb der 1. bis 4. Aminosäure, bevorzugt der 1. bis 6. Aminosäure und stärker bevorzugt der 1. bis 10. Aminosäure am Aminoende zugefügt oder deletiert sein.
Die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt eine Peptidverbindung, die die Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration aufweist und die Sekretion von Wachstumshormon in vivo induziert, wobei mindestens eine Aminosäure durch eine modifizierte Aminosäure- und/oder eine Nicht-Aminosäureverbindung ersetzt ist.
Das heißt, die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung ist eine peptidartige Verbindung mit der Aktivität zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration und/oder der Wirkung zum Induzieren der Sekretion von Wachstumshormon in vivo, wobei eine Aminosäure in der Peptidkette durch eine modifizierte Aminosäure- und/oder eine Nicht-Aminosäureverbindung ersetzt ist.
Beispiele der Verbindung umfassen die Verbindungen, bei denen in dem Peptid, gezeigt in SEQ ID Nr.: 1, 2 oder 3, eine Hydroxylgruppe der Aminosäure Ser 3 acyliert ist, die Verbindungen, bei denen in dem Peptid, gezeigt in SEQ ID Nr.: 4 oder 5, eine Hydroxylgruppe der 25. Aminosäure Ser acyliert ist, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Andere Beispiele umfassen die Verbindungen, bei denen in dem Peptid, gezeigt in SEQ ID Nr.: 10, 11, 16 oder 17, eine Hydroxylgruppe der Aminosäure Ser 3 acyliert ist, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Noch weitere Beispiele umfassen die Verbindungen, bei denen in dem Peptid, gezeigt in SEQ ID Nr.: 22, 25, 26 oder 27, eine Hydroxylgruppe der Aminosäure Ser 3 acyliert ist, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Noch weitere Beispiele umfassen die Verbindungen, bei denen in dem Peptid, gezeigt in SEQ ID Nr.: 29 oder 30, eine Hydroxylgruppe der Aminosäure Ser 3 acyliert ist, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Noch weitere Beispiele umfassen die Verbindungen, bei denen in dem Peptid, gezeigt in SEQ ID Nr.: 28, eine Hydroxylgruppe der Aminosäure Thr 3 acyliert ist, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Die Acylgruppe, die in eine Hydroxylgruppe durch Acylierung in der vorliegenden Erfindung eingeführt wurde, ist eine Gruppe, die durch Entfernung einer Hydroxylgruppe aus z. B. einer organischen Carbonsäure, einer organischen Sulfonsäure oder einer organischen Phosphorsäure gebildet wurde.
Die organische Carbonsäure umfaßt z. B. Fettsäuren, und die Anzahl an Kohlenstoffatomen davon beträgt bevorzugt etwa 2 bis 35, stärker bevorzugt etwa 6 bis 18 und am stärksten bevorzugt etwa 8 bis 16. Solche Fettsäuren umfassen z. B. Octansäure (bevorzugt Caprylsäure), Decansäure (bevorzugt Caprinsäure) und Dodecansäure (bevorzugt Laurylsäure [sic: Laurinsäure]) sowie deren Monoen- oder Polyenfettsäuren.
In der organischen Sulfonsäure oder organischen Phosphorsäure beträgt die Anzahl von Kohlenstoffatomen bevorzugt etwa 2 bis 35.
Jegliche peptidartige Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon, einschließlich der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 angegeben ist, wobei eine Hydroxylgruppe vom dritten Ser acyliert ist, sind ebenso bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Das heißt, in dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung sind jegliche peptidartige Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon, einschließlich Fettsäure-modifizierte Peptide, bei denen eine Hydroxylgruppe des dritten Ser in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 8 angegeben ist, bevorzugt der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 angegeben ist, und stärker bevorzugt der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 9 angegeben ist, acyliert ist, ebenso bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Ferner sind jegliche Peptidverbindungen oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon, einschließlich Fettsäure-modifizierte Peptide, bei denen eine Hydroxylgruppe von Thr 3 in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 8 angegeben ist, bevorzugt der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 angegeben ist, und stärker bevorzugt einer Aminosäuresequenz, wobei in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 9 angegeben ist, der Aminosäurerest Serin an der dritten Stelle am Aminoende in Threonin umgewandelt ist, acyliert ist, ebenso bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Ferner ist hierin eine Verbindung oder pharmazeutisch annehmbare Salze, dargestellt durch die Formel (2): X-AA1-AA2-AA3-Y (2), offenbart, worin X eine Komponente ist, die einem Wasserstoffatom in einer Aminogruppe der aminterminalen Aminosäure entspricht, und H oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl- oder Acylgruppe darstellt, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome; Y eine Komponente ist, die einer Hydroxylgruppe in einer α-Carboxylgruppe der carboxylterminalen Aminosäure entspricht, und OH, OZ oder NR6R7 darstellt, woraufhin Z ein pharmazeutisch annehmbares Kation oder eine niedriger verzweigte oder lineare Alkylgruppe ist; und R6 und R7 dieselben oder verschieden sein können und H oder eine niedriger verzweigte oder lineare Alkylgruppe darstellen.
Hier stellt AA1:
dar, worin n 1 oder 2 ist, R₁ und R₁' dieselben oder verschieden sein können und Wasserstoff oder einen Substituenten darstellen, vorausgesetzt, daß, wenn n 2 ist, die zwei Substituenten R₁ dieselben oder verschieden sein können; dies trifft ebenso auf R₁' zu.
Beispiele des Substituenten umfassen (1) eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome, die in einer Bindungsweise, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ester, Ether, Thioester, Thioether, Amid und Carbamid, über oder nicht über eine Alkylkette, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome enthält, binden, (2) H oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome enthält, und (3) eine Seitenkette von natürlicher Aminosäure.
Ferner kann der Substituent eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette sein, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome enthält, die über eine Disulfid- oder Thiocarbamidbindung über oder nicht über eine Alkylkette, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome enthält, gebunden sind.
AA2 stellt:
dar, worin R₁ and R₁' dieselben Bedeutungen wie oben definiert aufweisen, und R₂ H oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe darstellt, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, oder AA2 -CH₂-CH(R₁)-CH₂- oder -CH₂-CH(R₁)-CO- darstellt, wobei R₁ dieselbe Bedeutung wie oben definiert aufweist.
AA3 stellt:
dar, worin m eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist, und R₁, R₁' und R₂ dieselben Bedeutungen wie oben definiert aufweisen, vorausgesetzt daß, wenn m eine ganze Zahl von 2 oder mehr ist, die zwei Substituenten R₁ dieselben oder verschieden sein können; dies trifft ebenso auf R₁' und R₂ zu.
Das gesättigte oder ungesättigte Alkyl, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome, welches durch X dargestellt ist, ist bevorzugt C_1-20-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, s-Butyl, t-Butyl, n-Heptyl, n-Hexyl, n-Decyl, Vinyl, Propanyl oder Hexenyl.
Das Acyl, dargstellt durch X, umfaßt C_1-10-Carbonsäureacyl, wie Formyl, Acetyl, Propionyl oder Benzoyl, oder C_7-13-Sulfonsäureacyl, wie Benzolsulfonylnaphthalinsulfonyl oder dergleichen.
Die Gruppe, dargestellt durch R₁ oder R₁', ist bevorzugt eine Gruppe, dargestellt durch z. B. Formel (2): -(CH₂)_n-P-Q (2),(worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, P -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -CS-S-, -S-CO-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO- oder -CO-NH-CO- ist, Q H oder C_1-20-Alkyl ist, dargstellt durch X, oben beschrieben.) Ferner kann P ebenso -CO- sein.
Außerdem kann P -S-S- oder -NH-CS- sein. In jedem oben beschriebenen -NH- kann H durch eine gesättigte oder ungesättigte C_1-35-Alkylgruppe, eine C_6-20-Arylgruppe oder eine C_7-13-Aralkylgruppe ersetzt werden.
Stärker bevorzugt ist P: -CO-O-, -CO-, -O-, -S-, -S-S-, -CO-S-, -CO-NH-, -NH-CO- oder -NH-CS-.
Die Gruppe, dargestellt durch R₁ oder R₁', kann eine Gruppe sein, bei der Q direkt, das heißt, nicht über P an -(CH₂)_n gebunden ist.
Es ist bevorzugt, daß die Niederalkylgruppe, dargestellt durch Z, R6 oder R7, C_1-6-Alkyl ist, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, s-Butyl, t-Butyl, i-Butyl, n-Pentyl oder n-Hexyl.
Hierin nachstehend sind bevorzugte Ausführungsformen der Peptidverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.

(1) Bevorzugte Ausführungsformen von AA1: (A) Aminosäuren oder Peptide, wie Ser, Gly-Ser oder -NH-(CH₂)₃CH(CH₂OH)CO-, wo eine Peptidbindungskomponente zwischen zwei Aminosäureresten -(CH₂)₂- ist, und (B) primäre Amine, beispielsweise -NH-(CH₂)₃CH(CH₂OH)CH₂-, wo eine Peptidbindungskomponente zwischen zwei Aminosäuren -(CH₂)₂- ist; -NH-(CH₂)₃CH(R₁)CH₂-, wo eine Peptidbindungskomponente zwischen zwei Aminosäuren -(CH₂)₂- ist, wobei R₁ dieselben Bedeutungen wie oben definiert aufweist; und -NH-CH(CH₂OH)CH₂.

Als (A) Aminosäuren oder Peptide können NH₂-(CH₂)₄-COOH, NH₂-C(CH₃)₂-(CH₂)₃-COOH und NH₂-CH(CH₃)-(CH₂)₂-CH(CH₃)-COOH ebenso veranschaulicht werden.

(2) Bevorzugte Ausführungsformen von AA2: (A) Aminosäuren, wie Ser, homoSer, Cys, homoCys, Asp, Glu, Lys, Ala, Val, Leu, homoLeu, Ile, homoIle, Ornithin, Aminoadipinsäure, Methionin, Ethionin, Butionin und S-Methylcystein, von denen Ser besonders bevorzugt ist, und (B) andere Strukturen als Aminosäurereste; beispiels weise können -CH₂-CH(R₁)-CO-, -CH₂-CH(R₁)-CH₂- usw. erwähnt werden, worin R₁ dieselbe Bedeutung wie oben definiert aufweist.

Insbesondere sind Aminosäuren (a) mit einer hydrophoben Seitenkette, wie Leucin, Valin, Norleucin, Homoleucin, Homoisoleucin, Naphthylalanin oder ihre Analoga, Tryptophan, Phenylalanin, Cyclohexylalanin usw. oder N-Methylaminosäuren davon bevorzugt. Ferner sind Aminosäuren (b) mit einer Seitenkette mit einer funktionellen Gruppe, die zur Modifikation mit einer Acylgruppe, einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe oder einer Aralkylgruppe befähigt ist, wie Serin, Homoserin, Threonin, Cystein, Homocystein, Aspartinsäure, Glutaminsäure, Adipinsäure, Lysin, Ornithin usw. und N-Methylaminosäuren davon bevorzugt.
Eine Acylgruppe, Alkylgruppe, Alkenylgruppe oder Aralkylgruppe usw. sind an Seitenketten der Aminosäuren (b) über eine Ester-, Amid-, Disulfid-, Ether-, Thioether-, Thioester-, Carbamid- oder Thiocarbamidbindung gebunden. Ferner kann eine Alkyl- oder Aralkylgruppe an den α-Kohlenstoff der Aminosäure gebunden sein.

(3) Bevorzugte Ausführungsformen von AA3: Aminosäuren oder Peptide, wie Phe oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz von dem 4. Phe bis 28. Arg am Aminoende in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 oder 3 angegeben ist, oder Peptide mit einer Aminosäuresequenz, wobei in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 oder 3 angegeben ist, nacheinander eine Aminosäure deletiert wird, ausgehend von der carboxylterminalen Aminosäure bis zu dem 5. Leu am Aminoende. Beispielsweise umfaßt AA3:

Selbstverständlich können die Aminosäuren, veranschaulicht als AA3, L-Aminosäuren oder D-Aminosäuren sein. Ferner können in den Aminosäuresequenzen, veranschaulicht als AA3, eine bis mehrere Aminosäuren (bevorzugt bis zu etwa 1/3 der Aminosäuresequenz) durch nicht-natürliche Aminosäureeinheiten oder Nicht-Aminosäureeinheiten ersetzt werden, beispielsweise: -NH-(CH₂)₃CH(CH₂OH)- -NH-(CH₂)₃CH(CH₂OH)CO- -NH-CH(CH₂OH)CH₂- -NH-(CH₂)₃CH(R₁)CH₂- -CH₂-CH(R₁)-CO- oder -CH₂-CH(R₁)-CH₂-, worin R₁ dieselben Bedeutungen wie oben definiert aufweist. Wenn AA3 eine Vielzahl von Gruppen, dargestellt durch die obigen Formeln, und eine Vielzahl von Gruppen, dargestellt durch R₁, enthält, sind diese Gruppen dieselben oder verschieden.
Ferner können jegliche Aminosäuren, veranschaulicht als AA3, Substituenten, die durch das oben beschriebene R₁ dargestellt sind, aufweisen. Wenn eine Vielzahl von R₁-Gruppen in einer durch AA3 dargestellten Gruppe vorliegt, können diese R₁-Gruppen dieselben oder verschieden sein.
Wenn Aminosäuren, die das Peptid bilden, eine Hydroxylgruppe, eine Mercaptogruppe, eine Iminogruppe oder eine Aminogruppe in deren Seitenketten aufweisen, sind bevorzugte Bespiele solcher Seitenketten nachstehend gezeigt. In den folgenden Beispielen ist R8 eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome enthält. Solch eine Alkylkette kann dieselben Bedeutungen aufweisen, wie für die durch X gezeigte oben beschriebene Alkylkette definiert.

A) Seitenkette von Ser; -CH₂-O-CO-R8 oder -CH₂-O-R8,
B) Seitenkette von homoSer; -CH₂-CH₂-O-CO-R8 oder -CH₂-CH₂-O-R8,
C) Seitenkette von Cys; -CH₂-S-CO-R8 oder -CH₂-S-R8,
D) Seitenkette von homoCys; -CH₂-CH₂-S-CO-R8 oder -CH₂-CH₂-S-R8,
E) Seitenkette von Asp; -CH₂-COO-R8 oder -CH₂-CO-NH-R8,
F) Seitenkette von Glu; -CH₂-CH₂-COO-R8 oder -CH₂-CH₂-CO-NH-R8
G) Seitenkette von Lys; -(CH₂)₄-NH-CO-R8,
H) Seitenkette von Aminoadipinsäure; -CH₂-CH₂-CH₂-COO-R8 oder CH₂-CH₂-CH₂-CO-NH-R8,
I) Seitenkette von Ornithin; -(CH₂)₃-NH-CO-R8.
J) Eine Alkylseitenkette in einer Aminosäure, wie Ala, Val, Leu, Homoleucin, Ile, Homoisoleucin, S-Methylcystein, Methionin, Ethionin oder Butionin, kann eine modifizierte Alkylgruppe sein, gezeigt in der Formel (2), wie oben beschrieben.

Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung als bevorzugte Ausführungsformen ein Mittel zum Erhöhen der intrazellulären Calciumionenkonzentration oder ein Mittel zum Induzieren der GH-Sekretion, wie in den Ansprachen definiert, das ein Teilpeptid umfaßt, bestehend aus Aminosäuren vom Aminoende bis zur 13., 14. oder 15. Aminosäure in der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder 3, wie in den Ansprachen definiert. In diesem Fall ist es nicht immer notwendig, daß die jeweiligen Aminosäureeinheiten, die das Teilpeptid bilden, chemisch modifiziert sind, außer für die zweite oder dritte Aminosäure am Aminoende.
Ferner ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die folgende peptidartige Verbindung.
Ein Ghrelinderivat bezieht sich auf eine peptidartige Verbindung, wobei die chemische Struktur von natürlichem Ghrelin teilweise modifiziert ist, und kurzkettiges Ghrelin bezieht sich auf ein Peptid, bestehend aus weniger als 27 oder 28 Aminosäuren, das von natürlichem Ghrelin mit 27 bis 28 Aminosäuren durch Deletion einiger der Aminosäuren abgeleitet ist. Ferner bezieht sich ein Aminosäurerest an der n-Position auf einen Aminosäurerest an der n-Position am Aminoende.
Die aminoterminale Aminosäure von Ghrelin oder seines kurzkettigen Ghrelinderivats kann jede Aminosäure sein (die aminoterminale Aminosäure von natürlichem Ghrelin ist Glycin), insofern die a-Aminogruppe der Aminosäure nicht geschützt ist, oder kann entweder D- oder L-Aminosäure sein, aber ist bevorzugt Alanin, Valin, Aminoisobutansäure oder Butansäure.
Der 2. Rest kann irgendeine Aminosäure sein (z. B. Serie in dem natürlichen Ghrelin), bevorzugt eine Aminosäure mit einer kleinen Seitenkette, wie Alanin, Serie, Histidin, Norvalin oder eine Nicht-Aminosäureverbindung.
Die 1. und 2. Reste können eine δ-Aminosäure sein, die zwei Aminosäuren entspricht, beispielsweise 5-Aminopentansäure, 5-Amino-5-dimethylpentansäure, 2,5-Diaminopentansäure usw., veranschaulicht in den Beispielen.
Die Aminosäurereste, ausgewählt an der 3. und 4. Stelle, können D- oder L-Aminosäuren, D- oder L-N-Methylaminosäuren oder eine Kombination aus diesen Aminosäuren sein. Insbesondere ist es bevorzugt, daß die Aminosäure an der 3. Stelle eine L-Aminosäure ist oder die Aminosäuren an der 3. und/oder 4. Stelle L-Aminosäuren sind.
Die sterische Konfiguration der Aminosäurereste, ausgewählt an der 3. und 4. Stelle, kann geeigneterweise in Abhängigkeit von der Sequenz von Aminosäuren an 1. und 2. Stelle ausgewählt sein. Das heißt, die Reste an der 3. und 4. Stelle sind bevorzugt L-Aminosäuren in dem Fall der Aminosäuresequenz Gly-Ser an der 1. und 2. Stelle in natürlichem Ghrelin, während sowohl die Reste an der 3. als auch an der 4. Stelle D-Aminosäuren in dem Fall einer anderen Aminosäuresequenz, wie Aib-His, sind. Wenn ferner die Reste an der 1. und 2. Stelle eine δ-Aminosäure (z. B. Aminopentansäure) mit einer Länge von 2 Aminosäuren sind, können die Reste an der 3. und 4. Stelle L- oder D-Aminosäuren sein.
Die Aminosäurereste, ausgewählt an der 3. und 4. Stelle, sind bevorzugt D- oder L-Aminosäuren, wie Leucin, Valin, Norleucin, Homoleucin, Homoisoleucin, Naphthylalanin und ihre Homologa, Tryptophan, Phenylalanin und Cyclohexylalanin oder D- oder L-N-Methylaminosäuren davon.
Die Aminosäurereste, ausgewählt an der 3. und 4. Stelle, sind von den oben beschriebenen hydrophoben Aminosäuren stärker bevorzugt aromatische hydrophobe Aminosäuren, wie Naphthylalanin und ihre Homologa, Tryptophan, Phenylalanin und Cyclohexylalanin.
Ferner sind die Aminosäurereste, ausgewählt an der 3. und 4. Stelle, bevorzugt basische Aminosäuren, wie Lysin, Arginin und Histidin. Insbesondere ist Lysin bevorzugt.
Das Ghrelin-Molekül sollte durch diese basischen Aminosäuren basisch sein, wodurch die Ca-freisetzende Aktivität weiter verbessert wird.
Die Aminosäurereste, ausgewählt an der 3. und 4. Stelle, sind bevorzugt die mit funktionellen Gruppen in deren Seitenketten, die mit einer Acylgruppe (Alkanylgruppe, Alkenonylgruppe oder Arylalkanylgruppe), einer Alkylgruppe oder einer Aralkylgruppe modifiziert sein können, und bevorzugte Beispiele von solchen Aminosäureresten umfassen Serin, Homoserin, Threonin, Cystein, Homocystein, Aspartinsäure, Glutaminsäure, Adipinsäure, Lysin, Ornithin usw.
Die Aminosäuren mit diesen reaktiven Seitenketten können entweder D- oder L-Aminosäuren oder deren entsprechende D- oder L-N-Methylaminosäuren sein, aber es ist besonders bevorzugt, daß der Rest der 3. Stelle eine L-Aminosäure ist oder die Reste der 3. und/oder 4. Stelle L-Aminosäuren sind.
Ferner können an Seitenketten dieser Aminosäuren eine Acylgruppe, wie eine Alkanylgruppe (deren Anzahl an Kohlenstoffatomen beträgt 2 bis 35, bevorzugt 6 bis 18, stärker bevorzugt 8 bis 12), eine Alkenonylgruppe (deren Anzahl an Kohlenstoffatomen beträgt 2 bis 35, bevorzugt 6 bis 18, stärker bevorzugt 8 bis 12), eine Arylalkanylgruppe (eine Benzoyl-, Phenacetyl-, Phenylbutyryl-, Naphthoyl-, Naphthylacetyl- oder Naphthylpropionylgruppe usw.), eine Alkylgruppe (deren Anzahl an Kohlenstoffatomen beträgt 2 bis 35, bevorzugt 6 bis 18, stärker bevorzugt 8 bis 12) oder eine Aralkylgruppe (eine Benzyl-, Phenetyl-, Phenylpropyl-, Phenylbutyl-, Phenylpentyl-, Naphthylmethylgruppe usw.) über eine Carbamat-, Thiocarbamat-, Ester-, Amid-, Disulfid-, Ether-, Thioether- oder Thioesterbindung gebunden sein. Ferner können die zuvor genannten Alkyl- und Aralkylgruppen nicht über die Bindung an die α-Kohlenstoffatome von Aminosäuren an der 3. und 4. Stelle gebunden sein.
Die Kombination von Aminosäureresten, ausgewählt an der 3. und 4. Stelle, ist bevorzugt eine Kombination einer Aminosäure mit einer hydrophoben Seitenkette als der Aminosäurerest der 3. Stelle und einer hydrophoben Aminosäure als der Aminosäurerest der 4. Stelle.
Der Aminosäurerest der 3. Stelle mit einer hydrophoben Seitenkette ist bevorzugt eine modifizierte Aminosäure, in dessen α-Kohlenstoff (a) eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome, über oder nicht über eine Alkylengruppe, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome, und über eine Ester-, Ether-, Thioether-, Amid- oder Disulfidbindung, eingeführt wurde, oder (b) eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome, eingeführt wurde. Insbesondere ist eine modifizierte Aminosäure, in dessen α-Kohlenstoff eine gesättigte Alkylkette, enthaltend ein oder mehrere Kohlenstoffatome, eingeführt wurde, stärker bevorzugt.
Die Carboxylgruppe der Aminosäure an der 4. Stelle kann ein Amid, ein Alkylamid (z. B. Methylamid oder Ethylamid) oder ein Aralkylamid (z. B. Benzylamid, Adamantanamid oder Adamantanalkylamid) sein.
Ferner kann eine basische Gruppe, wie eine Aminogruppe oder eine Guanididogruppe, an das Alkyl- oder Aralkylamid gebunden sein. Die basische Gruppe umfaßt z. B. -CONH-CH₂CH₂-NH₂, -CONH-CH₂NHCH₃, -CONH-CH₂CH₂CH₂-NH-C(NH₂)=NH und -CONHCH₂Ph-NH₂.
Eine basische Aminosäure, wie Arginin, Lysin und Histidin, kann zu der Carboxylgruppe der Aminosäure an der 4. Stelle zugefügt werden, und diese basische Aminosäure kann eine D- oder L-Aminosäure, ein Razemat oder eine D- oder L-N-Methylaminosäure sein.
Die Carboxylgruppe der Aminosäure kann ein Alkyl- oder Aralkylamid, wie oben beschrieben, sein. Ferner kann eine basische Gruppe, wie eine Aminogruppe oder eine Guanididogruppe, zu dem Alkyl- oder Aralkylamid zugefügt werden. Die basische Gruppe umfaßt die oben als Beispiele angegebenen Gruppen.
Als eine Aminosäuresequenz der Aminosäure an der 5. Stelle und anschließenden Aminosäuren kann eine Sequenz mit jeder Länge, bestehend aus Leucin an der 5. Stelle, und anschließenden Aminosäuren bis zur Aminosäure an der 28. Stelle in Menschen- oder Ratten-Ghrelin zu der Aminosäure an der 4. Stelle zugefügt werden.
Diese Aminosäuresequenzen sind bevorzugt Ghrelin(1-5), Ghrelin(1-6), Ghrelin(1-7), Ghrelin(1-8), Ghrelin(1-9), Ghrelin(1-10) und Ghrelin(1-11), wobei sich Ghrelin(m-n) auf ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz an der m- bis n-Stelle am Aminoende in Ghrelin bezieht. Insbesondere ist Ghrelin(1-5) bevorzugt.
Das Carboxylende davon ist bevorzugt ein Alkyl- oder Aralkylamid, wie oben beschrieben.
Ferner kann eine basische Gruppe, wie eine Aminogruppe oder eine Guanididogruppe, an das Alkyl- oder Aralkylamid gebunden sein. Die basische Gruppe umfaßt die oben als Beispiele angegebenen Gruppen.
Ferner kann eine basische Aminosäure, wie Arginin, Lysin und Histidin, zu der carboxylterminalen Aminosäure eines Ghrelinderivats mit deletiertem Carboxylende zugefügt werden, wobei eine Aminosäuresequenz mit jeder Länge, bestehend aus Aminosäuren von der Aminosäure an der 5. Stelle bis zu der Aminosäure an der 28. Stelle, zu dem Carboxylende von Ghrelin(1-4) zugefügt wurde.
Diese basische Aminosäure kann eine D- oder L-Aminosäure, ein Razemat oder eine D- oder L-N-Methylaminosäure sein.
Die Carboxylgruppe der basischen Aminosäure kann ein Alkyl- oder Aralkylamid, wie oben beschrieben, sein. Ferner kann eine basische Gruppe, wie eine Aminogruppe oder eine Guanididogruppe, an das Alkyl- oder Aralkylamid gebunden sein. Die basische Gruppe umfaßt die oben als Beispiele angegebenen Gruppen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die carboxylterminale Aminosäure von Ghrelin(1-5), Ghrelin(1-6) und Ghrelin(1-7) eine D- oder L-Aminosäure oder ihre entsprechende D- oder L-N-Methylaminosäure.
Ferner können basische Aminosäuren, wie Arginin, Lysin und Histidin, zu den Resten an der 5., 6. und 7. Stelle zugefügt werden, und diese basischen Aminosäuren können D- oder L-Aminosäuren, Razemate oder D- oder L-N-Methylaminosäuren sein.
Die Carboxylgruppe einer solchen basischen Aminosäure kann ein Alkyl- oder Aralkylamid, wie oben beschrieben, sein. Ferner kann eine basische Gruppe, wie eine Aminogruppe oder eine Guanididogruppe, an das Alkyl- oder Aralkylamid gebunden sein. Die basische Gruppe umfaßt die oben als Beispiele angegebenen Gruppen.
In einer bevorzugten Ausführungsform in der vorliegenden Erfindung kann die Peptidverbindung der vorliegenden Erfindung in dem Fall, wo das Carboxylende ein Alkyl- oder Aralkylamid ist, wie oben beschrieben, ein Amidderivat sein, wobei eine Aminogruppe ferner an die Alkyl- oder Aralkylgruppe gebunden ist. Speziell kann eine Peptidverbindung, bei der das Carboxylende z. B. Aminoethylamid ist, erwähnt werden.
Die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung, bei der das Carboxylende ein Amid oder ein Amidderivat ist, wie oben beschrieben, ist eine nützliche Verbindung aufgrund ihrer Beständigkeit gegen die Spaltung durch Enzyme wie Carboxypeptidasen in vivo.
Die N-Methylaminosäure umfassende peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung ist aufgrund ihrer Beständigkeit gegen Enzyme ebenso eine nützliche Verbindung.
Die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung kann in einer üblichen Weise erhalten werden. Beispielsweise kann sie aus einer natürlichen Quelle, wie oben erwähnt, isoliert oder durch rekombinante DNA-Technik und/oder chemische Synthese hergestellt werden. Ferner, wenn eine Modifikation (z. B. Acylierung) in den Aminosäureresten notwendig ist, kann die Peptidverbindung einer Modifikationsreaktion durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren unterzogen werden.
Speziell kann die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung durch Kultivieren von Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, welcher eine DNA beherbergt, die das Peptid der vorliegenden Erfindung kodiert, und dann Gewinnen des gewünschten Peptids aus der Kultur erhalten werden.
Mittels Selektion der Wirtszellen kann eine Verbindung mit dem gewünschten Peptid, das beispielsweise durch Acylierung modifiziert ist, in den Zellen erhalten werden. Wenn das Peptid nicht modifiziert ist, kann eine Modifikationsreaktion, wie Acylierung, wenn notwendig, durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren durchgeführt werden. Für die Acylierungsreaktion können auch Enzyme wie Lipase verwendet werden.
Der Vektor, in den das Gen integriert werden soll, umfaßt z. B. E. coli-Vektoren (pBR322, pUC18, pUC19 usw.), Bacillus subtilis-Vektoren (pUB110, pTP5, pC194 usw.), Hefevektoren (YEp-Typ, YRp-Typ, YIp-Typ) oder Tierzelivektoren (Retrovirus, Vacciniavirus usw.), aber auch alle anderen Vektoren, die das gewünschte Gen in Wirtszellen stabil halten können, können verwendet werden. Der Vektor wird in geeignete Wirtszellen eingeführt. Zum Integrieren des gewünschten Gens in ein Plasmid und Einführen des Plasmids in Wirtszellen können Verfahren, die in Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989) beschrieben sind, verwendet werden.
Um das gewünschte Peptidgen in dem obigen Plasmid zu exprimieren, wird ein Promotor stromaufwärts des Gens funktionsfähig gekoppelt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Promotor kann jeder geeignete Promotor sein, der mit Wirtszellen, die für die Expression des gewünschten Gens verwendet werden, kompatibel ist. Beispielsweise können der lac-Promotor, der trp-Promotor, der lpp-Promotor, der λPL-Promotor, der recA-Promotor usw. in den zu transformierenden Wirtszellen der Gattung Escherichia verwendet werden; der SP01-Promotor, der SP02-Promotor usw. können in der Gattung Bacillus verwendet werden; der GAP-Promotor, der PH05-Promotor, der ADH-Promotor usw. können in Hefen verwendet werden und der SV40-abgeleitete Promotor, der Retrovirus-abgeleitete Promotor usw. können in Tierzellen verwendet werden.
Der gewünschte Gen-enthaltende Vektor, der in dieser Weise erhalten wird, wird verwendet, um Wirtszellen zu transformieren. Die Wirtszellen umfassen Mikroorganismen (beispielsweise die Gattung Escherichia, die Gattung Bacillus usw.), Hefe (die Gattung Saccharomyces, die Gattung Pichia, die Gattung Candida usw.), Tierzellen (CHO-Zellen, COS-Zellen usw.) usw. Das Medium für die Kultur ist bevorzugt ein flüssiges Medium, und besonders bevorzugt enthält das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle usw., die für das Wachstum der transformierten Zelle, die kultiviert werden soll, notwendig ist. Wenn gewünscht, können Vitamine, Wachstumspromotoren, Serum usw. zugegeben werden.
Für die direkte Herstellung des Fettsäure-modifizierten Peptids sind die Zellen bevorzugt jene, die die Aktivität einer Prozessierungsprotease, die eine geeignete Stelle in einem Präkursorpolypeptid des Peptids schneiden kann, und die Aktivität zum Acylieren des Serinrests in dem Peptid aufweisen. Wirtszellen mit dieser Prozessierungsproteaseaktivität und Serin-acylierenden Aktivität können durch Transformieren von Wirtszellen mit einem Expressionsvektor, der eine cDNA enthält, die das Präkursorpolypeptid kodiert, und dann Selektieren der transformierten Zellen durch Bestätigen, ob sie das Fettsaüre-modifizierte Peptid mit einer Ca-freisetzenden Aktivität oder einer GH-Sekretion-induzierenden Aktivität herstellen oder nicht, erhalten werden.
Nach der Kultivierung wird das Peptid der vorliegenden Erfindung von der Kultur in einer üblichen Weise abgetrennt und gereinigt. Um das gewünschte Produkt aus den kultivierten Mikroorganismen oder Zellen zu kulti vieren, werden beispielsweise die Mikroorganismen oder Zellen nach der Kultivierung gesammelt und in einem Puffer, der ein Proteindenaturierungsmittel (z. B. Guanidinhydrochlorid) enthält, suspendiert, und die Mikroorganismen oder Zellen werden durch Beschallung usw. aufgespalten und dann zentrifugiert. Um das gewünschte Produkt aus dem Überstand zu reinigen, können Trennungs- und Reinigungsverfahren, wie Gelfiltration, Ultrafiltration, Dialyse, SDS-PAGE, verschiedene Chromatographieverfahren geeigneterweise unter Berücksichtigung des Molekulargewichts, der Löslichkeit, der Ladung (isoelektrischer Punkt), Affinität usw. des gewünschten Produktes kombiniert werden.
Die Peptidverbindung der vorliegenden Erfindung kann in einer üblichen Weise chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise werden Aminosäuren mit Schutzgruppen durch ein Flüssigphasenverfahren und/oder ein Festphasenverfahren kondensiert, um eine Peptidkette zu verlängern, dann werden alle Schutzgruppen daraus durch eine Säure entfernt, und das resultierende rohe Produkt wird durch die obigen Reinigungsverfahren gereinigt, wodurch die gewünschte Peptidverbindung erhalten wird. Ein Aminosäurerest an der gewünschten Stelle kann selektiv durch eine Acylase oder Acyltransferase acyliert werden.
Zur Herstellung von Peptid sind verschiedene Verfahren gut etabliert, und die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch leicht durch diese bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann die peptidartige Verbindung durch das klassische Peptidsyntheseverfahren oder durch das Festphasenverfahren synthetisiert werden.
Hierin nachstehend wird ein Verfahren zur Herstellung der Peptidverbindung der vorliegenden Erfindung durch eine Kombination von rekombinanter DNA-Technik und chemischer Synthese in bezug auf die Beispiele beschrieben.
Aktive Ester von aminoterminalen Peptiden, beispielsweise,

(1) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Osu,
(2) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Osu und
(3) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu werden chemisch synthetisiert und dann an carboxylterminale Peptide, die durch rekombinante DNA-Technik hergestellt wurden, gebunden, das heißt,
(4) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR,
(5) LSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR bzw.
(6) SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR; das heißt, (1) wird an (4) gebunden, (2) an (5) und (3) an (6), wodurch Peptidverbindungen, die jeweils aus 28 Aminosäuren bestehen, erhalten werden. Speziell wird XXXXZSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR in E. coli exprimiert, gefolgt von dem Schutz seiner Aminogruppen mit Boc2(O), wodurch Boc-XXXXZSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAL(Boc)LQPR erhalten wurde. Dann wird das resultierende Peptid in NH₂-SPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR durch Spaltung mit einem Enzym, das für das Carboxylende der Aminosäure Z selektiv ist, umgewandelt. Diese Verbindung wird mit Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu in einer wässerigen neutralen bis schwach alkalischen Lösung gemischt, und das resultierende BocGlySer(Bu)Ser(R10)FLSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR wird mit Trifluoressigsäure behandelt, wodurch das gewünschte Produkt erhalten werden kann.

Die obige Ein-Buchstaben-Bezeichnung einer Aminosäure erfolgt gemäß einer Beschreibung in Cellular Molecular Biology, 3. Auflage, veröffentlicht am 10. Dezember 1997 von Newton Press Co., Ltd.
Außerdem stellt Boc t-Butyloxycarbonyl dar, Osu stellt einen Rest, abgeleitet von N-Hydroxysuccinimid durch Eliminierung von Wasserstoff aus dessen Hydroxylgruppe, dar, Bu eine Butylgruppe und R10 den Substituenten der modifizierten Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung.
Salze der peptidartigen Verbindung der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt pharmazeutisch annehmbare Salze, einschließlich beispielsweise Salze mit anorganischen Basen, Salze mit organischen Basen, Salze mit anorganischen Säuren, Salze mit organischen Säuren und Salze mit basischen oder sauren Aminosäuren.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit anorganischen Basen umfassen Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze usw.; Erdalkalimetallsalze, wie Calciumsalze, Magnesiumsalze usw.; und Aluminiumsalze, Ammoniumsalze usw.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit organischen Basen umfassen Salze mit Trimethylamin, Triethylamin, Pyridin, Picolin, Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin usw.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit anorganischen Säuren umfassen Salze mit Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure usw.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit organischen Säuren umfassen Salze mit Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Fumarsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure usw.
Bevorzugte Beispiele von Salzen mit basischen Aminosäuren umfassen Salze mit Arginin, Lysin, Ornithin usw. und geeignete Beispiele von Salzen mit sauren Aminosäuren umfassen Salze mit Asparaginsäure, Glutaminsäure usw.
Von diesen Salzen sind Natriumsalze und Kaliumsalze am stärksten bevorzugt.
Die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon sind gering toxisch und weisen eine GH-Sekretion-induzierende Wirkung auf, und sie können als solche oder nach der Mischung mit bekannten, pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Hilfsmitteln, Vehikel, Verstärker usw., an einen Säuger verabreicht werden (beispielsweise Mensch, Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Katze, Rind, Pferd, Schwein, Affe usw.). Bei intravenöser Injektion in einen Erwachsenen beträgt die tägliche Dosis 0,01 bis 5 mg/kg, bevorzugt 0,04 bis 1,5 mg/kg. Diese Dosis wird wünschenswerterweise ein- bis dreimal täglich verabreicht. Die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung wird mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern gemischt und kann als feste pharmazeutische Präparate, wie Tabletten, Kapseln, Granulate, Pulver usw., oder als flüssige pharmazeutische Präparate wie Sirups, Injektionen usw. oral oder parenteral verabreicht werden.
Die pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen eine breite Vielzahl an organischen und anorganischen Trägern, die üblicherweise als pharmazeutische Materialien verwendet werden, und diese werden als Vehikel, Schmiermittel, Bindemittel, Lösungsvermittler in festen pharmazeutischen Präparaten oder als Lösungsmittel, Ad juvanzien, Suspendiermittel, Isotonizitäts-verleihende Mittel, Puffer und Beruhigungsmittel in flüssigen pharmazeutischen Präparaten zugemischt.
Nach Bedarf können auch pharmazeutische Additive, wie Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, Farbmittel, Süßungsmittel usw. verwendet werden.
Bevorzugte Beispiele der Vehikel umfassen z. B. Lactose, Weißzucker, D-Mannitol, Stärke, kristalline Cellulose, leichte wasserfreie Kieselsäure usw. Bevorzugte Beispiele der Schmiermittel umfassen Magnesiumstearat, Calciumstearat, Talk, kolloides Siliciumdioxid usw.
Bevorzugte Beispiele der Bindemittel umfassen kristalline Cellulose, Weißzucker, D-Mannitol, Dextrin, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon usw.
Bevorzugte Beispiele des Lösungsvermittlers umfassen Stärke, Carboxymethylcellulose, Carboxymethylcellulose-Calcium, Croscalomelose-Natrium, Carboxymethylstärke-Natrium usw.
Bevorzugte Beispiele der Lösungsmittel umfassen Wasser zur Injektion, Alkohol, Propylenglycol, Macrogol, Sesamöl, Maisöl usw.
Bevorzugte Beispiele der Löslichmacher umfassen Polyethylenglycol, Propylenglycol, D-Mannitol, Benzylbenzoat, Ethanol, Trisaminomethan, Cholesterol, Triethanolamin, Natriumcarbonat, Natriumzitrat usw.
Bevorzugte Beispiele der Suspendiermittel umfassen oberflächenaktive Mittel, wie Stearyltriethanolamin, Natriumlaurylsulfat, Laurylaminopropionsäure, Lecithin, Benzalconiumchlorid, Benzethoniumchlorid und Glycerinmonostearat, und hydrophile Polymere, wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Carboxymethylcellulose-Natrium, Methylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylcellulose.
Bevorzugte Beispiele der Isotonizitäts-verleihenden Mittel umfassen Natriumchlorid, Glycerin, D-Mannitol usw.
Bevorzugte Beispiele der Puffer umfassen Pufferlösungen, wie Phosphate, Acetate, Carbonate, Citrate usw.
Bevorzugte Beispiele der Beruhigungsmittel umfassen Benzylalkohol usw.
Bevorzugte Beispiele der Konservierungsmittel umfassen p-Oxyesterbenzoate, Chlorbutanol, Benzylalkohol, Phenethylalkohol, Dehydroessigsäure, Sorbinsäure usw.
Bevorzugte Beispiele der Antioxidationsmittel umfassen Sulfite, Ascorbinsäure usw.
Die obige pharmazeutische Zusammensetzung ruft eine Wirkung hervor, die gleich oder höher als die Wirkung von GH bei der Verabreichung ist, und verschiedene Nebenwirkungen, die durch die Verabreichung von GH hervorgerufen werden, verringern kann.
In bezug auf Krankheiten, die dem Mangel oder der Verringerung von GH zuzuschreiben sind, umfassen Krankheiten, auf die die pharmazeutische Zusammensetzung angewendet werden kann, oder Wirkungen der pharmazeutischen Zusammensetzung die Aktivierung der Rekonstitution von Osteoblasten und Knochen, die Erhöhung der Muskelkraft und der Muskelmasse bei Erwachsenen mit GH-Mangel, die Verbesserung der Motilität bei Erwachsenen mit GH-Mangel, Heilung schwerer Verbrennungen bei Kinder, ihre kombinierte Verwendung mit Gonadotropinen bei der Induktion der Ovulation, die Vorbeugung einer Stoffwechselstörung durch Verabreichung von Prednison, die Förderung der T-Zell-„Bildung” bei einer schweren Immunstörung und die Wirkung einer Inhibierung der Verringerung des Körpergewichts bei alten Menschen und die Wirkung einer Vergrößerung von adipösen Geweben und einer Vorbeugung von Hautatrophie, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ferner, umfassen die Krankheiten oder Wirkungen, die nicht direkt mit dem Mangel oder der Verringerung von GH korrelieren, beispielsweise die Wirkung einer Erhöhen der pulsierenden Strömung, wie in Beispiel 7 gezeigt, und sie ist daher zur Behandlung von Herzkrankheiten, wie Herzversagen usw. wirksam.
Die Wirkung der pharmazeutischen Zusammensetzung ist nicht auf Menschen beschränkt. Das heißt, sie hat eine wachstumsfördernde Wirkung bei Tieren, bewirkt eine Verringerung von Fett im Fleisch usw., wobei diese Wirkungen gleich oder höher als die von verabreichtem GH sind.
Beispielsweise, wie in Beispiel 13 gezeigt, zeigt die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Appetit fördernde Wirkung bei der Verabreichung in den Ventrikel oder bei intravenöser Verabreichung, so kann sie als ein Appetit förderndes Mittel zum Behandeln von Anorexie oder Sitophobie verwendet werden.
Außerdem, wie in Beispiel 14 gezeigt, weist die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Magenmotilität- und Magensäuresekretion-fördernde Wirkung auf, und kann daher als ein Mittel zum Behandeln von Magenfunktionskrankheiten, wie Nicht-Geschwür-Indigestion, plötzliche leichte Magenatonie, Funktionsindigestion und Refluxösophagitis verwendet werden.
Ferner, wie beispielsweise in Beispiel 15 gezeigt, zeigt die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Zellwachstum-fördernde Wirkung im Knochenmark, Zwölffingerdarm und Leerdarm durch intravenöse Verabreichung, und kann daher als ein Mittel zum Schutz der Schleimhaut im Darmtrakt, ein Mittel zur Verhütung einer Schädigung der Schleimhaut im Dünndarm während intravenöser Ernährung und ein Mittel zur Behandlung von Osteoporose verwendet werden.
Ferner weist die oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung eine Wirkung bei der Behandlung der Krankheiten oder zum Verbessern der nachstehend beschriebenen physischen Zustände auf.
Beispielsweise kann sie zur stimulierenden Behandlung zur Freisetzung von Wachstumshormonen im Alter, Vorbeugung von katabolischen Nebenwirkungen von Zuckercorticoiden, Vorbeugung und Behandlung von Osteoporose, Stimulation des Immunsystems, Förderung der Heilung von Schädigungen, Förderung der Wiederherstellung gebrochener Knochen, Behandlung von Wachstumsverzögerung, Behandlung von Niereninsuffizienz oder Funktionsinsuffizienz, die der Wachstumsverzögerung zuzuschreiben sind, Behandlung von insuffizienten Zuständen, die mit physiologisch insuffizienten Zuständen korrelieren, einschließlich Kindern mit Wachstumshormonmangel und chronischen Krankheiten, Behandlung von Fettleibigkeit und Wachstumsverzögerung, die mit der Fettleibigkeit korreliert, Behandlung von Wachstumsverzögerung, die mit dem Plauda-Villi-Syndrom und Taner-Syndrom korreliert, Förderung der Wiederherstellung von Verbrennungspatienten und Verkürzung des Krankhausaufenthalts, Behandlung intrauteriner Wachstumsverzögerung, Skelettfehlbildung, Hypercorticoid-Krankheit und Cusshing-Syndrom, Induktion der Freisetzung von pulsierendem Wachstumshormon, Ersatz von Wachstumshormon in beanspruchten Patienten, Knorpelfehlbildung, Noonan-Syndrom, Schizophrenie, Depression, Alzheimer-Krankheit, Heilung der verzögerten Beseitigung von Schäden und physiko-sozialem Mangel, Behandlung von Pulmonalinsuffizienz und Atmungsorganabhängigkeit, Verringerung von katabolischer Reaktion von Protein nach der Hauptoperation, Reduktion von Proteinverlust und Kachexie, verursacht durch chronische Krankheiten, wie Krebs und AIDS, Behandlung von Hyperinsulinismus, einschließlich Bauchspeicheldrüsen-Inselzellenproliferation, adjuvante Therapie zur Induktion von Ovulation und Behandlung von Patienten mit Immunrepression, Verstärkung der Muskelkraft und Motilität, Aufrechterhaltung der Dicke der Haut im Alter, metabolische Homöostase und Nierenhomöostase, Stimulation von Osteoblasten, Neubildung von Knochen und Stimulation des Knorpelwachstums, um das Wachstum von Thymus zu stimulieren, und die Verschlechterung der Thymusfunktionen, die die Alterung begleiten, zu verhindern, verwendet werden.
Ferner werden auch die folgenden Wirkungen auf Lebewesen erwartet. Beispielsweise wird die Erhöhung der Rate von Tierwachstum, eine Erhöhung in der Produktion von Milch und Pelz bei Tieren, die Stimulation des Immunsystems bei Haustieren, die Behandlung von Krankheiten, verursacht durch fortgeschrittenes Alter bei Haustieren, Wachstumsförderung von Nutztieren, und eine Zunahme des Pelzes bei Schafen erwähnt.
Ein Antikörper, dessen Antigen ein Fettsäure-modifiziertes Peptid der vorliegenden Erfindung mit einer Ca-freisetzenden Aktivität oder einer GH-Sekretion-induzierenden Aktivität ist, kann durch ein in der Technik bekanntes Verfahren erhalten werden. Der Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein und kann durch ein in der Technik bekanntes Verfahren erhalten werden. Ferner kann ein Verfahren zum Messen des Fettsäure-modifizierten Peptids, bei dem der Antikörper verwendet wird, und ein Meßkit, bei dem das Meßverfahren verwendet wird, ebenso Gebrauch von einem in der Technik bekannten Verfahren machen.
Wie in Beispiel 17 beschrieben, werden Antikörper gegen amino- bzw. carboxylterminale Peptide aus Ghrelin hergestellt, und da ersterer Fettsäure-modifiziertes Serin an der 3. Stelle erkennt, können die Antikörper verwendet werden, um sowohl Ghrelin, das mit einer Fettsäure modifiziert ist, als auch Ghrelin, aus dem die Fettsäure beseitigt worden ist, abzutrennen und zu quantifizieren.
Die Antikörper gegen amino- und carboxylterminal Peptide in Ghrelin können in einem bekannten Verfahren erhalten werden, und sie können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein.
Für die vorliegende peptidartige Verbindung mit einer modifizierten Aminosäure an der 3. Stelle am Aminoende oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon kann ein Antikörper, der spezifisch eine Seitenkette vom 3. Aminosäurerest (bevorzugt eine Fettsäure) erkennt und an ein aminoterminales Teilpeptid der peptidartigen Verbindung bindet, ebenso in derselben Weise hergestellt werden. Außerdem kann für die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ein Antikörper, der spezifisch an das Peptid mit einer modifizierten Aminosäure bindet, ebenso in derselben Weise hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso einen Untersuchungskit, umfassend eine Kombination eines Antikörpers, der spezifisch eine Seitenkette der modifizierten Aminosäure erkennt, und eines Antikörpers, der Aminosäuren (oder ein Peptid) erkennt, ausgenommen der modifizierten Aminosäure und/oder einer Nicht-Aminosäureverbindung, bevorzugt eines Antikörpers gegen ein carboxylterminales Teilpeptid der peptidartigen Verbindung der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, wie oben beschrieben.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Assayverfahren, bei dem die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer modifizierten Aminosäure, bevorzugt einer acylierten Aminosäure, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, und die peptidartige Verbindung der vorliegenden Erfindung, die keine modifizierte Aminosäure enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, durch die Verwendung des Untersuchungskits abgetrennt und detektiert werden.
Hierin nachstehend werden das oben beschriebene Assayverfahren und der Untersuchungskit in bezug auf ihre Ausführungsformen beschrieben, die jedoch den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken sollen.
Das heißt, das Assayverfahren umfaßt beispielsweise (i) ein Verfahren zum Quantifizieren der peptidartigen Verbindung usw. der vorliegenden Erfindung in einer Testlösung, umfassend die vollständige Reaktion eines Testmaterials in einer Testlösung und der markierten peptidartigen Verbindung usw. der vorliegenden Erfindung mit einem Antikörper gegen die peptidartigen Verbindung usw. der vorliegenden Erfindung, und dann Bestimmen des Verhältnisses der markierten peptidartigen Verbindung usw. der vorliegenden Erfindung, die an den Antikörper gebunden ist, und (ii) ein Verfahren zum Quantifizieren der Proteine usw. der vorliegenden Erfindung in einer Testlösung, umfassend die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Reaktion einer Testlösung mit dem Antikörper der vorliegenden Erfindung, der auf einem Träger unlöslich gemacht ist, und einem anderen markierten Antikörper der vorliegenden Erfindung, und dann Messen der Aktivität des Markierungsmittels auf dem unlöslich machenden Träger und/oder der Aktivität des Markierungsmittels, das nicht auf dem unlöslich machenden Träger eingefangen ist. Bei den Quantifikationsverfahren (i) und (ii) ist es bevorzugt, daß ein Antikörper ein Antikörper ist, der einen aminoterminalen Bereich des Proteins usw. der vorliegenden Erfindung erkennt, während der andere Antikörper ein Antikörper ist, der mit einem carboxylterminalen Bereich des Proteins usw. der vorliegenden Erfindung reagiert.
Bei dem Verfahren zum Analysieren der peptidartigen Verbindung usw. der vorliegenden Erfindung kann der monoklonale Antikörper gegen die Verbindung (nachstehend auch als Anti-Protein-Antikörper bezeichnet) nicht nur zum Quantifizieren des Proteins usw. der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sondern auch zu dessen Detektion durch Gewebefärbung usw.
Für diese Zwecke kann entweder das Antikörpermolekül selbst oder ein F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fragment des Antikörpermoleküls verwendet werden.
Das Verfahren zum Quantifizieren der peptidartigen Verbindung usw. der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung des Antikörpers ist nicht besonders beschränkt, so lange wie das Verfahren das Detektieren der Menge des Antikörpers, die der Menge des Antigens (z. B. der Menge des Proteins), des Antigens oder eines Antigen-Antikörper-Konjugats in einer Testlösung entspricht, durch chemische oder physikalische Mittel und deren Berechnen auf der Grundlage einer Standardkurve, hergestellt unter Verwendung von Standardlösungen, die bekannte Mengen des Antigens enthalten, umfaßt. Beispielsweise werden Nephelometrie, das Konkurrenzverfahren, das immunometrische Verfahren und das Sandwich-Verfahren bevorzugt verwendet, aber das später beschriebene Sandwich-Verfahren wird in bezug auf Empfindlichkeit und Spezifität besonders bevorzugt verwendet.
Für ein Meßverfahren unter Verwendung einer Markierung in dem Assayverfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Markierung z. B. ein Radioisotop, ein Enzym, ein fluoreszierendes Material und ein lumineszierendes Material.
Das Radioisotop umfaßt beispielsweise ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C usw.
Das Enzym ist bevorzugt ein stabiles Enzym mit hoher spezifischer Aktivität, welches beispielsweise β-Galactosidase, β-Glucosidase, Alkaliphosphatase, Peroxidase und Malatdehydrogenase umfaßt.
Das fluoreszierende Material umfaßt beispielsweise Fluoreszamin und Fluoreszeinisocyanat.
Das lumineszierende Material umfaßt beispielsweise Luminol, Luminolderivate, Luciferin und Lucigenin.
Ferner kann auch ein Biotin-Avidin-System zum Binden der Markierung an den Antikörper oder das Antigen verwendet werden.
Hierin nachstehend wird die vorliegende Erfindung in bezug auf die Beispiele ausführlicher beschrieben. Wenn nicht anders angegeben, stimmten die genetischen Manipulationsmittel mit Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989) überein.
Beispiel 1. Erzeugung eines Zellstammes, der GHS-R exprimiert, und Messung der Ca-freisetzenden Aktivität.
Um eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration (Ca-freisetzende Aktivität), die bei der Bindung eines GH-Sekretagogues (GHS) an einen GHS-Rezeptor (GHS-R) auftritt, zu analysieren, wurde ein Zellstamm, der Ratten-GHS-R exprimiert, folgendermaßen erzeugt. Eine Voll-Langen-cDNA für Ratten-GHS-R wurde durch RT-PCR (Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion) erhalten, wobei eine cDNA, abgeleitet von Rattenhirn, als Matrize verwendet wurde. Aus der Nukleotidsequenz von bekanntem Ratten-GHS-R [K. K. Mckee, et al, Molecular Endocrinology 11, 415-423 (1997)] wurden Sense- und Antisense-Primer, bestehend aus den folgenden Nukleotidsequenzen, synthetisiert.
Sense-Primer: 5'-ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3'
Antisense-Primer: 5'-ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3'
Die amplifizierte cDNA wurde an den Vektor pcDNAIII (Invitrogen) unter Konstruktion des Expressionsvektors GHSR-pcDNAIII ligiert. CHO-Zellen wurden über den Expressionsvektor transformiert, und die transformierten Zellen, die GHS-R stabil exprimieren, wurden in einem Medium, enthaltend 1 μg/ml G418, selektiert. Der selektierte Zellstamm CHO-GHSR62 sprach auf 10^–10 bis 10^–9 M GHRP-6 (Wachstumshormon-Releasing-Hexapeptid) an. Eine Veränderung der intrazellulären Calciumionenkonzentration (Ca-freisetzende Aktivität) wurde durch ein FLIPR-System (Molecular Device) gemessen. Vor dieser Messung wurden 4 × 10⁴ CHO-GHSR62-Zellen in eine 96-Loch-Mikroplatte mit schwarzer Wand gegeben (Corning Co., Ltd) und für 12 bis 15 Stunden kultiviert. Dann wurden die Zellen mit 4 μM fluoreszierendem Fluo4 (Molecular Probe Co., Ltd) für 1 Stunde inkubiert und viermal mit Hank's BSS (Hank's Mineralsalzmedium), enthaltend 20 mM Hepes ([N-2-Hydroxyethyl]-piperazin-N-[2-ethansulfonsäure]) und 2,5 mM Probenecid, gewaschen, und die Ca-freisetzende Aktivität wurde mittels Zugabe einer Probe und Messen einer Veränderung der Fluoreszenz analysiert.
Beispiel 2. Reinigung eines endogenen GH-Sekretion-induzierenden Peptids
Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen CHO-GHSR62-Zellen wurde eine breite Vielzahl an Ratten-abgeleiteten Geweben und Organen hinsichtlich ihrer Ca-freisetzenden Aktivität untersucht, und es wurde infolgedessen herausgefunden, daß ein vom Rattenmagen abgeleiteter Peptidextrakt eine starke Ca-freisetzende Aktivität sogar in einer kleinen Menge von 0,5 mg aufwies. Folglich wurde ein Peptid mit der Ca-freisetzenden Aktivität aus einem Rattenmagenextrakt durch mehrere Arten von Chromatographie gereinigt.
40 g frischer Rattenmagen wurden für 5 Minuten in dem 5fachen an kochendem Wasser gekocht, um die darin vorhandenen Proteasen zu inaktivieren. Nach der Abkühlung wurde die gekochte Probe in 1M AcOH-20 mM HCl gegeben, gefolgt von Extrahieren des Peptids mit einem Polytron-Mischer. Der Extrakt wurde bei 11.000 U/min für 30 min zentrifugiert, und der Überstand wurde in einem Verdampfer auf etwa 40 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit Aceton durch Zugabe von Aceton dazu bei einer Konzentration von 66% ausgefällt, und nachdem die sich gebildeten Niederschläge entfernt wurden, wurde das Aceton in dem Überstand eingedampft. Der Überstand wurde auf 10 g Sep-Pak-C18-Patrone (Waters Co., Ltd), die zuvor mit 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) äquilibriert wurde, aufgebracht, mit 10% CH₃CN/0,1% TFA gewaschen und dann mit 60% CH₃CN/0,1% TFA eluiert. Nachdem das Lösungsmittel in dem Eluat eingedampft war, wurde die Probe lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe wurde in 1M AcOH gelöst und auf SP-Sephadex C-25 (H^±-Typ), zuvor äquilibriert mit 1M AcOH, absor biert. Die Probe wurde schrittweise mit 1M AcOH, dann mit 2M Pyridin und schließlich mit 2M Pyridin-AcOH (pH 5,0) eluiert, wodurch 3 Fraktionen, das heißt SP-I, SP-II beziehungsweise SP-III, erhalten wurden. Die SP-III-Fraktion wurde auf eine Sephadex-G-50-Gelfiltrationssäule aufgebracht, und ein aliquoter Teil jeder Fraktion wurde hinsichtlich der Ca-freisetzenden Aktivität durch die Verwendung der CHO-GHSR62-Zellen analysiert. Ein Profil der Sephadex-G-50-Säulenchromatographie ist in 1a gezeigt, und aktive Fraktionen (Fraktionen 43 bis 48 in 1a) mit Molekulargewichten von etwa 3.000 wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) durch CM-Ionenaustausch auf einer TSK-CM-2SW-Säule (4,6 × 250 mm, Tosoh Corp.) bei pH 6,4 fraktioniert. Die aktiven Fraktionen durch CM-HPLC wurden durch CM-HPLC auf derselben Säule bei pH 4,8 (1b) sekundär fraktioniert. Die aktiven Fraktionen (Elutionszeit 55 bis 56 Minuten in 1b) wurden zur Homogenität durch Umkehrphasen-HPLC auf einer μBondasphere-C-18-Säule (3,9 × 150 mm, Waters Co., Ltd) gereinigt. Aus 40 g Rattenmagen wurden 16 μg Peptid mit einer Ca-freisetzenden Aktivität gereinigt und als Ghrelin bezeichnet.
Beispiel 3. Strukturanalyse von Ghrelin
Die Aminosäuresequenz des gereinigten Ghrelins, abgeleitet von der Ratte, wurde durch einen Peptidsequenzer bestimmt (ABI 494, Applied Biosysytems Co., Ltd). Das Ghrelin war ein Peptid, zusammengesetzt aus 28 Aminosäureresten, bestehend aus der folgenden Sequenz:
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
wobei Xaa eine nicht identifizierte Aminosäure ist. Auf der Grundlage der Nukleotidsequenz von Ratten-cDNA wurde bestimmt, daß Xaa Ser ist, was eine bestimmte Modifikation an Ser in dem Peptid anzeigt.
Demgemäß wurde nicht modifiziertes Ghrelin, bei dem Serin an der 3. Stelle am Aminoende modifiziert ist, durch einen Peptidsynthesizer chemisch synthetisiert (ABI 433A, Applied Biosystems Co., Ltd). Da die Elutionszeit des nicht modifizierten synthetischen Ghrelins in Umkehrphasen-HPLC signifikant anders als die von natürlichem Ghrelin war (2a), wurde festgestellt, daß das nicht modifizierte synthetische Ghrelin signifikant hydrophiler war als natürliches Ghrelin.
Aus dem obigen Ergebnis wurde festgestellt, daß in natürlichem Ghrelin Serin an 3. Stelle am Aminoende (3. Serin) mit einem hydrophoben Rest modifiziert war.
Um die modifizierende Gruppe am 3. Serin zu erkennen, wurde das gereinigte Ghrelin durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) analysiert. Das gefundene Molekulargewicht (3314,9 ± 0,7) von natürlichem Ghrelin war um etwa 126 größer als das Molekulargewicht (3188,5) des nicht modifizierten Ghrelinpeptids, das aus der Nukleotidsequenz der cDNA bestimmt wurde. Aus dem obigen Ergebnis wurde festgestellt, daß die Hydroxylgruppe des 3. Serins in natürlichem Ghrelin mit n-Octanoyl-(C8:0) Fettsäure modifiziert war.
Um dies zu bestätigen, wurde das n-Octanoyl-(C8:0) Ghrelinpeptid chemisch synthetisiert und hinsichtlich seiner Elutionszeit in Umkehrphasen-HPLC untersucht. Bei der chemischen Synthese des n-Octanoyl-(C8:0) Peptids wurde das Peptid, worin alle funktionellen Gruppen, außer der Hydroxylgruppe des 3. Serins geschützt waren, durch das Fmoc-Festphasenverfahren unter Verwendung eines Peptidsynthesizers (ABI 433A, Applied Biosystems Co., Ltd) synthetisiert, und dann wurde das gewünschte Peptid durch Acylierung der Hydroxylgruppe des 3. Serins mit n-Octansäure und Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid in Gegenwart von 4-(Dimethylamino)pyridin erhalten. Das synthetische n-Octanoylpeptid zeigte dieselbe Elutionszeit wie die des gereinigten natürlichen Ghrelins (2a). Ferner zeigte das synthetische n-Octanoylpeptid und ein Peptidfragment an der 1. bis 4. Stelle am Aminoende (Gly 1 - Phe 4), das durch Behandeln des natürlichen Ghrelins mit Chymotrypsin erhalten wurde, dieselbe Retentionszeit in Umkehrphasen-HPLC.
Aus dem obigen Ergebnis wurde geschlußfolgert, daß das natürliche Ghrelin, abgeleitet von der Ratte, die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 angegeben ist, aufweist, wobei die Hydroxylgruppe des 3. Serins mit n-Octansäure (Caprylsäure) (2c) acyliert war.
Ferner wurde menschliches Ghrelin aus einem menschlichen Magenextrakt gereinigt, und es wurde festgestellt, daß seine Struktur die Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr.: 3 angegeben ist, wobei die Seitenketten-Hydroxylgruppe des 3. Serins mit n-Octansäure (Caprylsäure) (4a) acyliert war.
Die Strukturen der Ratten- und Menschen-abgeleiteten Ghreline wurden unter Verwendung der Fraktionen bestimmt, die als Fraktionen des ersten Peaks (Elutionszeit von 55 bis 56 Minuten) aus den aktiven Fraktionen in 1b gereinigt wurden, und nach der Reinigung wurde die Struktur der anderen aktiven Fraktionen in 1b ebenso in derselben Weise analysiert, was die Gegenwart nicht nur von Caprylsäure (C8:0), sondern auch ihrer Monoensäure (C8:1), Caprinsäure (C10:0) und ihrer Monoensäure (C10:1), und Laurinsäure (C12:0) und ihrer Monoensäure (C12:1) als die modifizierende Fettsäure am 3. Serin angab.
Ferner wurden Hühner-, Aal- und Frosch-Ghreline aus Magenextrakten in derselben Weise wie in Beispiel 2 gereinigt und hinsichtlich ihrer Struktur in derselben Weise wie in Beispiel 3 analysiert. Es wurde herausgefunden, daß das Hühner-Ghrelin die in SEQ ID NR.: 25 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, das Aal-Ghrelin die in SEQ ID NR.: 26 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist und das Frosch-Ghrelin die in SEQ ID NR.: 27 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, und in allen Ghrelinen die Seitenketten-Hydroxylgruppe vom 3. Serin mit n-Octansäure (Caprylsäure) acyliert war.
Ferner wurden Frosch-(Xenopus Laevis), Fisch-(Regenbogenforelle) und Hunde-Ghreline aus Magenextrakten in derselben Weise wie in Beispiel 2 gereinigt und hinsichtlich ihrer Struktur in derselben Weise wie in Beispiel 3 analysiert.
Es wurde herausgefunden, daß das Frosch-Ghrelin die in SEQ ID NR.: 28 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, das Regenbogenforelle-Ghrelin die in SEQ ID NR.: 29 und 30 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, und das Hunde-Ghrelin die in SEQ ID NR.: 31 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, und in allen Ghrelinen die Seitenketten-Hydroxylgruppe des 3. Serins oder Threonins mit n-Octansäure (Caprylsäure) acyliert war.
Aus der Regenbogenforelle wurden Ghrelin-23, bestehend aus 23 Aminosäureresten, gezeigt in SEQ ID NR.: 29, und Ghrelin-20, bestehend aus 20 Aminosäureresten, gezeigt in SEQ ID NR.: 30, erhalten.
Beispiel 4. Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin.
Das natürliche Ghrelin und das n-Octanoyl-modifizierte synthetische Ghrelin wiesen eine Ca-freisetzende Aktivität auf, aber das nicht modifizierte synthetische Ghrelin zeigte keine signifikante Ca-freisetzende Aktivität (2b). Ferner wurde, da n-Octansäure oder ein Gemisch aus n-Octansäure und dem nicht modifizierten synthetischen Ghrelin keine signifikante Ca-freisetzende Aktivität zeigte, herausgefunden, daß der n-Octansäurerest in dem natürlichen Ghrelin eine wichtige Struktur für die Ca-freisetzende Aktivität bildet. Hierin nachstehend bezieht sich Ghrelin auf [O-n-Octanoyl-serin-3]-ghrelin (2c).
In CHO-GHSR62-Zellen zeigte das Ghrelin eine höhere Aktivität bei der Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration (Ca-freisetzende Aktivität) als die von GHRP-6, während GHRH (GH-Freisetzungsfaktor, in 3a als GRF bezeichnet) keine Ca-freisetzende Aktivität (3b) zeigte. Die Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin war bei einer Konzentration von 10^–11 M oder mehr zu erkennen, und sein EC₅₀ war 2,5 nM. Die Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin wurde in Gegenwart 10^–4 M eines spezifischen Antagonisten ([D-Lys 3]-GHRP-6) für GHS-R inhibiert [R. G. Smith, et al., Science 260, 1640-1643 (1993)], und die Ca-freisetzende Aktivität wurde bei einer hohen Konzentration von Ghrelin in Abwesenheit des Antagonisten (3b) wiederhergestellt. Das obige Ergebnis gibt an, daß die Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin antagonistisch durch den spezifischen Antagonisten für GHS-R inhibiert wird.
Beispiel 5. Eine cDNA für einen Ghrelin-Präkursor und dessen Expression in verschiedenen Organen
Die Aminosäuresequenz des Ghrelins wies keine Homologie mit den Aminosäuresequenzen aller bekannten Peptiden auf, aber als ein Ergebnis der Homologieuntersuchung in der GenBank-Datenbank wurde dieselbe Sequenz in einer Ratten-EST-Sequenz (EST = Expressed Sequenz Tag) gefunden (GenBank-Hinterlegungsnummer AI549172). Auf der Grundlage dieser EST-Sequenz wurden die folgenden PCR-Primer synthetisiert:
Sense Primer: 5'-TTGAGCCCAGAGCACCAGAAA-3'
Antisense-Primer: 5'-AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3'
Diese 2 Primer wurden in RT-PCR verwendet, wobei eine Rattenmagen-abgeleitete cDNA als Matrize verwendet wurde. Die verwendeten PCR-Bedingungen waren 35 Kreisläufe, jeweils bestehend aus 98°C für 10 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde als eine Sonde zum Screenen einer Rattenmagen-cDNA-Bibliothek verwendet. Durch Screenen von etwa 2 × 10⁵ rekombinanten Phagen wurde eine Voll-Längen-cDNA, die das Ratten-abgeleitete Ghrelin kodiert, erhalten.
Die Ratten-Ghrelin-cDNA bestand aus 501 Basen, die in SEQ ID NR.: 6 gezeigt sind und die einen Ghrelin-Präkursor (Prepro-Ghrelin), bestehend aus 117 Aminosäuren (4a), kodieren. Die aminoterminalen 23 Aminosäurereste in dem Ghrelin-Präkursor wiesen die Eigenschaften eines Signalpeptids auf. Das Ghrelin beginnt mit Glycin 24 und die letzten 2 Aminosäuren (Pro-Arg) in dem reifen Ghrelin waren eine Sequenz, die der Spaltung mit einer Protease unterlag.
Unter Verwendung der Ratten-Ghrelin-cDNA wurde eine menschliche Magen-cDNA-Bibliothek unter wenig stringenten Bedingungen gescreent, um eine menschliche Voll-Längen-Ghrelin-cDNA zu erhalten. Die menschliche Magen-cDNA-Bibliothek wurde aus menschlicher Magen-Poly(A)⁺-RNA (Clontech Co., Ltd) durch die Verwendung eines cDNA-Synthesekits (Pharmacia Co., Ltd) hergestellt. Die so erhaltene menschliche Voll-Längen-Ghrelin-cDNA bestand aus 511 Basen, gezeigt in SEQ ID NR.: 7, die einen menschlichen Ghrelin-Präkursor (Prepro-Ghrelin), bestehend aus 117 Aminosäuren (4a), kodieren. Die Homologie auf dem Aminosäuresequenzniveau zwischen den Ratten- und Menschen-abgeleiteten Ghrelin-Präkursoren betrug 82,9%, was zeigt, daß Ghreline zwischen Spezies stark konserviert sind.
Um die Verteilung von Ghrelin in Geweben zu erkennen, wurde Poly(A)⁺-RNA, isoliert aus verschiedenen Rattengeweben, analysiert (4b). Durch Northern-Blot-Analyse der Rattengewebe wurden 0,62 kb Ghrelin-Präkursor-mRNA im Magen erkannt. Zwei schwache Banden wurden auch im Ventrikel erkannt, und diese waren 6,2 kb- und 1,2 kb-mRNAs, die länger waren als die der mRNA im Magen, was ein anderes mRNA-Spleißen als im Magen nahelegt. Aus dem obigen Ergebnis wurde herausgefunden, daß eine Hauptexpressionsstelle für Ghrelin der Magen ist.
Beispiel 6. Wirkung von Ghrelin auf die Sekretion von Hypophysenhormonen
Ob Ghrelin GH-Sekretion-induzierende Aktivität aufweist oder nicht, wurde in vitro und in vivo untersucht. Zuerst wurde die Wirkung von Ghrelin auf primär kultivierte Zellen von Hypophysenvorderlappenextrakt für einen Assay in vitro untersucht. Hypophysenvorderlappenextrakte wurden aus 4 Wochen alten männlichen SD-Ratten gesammelt und durch Behandlung mit Kollagenase dispergiert, und die Zellen wurden gesammelt, zweimal mit DMEM-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium), enthaltend 10% FKS (fetales Rinderserum) und ein Antibiotikum, gewaschen und in DMEM-Medium suspendiert, um primär kultivierte Zellen von Hypophysenvorderlappenextrakt herzustellen. Die 5 × 10⁴ Zellen wurden auf einer 96-Loch-Zellkulturplatte, beschichtet mit Poly-D-Lysin, inokuliert und für 3 bis 4 Tage kultiviert. Das Kulturmedium wurde gegen DMEM-Medium, enthaltend 0,1 ml Probe, ausgetauscht und bei 37°C für 15 Minuten gehalten. Ein aliquoter Teil des Kulturmediums wurde gesammelt und durch Radioimmunoassay hinsichtlich der Konzentrationen von verschiedenen Hypophysenhormonen in dem Kulturmedium gemessen. Von den Hypophysenhormonen wurden GH, FSH, LH, PRL und TSH unter Verwendung eines Kits, hergestellt von Biotrak/Amersham Co., Ltd, gemessen, und ACTH wurde unter Verwendung eines hochempfmdlichen EIA-Kits, hergestellt von Peninsula Laboratories, gemessen.
Wenn Ghrelin zu primär kultivierten Zellen von Hypophysenvorderlappenextrakt zugegeben wurde, wurde eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration erkannt, während nicht modifiziertes synthetisches Ghrelin ebenso eine leicht erhöhte Ca-freisetzende Aktivität zeigte (5a). Dieses Ergebnis zeigt, daß sowohl Ghrelin als auch nicht modifiziertes Ghrelin direkt auf Hypophysenzellen einwirken. Dann wurde die GH-Sekretion-induzierende Aktivität von Ghrelin unter Verwendung der primär kultivierten Zellen von Hypophysenvorderlappenextrakt untersucht, und durch die Zugabe von 10^–6 M Ghrelin wurde die Konzentration von GH in der Kultur in Abhängigkeit der Konzentration erhöht, aber es wurde keine Erhöhung der Konzentrationen anderer Hypophysenhormone (FSH, LH, PRL, TSH) beobachtet (5b).
Die GH-Sekretion-induzierende Aktivität von Ghrelin wurde in vivo untersucht. Nachdem 10 μg synthetisches Ghrelin intravenös in eine männliche Ratte (250 g) injiziert worden waren, wurde das Blut periodisch für bis zu 60 Minuten gesammelt, um die Konzentration der Hypophysenhormone in Plasma durch einen Radioimmunoassay zu messen. Von den Hypophysenhormonen wurde nur GH in das Blut freigesetzt und erreichte den maximalen Gehalt in 5 bis 10 Minuten nach intravenöser Injektion von Ghrelin. Aus diesem Ergebnis geht hervor, daß Ghrelin, das aus dem Magen in das Blut freigesetzt wurde, auf Zellen vom Hypophysenvorderlappenextrakt einwirkt und GH in das Blut freisetzt, und es wurde bestätigt, daß das Ghrelin eine nicht identifizierte spezifische endogene GH-Sekretion-induzierende Substanz ist.
Beispiel 7. Erhöhung des Herzminutenvolumens bei der Ratte
Die Wirkung einer akuten Verabreichung von Ghrelin an eine Ratte unter Anästhesie auf das Herz-Gefäß-System wurde untersucht. Männliche Wistar-Ratten (Carerie), die jeweils 220 bis 250 g wogen, wurden beliebig in 4 Gruppen (als Gruppen, denen 10, 1, 0,5 beziehungsweise 0,2 μg Ghrelin gegeben wurde) unterteilt, um die Wirkung der akuten Verabreichung von Ghrelin auf das Herz-Gefäß-System zu untersuchen. Ghrelin wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, und dann wurde eine Dosis von 10, 1, 0,5 oder 0,2 μg/Ratte hergestellt, und es wurden schnell 120 μl über ein Injektionsröhrchen (PE50), das in die rechte gemeinsame Drosselvene zum Messen des Herzminutenvolumens eingeführt wurde, verabreicht.

Als ein dynamischer Indikator wurden der systemische Blutdruck und das Herzminutenvolumen gemessen und der periphere Gefäßwiderstand berechnet. Die Ratten wurden mit Pentobarbital anästhesiert und in Rückenlage fixiert. Zum Messen des mittleren Blutdrucks wurde eine mit Heparin gefüllte Polyethylenkanüle (PE50) in die rechte Femoralarterie eingeführt. Das Herzminutenvolumen wurde unter Verwendung eines Herzleistungsmeßgerätes vom Thermodilutionstyp (CARDIOTHER M500R) gemessen. Ein mit physiologischer Kochsalzlösung gefülltes Injektionsröhrchen (PE50) wurde in die rechte gemeinsame Drosselvene in die Ratte eingeführt und im rechten Ventrikel gehalten. Ein Mikrokatheter wurde in die rechte gemeinsame Drosselvene in die Ratte eingeführt und in dem initiierenden Teil der Aorta gehalten. Zur Infusion wurden 100 μl physiologische Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (25°C) verwendet. Durch Drücken eines MEASURE-Schalters des Herzleistungsmeßgerätes vom Thermodilutionstyp und gleichzeitiges Injizieren der Infusion (100 μl physiologische Kochsalzlösung) wurde die Messung vom Herzminutenvolumen initiiert. Das Herzminutenvolumen wurde fünfmal gemessen, um das durchschnittliche Herzminutenvolumen zu ermitteln. Der mittlere Blutdruck und das Herzminutenvolumen wurden 1, 5, 15 und 30 Minuten vor und nach der Verabreichung von Ghrelin bestimmt. Der periphere Gefäßwiderstand wurde durch Teilen des mittleren Blutdrucks durch das Herzminutenvolumen bestimmt. Tabelle 1

	Körpergewicht (g)	Herzminutenvolumen (ml/min/kg) nach der Verabreichung von 1 μg Ghrelin
	Körpergewicht (g)	0 min	1 min	5 min	15 min	30 min
Mittelwert	230	347	382	367	341	338
SEM	3,7	14,3	10,2	11,5	7,9	8,8

In der Tabelle ist SEM der Standardfehler-Mittelwert. Tabelle 2

	Körpergewicht (g)	Herzminutenvolumen (ml/min/kg) nach der Verabreichung von 10 μg Ghrelin
	Körpergewicht (g)	0 min	1 min	5 min	15 min	30 min
Mittelwert	237	350	390	392	370	344
SEM	1,0	8,5	7,4	15,8	14,7	13,8

In der Tabelle ist SEM der Standardfehler-Mittelwert.
In der Gruppe, die 1 μg Ghrelin (Tabelle 1) erhielt, und der Gruppe, die 10 μg Ghrelin (Tabelle 2) erhielt, wurde eine Erhöhung des Herzminutenvolumens 1 bis 5 Minuten nach der Verabreichung festgestellt.
Beispiel 8. Isolation von Ghrelin und Ghrelin-27 verschiedenen Ursprungs
Aus Rattenmagenextrakt wurde Ghrelin unter Verwendung der Ca-freisetzenden Aktivität als Indikator nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gereinigt. Die aktive Fraktion (Elutionszeit von 59 Minuten in 1b) in sekundärer CM-HPLC wurde zur Homogenität durch Umkehrphasen-HPLC auf einer μBondasphere-C-18-Säule gereinigt (3,9 × 150 mm, hergestellt von Waters Co., Ltd). Diese Fraktion wurde durch Elektrospray-Ionisa tions-Massenspektrometie (ESI-MS) analysiert, was einen Peak des Molekulargewichts (3187,2 ± 0,9) zeigt, der um etwa 126 kleiner war als der von natürlichem Ghrelin, das mit Octansäure (C8), bestehend aus 28 Aminosäuren, modifiziert war. Die Bestimmung der Aminosäuresequenz dieses Peptid durch einen Peptidsequenzer (ABI 494, hergestellt von Applied Biosystems Co., Ltd) offenbart, daß es ein Peptid ist, bestehend aus den folgenden 27 Aminosäureresten:
Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
(Xaa ist eine nicht identifizierte Aminosäure). Das heißt, dieses Peptid bestand aus einer Aminosäuresequenz, in der in Ghrelin, bestehend aus 28 Aminosäuren, das 13. oder 14. Glutamin deletiert war. Da die Ca-freisetzende Aktivität dieses Peptids ähnlich der von Ghrelin mit 28 Aminosäuren war, wie in Beispiel 9 gezeigt, wurde dieses Peptid als Ghrelin-27 bezeichnet. Aus menschlichem Magenextrakt wurde menschliches Ghrelin-27 in derselben Weise wie Ratten-Ghrelin isoliert, und bestätigt, das es aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 11 angegeben ist, besteht. Peakfraktionen mit Retentionszeiten von 64 bis 65 Minuten in sekundärer CM-HPLC wurden gereinigt und durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) analysiert, was einen Peak des Molekulargewichts (3341,4 ± 0,9) zeigt. Da dieses Fettsäure-modifizierte Peptid aus 28 Aminosäuren bestand, wurde offenbart, daß es ein Peptid ist, bei dem in Ghrelin (28 Aminosäuren) das 3. Serie mit Decansäure (C10) modifiziert war.
Aus der Rattenmagen-cDNA-Bibliothek, hergestellt in Beispiel 5, wurde eine cDNA, die einen Präkursor von Ghrelin-27 kodiert, durch Plaquehybridisierung geklont, wobei das PCR-amplifizierte DNA-Fragment, hergestellt in Beispiel 5, als eine Sonde verwendet wurde. Die Nukleotidsequenz der cDNA wurde bestimmt, und es wurde bestätigt, daß sie den Präkursor von Ghrelin-27 kodiert. Die resultierende cDNA für den Ratten-Ghrelin-27-Präkursor bestand aus der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR.: 14 angegeben ist und den Ghrelin-27-Präkursor mit der Aminosäuresequenz (116 Aminosäuren), die in SEQ ID NR.: 12 angegeben ist, kodiert. Eine cDNA für den menschlichen Ghrelin-27-Präkursor wurde ebenso in derselben Weise, wie oben beschrieben, geklont, und es wurde offenbart, daß er aus der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR.: 15 angegeben ist, bestand, die den menschlichen Ghrelin-27-Präkursor mit der Aminosäuresequenz (116 Aminosäuren), die in SEQ ID NR.: 13 angegeben ist, kodiert.
Eine cDNA, die einen Präkursor von Schwein-abgeleitetem Ghrelin oder Ghrelin-27 kodiert, wurde aus einer Schweine-cDNA-Bibliothek nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durch Plaquehybridisierung geklont, wobei das in Beispiel 5 beschriebene PCR-amplifizierte DNA-Fragment als eine Sonde verwendet wurde. Die Nukleotidsequenz des resultierenden cDNA-Klons wurde bestimmt, und es wurde bestätigt, daß es einen Schweine-Ghrelin-Präkursor oder einen Schwein-Ghrelin-27-Präkursor kodiert. Die resultierende cDNA für den Schweine-Ghrelin-Präkursor bestand aus der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR.: 20 angegeben ist und einen Ghrelin-Präkursor mit der Aminosäuresequenz (118 Aminosäuren), die in SEQ ID NR.: 18 angegeben ist, kodiert. Die cDNA für den Schwein-Ghrelin-27-Präkursor bestand aus der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR.: 21 angegeben ist, die den Ghrelin-27-Präkursor mit der Aminosäuresequenz (117 Aminosäuren), die in SEQ ID NR.: 19 angegeben ist, kodiert. Folglich bestand das Schweine-Ghrelin (28 Aminosäuren) und das Schweine-Ghrelin-27 (27 Aminosäuren) aus den Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID Nr.: 16 bzw. 17 angegeben sind.
Eine cDNA, die einen Ghrelin-Präkursor kodiert, abgeleitet von Aal, Xenopus Laevis oder Regenbogenforelle, wurde aus verschiedenen cDNA-Bibliotheken nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durch Plaquehybridisierung geklont, wobei das in Beispiel 5 beschriebene PCR-amplifizierte DNA-Fragment als eine Sonde verwendet wurde. Die Nukleotidsequenz des resultierenden cDNA-Klons wurde bestimmt, und es wurde bestätigt, daß sie den Ghrelin-Präkursor kodiert.
Die resultierende cDNA für den Aal-Ghrelin-Präkursor bestand aus dem Nukleotid, das in SEQ ID NR.: 36 angegeben ist, die cDNA für den Frosch-Ghrelin-Präkursor bestand aus dem Nukleotid, das in SEQ ID NR.: 37 angegeben ist, und die cDNA für den Regenbogenforelle-Ghrelin-Präkursor bestand aus dem Nukleotid, das in SEQ ID NR.: 38 oder 39 angegeben ist.
Aus der Regenbogenforelle wurden die cDNA, die den Ghrelin-23-Präkursor kodiert, angegeben in SEQ ID NR.: 38, und die cDNA, die den Ghrelin-20-Präkursor kodiert, angegeben in SEQ ID NR.: 39, erhalten.
Aus den Nukleotidsequenzen der obigen cDNAs wurde herausgefunden, daß der Aal-Ghrelin-Präkursor die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 32 angegeben ist, aufweist, der Frosch-Ghrelin-Präkursor die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 33 angegeben ist, aufweist, und der Regenbogenforelle-Ghrelin-Präkursor die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 34 oder 35 angegeben ist, aufweist.
Bei der Regenbogenforelle wurden die Aminosäuresequenz des Ghrelin-23-Präkursors, angegeben in SEQ ID NR.: 34, und die Aminosäuresequenz des Ghrelin-20-Präkursors in SEQ ID NR.: 35 gefunden.
Eine cDNA für einen Rinder-Ghrelin-Präkursor wurde durch das PCR-Verfahren geklont. Das heißt, PCR wurde durchgeführt, wobei synthetische DNA, die Nukleotidsequenzen aufwies, die auf der Basis von Aminosäuresequenzen konstruiert wurden, die bei den Ratten-, Menschen- und Schwein-abgeleiteten Ghrelinen und Ghrelin-27 konserviert waren, als Primer und eine Rindermagen-cDNA-Bibliothek als Matrize verwendet wurde. Das so amplifizierte DNA-Fragment wies die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR.: 24 angegeben ist, auf, die einen Teil des Rinder-Ghrelin-27-Präkursors, der in SEQ ID NR.: 23 angegeben ist, kodiert. Folglich wies das Rinder-Ghrelin-27 die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 22 angegeben ist, auf. In dem DNA-Fragment, amplifiziert durch die obige PCR unter Verwendung einer Rindermagen-cDNA-Bibliothek als Matrize, gab es keine DNA, die einen Ghrelin-(28 Aminosäuren)-Präkursor kodiert.
Die Aminosäuren der Ratten-, Menschen- und Schwein-abgeleiteten Ghreline und der Ratten-, Menschen-, Schwein- und Rinder-abgeleiteten Ghreline-27 waren sehr ähnlich und insbesondere waren die Aminosäuresequenzen der 1. bis 10. Aminosäuren in den oben beschriebenen 7 Ghrelinen vollkommen identisch.
Beispiel 9. Vergleich der Aktivität verschiedener Ghrelinderivate

Peptidfragmente, die durch teilweisen Verdau der Ratten- und Menschen-abgeleiteten Ghreline mit verschiedenen Proteasen erhalten wurden, oder chemisch synthetisierte Peptide wurden hinsichtlich ihrer Ca-freisetzenden Aktivität untersucht, um eine Kernaminosäuresequenz und die optimale Kettenlänge einer modifizierenden Fettsäure, die für die Ca-freisetzende Aktivität notwendig, zu bestimmen. Die Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin wurde als Ghrelinkonzentration (EC₅₀, nM), bei der 50% der maximalen Aktivität erreicht sind, angegeben. Folglich zeigen niedrigere EC₅₀-Werte eine höhere Aktivität an. Tabelle 3 Vergleich der Aktivität verschiedener Ghrelinderivate

Ursprung	SEQ ID Nr.	Aminosäuren	Fettsäuremodifikation	Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀, nM)	Bemerkung
Mensch	3	1-28	Acyl (C:8)	2,6	natürliches Ghrelin
Mensch	3	1-15	Acyl (C:8)	7,0
Mensch	3	1-11	Acyl (C:8)	15
Ratte	2	1-28	Acyl (C:8)	2,9	natürliches Ghrelin
Ratte	2	1-15	Acyl (C:8)	8,6
Ratte	2	1-11	Acyl (C:8)	15
Ratte	2	1-10	Acyl (C:8)	19
Ratte	2	1-9	Acyl (C:8)	38
Ratte	2	1-8	Acyl (C:8)	100
Ratte	2	1-4	Acyl (C:8)	480
Ratte	2	16-28	Acyl (C:8)	> 10000
Ratte	2	(1-28) + (14-28)	Acyl (C:8)	2,8	Ghrelin-27
Ratte	2	1-28	Acyl (C:16)	3,1
Ratte	2	1-28	Acyl (C:10)	2,6
Ratte	2	1-28	Acyl (C:6)	16
Ratte	2	1-28	Acyl (C:4)	280
Ratte	2	1-28	Acyl (C:2)	780

Die Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin liegt auf der Seite des Aminoendes. Ein Peptid von dem Aminoende bis zur 4. Aminosäure weist eine ausreichende Ca-freisetzende Aktivität auf und ein Peptid von dem Aminoende bis zur 10. Aminosäure zeigt eine starke Ca-freisetzende Aktivität nahe der von natürlichem Ghrelin. Wenn die Kettenlänge von modifizierender Fettsäure C:2 (Acetylgruppe) beträgt, wird eine ausreichende Aktivität hervorgebracht, und wenn die Kettenlänge C:8 (Octanoylgruppe) beträgt, wird die maximale Ca-freisetzende Aktivität erreicht, und selbst wenn die Anzahl an Kohlenstoffatomen von Fettsäure weiter auf C:10 (Decanoylgruppe) oder auf C:16 erhöht wird, verändert sich die starke Ca-freisetzende Aktivität nicht. Das heißt, wenn die Fettsäure zum Modifizieren des 3. Serins am Aminoende 8 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, wird die stärkste Ca-freisetzende Aktivität hervorgebracht.
Beispiel 10. Synthese verschiedener Ghrelinderivate
(1) Synthese von Peptidderivaten
Andere Aminosäurederivate als Fmoc-^DSer (C₈H₁₇) und Fmoc-Ser (C₈H₁₇) und Synthesereagenzien wurden von Perkin Elmer, Novabiochem oder Watanabe Kagaku Co., Ltd. bezogen. Die Peptidkettenverlängerung wurde hauptsächlich unter Verwendung des Applied Biosystem-433A-Synthesizers, hergestellt von Perkin Elmer, durchgeführt und ein geschütztes Peptidderivat-Harz wurde durch das Boc- oder Fmoc-Verfahren konstruiert. Das durch das Boc-Verfahren erhaltene geschützte Peptidharz wurde mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (HF) in Gegenwart von p-Cresol entschützt, wodurch das Peptid freigesetzt wurde, welches dann gereinigt wurde. Das durch das Fmoc-Verfahren erhaltene geschützte Peptidharz wurde mit Trifluoressigsäure (TFA) oder verdünnter TFA, die verschiedene Fänger enthielten, entschützt, und das freigesetzte Peptid wurde gereinigt. Die Reinigung wurde in Umkehrphasen-HPLC auf einer C4- oder C18-Säule durchgeführt. Die Reinheit des gereinigten Produktes wurde durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt, und seine Struktur wurde durch Aminosäurezusammensetzungsanalyse und Massenspektrometrie bestätigt.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung wurde durch ein herkömmliches Peptidsyntheseverfahren hergestellt. Beispielsweise kann es durch ein Verfahren hergestellt werden, das in Kapitel 2 und 3 von „Biochemical Experimental Course 1, Protein Chemistry IV" (Tokyo Kagaku Dojin) oder in „Development of Medicines, a second series, Bd. 14, Peptide Synthesis" (Hirnkawa Shoten Co., Ltd) beschrieben ist. Demgemäß werden typische Beispiele des Peptids der vorliegenden Erfindung nachstehend gezeigt. Speziell wird die Synthese acylierter oder alkylierter Peptide nachstehend veranschaulicht. Ferner wurde Menschen-abgeleitetes Ghrelin (das hierin nachstehend als hGhrelin abgekürzt sein kann) oder Ratten-abgeleitetes Ghrelin (das hierin nachstehend als rGhrelin abgekürzt sein kann) mit Trypsin oder Chymotrypsin oder beiden Enzymen nacheinander umgesetzt, wodurch die folgenden Ghrelinfragment erhalten wurden: 19. Ghrelin(16-28), 20. hGhrelin(1-15), 21. rGhrelin(1-15), 23. hGhrelin(1-11), 24. rGhrelin(1-11), 25. Ghrelin(1-10), 26. Ghrelin(1-9), 27. Ghrelin(1-8) und 30. Ghrelin(1-4). Dann wurden diese Fragmente durch analytische HPLC isoliert und hinsichtlich ihrer Aktivität gemessen. 41. [N-Acetyl]-Ghrelin(1-10) wurde in einer üblichen Weise durch Behandlung von Ghrelin(1-10) mit N-Acetylsuccinimid hergestellt. Verbindung Nr. 2 (Ratten-Ghrelin) nutzte ein natürliches Material, und 10. [Ser³(Butyryl)]-rGhrelin, 11. [Ser³(Hexanoyl)]-rGhrelin, 12. [Ser³(Decanoyl)]-rGhrelin, 13. [Ser³(Lauroyl)]-rGhrelin und 14. [Ser³(Palmitoyl)]-rGhrelin wurden in derselben Weise wie in der Synthese von Verbindung 1 (hGhrelin) synthetisiert und dann hinsichtlich ihrer Aktivität gemessen.
[Hauptabkürzungen]

HMP-Harz;

4-Hydroxymethyl-phenoxymethylharz

Fmoc-Amidharz;

4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacctamido-ethylharz

PAM-Harz;

Phenylacetoamidomethylharz

HBTU;

2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat

TBTU;

2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat

HOBt;

1-Hydroxybenzotriazol

DCC;

Dicyclohexylcarbodiimid

DIPCI;

Diisopropylcarbodiimid

TFA;

Trifluoressigsäure

DIPEA;

Diisopropylethylamin

TIPS;

Triisopropylsilan

Fmoc;

Fluorenylmethoxycarbonyl

Boc;

t-Butyloxycarbonyl

Trt;

Trityl

Bu^t;

t-Butyl

Pmc;

2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl

Prl;

Propionyl

PhPrl;

Phenylpropionyl

Bzl;

Benzyl

Bom;

Benzyloxymethyl

Tos;

Toluolsulfonyl

Cl-Z;

2-Chlor-benzyloxycarbonyl

Pis;

2-Phenylisopropyl

Mtt;

4-Methyltrityl

DMF;

N,N-Dimethylformamid

NMP;

N-Methylpyrrolidon

DMAP;

4-Dimethylaminopyridin

HOSu;

N-Hydroxysuccinimid

Adod;

2-Aminododecansäure

Aib;

2-Aminoisobutylsäure

Ape;

5-Aminopentansäure

Cha;

Cyclohexylalanin

Dap;

2,3-Diaminopropionsäure

Nal;

Naphthylalanin

Nle;

Norleucin

[Schutz von Aminosäuren, die bei der Synthese verwendet werden]
Fmoc-Verfahren:

Boc-Gly, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser (Bu^t), Fmoc-Ser (Trt), Fmoc-Glu (OBu^t), Fmoc-His (Boc), Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Leu, Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-Phe, Fmoc-^DPhe, Fmoc-Ser (n-C₈H₁₇), Fmoc-^DSer (n-C₈H₁₇), Fmoc-Cys (n-C₈H₁₇), Fmoc-Asp (OPis), Fmoc-Ser (Bzl), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Dap (Octanoyl), Fmoc-2-^LNal, Fmoc-2-^DNal, Fmoc-Nle, Fmoc-Lys (Mtt), Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Asp (O-C₇H₁₅)

Boc-Verfahren:

Boc-Gly, Boc-Ser (Bzl), Boc-Ser (Ac), Boc-Ser (Prl), Boc-Glu (OBzl), Boc-His (Bom), Boc-Gln, Boc-Arg (Tos), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Ala, Boc-Val, Boc-Phe, Boc-Cys (n-C₈H₁₇), Boc-Ape Boc-Ser (n-C₈H₁₇)

[verwendete Einheiten]

(a) Analytisches HPLC-System

Einheit:	Shimadzu LC-10A System
Säule:	YMC PROTEIN-RP (4,6 mm ϕ × 150 mm)
Säulentemperatur:	40°C
Elutionsmittel:	ein linearer Gradient von 0 bis 50% Acetonitril für 20 Minuten in 0,1% Trifluoressigsäure
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Detektion:	UV (210 nm)
Injektionsvolumen:	10 bis 100 μl

(b) Präparatives HPLC-System

Einheit:	Waters 600 Multisolvent Delivery System
Säulen:	YMC-Pack-ODS-A (5 um, 20 mm × 250 mm) YMC-Pack-PROTEIN-RP (5 um, C4, 10 mm × 250 mm) YMC-Pack PROTEIN-RP (5 um, C4, 20 mm × 250 mm) YMC PROTEIN-RP (4,6 mm ϕ × 150 mm)
Elutionsmittel:	ein geeigneter linearer Gradient an Acetonitrilkonzentration in 0,1% Trifluoressigsäure
Fließgeschwindigkeit:	10 ml/min (für die Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm), 3 ml/min (für die Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm), 1 ml/min (für die Säule mit einem Innendurchmesser von 4,6 mm)
Detektion:	210 nm, 260 nm
Injektion:	10 bis 2000 μl (2000 μl oder mehr wurden durch eine Pumpe injiziert)

(c) Massenspektrometer

Einheit:	Finigan MAT TSQ700
Innenquelle:	ESI
Ionendetektionsmodus:	positiv
Sprühspannung:	4,5 kV
Kapillartemperatur:	250°C
mobile Phase:	ein Gemisch aus 0,2% Essigsäure und Methanol (1:1)
Fließgeschwindigkeit:	0,2 ml/min
Scannbereich:	m/z 300 bis 1500

(d) Analyse der Aminosäuresequenz

Einheit: Applied Biosystem 477A, Sequenzer-Modell 492, hergestellt von Perkin Elmer

(e) Analyse der Aminosäurezusammensetzung

Einheit:	Aminosäureanalysator-Modell L-8500, hergestellt von Hitachi, Co., Ltd.
Probe:	wenn nicht anders angegeben, wurde die Probe mit 6M HCl bei 110°C für 24 Stunden in einem verschlossenen Röhrchen hydrolysiert.

(2) Beispiel der Synthese eines Derivats mit Acylserin oder Acylthreonin (Fmoc-Verfahren, carboxylterminale Amidderivate)
Verbindung 1 hGhrelin: GSS(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-Harz (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt und Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch
Fmoc-Ser(Bu^t)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^t)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ser(Bu^t)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-Harz
konstruiert wurde. Nachdem Boc-Gly schließlich durch DCC/HOBt eingeführt war, wurde das resultierende geschützte Peptidharz (1,3 g) mit einer Lösung aus 1% TFA-5% TIPS-Methylenchlorid (15 ml) für 30 Minuten be handelt. Das Peptidharz wurde filtriert, mehrmals mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen und mit 5% DIEA (10 ml) und dann mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen. Das resultierende de-Trt-Peptidharz (etwa 1,3 g) wurde mit NMP (10 ml) gequollen, und Octansäure (144,2 mg, 1,0 mmol) und DIPCI (126,2 mg, 1,0 mmol) wurden in Gegenwart von DMAP (61,1 mg, 0,5 mmol) zugegeben und konnten für 8 Stunden reagieren. Das Harz wurde durch Filtration rückgewonnen und mit NMP und dann mit Methylenchlorid gewaschen, gefolgt vom Trocknen unter Vakuum, wodurch etwa 1,2 g geschütztes Peptidharz erhalten wurden, wobei die Seitenkette des 3. Serins octanoyliert war. Zu diesem Produkt wurde ein Entschützungsreagens (10 ml), bestehend aus 88% TFA-5% Phenol-2% TIPS-5% H₂O, zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückstanden unter Bildung von Niederschlägen. Die Niederschläge wurden durch Filtration rückgewon nen und getrocknet, wodurch etwa 550 mg reines Peptid erhalten wurden. 200 mg von diesem Produkt wurden in 10 ml Wasser gelöst und auf YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 120 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden.
(3) Beispiel der Synthese eines Derivats mit Acylserin oder Acylthreonin (Fmoc-Verfahren, carboxylterminale Amidverbindungen)
Verbindung 3 Ghrelin(1-9)-NH₂; GSS(CO-C₇H₁₅)FLSPEH-NH₂
Fmoc-Amid-Harz (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt und Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch Fmoc-Ser(Bu^t)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Glu(OBu^t)-His(Boc)-Harz konstruiert wurde. Nachdem Boc-Gly schließlich durch DCC/HOBt eingeführt war, wurde das resultierende geschützte Peptidharz (etwa 550 mg) mit einer Lösung aus 1% TFA-5% TIPS-Methylenchlorid (10 ml) für 30 Minuten behandelt. Das Peptidharz wurde durch Filtration rückgewonnen, mehrmals mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen, und mit 5% DIEA (10 ml) und dann mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen. Das resultierende de-Trt-Peptidharz (etwa 750 mg) wurde mit NMP (10 ml) gequollen, und Octansäure (144,2 mg, 1,0 mmol) und DIPCI (126,2 mg, 1 mmol) wurden in Gegenwart von DMAP (61,1 mg, 0,5 mmol) zugegeben und konnten für 4 Stunden reagieren. Das Harz wurde durch Filtration rückgewonnen und mit NMP und dann mit Methylenchlorid gewaschen, gefolgt vom Trocknen unter Vakuum, wodurch etwa 800 mg geschütztes Peptidharz erhalten wurden, wobei die Seitenkette des 3. Serins octanoyliert war. TFA (10 ml) wurde zu diesem Produkt zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückständen unter Bildung von Niederschlägen. Die Niederschläge wurden durch Filtration rückgewonnen und getrocknet, wodurch etwa 250 mg rohes Peptid erhalten wurden. Etwa 200 mg von diesem Produkt wurden in 10 ml 30%iger wässeriger Essigsäure gelöst und auf YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 150 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden.
(4) Beispiel der Synthese eines Derivats mit Acylserin oder Acylthreonin (Boc-Verfahren)
Verbindung 9 [Ser³(Propionyl)]-rGhrelin(1-28); GSS(CO-CH₂CH₃)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
Geschütztes Ratten-Ghrelin-Harz(4-28) wurde aus Boc-Arg(Tos)-Pam-Harz (0,75 g, 0,5 mmol) durch Boc-Chemie konstruiert, und Boc-Ser(CO-CH₂CH₃)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH und Boc-Gly-OH wurden mit der Hälfte (1,4 g) des Harzes kondensiert. Das resultierende Harz, 1,5 g, wurde mit einem Gemisch aus HF und p-Cresol (8,5 ml:1,5 ml) bei 0°C für 1 Stunde behandelt, und das HF wurde eingedampft. Ether wurde zu den Rückständen zugegeben, wodurch 671 mg rohes Peptid erhalten wurden. Diese Probe wurde in 50%iger Essigsäure (AcOH) gelöst und auf eine präparative Säule YMC-Pack-ODS-A (5 μm, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und bei einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit einem Gradienten von 0 bis 95% Acetonitrilkonzentration in 0,1% TFA-Lösung für 75 Minuten eluiert. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden lyophilisiert, wodurch 135,8 mg rohes Peptid erhalten wurden. Ein Teil (0,5 mg) dieses Produktes wurde auf eine YMC-A-302-Säule (C18, 4,6 mm × 150 mm) aufgebracht und bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einem Gradienten von 15 bis 19% Acetonitrilkonzentration eluiert. Dieses Reinigungsverfahren wurde wiederholt und die gewünschten Fraktionen wurden vereinigt, wodurch 0,41 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden.
Die folgenden Peptidderivate mit Acylserin oder Acylthreonin wurden in derselben Weise wie bei der Herstellung der oben beschriebenen Verbindung 3 oder 9 hergestellt.
Die Ergebnisse der Massenspektrometrie und Aminosäurezusammensetzungsanalyse der Peptidderivate mit Acylserin oder Acylthreonin werden nachstehend zusammengefaßt.
Verbindung 1. hGhrelin

ESI-MS 3371,0 (theoretisch: 3370,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 3,53 (4), Glx; 5,91 (6), Gly; 1,02 (1), Ala; 1,00 (1), Val; 0,96 (1), Leu; 2, Phe; 1,06 (1), Lys; 3,90 (4), His; 0,97 (1), Arg; 2,87 (3), Pro; 3,87 (4)

Verbindung 3, Ghrelin(1-9)-Amid

ESI-MS [M+H]; 1085,7 (theoretisch: 1085,2), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,45 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1), His; 1,08 (1), Pro; 0,97 (1)

Verbindung 4, [Ser²(Octanoyl), Ser³]-Ghrelin(1-9)-Amid

ESI-MS [M+H]; 1085,8 (theoretisch: 1085,2), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,46 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), His; 1,09 (1), Pro; 0,97 (1)

Verbindung 5, [Ser²(Octanoyl)1-Ghrelin(1-9)-Amid

ESI-MS [M+H]; 1211,7 (theoretisch: 1211,4), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,48 (3), Glx; 1,00 (1), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), His; 1,11 (1), Pro; 0,98 (1)

Verbindung 8, [Ser³(Acetyl)]-rGhrelin

ESI-MS 3231,0 (theoretisch: 3230,7), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 3,50 (4), Glx; 5,90 (6), Gly; 0,98 (1), Ala; 2,00 (2), Leu; 2, Phe; 1,01 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,99 (2), Pro; 3,99 (4)

Verbindung 9, [Ser³(Propionyl)]-rGhrelin

ESI-MS 3245,0 (theoretisch: 3242,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 3,42 (4), Glx; 5,93 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 2,00 (2), Leu; 2, Phe; 1,10 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,99 (2), Pro; 3,83 (4)

Verbindung 15, [Ser³(3-Phenylpropionyl)]-hGhrelin

ESI-MS 3377,0 (theoretisch: 3376,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 3,06 (4), Glx; 5,92 (6), Gly; 0,93 (1), Ala; 0,98 (1), Val; 0,99 (1), Leu; 2, Phe; 1,13 (1), Lys; 4,03 (4), His; 1,08 (1), Arg; 3,00 (3), Pro; 3,76 (4)

Verbindung 16, [Ser³(3-Octenoyl)]-hGhrelin

ESI-MS 3369,0 (theoretisch: 3368,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 3,59 (4), Glx; 5,91 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,02 (1), Val; 0,99 (1), Leu; 2, Phe; 1,15 (1), Lys; 3,97 (4), His; 0,98 (1), Arg; 2,93 (3), Pro; 3,88 (4)

Verbindung 28, Ghrelin(1-8)-Amid

ESI-MS [M+H] 948,5 (theoretisch: 948,1), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,45 (3), Glx; 0,97 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 0,97 (1)

Verbindung 29, Ghrelin(1-7)-amid

ESI-MS [M+H] 819,6 (theoretisch: 819,0), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,52 (3), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1), Pro; 1,09 (1)

Verbindung 30, Ghrelin(1-6)-Amid

ESI-MS [M+H]; 722,4 (theoretisch: 721,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,47 (3), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1)

Verbindung 31, Ghrelin(1-5)

ESI-MS [M+H] 636,5 (theoretisch: 635,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,78 (2), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1)

Verbindung 32, Ghrelin(1-5)-Amid

ESI-MS [M+H] 635,4 (theoretisch: 634,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,67 (2), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1)

Verbindung 33-2, Ghrelin(1-4)-Amid

ESI-MS [M+H] 522,2 (theoretisch: 521,6), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,65 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; 1

Verbindung 34, Ghrelin(1-3)-Amid

ESI-MS [M+H] 375,2 (theoretisch: 374,4), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,66 (2), Gly; 1

Verbindung 35, [Lys⁸]-Ghrelin(1-8)-Amid

ESI-MS [M+H] 947,9 (theoretisch: 947,1), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,70 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 0,99 (1), Pro; 1,00 (1)

Verbindung 36, [Arg⁸]-Ghrelin(1-8)-Amid

ESI-MS [M+H] 975,8 (theoretisch: 975,2), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,70 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Arg; 0,99 (1), Pro; 1,00 (1)

Verbindung 37, [Lys⁶]-Ghrelin(1-6)-Amid

ESI-MS [M+H] 763,6 (theoretisch: 762,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Lys; 1,00 (1)

Verbindung 38, [Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid

ESI-MS [M+H] 650,5 (theoretisch: 649,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,79 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; 1, Lys; 0,99 (1)

Verbindung 39, [^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid

Verbindung 40, [N-Aminopentanoyl]-Ghrelin(3-7)-Amid

ESI-MS [M+H] 774,7 (theoretisch: 774,0), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,80 (2), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Pro; 1,00 (1)

Verbindung 43, [N-Glycyl]-Ghrelin(3-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 732,7 (theoretisch: 731,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Pro; 1,00 (1)

Verbindung 44, [Leu²]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 845,7 (theoretisch: 845,1), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,01 (1), Leu; 2, Phe; 1,02 (1), Pro; 0,99 (1)

Verbindung 45, [His²]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 869,7 (theoretisch: 869,0), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure·Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 1,02 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), His; 0,95 (1), Pro; 0,99 (1)

Verbindung 46, [Lys²]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 860,7 (theoretisch: 860,1), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 1,04 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Verbindung 47, [Gly²]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 789,5 (theoretisch: 788,9), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure·Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 1,14 (2), Gly; 2,01 (2), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Verbindung 59, [Thr³(Octanoyl)]-hGhrelin

ESI-MS M; 3384,0 (theoretisch: 3384,9), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,02 (1) Arg; 2,99 (3), Glx; 5,91 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4,05 (4), Phe; 1,00 (1), Pro; 4,06 (4), Ser; 2,66 (3), Thr; 0,94 (1), Val; 0,96 (1)

Verbindung 60, [Leu², Thr³(Octanoyl)]-hGhrelin

ESI-MS M; 3410,0 (theoretisch: 3411,0), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,01 (1), His; 1,01 (1), Leu; 3 (3), Lys; 4,02 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 4,00 (4), Ser; 1,81 (2), Thr; 0,96 (1), Val; 0,97 (1)

Verbindung 69, [Ser³(4-Methylpentanoyl)]-hGhrelin

ESI-MS M; 3343,0 (theoretisch: 3342,9), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,97 (3), Glx; 5,86 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2, Lys; 4,00 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 3,99 (4), Ser; 3,54 (4), Val; 0,98 (1)

Verbindung 75, [Lys⁷]-Ghrelin(1-7)-amid

ESI-MS [M+H]; 850,5 (theoretisch: 850,0), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,67 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1)

(5) Beispiel der Synthese eines aminoterminalen acylierten Derivats
Verbindung 6. [N-Octanoyl, Ser³]-Ghrelin(1-9)-Amid; C₇H₁₅CO-GSSFLSPEH-NH₂
Fmoc-Amidharz (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt und der Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch Fmoc-Gly-Ser(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^t)-His(Boc)-Harz konstruiert wurde. Nach der Behandlung mit Piperazin wurde das resultierende Peptidharz (550 mg) mit NMP gewaschen, und DIPCI (126,2 mg, 1 mmol) und Octansäure (144,2 mg, 1,0 mmol) wurden in Gegenwart von HOBt (135,1 mg, 1 mmol) dazugegeben und konnten für 4 Stunden reagieren. Das Harz wurde durch Filtration rückgewonnen, mit NMP und dann mit Methylenchlorid gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch etwa 600 mg geschütztes Peptidharz erhalten wurden, wobei die Aminogruppe in dem aminoterminalem Gly octanoyliert war. Dieses Produkt wurde mit TFA (10 ml) (Behandlung für 30 Minuten) entschützt, wodurch 200 mg rohes Peptid erhalten wurden. Die gesamte Probe wurde auf YMC-Pack PROTEIN-RP (5 um, C4, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Etwa 180 mg des gewünschten Produkts wurden erhalten.

Gemessene Werte: ESI-MS [M+H]; 1085,6 (theoretisch: 1085,2), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,47 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1), His; 1,09 (1), Pro; 0,96 (1)

(6) Beispiel der Synthese eines Derivats, enthaltend Serin mit einer Alkylseitenkette
Verbindung 50. [Ser³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-Amid; GSS(C₈H₁₇)FLSP-NH₂
Fmoc-Ser (C₈H₁₇)
Unter Kühlung auf Eis wurde Natriumhydrid (3,19 g, 133 mmol) zu einer Lösung aus Boc-Ser (12,3 g, 53,9 mmol) in DMF (300 ml) gegeben und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Octaniodid (11,0 ml, 60,9 mmol) wurde zugegeben und bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt. Nachdem Wasser (40 ml) tropfenweise zu der Reaktionslösung unter Kühlung auf Eis zugegeben worden war, wurde das Lösungsmittel unter Vakuum eingedampft. Die resultierenden Rückstände wurden durch deren Aufbringen auf Kieselgelsäulenchromatographie (Gel; Art9385, Merck Co., Ltd, Elutionsmittel; Dichlormethan:Methanol:Essigsäure = 120:10:1) gereinigt, wodurch 6,88 g Boc-Ser (C₈H₁₇) (Ausbeute 36,2%) als eine hellgelbe ölige Substanz erhalten wurden. Trifluoressigsäure (120 ml) wurde zu diesem Produkt, Boc-Ser (C₈H₁₇) (6,88 g, 21,7 mmol), unter Kühlung auf Eis zugegeben und 0,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem die Trifluoressigsäure eingedampft war, wurden die resultierenden Rückstände in Diethylether (120 ml) gelöst, und 4N HCl-Dioxan (22 ml) wurde zugegeben und 1 Stunde unter Eiskühlung gerührt. Die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration rückgewonnen, wodurch 5,23 g H-Ser (C₈H₁₇)·HCl (Ausbeute 96,3%) als farblose Kristalle erhalten wurden. Nachdem Triethylamin (1,40 ml, 10 mmol) zu einer Suspension (50 ml) aus dem Produkt H-Ser (C₈H₁₇)·HCl (2,54 g, 10,0 mmol) in 10%igem Natriumhydrogencarbonat zugegeben worden war, wurde eine Lösung aus Fmoc-Osu (5,00 g, 14,8 mmol) in 1,2-Dimethoxyethan (20 ml) über einen Zeitraum von 10 Minuten tropfenweise zugegeben und bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt. Die unlöslichen Substanzen wurden abfiltriert, dann wurde Dichlormethan zu dem Filtrat zugegeben, und die organische Phase wurde abgetrennt und mit 13%iger NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde eingedampft. Die resultierenden Rückstände wurden durch deren Aufbringen auf Kieselgelsäulenchromatographie (Gel; BW-300, Fuji Silicia Co., Ltd, Elutionsmittel; Dichlormethan:Methanol = 93:7) gereinigt, wodurch 2,75 g Fmoc-Ser (C₈H₁₇) (Ausbeute: 62,6%) als farblose Kristalle erhalten wurden. Rf = 0,45 (CHCl₃:MeOH = 9:1, Kieselgel 60F₂₅₄, MERCK Co., Ltd). Fmoc-^DSer(C₈H₁₇): Rf = 0,45 (CHCl₃:MeOH = 9:1, Kieselgel 60F₂₅₄, MERCK Co., Ltd).
Fmoc-Amidharz (400 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt and der Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch Fmoc-Ser(Bu^t)-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Harz konstruiert wurde. Nachdem Boc-Gly schließlich durch DCC/HOBt eingeführt worden war, wurde ein Teil (250 mg) des resultierenden geschützten Peptidharzes mit TFA (10 ml) für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückständen, wodurch etwa 120 mg rohes Peptid als Niederschläge erhalten wurden. Diese Produkt wurde in 5%igem AcOH (10 ml) gelöst und auf YMC-Pack-ODS-A (5 μm, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linear Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 40 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden.
Verbindung 84. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Benzylamid; H-Ape-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-NH-CH₂-Ph
Oximharz (230 mg/0,25 mmol, Novabiochem Co., Ltd) wurde in ein Reaktionsgefäß, ausgestattet mit einem Glasfilter, gegeben, und Boc-Leu-OH·H₂O (190 mg, 0,75 mmol), das zuvor in Methylenchlorid (DCM) gelöst und über MgSO₄ getrocknet wurde, DCC (160 mg, 0,75 mmol) und 5 ml DCM wurden zugegeben und über Nacht geschüttelt. Das Reaktionsprodukt wurde mehrmals mit einer geeigneten Menge an DCM, DCM/EtOH (1:1) und DCM in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach der Einführung von Leu wurden <1> 10 ml 25% TFA/DCM zugegeben und 30 Minuten geschüttelt, und das Harz wurde mehrmals mit DCM, Isopropylalkohol (iPrOH), DCM und DMF in dieser Reihenfolge gewaschen, und <2> eine Lösung, hergestellt durch das Lösen von 0,75 mmol (3 Äquivalenten) Boc-Aminosäure, 0,75 mmol (3 Äquivalenten) TBTU und 0,75 mmol (3 Äquivalenten) HOBt und dann Zugeben von 1,25 mmol (5 Äquivalenten) DIPEA dazu in 5 ml DMF in einem Erlenmeyerkolben, in das Reakti onsgefäß eingeführt und 1 Stunde geschüttelt; dieser Vorgang wurde wiederholt durchgeführt, um die Aminosäuren nacheinander zu kondensieren. Schließlich wurde Boc-NH-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-Oximharz, 370 mg, erhalten. Das Harz wurde in etwa 5 ml DMF suspendiert, und Benzylaminhydrochlorid (180 mg, 1,25 mmol), Triethylamin (173 μl, 1,25 mmol) und Essigsäure (72 μl, 1,25 mmol) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Nach 24 Stunden wurde das Harz abfiltriert, und das Filtrat wurde eingedampft, und das resultierende Boc-geschützte Peptid wurde in 10 ml 1N HCl ausgefällt. Dieses Produkt wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet, und 5 ml TFA wurden zugegeben und 30 Minuten umgesetzt, wodurch das Boc beseitigt wurde. Die TFA wurde eingedampft, und das Produkt wurde mit Ether (Et₂O) ausgefällt, wodurch das gewünschte Produkt [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Benzylamid, 110 mg, erhalten wurde. Die Verbindungen 82, 83 und 85 wurden in derselben Weise synthetisiert.
Die folgenden Peptidderivate mit Alkylserin, außer die Verbindungen 82 bis 85, wurden in derselben Weise wie bei der Herstellung der oben beschriebenen Verbindung 50 hergestellt.
Die Ergebnisse der Massenspektrometrie und Aminosäurezusammensetzungsanalyse der Peptidderivate mit Alkylserin werden nachstehend zusammengefaßt.
Verbindung 17. [Ser³(Octyl)]-hGhrelin

ESI-MS; 3357,0 (theoretisch: 3356,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,92 (3+1), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 0,98 (1), Val; 0,99 (1), Leu; 2, Phe; 1,13 (1), Lys; 4,04 (4), His; 1,09 (1), Arg; 3,01 (3), Pro; 3,89 (4)

Verbindung 50, [Ser³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 805,5 (theoretisch: 805,0), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure·Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 0,86 (2+1), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,95 (1)

Verbindung 51, [Ser³(Octyl), ^DPhe4]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 805,4 (theoretisch: 805,0), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure·Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 0,97 (2+1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,05 (1), Pro; 1,16 (1)

Verbindung 52, [^DSer³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 805,4 (theoretisch: 805,0), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure·Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 1,51 (2+1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Verbindung 53, [^DSer³(Octyl), ^DPhe⁴]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 805,5 (theoretisch: 805,0), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure·Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 1,51 (2+1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,01 (1)

Verbindung 67, [Ser³(Bzl)]-hGhrelin

ESI-MS M; 3335,0 (theoretisch: 3334,8), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4,00 (4), Phe; 1,02 (1), Pro; 4,08 (4), Ser; 3,58 (4), Val; 0,98 (1)

Verbindung 76, [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl), Lys⁵]-Ghrelin(3-5)-Amid

ESI-MS [M+H]; 591,5 (theoretisch: 590,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,45 (1), Phe; 1, Lys; 1,00 (1)

Verbindung 77, [N-Amiopentanoyl, ^DSer³(Octyl), ^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(3-5)-Amid

ESI-MS [M+H]; 591,5 (theoretisch: 590,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,45 (1), Phe; 1, Lys; 1,01 (1)

Verbindung 78, [Aib¹, His², Ser³(Octyl), Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid

ESI-MS [M+H]; 714,6 (theoretisch: 713,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,45 (1), Phe; 1, His; 1,01 (1), Lys; 1,00 (1)

Verbindung 79, [Aib¹, His², DSer³(Octyl), ^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid

ESI-MS [M+H]; 714,5 (theoretisch: 713,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,44 (1), Phe; 1, His; 1,00 (1), Lys; 1,01 (1)

Verbindung 81, [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Amid

ESI-MS [M+H]; 576,5 (theoretisch: 575,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,49 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

Verbindung 82, [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Methylamid

ESI-MS [M+H]; 590,6 (theoretisch: 589,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,49 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

Verbindung 83, [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Ethylamid

ESI-MS [M+H]; 604,3 (theoretisch: 603,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,50 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

Verbindung 84, [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Benzylamid

ESI-MS [M+H]; 666,5 (theoretisch: 665,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,46 (1), Leu; 1, Phe; 0,98 (1)

Verbindung 85, [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Aminoethylamid

ESI-MS [M+H]; 619,6 (theoretisch: 618,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 0,47 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

(7) Beispiel der Synthese eines Derivats, enthaltend Cystein mit einer Alkylseitenkette
Verbindung 48. [Cys³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-NH₂; GSC(C₈H₁₇)FLSP-NH₂
Fmoc-Amidharz (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt and der Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch Fmoc-Ser(Bu^t)-Cys(C₈H₁₇)-Phe-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Harz konstruiert wurde. Nachdem Boc-Gly schließlich durch DCC/HOBt eingeführt worden war, wurde das resultierende geschützte Peptidharz (550 mg) mit TFA (10 ml) für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückstände, wodurch etwa 120 mg rohes Peptid als Niederschläge erhalten wurden. Dieses Produkt wurde in 10 ml 5%iger Essigsäure gelöst und auf YMC-Pack-ODS-A (5 um, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 44 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden.
Verbindung 68. [Cys³(Trt)]-hGhrelin; GSC(C-Ph₃)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Fmoc-Arg(Pmc)-Harz (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt und der Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch
Fmoc-Ser(Bu^t)-Cys(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^t)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ser(Bu^t)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP-Harz
konstruiert wurde. Nachdem Boc-Gly schließlich durch DCC/HOBt eingeführt worden war, wurde das resultierende geschützte Peptidharz (1,4 g) rückgewonnen. TFA (15 ml) wurde zu einem Teil (400 mg) des resultierenden Harzes gegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückständen unter Bildung von Niederschlägen. Etwa 90 mg der Niederschläge wurden in 40 ml Wasser gelöst, dann auf YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 60 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden.
Die folgenden Peptidderivate mit Alkylcystein wurden in derselben Weise wie bei der Herstellung der oben beschriebenen Verbindung 48 oder 68 hergestellt.
Die Ergebnisse der Massenspektrometrie und Aminosäurezusammensetzungsanalyse der Peptidderivate mit Alkylcystein werden nachstehend zusammengefaßt.
Verbindung 18. [Cys³(Octyl)]-rGhrelin

ESI-MS; 3317,0 (theoretisch: 3316,9), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,69 (3), Glx; 5,90 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,99 (2), Leu; 2, Phe; 1,02 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,98 (2), Pro; 3,87 (4)

Verbindung 48, [Cys³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 821,7 (theoretisch: 821,1), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure·Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 0,60 (2), Gly; 1,08 (1), Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,96 (1)

Verbindung 49, [Cys³(Octyl), ^DPhe⁴]-Ghrelin(1-7)-Amid

ESI-MS [M+H]; 821,6 (theoretisch: 821,1), Aminosäurezusammensetzung nach Hydrolyse mit Propionsäure Salzsäure (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser; 0,58 (2), Gly; 1,02 (1), Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,97 (1)

Verbindung 68, [Cys³(Trt)]-hGhrelin

ESI-MS 3503,0 (theoretisch: 3503,1), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,42 (3), Glx; 5,77 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,01 (1), Val; 0,94 (1), Leu; 2, Phe; 0,99 (1), Lys; 3,94 (4), His; 0,99 (1), Arg; 2,92 (3), Pro; 3,81 (4)

(8) Beispiel der Synthese eines Peptidderivats, enthaltend N-Methylaminosäuren
Verbindung 86. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl), MePhe⁴, MeLeu⁵]-Ghrelin(3-5)-Amid; NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-MePhe-MeLeu-NH₂
Fmoc-Amidharz (0,40 g, 0,25 mmol) wurde in ein Reaktionsgeufäß, ausgestattet mit einem Glasfilter, gegeben und 15 ml 20%iges Piperidin in NMP wurden zugegeben und 20 Minuten geschüttelt, wodurch die Fmoc-Gruppe entfernt wurde. Danach wurden 15 ml NMP, 1,0 mmol (4 Äquivalente) Fmoc-MeLeu-OH, 1,0 mmol (4 Äquivalente) TBTU, 1,0 mmol (4 Äquivalente) HOBt und 1,0 mmol (4 Äquivalente) DIPEA zugegeben und 1 Stunde geschüttelt, um das Fmoc-MeLeu zu kondensieren. Danach wurde die Peptidkette durch wiederholte Durchführung der Entfernung der Fmoc-Gruppe durch 20% Piperidin und Kondensation von Fmoc-Aminosäure (3 Äquivalente) durch Brom-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorphosphat (3 Äquivalente) in Gegenwart von 2,25 mmol (9 Äquivalenten) DIPEA verlängert. Das Ende der Kondensationsreaktion wurde durch Entschützen einer kleinen Menge des Harzes mit TFA und deren Untersuchen durch HPLC und Massenspektrometrie (MS) bestätigt. Nachdem Boc-NH-(CH₂)₄-CO-Ser(O-C₈H₁₇)-MePhe-MeLeu-Harz erhalten worden war, wurde dieses Harz mit TFA für 30 Minuten behandelt, wobei das Harz gespalten wurde, um das Peptid zu entschützen. Nachdem die TFA eingedampft war, wurde das Peptid mit Ether (Et₂O) gewaschen, wodurch 120 mg NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-MePhe-MeLeu-NH₂ erhalten wurden. Dieses Produkt wurde auf YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 70 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden. Nachdem dieses Derivat mit Propionsäure·HCl (50/50) bei 150°C für 2 Stunden hydrolysiert worden war, wurde die Menge des Peptids unter Verwendung des Verhältnisses der Peakfläche von Aminopentansäure, detektiert in dem Aminosäureanalysator, zu der von 10 nmol Aminopentansäure als Standard quantifiziert.

ESI-MS [M+H]; 604,5 (theoretisch: 603,8), detektierte Aminosäuren nach Hydrolyse mit Propionsäure·HCl (50/50) bei 150°C für 2 Stunden: Ser, Ape.

(9) Synthese eines Misch-Disulfidderivats
Verbindung 57. [Cys³(S-Heptyl)]-hGhrelin; GSC(S-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Ein Entschützungsreagens (15 ml), bestehend aus 88% TFA-5% Phenol-2% TIPS-5% H₂O, wurde zu einem geschützten Peptid-HMP-Harz (1 g), erhalten durch die Synthese in derselben Weise wie bei der Herstellung der Verbindung 68, zugegeben und dann bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückständen, wobei etwa 550 mg rohes [Cys³]-hGhrelin-Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt wurde auf YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 300 mg [Cys³]-hGhrelin(1-28) erhalten wurden. 40 mg (11,4 μmol) dieses Produkts wurden in Wasser (20 ml) gelöst, und 1 ml einer Lösung aus 4,4'-Dithiodipyridin (7,5 mg, 34,2 μmol) in Acetonitril wurde zugegeben und 1 Stunde stehengelassen. Nachdem das Ende der Reaktion bestätigt war, wurde die Reaktionslösung mehrmals mit Chloroform gewaschen, wodurch überschüssiges 4,4'-Dithiodipyridin und das Pyridonderivat entfernt wurden. Die wässerige Schicht (10 ml), enthaltend [ThiopyridylCys³]-hGhrelin(1-28), wurde auf pH 7,4 mit wäss. 5%igem NH₃ eingestellt, und eine Lösung aus 1-Heptan[sic.]thiol (4,5 mg, 34,2 μmol) in 2 ml Acetonitril wurde zugegeben. Nach 1 Stunde wurde die Reaktionslösung auf YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 15 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden.
Verbindung 57. [Cys³(S-Heptyl)]-hGhrelin

ESI-MS 3391,0 (theoretisch: 3391,0), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 2,76 (3), Glx; 5,81 (6), Gly; 0,99 (1), Ala; 1,01 (1), Val; 0,95 (1), Leu; 2, Phe; 0,99 (1), Lys; 3,95 (4), His; 0,99 (1), Arg; 2,93 (3), Pro; 3,84 (4)

(10) Beispiele der Synthese eines Derivats mit einem Amid in einer Seitenkette an der 3. Stelle und eines Esters in Umkehrrichtung
Verbindung 55. [Asp³(NH-Heptyl)]-hGhrelin; GSD(NH-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRRESKKPPAKLQPR
Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-Harz (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt und der Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch
Fmoc-Ser(Bu^t)-Asp(OPis)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^t)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ser(Bu^t)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP-Harz
konstruiert wurde. Nachdem Boc-Gly schließlich durch DCC/HOBt eingeführt worden war, wurde das resultierende geschützte Peptidharz (1,3 g) mit einer Lösung aus 4% TFA-Methylenchlorid (15 ml) für 15 Minuten behandelt. Das Peptidharz wurde durch Filtration rückgewonnen und mehrmals mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen, mit 4% DIEA (10 ml) und dann mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen.
Das resultierende de-Pis-Peptidharz (etwa 1,3 g) wurde mit NMP (10 ml) gequollen, und wasserlösliches Carbodiimidhydrochlorid (191,7 mg, 1,0 mmol), HOBt (135,2 mg, 1,0 mmol) und n-Heptylamin (115,2 mg, 1,0 mmol) wurden zugegeben und konnten für 8 Stunden reagieren.
Das Harz wurde durch Filtration rückgewonnen, mit NMP und Methylenchlorid gewaschen, und unter Vakuum getrocknet, wodurch etwa 1,2 g geschütztes Peptidharz erhalten wurden, wobei der Asp3-Rest heptylamidiert war. Ein Entschützungsreagens (10 ml), bestehend aus 88% TFA-5% Phenol-2% TIPS-5% H₂O, wurde zugegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückständen unter Bildung von Niederschlägen. Die Niederschläge wurden durch Filtration rückgewonnen und getrocknet, wodurch etwa 550 mg rohes Peptid erhalten wurden.
200 mg von diesem Produkt wurden in 10 ml Wasser gelöst und auf YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 54% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 120 mg des gewünschten Produktes erhalten wurden.
Verbindung 61. [Lys³(Octanoyl)]-hGhrelin; GSK(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-Harz (403 mg, 0,25 mmol, ein Produkt von ABI Co., Ltd) wurde mit 20% Piperazin für 20 Minuten behandelt und wiederholt der Einführung von Fmoc-Aminosäure durch HBTU/HOBt und der Beseitigung von Fmoc durch Piperazin nacheinander unterzogen, wodurch
Boc-Gly-Ser(tBu)-Lys(Mtt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^t)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^t)-Ser(Bu^t)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP-Harz
konstruiert wurde. Etwa 300 mg des resultierenden geschützten Peptidharzes wurden mit einer Lösung aus 1% TFA-5% TIPS-Methylenchlorid (15 ml) für 60 Minuten behandelt.
Das Peptidharz wurde durch Filtration rückgewonnen und mehrmals mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen, mit 10% DIEA (10 ml) und dann mit Methylenchlorid (30 ml) gewaschen. Das resultierende de-Mtt-Peptidharz (etwa 300 mg) wurde mit NMP (2 ml) gequollen, und Octansäure (40 μl, 0,25 mmol) und DCC (52 mg, 0,25 mmol) wurden in Gegenwart von HOBt (34 mg, 0,25 mmol) zugegeben und konnten über Nacht reagieren.
Das Harz wurde durch Filtration rückgewonnen, mit NMP und dann mit Methylenchlorid gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch etwa 300 mg geschütztes Peptidharz erhalten wurden, wobei der 3.Lysinrest octanoyliert war. Ein Entschützungsreagens (5 ml), bestehend aus 88% TFA-5% Phenol-2% TIPS-5% H₂O, wurde zugegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, gefolgt von der Zugabe von Ether zu den resultierenden Rückständen unter Bildung von Niederschlägen. Die Niederschläge wurden durch Filtration getrennt und getrocknet, wodurch etwa 234 mg rohes Peptid erhalten wurden.
Dieses Produkt wurde in 6 ml Essigsäure gelöst und auf YMC-Pack ODS-A (5 μm, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 100 mg Pulver erhalten wurden. Dieses Produkt wurde in 2 ml 50%iger Essigsäure gelöst und auf YMC-Pack PROTEIN-RP (5 μm, C4, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch etwa 52 mg Pulver erhalten wurden.
Die folgenden Verbindungen wurden in derselben Weise wie bei der Herstellung der oben beschriebenen Verbindung 55 oder 61 hergestellt.
Die Ergebnisse der Massenspektrometrie und Aminosäurezusammensetzungsanalyse der Peptidderivate, synthetisiert durch das herkömmliche Fmoc-Verfahren, werden nachstehend zusammengefaßt.
Verbindung 54. [Asp³(O-Heptyl)]-hGhrelin(1-28)

ESI-MS 3371,0 (theoretisch: 3370,9), Aminosäurezusammensetzung: Asx; 0,99 (1), Ser; 2,70 (3), Glx; 5,87 (6), Gly; 1,01 (1), Ala; 1,01 (1), Val; 0,94 (1), Leu; 2, Phe; 1,00 (1), Lys; 4,02 (4), His; 1,00 (1), Arg; 2,98 (3), Pro; 3,84 (4)

Verbindung 55, [Asp³(NH-Heptyl)]-hGhrelin(1-28)

ESI-MS 3370,0 (theoretisch: 3369,9), Aminosäurezusammensetzung: Asx; 0,88 (1), Ser; 2,95 (3), Glx; 5,97 (6), Gly; 1,21 (1), Ala; 1,03 (1), Val; 0,98 (1), Leu; 2, Phe; 1,00 (1), Lys; 3,94 (4), His; 0,92 (1), Arg; 2,91 (3), Pro; 3,99 (4)

Verbindung 56, [Dap³(Octanoyl)]-hGhrelin

ESI-MS M; 3370,0 (theoretisch: 3369,9), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,94 (3), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,00 (1), His; 0,91 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3,93 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,01 (4), Ser; 2,88 (3), Val; 0,98 (1), Dap; N.D.

Verbindung 58, [Adod³]-hGhrelin(1-28)

ESI-MS M; 3355,0 (theoretisch: 3355,0), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,91 (3), Glx; 5,95 (6), Gly; 1,01 (1), His; 0,91 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3,94 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,02 (4), Ser; 2,88 (3), Val; 0,96 (1)

Verbindung 61, [Lys³(Octanoyl)]-hGhrelin

ESI-MS M; 3412,0 (theoretisch: 3412,0), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,05 (1), Arg; 3,05 (3), Glx; 6,02 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 5,11 (5), Phe; 0,97 (1), Pro; 4,20 (4), Ser; 2,68 (3), Val; 1,00 (1)

Verbindung 62, [Trp³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3343,0 (theoretisch: 3343,9), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,00 (1), Arg; 3,03 (3), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,01 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4,00 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 3,96 (4), Ser; 2,60 (3), Trp; N.D., Val; 0,98 (1)

Verbindung 63, [Phe³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3305,0 (theoretisch: 3304,8), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 0,99 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,86 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3,98 (4), Phe; 2,01 (2), Pro; 3,99 (4), Ser; 2,67 (3), Val; 0,98 (1)

Verbindung 64, [Cha³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3411,0 (theoretisch: 3410,9), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,02 (1), Arg; 3,01 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,01 (1), His+Cha; 2,01 (1+1), Leu; 2 (2), Lys; 4,02 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 4,03 (4), Ser; 2,72 (3), Val; 0,97 (1)

Verbindung 65, [2-^LNal³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3354,0 (theoretisch: 3354,9), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,87 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3,98 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 3,94 (4), Ser; 2,73 (3), Val; 0,97 (1), Nal; N.D., (1)

Verbindung 66, [2-^DNal³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3355,0 (theoretisch: 3354,9), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,96 (6), Gly; 1,00 (1), His; 0,92 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3,94 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,02 (4), Ser; 2,91 (3), Val; 0,98 (1), Nal; N.D. (2)

Verbindung 70, [Leu³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3270,0 (theoretisch: 3270,8), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 0,99 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,88 (6), Gly; 1,01 (1), His; 1,00 (1), Leu; 3 (3), Lys; 3,96 (4), Phe; 1,00 (1), Pro; 3,89 (4), Ser; 2,65 (3), Val; 0,97 (1)

Verbindung 71, [Ile³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3270,0 (theoretisch: 3270,8), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 0,98 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,87 (6), Gly; 0,99 (1), His; 1,01 (1), Ile; 0,98 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3,97 (4), Phe; 1,00 (1), Pro; 3,97 (4), Ser; 2,65 (3), Val; 0,98 (1)

Verbindung 72, [Lys³(Octanoyl)]-hGhrelin

ESI-MS M; 3286,0 (theoretisch: 3285,8), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,94 (3), Glx; 5,95 (6), Gly; 0,99 (1), His; 0,92 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4,92 (5), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,02 (4), Ser; 2,91 (4), Val; 0,99 (1)

Verbindung 73, [Nle³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3270,0 (theoretisch: 3270,8), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,98 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4,01 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 4,01 (4), Ser; 2,71 (3), Val; 0,98 (1), Nle; N.D. (1)

Verbindung 74, [Val³]-hGhrelin

ESI-MS M; 3256,0 (theoretisch: 3256,8), Aminosäurezusammensetzung: Ala; 0,98 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,84 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3,97 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 3,94 (4), Ser; 2,64 (3), Val; 1,97 (2)

Verbindung 80, [Aib¹, HiS², ^DNal³, ^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid; Ipamorelin

ESI-MS [M+H]; 712,5 (theoretisch: 711,9), Aminosäurezusammensetzung: Phe; 1, His; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1)

Beispiel 11. Vergleich der Aktivität von peptidartigen Ghrelinderivat-Verbindungen
Die Ca-freisetzenden Aktivitäten der peptidartigen Ghrelinderivat-Verbindungen, synthetisiert in Beispiel 10, und des natürlichen Ghrelinpeptids wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
(1) Modifikation einer Seitenkette des 3. Serins
A. Position einer Octanoylgruppe
Das signifikante Strukturmerkmal von Ghrelin liegt in der Octanoylgruppe an der Hydroxylgruppe des 3. Serins. Zunächst wurde untersucht, ob es vorteilhaft ist oder nicht, daß die Stelle von Serin, das octanoyliert werden soll, die 3. Stelle ist, damit Aktivität gezeigt wird. Bei dieser Untersuchung wurde die intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität in CHO-Zellen, die den Ratten-GSH-Rezeptor exprimieren, als Indikator verwendet.
Auf der Basis von Ghrelin(1-9)Amid (einem kurzkettigen Ghrelinderivat), dessen EC₅₀-Wert bei 5,4 nM gehalten wurde, wurden [Serin²(Octanoyl), Serin³]-Ghrelin(1-9)amid, [Serin²(Octanoyl)]-Ghrelin(1-9)amid und [N^α-Octanoyl, Serin³]-Ghrelin(1-9)amid synthetisiert und ihre intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4 Ghrelinderivat-Aktivität 1

Verbindung Struktur	Ca-freisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
1. Menschen-Ghrelin GSS(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	1,3
2. Ratten-Ghrelin GSS(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	1,5
3. Ghrelin(1-9)-amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH₂	5,4
4. [Ser²(Octanoyl), Ser³]-Ghrelin(1-9)-amid H-Gly-Ser(CO-C₇H₁₅)-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH₂	1.100
5. [Ser²(Octanoyl)]-Ghrelin(1-9)-amid H-Gly-Ser(CO-C₇H₁₅)-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH₂	1.400
6. [N-Octanoyl, Ser³]-Ghrelin(1-9)-amid C₇H₁₅CO-Gly-Leu-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH₂	> 10.000

Die Aktivität wurde auf etwa 1/200 durch Übertragen einer Octanoylgruppe vom 3. Serin auf das 2. Serin in Menschen-Ghrelin (EC₅₀ = 1.100 nM) verringert.
Das Derivat mit Octanoylgruppen an sowohl der 2. als auch der 3. Stelle zeigt ebenso eine reduzierte Aktivität (EC₅₀ = 1.400 nM).
Ferner war die Aktivität durch N-Octanoylierung an nur der aminoterminalen Aminogruppe (EC₅₀ > 10.000 nM) verhältnismäßig abgeschwächt.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die Stelle der Aminosäure, die mit einer Octanoylgruppe modifiziert ist, besonders bevorzugt die 3. Stelle in dem Ghrelinmolekül ist.
B. Kettenlänge einer Fettsäure
Die intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität des Des-Octanoylderivats, abgeleitet von Ratten-Ghrelin durch Beseitigen der Seitenketten-Octanoylgruppe vom 3. Serin, betrug 3.500 nM im Vergleich zu der Aktivität (2,6 nM) des octanoylierten Ghrelins, und es ist daher offensichtlich, daß die Seitenketten-Octanoylgruppe des 3. Serins eine wichtige Rolle bei der Hervorbringung der Aktivität spielt.
Folglich wurde die Beziehung zwischen der Aktivität und der Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Seitenketten-Acylgruppe von Serin in Ratten-Ghrelin unter Verwendung verschiedener gesättigter Fettsäuren untersucht. Das heißt, die intrazellulären Ca-freisetzenden Aktivitäten der Ghrelinderivate, bei denen die Hydroxylgruppe des 3. Serins mit einer Acetylgruppe (CH₃CO-), einer Propionylgruppe (CH₃CH₂CO-), einer Butyrylgruppe (CH₃(CH₂)₂CO-), einer Hexanoylgruppe (CH₃(CH₂)₄CO-), einer Decanoylgruppe (CH₃(CH₂)₈CO-), einer Lauroylgruppe (CH₃(CH₂)₁₀CO-) und einer Palmitoylgruppe (CH₃(CH₂)₁₄CO-) acyliert war, wurden bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5 Ghrelinderivat-Aktivität 2

Verbindung Struktur	Ca-freisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
7. [Ser³]-Ratten-Ghrelin GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	3.500
8. [Ser³(Acetyl)]-rGhrelin GSS(CO-CH₃)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	780
9. [Ser³(Propionyl)]-rGhrelin GSS(CO-C₂H₅)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	n.t.
10. [Ser³(Butyryl)]-rGhrelin GSS(CO-C₃H₇)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	280
11. [Ser³(Hexanoyl)]-rGhrelin GSS(CO-C₅H₁₁)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	16
12. [Ser³(Decanoyl)]-rGhrelin GSS(CO-C₉H₁₉)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	1,7
13. [Ser³(Lauroyl)]-rGhrelin GSS(CO-C₁₁H₂₃)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	2,4
14. [Ser³(Palmitoyl)]-rGhrelin GSS(CO-C₁₅H₃₁)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	6,5

In der Tabelle gibt „n.t." an, daß die Probe nicht getestet wurde.
Der Einfluß der Kettenlänge einer Fettsäure auf die Aktivität erhöhte sich signifikant im Hinblick auf einen EC₅₀-Wert von 780 nM für das Ghrelinderivat mit der Acetylgruppe (C2) und einen EC₅₀-Wert von 280 nM für die Ghrelinderivate mit der Butanoylgruppe (C4), und die Ghrelinderivate mit der Hexanoylgruppe (C7) bewirkten eine weitere Erhöhung der Ca-freisetzenden Aktivität (EC₅₀-Wert, 16 nM), und das Ghrelin der Octanoylgruppe ermöglichte, daß die Ca-freisetzende Aktivität einen Peak erreichen konnte (EC₅₀-Wert, 1,5 nM). Selbst die Ghrelinderivate mit der Decanoylgruppe (C10) hatten eine ähnliche Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀-Wert, 1,7 nM) wie Ghrelin, und ferner betrug der EC₅₀-Wert 2,4 nM für das Ghrelinderivat mit der Lauroylgruppe (C12) und 6,5 nM für die Ghrelinderivate mit der Palmitoylgruppe (C16), was angibt, daß die Ca-freisetzende Aktivität selbst bei einer Erhöhung der Kettenlänge der Fettsäure erhalten blieb.
C. Substitution verschiedener Acylgruppen
Menschen-Ghrelinderivate wurden durch Bindung von 3-Phenylpropionsäure (HO-CO-CH₂CH₂Ph) als ein typisches Beispiel einer aromatischen Fettsäure, 3-Octensäure (CH₃(CH₂)₃CH=CH-CH₂COH) als ein typisches Beispiel einer ungesättigten Fettsäure oder 4-Methylpentansäure ((CH₃)₂CH-CH₂CH₂CO₂H) als ein typisches Beispiel einer verzweigten Fettsäure, anstelle von gesättigter Fettsäure, über eine Esterbindung an die Hydroxylgruppe des 3. Serins hergestellt und ihre Aktivität untersucht.
D. Umwandlung in Alkylgruppen
Durch Umwandeln der chemisch instabilen Esterbindung in eine chemisch stabile Ether- oder Thioetherbindung oder dergleichen können chemisch stabile Ghrelinderivate gebildet werden. Jedoch versteht es sich von selbst, daß die Aufrechterhaltung der Aktivität eine Bedingung für diese Umwandlung ist.
Daher wurden ein Etherderivat von Menschen-Ghrelin, bei dem das 3. Serie octyliert war (C₈H₁₇), und ein Thioetherderivat von Ratten-Ghrelin, bei dem das 3. Serie durch Cystein ersetzt und octyliert war, hinsichtlich ihrer Aktivität untersucht.
Ferner wurden ein Derivat von Menschen-Ghrelin, bei dem das 3. Serie benzyliert war (-CH₂Ph), und ein Derivat von Menschen-Ghrelin, bei dem das 3. Serie durch Cystein ersetzt und trityliert war (-C(Ph)₃), hergestellt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Die Ca-freisetzenden Aktivitäten des Derivats von Menschen-Ghrelin, bei dem das 3. Serie benzyliert war (-CH₂Ph), und des Derivats von Menschen-Ghrelin, bei dem das 3. Serie durch Cystein ersetzt und trityliert war (-C(Ph)₃), werden in Tabelle 13 als die der Verbindungen 67 beziehungsweise 68 gezeigt. Die Ca-freisetzende Aktivität des Derivats von Menschen-Ghrelin, bei dem 4-Methylpentansäure ((CH₃)₂CH-CH₂CH₂CO₂H) über eine Esterbindung an die Hydroxylgruppe des 3. Serins gebunden war, ist ebenso als die der Verbindung 69 in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 6 Ghrelinderivat-Aktivität 3

Verbindung Struktur	Ca-feisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
15. [Ser³(3-Phenylpropionyl)]-hGhrelin GSS(CO-CH₂CH₂Ph)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	1,4
16. [Ser³(3-Octenoyl)]-hGhrelin GSS(CO-CH₂CH=CH(CH₂)₃CH₃₎)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	1,7
17. [Ser³(Octyl)]-hGhrelin GSS(C₈H₁₇)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	1,2
18. [Cys³(Octyl)]-rGhrelin GSC(C₈H₁₇)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	5,4

Die Einführung der 3-Octenoylgruppe als ein Beispiel einer ungesättigten Fettsäure in die Seitenkette des 3. Serins ergab eine ähnliche Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 1,7 nM) wie die Aktivität der Ghrelinderivate mit einer Octanoylgruppe.
Interessanterweise blieb, selbst wenn eine Phenylpropionylgruppe eingeführt wurde, die Ca-freisetzende Aktivität hoch (EC₅₀ = 1,4 nM), und selbst wenn eine 4-Methylpentanoylgruppe (C6) als ein Beispiel verzweigter Fettsäure eingeführt wurde, betrug der EC₅₀-Wert 4,4 nM, was zeigt, daß die Ca-freisetzende Aktivität aufrechterhalten wurde (Verbindung 69 in Tabelle 13), was offenbart, daß es nicht immer notwendig ist, daß die Seitenketten-Acylgruppe im 3. Serie eine lineare Alkanoylgruppe ist.
Ferner wurden die EC₅₀-Werte der Ether- und Thioetherderivate, die erwartungsgemäß chemisch stabil sind und bei denen das 3. Serin oder das 3. Cystein octyliert waren, bei 1,2 nM bzw. 5,4 nM gehalten, was offenbart, daß es nicht immer notwendig ist, daß die Seitenkette des Aminosäurerests an der 3. Stelle eine Acylgruppe ist.
Ferner betrugen die EC₅₀-Werte von Ghrelinen, bei denen der Aminosäurerest an der 3. Stelle durch Ser (Bzl) [das heißt, das Derivat von Menschen-Ghrelin, bei dem das 3. Serin benzyliert war (-CH₂Ph)], oder durch Cys (Trt) [das heißt, das Derivat von Menschen-Ghrelin, bei dem das 3. Serin durch Cystein ersetzt und trityliert war (-C(Ph)₃)] ersetzt war, 7,6 nM bzw. 20 nM, was angibt, daß die Ca-freisetzende Aktivität gehalten wurde (Verbindungen 67 und 68 in Tabelle 13).
(2) Bestimmung der aktiven Region

Die intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin(16-28), enthaltend die ursprüngliche carboxylterminale Region, war relativ niedrig (EC₅₀ > 10.000 nM), während die EC₅₀-Werte von Menschen-Ghrelin(1-15) und Ratten-Ghrelin(1-15), beide enthaltend die ursprüngliche aminoterminale Region, 7,0 nM bzw. 8,6 nM betrugen, was angibt, daß die intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität gehalten wurde, und es wurde dadurch offenbart, daß die aktive Stelle von Ghrelin in der aminoterminalen Region vorliegt (Tabelle 7). Tabelle 7 Ghrelinderivat-Aktivität 4

Verbindung Struktur	Ca-freisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
19. Ghrelin(16-28) H-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-pro-Ala-lysLeu-Gln-Pro-Arg-OH	> 10.000
20. hGhrelin(1-15) H-Gly-Ser-Ser(CO-C-H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-OH	7,0
21. rGhrelin(1-15) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Ala-Gln-Gln-Arg-OH	8,6
22. [des Gln¹⁴]-rGhrelin GSS(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQKAQ RKESKKPPAKLQPR	1,5

Ferner sind, da die Aktivitäten von Menschen- und Ratten-Ghrelinen(1-15) fast dieselben waren, die Aminosäurereste der 11. und 12. Stelle (Arginyl-Valyl- im Menschen und -Lysyl-Aranyl- in Ratten) nicht auf diese Aminosäuren beschränkt.
Die Ergebnisse der Korrelation zwischen Struktur und Aktivität, die unter Verwendung von Menschen- oder Ratten-Ghrelin erhalten wurden, können auf Ratten- bzw. Menschen-Ghreline übertragen werden.
Ferner zeigte [Des-Glutamin¹⁴]-Ratten-Ghrelin, hergestellt durch Entfernen des 14. Glutamins aus dem Ghrelin, eine Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 1,5 nM) ähnlich der von Ratten-Ghrelin, was angibt, daß die Aminosäure in der Mitte des Ghrelinmoleküls deletiert werden kann.
(3) Peptidkettenlänge und Einführen einer basischen Gruppe in das Carboxylende
Auf der Grundlage von Ghrelin(1-15), das nachgewiesenermaßen eine relativ starke Aktivität aufweist, wurde ein Derivat durch geeignetes Deletieren carboxylterminaler Aminosäurereste aus dem Ghrelin(1-15) hergestellt und dessen Aktivität bewertet.

Die Aktivitäten der kurzkettigen Derivate mit Carboxylsäure am Carboxylende und der kurzkettigen Derivate, die an dem Carboxylende amidiert sind, sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Ghrelinderivat-Aktivität 5

Verbindung Struktur	Ca-freisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
23. hGhrelin(1-11) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-OH	15
24. rGhrelin(1-11) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-OH	15
25. Ghrelin(1-10) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-OH	19
26. Ghrelin(1-9) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-OH	38
27. Ghrelin(1-8) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-OH	100
28. Ghrelin(1-8)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-NH₂	13
29. Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	2,6
30. Ghrelin(1-6)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅) -Phe-Leu-Ser-NH₂	4,8
31. Ghrelin(1-5) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-OH	68
32. Ghrelin(1-5)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-NH₂	6,2
33-1. Ghrelin(1-4) H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-OH	480
33-2. Ghrelin(1-4)-Amid H-G1y-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-NH₂	160
34. Ghrelin(1-3)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-NH₂	> 10.000

Die Ca-freisetzende Aktivität von Ghrelin(1-3)amid war relativ niedrig (EC₅₀ > 10.000 nM). Der EC₅₀ von Ghrelin(1-4), bei dem Phenylalanin an das Ghrelin(1-3) zugefügt war, betrug 480 nM, und der EC₅₀ des carboxylterminalen Amidderivats betrug 160 nM, wodurch offenbart wird, daß sie eine signifikante Ca-freisetzende Aktivität aufweisen.
Ferner betrugt die Aktivität von Ghrelin(1-5)amid, bei dem Leucinamid an das Ghrelin(1-4) zugefügt war, etwa 26mal höher (EC₅₀ = 6,2 nM) als die von Ghrelin(1-4)amid, was eine Ca-freisetzende Aktivität auf demselben Niveau wie dem von natürlichem Ghrelin zeigt.
Die höchste Ca-freisetzende Aktivität wurde in Ghrelin(1-7)amid festgestellt, und sein EC₅₀-Wert war beinahe äquivalent zu dem von natürlichem Ghrelin.
Aufgrund des obigen Ergebnisses konnte der Strukturfaktor, der zum Exprimieren der Ghrelin-Aktivität wesentlich ist, der Sequenz der 4. aminoterminalen Reste zugeschrieben werden, da aber seine Affinität für den Ghrelinrezeptor oder die Signaltransduktion durch Zugabe eines Restes wie Leucin an der 5. Stelle drastisch verbessert wird, wird ein Rest, wie Leucin bevorzugt an der 5. Stelle zugefügt.
Wie aus dem obigen Ergebnis hervorgeht, wird die Ca-freisetzende Aktivität gewöhnlich durch Amidierung der carboxylterminalen Carbonsäure erhöht.
Beispielsweise war die Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 5,4 nM) von Ghrelin(1-9) nach der Amidierung etwa 7mal höher als die Aktivität (EC₅₀ = 38 nM) vor der Amidierung, und die Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 160 nM) von Ghrelin(1-4) war nach der Amidierung etwa 3mal höher als die Aktivität (EC₅₀ = 480 nM) vor der 5 Amidierung. Ferner war die Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 13 nM) von Ghrelin(1-8)amid, hergestellt aus Ghrelin(1-9)amid durch Entfernen des basischen Histidinrestes 9, niedriger als die Aktivität (EC₅₀ = 5,4 nM) von Ghrelin(1-9)amid, während die Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 2,6 nM) von Ghrelin(1-7)amid, hergestellt durch Entfernen von Glutaminsäure 8 als saure Aminosäure, höher als die Aktivität (EC₅₀ = 13 nM) vor der Entfernung.
Eine Wirkung der Amidierung ist die Neutralisation der negativen Ladung der Carbonsäure, und das obige Ergebnis zeigt, daß die Basizität der carboxylterminalen Aminosäure in dem kurzkettigen Derivat signifikant zur Erhöhung der Aktivität beiträgt.
Auf der Grundlage dieses Ergebnisses wurden Derivate, die am Carboxylende Basizität besitzen und Ghrelin(1-7)amid, das hohe Aktivität zeigt, ähneln, hergestellt und deren Aktivität untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Ghrelinderivat-Aktivität 6

Verbindung Struktur	Ca-freisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
35. [Lys⁸]-Ghrelin(1-8)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Lys-NH₂	1,1
36. [Arg⁸]-Ghrelin(1-8)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Arg-NH₂	1,1
37. [Lys⁶]-Ghrelin(1-6)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Lys-NH₂	12
38. [Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Lys-NH₂	10
39. [^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-^DPhe-Lys-NH₂	1.700

Die Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 12 nM) von [Lysin]-Ghrelin(1-6)amid mit Lysin, zugefügt an dem Carboxylende von Ghrelin(1-5), war leicht niedriger als die Aktivität (EC₅₀ = 4,8 nM) von Ghrelin(1-5), während die Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 10 nM) von Ghrelin(1-4) mit Lysin, zugefügt an dem Carboxylende, etwa 50mal höher war als die Aktivität (EC₅₀ = 480 nM) vor der Zugabe. Ferner war die Ca-freisetzende Aktivität (EC₅₀ = 1,1 nM), des Amidderivats mit Arginin oder Lysin, zugefügt an dem Carboxylende von Ghrelin(1-7), viel stärker als die Aktivität (EC₅₀ = 2,6 nM) von Ghrelin(1-7)amid.
Es wurde offenbart, daß sich in beinahe allen Fällen die Aktivität durch Maskieren der Azidität am Carboxylende und Einführen einer basischen Gruppe erhöhte.
(4) Aminoterminales Glycin und 2. Serinrest
Auf der Basis von Ghrelin(1-7)amid (EC₅₀ = 2,6 nM) [Verbindung 29 in Tabelle 8] oder Ghrelin(1-9)amid (EC₅₀ = 5,4 nM) [Verbindung 3 in Tabelle 4], bei denen Aktivität festgestellt wurde, wurde der Einfluß auf die Aktivität von aminoterminalem Glycin und dem 2. Serin untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Tabelle 10 Ghrelinderivat-Aktivität 7

Verbindung Struktur	Ca-freisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
40. [N-Aminopentanoyl]-Ghrelin(3-7)-amid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	3,4
41. [N-Acetyl]-Ghrelin(1-10) CH₃CO-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-OH	> 10.000
42. [N-Tyr]-rGhrelin YGSS(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR	120
43. [N-Glycyl]-Ghrelin(3-7)-Amid H-Gly-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	380
44. [Len²]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Leu-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	42
45. [His²]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-His-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	35
46. [Lys²]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Lys-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	24
47. [Gly²]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Gly-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	78

Die Aktivität von N^α-Acetyl-Ghrelin(1-10), bei dem die aminoterminale Aminogruppe in dem Ghrelin(1-10) blockiert war, war relativ niedrig (EC₅₀ > 10.000 nM). Wie oben beschrieben, war die Aktivität von [N^α-Octanoyl, Serin³]-Ghrelin(1-9)amid (Verbindung 6 in Tabelle 1) auch relativ gering (EC₅₀ > 10.000 nM), und daher ist die aminoterminale Aminogruppe bevorzugt nicht blockiert, wenn die Ca-freisetzende Aktivität hervorgebracht werden soll.
Andererseits war die Ca-freisetzende Aktivität von N^α-Aminopentanoyl-Ghrelin(3-7)amid, bei dem das aminoterminale Glycin und das 2. Serie durch 5-Amino-n-pentansäure (NH₂-(CH₂)₄-CO-) mit einer Länge von zwei Resten ersetzt war, beinahe gleich geblieben (EC₅₀ = 3,4 nM), die Ca-freisetzende Aktivität von [N^α-Glycyl]-Ghrelin(3-7)amid, bei dem das 2. Serie deletiert worden war, war niedriger (EC₅₀ = 380 nM) und die Ca-freisetzende Aktivität von [N-Tyrosyl]-Ratten-Ghrelin mit einem Tyrosinrest, zugefügt am Aminoende in dem Ratten-Ghrelin, war niedriger (EC₅₀ = 120 nM), so daß zum Erhalt einer stärkeren Aktivität die aminoterminale Aminogruppe bevorzugt an einer Stelle, die zwei Reste lang ist, vom octanoylierten 3. Serinrest bis zum Aminoende vorliegt.
Ferner betrugen die EC₅₀-Werte der Derivate von Ghrelin(1-7)amid, bei dem das 2. Serie durch Leucin, Glycin, Histidin und Lysin ersetzt war, 42 nM, 78 nM, 24 nM bzw. 35 nM, was eine leicht niedrigere Ca-freisetzende Aktivität als die von Ghrelin(1-7)amid zeigt.
Da dieses Ergebnis zeigt, daß der 2. Serinrest (-NH-CH(CH₂OH)-CO-) durch die Teilstruktur -CH₂-CH₂-CO- in Aminopentansäure ersetzt werden kann, fungiert der 2. Serinrest zumindest als ein Spacer zum Trennen der aminoterminalen Aminogruppe von Ghrelin um einen vorbestimmten Abstand von der 3. Octanoylgruppe. Der Grund dafür, daß die Aktivität beim Ersetzen des 2. Serinrestes durch 5-Aminopentansäure beibehalten wird, liegt darin, daß die Basizität des Aminoendes durch Einführen ihrer Alkylaminstruktur erhöht wurde.
Im Ergebnis soll die Aminogruppe des aminoterminalen Glycinrestes dem Aminoende des Ghrelinmoleküls Basizität verleihen, so daß die Aktivität von Ghrelin hervorgerufen wird, und daher ist die Aminogruppe an dem Aminoende bevorzugt nicht blockiert.
Ferner soll der 2. Serinrest als ein Spacer zum Trennen der Aminogruppe an dem Aminoende um einen vorbestimmten Abstand von der 3. Octanoylgruppe fungieren, und deshalb kann der 2. Serinrest durch eine Aminosäure- oder Nicht-Aminosäureverbindung mit einer relativ geringvolumigen Seitenkette ersetzt sein. Das heißt, die Stelle der Octanoylgruppe in dem Ghrelinmolekül wird in bezug auf die aminoterminale Aminogruppe definiert, und diese Stellenbeziehung bildet einen Teil der aktiven Struktur von Ghrelin.
Das heißt, die Seitenkette der 2. Aminosäure ist bevorzugt relativ geringvolumig wie in Serie, Alanin und Norvalin, eher als eine Aminosäure mit einer voluminösen Struktur, und ein Aminosäurerest, der die Flexibilität der nachbarständigen Reste nicht beeinträchtigt, ist als die 2. Aminosäure bevorzugt. Da ferner die Ca-freisetzende Aktivität von N^α-Aminopentanoyl-Ghrelin(3-7)amid beinahe gehalten wird (EC₅₀ = 3,4 nM), kann das 2. Serie durch eine Nicht-Aminosäureverbindung ersetzt werden.
(5) Optische Aktivität des 3. und 4. Aminosäurerestes
Auf der Grundlage der Struktur von Ghrelin(1-7)amid wurden seine Derivate, in denen das 3. L-Serin und das 4. L-Phenylalanin durch die entsprechenden L-Aminosäuren ersetzt sind, hergestellt, und der Einfluß, den die Konfiguration der 3. und 4. Aminosäure auf die Ca-freisetzende Aktivität hat, wurde untersucht. Speziell wurden auf der Grundlage von [Serin³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)amid (EC₅₀ = 5,8 nM) [Verbindung 50 in Tabelle 11] und [Cystein³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)amid (EC₅₀ = 7,4 nM) [Verbindung 48 in Tabelle 11], die eine gute Aktivität beibe halten, deren Derivate, in denen das 3. Serin und das 4. Phenylalanin durch die entsprechenden L- oder D-Aminosäuren ersetzt sind, hergestellt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt. Aufgrund dieser Ergebnisse sind sowohl die 3. als auch die 4. Aminosäure bevorzugt L-Aminosäuren. Tabelle 11 Ghrelinderivat-Aktivität 8

Verbindung Struktur	Ca-freisetzende Aktivität EC₅₀ (nM)
48. [Cys³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-Cys(C₈H₁₇)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	7,4
49. [Cys³(Octyl), ^DPhe⁴]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-Cys(C₈H₁₇)-^DPhe-Leu-Ser-Pro-NH₂	3.000
50. [Ser³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	5,8
51. [Ser³(Octyl), ^DPhe⁴]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-Ser(C₈K₁₇)-^DPhe-Leu-Ser-Pro-NH₂	2.200
52. [^DSer³(Octyl)]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-^DSer(C₈H₁₇)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH₂	> 10.000
53. [^DSer³(Octyl), ^DPhe⁴]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-^DSer(C₈H₁₇)-^DPhe-Leu-Ser-Pro-NH₂	> 10.000

(6) Art und Weise der Bindung einer Seitenkette an der 3. Stelle

Derivate von Ghrelin, bei denen die ursprüngliche Esterbindung durch einen Ester in Umkehrrichtung (Verbindung Nr. 54), ein Amid (Verbindung Nr. 55 und 56), ein Disulfid (Verbindung Nr. 57) und Methylen (Verbindung Nr. 58) ersetzt war, wurden so hergestellt, daß die Seitenkette an der 3. Stelle dieselbe Länge wie die der Ghrelinkette (-CH₂-O-CO-C₇H₁₅) hatte. Außerdem wurden Esterderivate mit sterischer Hinderung an dem β-Kohlenstoffatom der Aminosäure an der 3. Stelle (Verbindung Nr. 59 und 60) und ein Amidderivat, bei dem drei Methyleneinheiten verlängert waren (Verbindung Nr. 61), hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefaßt. Tabelle 12 Ghrelinderivat-Aktivität 9

Verbindung Struktur	Aktivität EC₅₀ (nM)
54. [Asp³(O-Heptyl)]-hGhrelin GSD(O-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	5,1
55. [Asp³(NH-Heptyl)]-hGhrelin GSD(NH-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	11
56. [Dap³(Octanoyl)]-hGhrelin GS-NH-^DCH(CH₂NHCO-C₇H₁₅)-CO-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	2,6
57. [Cys³(S-Heptyl)]-hGhrelin GSC(S-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	1,4
58. [Adod³]-hGhrelin GS-NH-CH(n-C₁₀H₂₁)-CO-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	0,91
59. [Thr³(Octanoyl)]-hGhrelin GST(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	10
60. [Leu², Thr³(Octanoyl)]-hGhrelin GLT(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	46
61. [Lys³(Octanoyl)]-hGhrelin GSK(CO-C₇H₁₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	32

Die Aktivität von Verbindung 58, bei der die Seitenkette an der 3. Stelle ausschließlich durch Methyleneinheiten ersetzt war, zeigt die stärkste Aktivität (EC₅₀-Wert = 1 nM oder weniger). Die Aktivität der anderen Derivate variierte in Abhängigkeit des Typs der Bindung, aber es wurde bestätigt, daß die Bindungsweise einer Seitenkette der Aminosäure 3 keinen signifikanten Einfluß auf die Aktivität ausübt.
(7) Hydrophobie einer Seitenkette an der 3. Stelle

Derivate, bei denen die Ser(Octanoyl)-Gruppe 3 durch eine hydrophobe Aminosäure ersetzt war, von denen die meisten natürliche Aminosäuren sind, wurden hergestellt und deren Aktivität wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefaßt. Tabelle 13 10. Aktivität von Ghrelinderivaten

Verbindung Struktur	Aktivität EC₅₀ (nM)
62. [Trp³]-hGhrelin GSWFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	31
63. [Phe³]-hGhrelin GSFFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	2.000
64. [Cha³]-hGhrelin GS-Cha-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	19
65. [2-^LNal³]-hGhrelin GS-^LNal-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	8,2
66. [2-^DNal³]-hGhrelin GS-^DNal-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	> 10.000
67. [Ser³(Bzl)]-hGhrelin GSS(CH₂-C₆H₅)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	7,6
68. [Cys³(Trityl)]-hGhrelin GSC(C-Ph₃)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	20
69. [Ser³(4-Methylpentanoyl)]-hGhrelin GSS(CO-CH₂CH₂CH(CH₃)₂)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	4,4
70. [Leu³)-hGhrelin GSLFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	4.400
71. [Ile³]-hGhrelin GSIFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	> 10.000
72. [Lys³]-hGhrelin GSKFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	120
73. [Nle³]-hGhrelin GS-Nle-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	2.800
74. [Val³]-hGhrelin GSVFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	1.600

Die EC₅₀-Werte der Derivate mit einer aromatischen hydrophoben Aminosäure wie Tryptophan, Cyclohexylalanin oder Naphthylalanin an der 3. Stelle betrugen 31 nM, 19 nM bzw. 8,2 nM, was zeigt, daß die Ca-freisetzende Aktivität beibehalten wurde. Wenn Phenylalanin an der 3. Stelle eingeführt wurde, war die Ca-freisetzende Aktivität unerwarteterweise etwas niedriger, aber selbst wenn stärker hydrophobes Ser(Bzl) oder Cys(Trityl) an der 3. Stelle eingefügt wurde, wurde die Ca-freisetzende Aktivität ebenso beibehalten, wodurch bestätigt wurde, daß die Hydrophobie der Seitenkette an der 3. Stelle zum Hervorbringen der Aktivität stärker bevorzugt ist.
Wenn andererseits eine aliphatische hydrophobe Aminosäure, wie Leucin, Isoleucin, Norleucin oder Valin, an der 3. Stelle eingefügt wurde, wurde die Ca-freisetzende Aktivität der Derivate im allgemeinen gehalten, aber war etwas niedriger als die der Derivate, bei denen die aromatische Aminosäure einfügt war. Die Aktivität der Verbindung 73 mit Norleucin an der 3. Stelle betrug EC₅₀ = 2.800 nM, während die Aktivität von 6-Amino-Norleucin (Lysin; Verbindung 72) mit einer Aminogruppe, zugefügt an einer Seitenkette von Norleucin, auf 120 nM hinsichtlich der EC₅₀-Werte erhöht war, wodurch bestätigt wurde, daß ähnlich der oben beschriebenen Basizität des Carboxylendes die Basizität einer Seitenkette an der 3. Stelle auch bevorzugt ist.
(8) kurzkettige Ghrelinderivate
Wie oben beschrieben wurde herausgefunden, daß ein Ghrelinfragment der aminoterminalen Aminosäuren 1 bis 4 signifikante Aktivität zeigt und diese Aktivität durch Zufügen von Leucin an der 5. Stelle zu dem Fragment weiter erhöht wird; der 3. Aminosäurerest bevorzugt einer, der eine hydrophobe Seitenkette aufweist, ist; die Aktivität durch Einführen eines basischen Rests erhöht wird; und die Aminosäurereste 1 und 2 durch eine Nicht-Aminosäureverbindung mit einer Länge von zwei Resten wie δ-Aminosäure ersetzt werden können. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden verschiedene kurzkettige Ghrelinderivate, basierend auf der aminoterminalen Region (1-5), hergestellt, wie in den Verbindungen Nr. 76 bis 87 in den Tabellen 14 und 15 gezeigt, und deren Aktivitäten untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 14 und 15 zusammengefaßt.

Verbindung 80 ist bekannt (Ipamorerin; K. Raum et al., Eur. J. of Endocrinol., 139: 552-561, 1998). Tabelle 14 Ghrelinderivat-Aktivität 11

Verbindung Struktur	Aktivität EC₅₀ (nM)
75. [Lys⁷]-Ghrelin(1-7)-Amid H-Gly-Ser-Ser(CO-C₇H₁₅)-Phe-Leu-Ser-Lys-NH₂	11
76. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl), Lys³]-Ghrelin(3-5)-Amid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Lys-NH₂	12
77. [N-Aminopentanoyl, ^DSer³(Octyl), ^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(3-5)-Amid NH₂-(CH₂)₄-CO-^DSer(C₈H₁₇)-^DPhe-Lys-NH₂	1.600
78. [Aib¹, His², Ser³(Octyl), Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid H-Aib-His-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Lys-NH₂	34
79. [Aib¹, His², ^DSer³(Octyl), ^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid H-Aib-His-^DSer(C₈H₁₇)-DPhe-Lys-NH₂	38
80. [Aib¹, His², ^DNal³, ^DPhe⁴, Lys⁵]-Ghrelin(1-5)-Amid H-Aib-His-^DNal-^DPhe-Lys-NH₂	2,5

Da die Ca-freisetzende Aktivität der bekannten Verbindung 80 hoch war (2,5 nM), wurde die Aktivität der Verbindung 79, abgeleitet von Verbindung 80, durch Ersetzen von 2-D-Naphthylalanin an der 3. Stelle durch D-Octylserin auch untersucht, und im Ergebnis betrug ihr EC₅₀-Wert 38 nM, was zeigt, daß die Aktivität gehalten wurde. Verbindung 77 mit D-Octylserin und D-Phenylalanin an der 3. und 4. Stelle, die dieselbe Aminosäurestruktur wie die von Verbindung 79 aufweisen, abgesehen von den Aminosäuren 1 und 2, zeigte eine niedrigere Aktivität (1.600 nM), und diese Ergebnisse zeigen, daß die Sequenz oder Struktur der Aminosäuren 1 und 2 auch die sterische Konfiguration der Seitenketten der 3. und 4. Aminosäure, die zum Zeigen der Aktivität wichtig sind, beeinflussen.

Das heißt, in dem Fall, wo die Aminosäuren 1 und 2 durch Aminopentansäure ersetzt waren, wurde die Aktivität bei 34 nM gehalten, selbst wenn 2-D-Naphthylalanin an der 3. Stelle und D-Phenylalamin an der 4. Stelle durch deren korrespondierende L-Aminosäuren (Verbindung 78) ersetzt wurden, und daher erfordert die Aminosäuresequenz (Gly-Ser) an der 1. bis 2. Stelle in Ghrelin die L-Konfiguration für die Aminosäuren 3 und 4, aber selbst wenn die Aminosäuren 3 und 4 die D-Konfiguration aufweisen, ist die Aktivität durch Einführung einer anderen Aminosäuresequenz wie Aib-His signifikant. Es wurde ebenso bestätigt, daß ungeachtet der L- oder D-Konfiguration an der 3. und 4. Stelle die Aktivität durch Einführung der Aminopentansäure an der 1. und 2. Stelle hervorgebracht wird. Tabelle 15 Ghrelinderivat-Aktivität 12

Verbindung Struktur	Aktivität EC₅₀ (nM)
81. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Amid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-NH₂	11
82. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Methylamid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-NH-CH₃	12
83. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5)-Ethylamid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-NH-C₂H₃	22
84. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl))-Ghrelin(3-5)-Benzylamid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-NH-CH₂-C₆H₅	98
85. [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5), Amin oethylamid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-Phe-Leu-NH-(CH₂)₂-NH₂	3,5
86. [N-Aminopentanoyl, Ser₃(Octyl), MePhe₄, MeLeu₅]-Ghrelin(3-5)-Amid NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(C₈H₁₇)-MePhe-MeLeu-NH₂	82
87. [^DLeu⁵]-hGhrelin GSS(CO-C₇H₁₅)F-^DL-SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR	220

Unter Verwendung von [N-Aminopentanoyl, Ser³(Octyl)]-Ghrelin(3-5), basierend auf der aminoterminalen Region (1-5) von Ghrelin, wurde die Korrelation zwischen Aktivität und Struktur der carboxylterminalen Region untersucht. Die Aktivität seiner Derivate, bei denen carboxylterminales Leucin an der 5. Stelle mit Amid, Methylamid, Ethylamid oder Benzylamid modifiziert war, wurde beibehalten, verringerte sich gewöhnlich aber, was die EC₅₀-Werte von 11 nM, 12 nM, 22 nM bzw. 98 nM zeigen. Andererseits wurde durch Ersetzen von Ethylamid durch Aminoethylamid die Aktivität erhöht, was ein EC₅₀-Wert von 3,5 nM zeigt, was offenbart, daß bevorzugt dem Carboxylende des Ghrelinmolekül Basizität verliehen wird.
Diese verschiedenen carboxylterminalen Amidderivate sind nützliche Verbindungen aufgrund ihrer Beständigkeit in vivo gegen Zersetzung durch Carboxypeptidasen. Verbindung 86 (EC₅₀ = 86 nM), enthaltend N-Methylaminosäure, ist ebenso eine nützliche Verbindung aufgrund ihrer Beständigkeit gegen das Enzym.
Beispiel 12. GH-freisetzende Aktivität von Ghrelinderivaten in Ratten
(1) GH-freisetzende Aktivität von verschiedenen langkettigen Ghrelinderivaten in Ratten
18 nmol/kg Verbindung 17 ([Ser³(Octyl)]-hGhrelin), 30 nmol/kg Verbindung 18 ([Cys³(Octyl)]-rGhrelin), 100 nmol/kg Verbindung 65 ([2-^LNal³]-hGhrelin) oder 18 nmol/kg Verbindung 15 ([Ser³(3-Phenylpropionyl)]-hGhrelin) wurden schnell und intravenös in Ratten vom IGS-SD-Stamm (etwa 7 Wochen alt) unter Anästhesie mit Nembutal für jede Probe (n = 3) verabreicht. Fünfzehn Minuten nach der Verabreichung wurde Plasma gesammelt und die Konzentration von GH in Plasma wurde durch Radioimmunoassay (Biotrak/Amersham) gemessen. Einzeln wurden 0,2% Rinderserumalbumin (BSA)-physiologische Kochsalzlösung, 6 nmol/kg rGhrelin und hGhrelin bzw. 80 nmol/kg Ipamorelin (Verbindung 80) an andere Ratten als Kontrolle verabreicht, und die Konzentrationen von GH im Plasma 15 Minuten nach der Verabreichung wurden verglichen (für jede Probe n = 3).

Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt. Verbindung 17 ([Ser³(Octyl)]-hGhrelin), Verbindung 18 ([Cys³(Octyl)]-rGhrelin) und Verbindung 15 ([Ser³(3-PhPrl)]-hGhrelin) zeigten eine starke GH-freisetzende Aktivität, und die GH-freisetzende Aktivität von [2-^LNal³]-hGhrelin zeigte eine gute Korrelation mit der intrazellulären Ca-freisetzenden Aktivität. Tabelle 16 GH-freisetzende Aktivität verschiedener langkettiger Ghrelinderivate

verabreichte Verbindung	EC50-Wert (nM)	Dosis (nmol/kg)	GH-Gehalt in Plasma 15 min nach Verabreichung (ng/ml)
verabreichte Verbindung	EC50-Wert (nM)	Dosis (nmol/kg)	Ratte 1	Ratte 2	Ratte 3	M ± SD
physiologische Kochsalzlösung	–	–	32	52	59	49 ± 12
hGhrelin	1,3	6	1802	1613	2203	1873 ± 301
rGhrelin	1,5	6	2056	1082	1205	1448 ± 530
Ipamorelin (Verbindung 80)	2,5	80	377	260	1184	607 ± 503
[Ser³(Octyl)]-hGhrelin	1,2	18	1626	1602	1743	1657 ± 75
[Cys³(Octyl)]-rGhrelin	5,4	30	2786	2342	2354	2494 ± 253
[Ser³(Phenylpropionyl)]-hGhrelin	1,4	18	2119	2078	1581	1926 ± 299
[2-^LNal³]-hGhrelin	8,2	100	1637	1576	1357	1524 ± 147

(2) Veränderung von GH in Plasma durch Verabreichung von [Cys³(Octyl)]-Ratten-Ghrelin
Nachdem die Verbindung 18 ([Cys(Octyl)]-Ratten-Ghrelin) intravenös in einer Dosis von 5 μg/Kopf an männliche Ratten vom Wistar-Stamm (etwa 260 bis 280 g) unter Anästhesie mit Nembutal verabreicht wurde, wurde GH, das in das Blut freigesetzt wurde, gemessen. Physiologische Kochsalzlösung als Kontrolle und Ratten-Ghrelin (5 μg/Kopf) wurden ebenso verabreicht und mit Verbindung 18 verglichen.

Wie in den Tabellen 17 bis 19 gezeigt, war die GH-Sekretion-fördernde Aktivität von [Cys³(Octyl)]-Ratten-Ghrelin äquivalent zu natürlichem Ratten-Ghrelin (das heißt, C_max von sekretiertem GH betrug etwa 1.100 ng/ml für beide Ghreline), und ferner verlängerte sich gewöhnlich die Sekretionszeit. Die intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität der Verbindung 18 betrug 5,4 nM ausgedrückt als EC₅₀. Tabelle 17 Veränderung des GH-Gehalts in Plasma durch Verabreichung von [Cys³(Octyl)]-Ratten-Ghrelin

[Cys(C18)³]-Ratten-Ghrelin 5 μg/Kopf	Zeit (min)
[Cys(C18)³]-Ratten-Ghrelin 5 μg/Kopf		0	5	10	15	20	30	60
GH-Gehalt in Plasma (ng/ml)	Ratte 1	377	338	687	927	900	469	98
	Ratte 2	101	294	258	300	358	245	86
	Ratte 3	59	476	949	1229	1417	704	133
	Ratte 4	33	530	959	1451	1299	800	220
	Ratte 5	32	613	1060	1561	1359	726	122
Mittelwert ± SD		120 ± 146	450 ± 133	783 ± 324	1093 ± 506	1067 ± 445	589 ± 229	132 ± 53

Tabelle 18 Veränderung des GH-Gehalts in Plasma durch Verabreichung von physiologischer Kochsalzlösung

physiologische Kochsalzlösung		Zeit (min)
physiologische Kochsalzlösung		0	5	10	15	20	30	60
GH-Gehalt in Plasma (ng/ml)	Ratte 1	0	88	129	133	116	107	430
	Ratte 2	204	122	118	134	128	69	36
	Ratte 3	77	0	0	0	0	0	11
	Ratte 4	0	0	0	0	48	27	110
	Ratte 5	0	0	0	0	0	0	210
Mittelwert ± SD		56 ± 89	42 ± 58	49 ± 67	53 ± 73	58 ± 61	41 ± 47	159 ± 170

Tabelle 19 Veränderung des GH-Gehalts in Plasma durch Verabreichung von Ratten-Ghrelin

Ratten-Ghrelin 5 μg/Kopf		Zeit (min)
Ratten-Ghrelin 5 μg/Kopf		0	5	10	15	20	30	60
GH-Gehalt in Plasma (ng/ml)	Ratte 1	143	186	425	405	215	56	3
	Ratte 2	10	1396	2028	1566	876	242	27
	Ratte 3	838	163	443	681	419	120	36
	Ratte 4	348	556	1387	1469	1293	663	100
	Ratte 5	0	875	1380	1009	1414	452	20
Mittelwert ± SD		268 ± 348	635 ± 517	1133 ± 690	1026 ± 498	843 ± 525	306 ± 250	37 ± 37

Beispiel 13. Steigerung der Wirkung von Ghrelin auf den Appetit
(1) Appetit-steigernde Wirkung durch Verabreichung in den Ventrikel
Physiologische Kochsalzlösung, enthaltend Ratten-Ghrelin in verschiedenen Konzentrationen, wurde um 8:45 Uhr in den Gehirnventrikel von männlichen Ratten vom Wistar-Stamm (16 bis 20 Tiere pro Gruppe), die jeweils 300 bis 325 g wogen, verabreicht. Als Kontrolle wurde Ghrelin-freie physiologische Kochsalzlösung in Ventrikel verabreicht. Nach der Verabreichung wurde den Ratten der freie Nahrungszugang erlaubt, und die Menge an Nahrung, die für 2 Stunden nach der Verabreichung aufgenommen wurde, wurde gemessen. Wie in 6 gezeigt, wurde eine Zunahme der Menge an aufgenommener Nahrung in den Ratten, denen 50 pmol Ghrelin intrazerebroventrikulär verabreicht worden waren, beobachtet, und eine dosisabhängige Zunahme der Menge an aufgenommener Nahrung wurde bei der Ratte, der 200 pmol und 500 prol Ghrelin verabreicht wurden, beobachtet, aber die Menge an aufgenommener Nahrung wurde bei den Ratten, denen 2 nmol Ghrelin verabreicht worden waren, geringer. Üblicherweise nahm die Ratte die Nahrung in der Nacht auf, so daß die Ratte am Morgen einen vollen Magen hatte und selten Nahrung aufnahm (siehe die Ratte, der physiologische Kochsalzlösung als Kontrolle in 6 verabreicht wurde), und daher zeigt die Zunahme der Menge an aufgenommener Nahrung durch Verabreichen von Ghrelin in den Gehirnventrikel, daß Ghrelin eine Appetit-steigernde Wirkung hat.
(2) Appetit-steigernde Wirkung durch intravenöse Verabreichung

50 μg/kg Ratten-Ghrelin wurden intravenös in die Schwanzvenen 9 Monate alter männlicher SD-Ratten (Sprague-Dawley-Ratten) (5 Tiere) und Wister-Ratten (4 Tiere) verabreicht, und die Menge an Nahrung, die innerhalb von zwei Stunden nach der Verabreichung aufgenommen wurde, wurde gemessen (bewertet von 16:00 bis 19:00 Uhr). Wie in Tabelle 20 gezeigt, wurde die Menge an aufgenommener Nahrung offensichtlich durch die intravenöse Verabreichung von Ghrelin erhöht, im Vergleich zu der Menge an aufgenommener Nahrung ohne die Verabreichung von Ratten-Ghrelin, das unter Verwendung desselben Tiers in derselben Stunde an einem anderen Tag bestimmt wurde. Das heißt, es wurde gezeigt, daß Ghrelin sogar bei intravenöser Verabreichung eine Appetitsteigernde Wirkung hat. Tabelle 20

		Menge an aufgenommener Nahrung (g)
Stamm	Ratte Nr.	Verabreichung von Ghrelin	keine Verabreichung von Ghrelin
S-D	1	3,2	2,2
	2	3,7	1,0
	3	3,2	0,1
	4	2,7	1,3
	5	2,6	0,8
	Mittelwert	3,1	1,1
	SD	0,4	0,8
Wister	6	2,3	0,2
	7	1,9	1,4
	8	1,6	0,1
	9	2,1	0,3
	Mittelwert	2,0	0,5
	SD	0,3	0,6

Beispiel 14. Verbesserung der Magenfunktionen durch Ghrelin
Um die Wirkung von Ghrelin auf Magenfunktionen zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Männliche SD-Ratten (7 bis 8 Wochen alt, 200 bis 280 g schwer) fasteten für 20 Stunden oder mehr und wurden dann in dem Experiment verwendet. Die Ratten wurden durch intraperitoneale Verabreichung von Urethan (1,25 g/kg) anästhetisiert und mittels eines Heizkissens und einer Wärmelampe warm gehalten. Eine Trachealkanüle wurde eingeführt, und der Ösophagus wurde mit einem Seidenfaden abgebunden, und jede Ratte wurde der folgenden Operation unterzogen, um die Magensäuresekretion oder Magenmotilität zu messen. In dem Experiment unter Verwendung eines Tiers bei Bewußtsein wurde die Ratte der Operation zur Messung der Magensäuresekretion oder Magenmotilität unter leichter Anästhesie durch Inhalation von Ether unterzogen.
In dem Experiment für die Magensäuresekretion unter Anästhesie mit Urethan wurde die Operation gemäß dem Verfahren, vorgeschlagen von Ohno et al. [Ohno, T., et al., Jpn. J. Pharmacol. 43, 429-439 (1987)] durchgeführt. Kurz, in der Rückenlage wurde der Bauch inzidiert und der Magen und der Zwölffingerdarm wurden freigelegt. Ein Polyethylenschlauch wurde in den vorderen Teil des Magen eingeführt, um eine akute Magenfistel zu präparieren. Ein weiterer Polyethylenschlauch wurde in den Magen nach der Trennung des Zwölffingerdarms eingeführt, und der umliegende Teil des Magenausgangs wurde abgebunden und fixiert. Die Innenseite des Magens wurde mit physiologischer Kochsalzlösung infundiert, die auf pH 7,0 in einem Behälter eingestellt und auf 37°C erwärmt war. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1,0 ml/min. Die Infusionsflüssigkeit wurde auf pH 7,0 eingestellt durch Titrierung mit 100 mM NaOH mittels einer pH-Fixiereinheit (Hiranuma, Comitite-8). Nachdem bestätigt wurde, daß die Grundmenge an Magensäuresekretion stabil war, wurde die Testchemikalie intravenös verabreicht, und die Sekretionsrate von Magensäure wurde in 5-Minuten-Intervallen gemessen. Vier Ratten wurden in jeder Gruppe verwendet.
In dem Experiment wurde während des Aufwachens die Ratte derselben Operation unter leichter Anästhesie durch Inhalation von Ether unterzogen, und dann wurde ein kleiner Schnitt in der Flanke gemacht, und ein Infusionsschlauch wurde aus dem Körper entfernt. Der exponierte Magen und Zwölffingerdarm wurden wieder in den Bauch eingebracht, die exzidierte Stelle vernäht und das Tier in Rückenlage in einem Ballman-Ratten-Fixierkäfig festgebunden, und nachdem bestätigt wurde, daß sich die Ratte von der Anästhesie erholt hatte, wurde die Ratte dem Experiment unterzogen. Der Ösophagus wurde abgebunden, aber es wurde keine Trachealkanüle eingeführt.
Für das Experiment zum Messen der Magenmotilität unter Urethananästhesie wurde ein miniaturisiertes Ballon-Verfahren gemäß dem Verfahren verwendet, das von Takeuchi & Nobuhara vorgeschlagen wurde [Takeuchi, K. und Nobuhara, Y., Digestive Diseases and Sciences 30, 1181-1188 (1985)]. Das heißt, ein mit Wasser gefüllter Ballon und ein Stützkatheter wurden nach der Abtrennung des vorderen Teils des Magens in den Magen eingeführt. Er wurde so fixiert, daß er auf einer Drüse der Magenlinie lag, und ein Ende des Katheters wurde mit einem Druckgeber verbunden (LPU-0.1-350-0-II, von Nihon Kohoden Corporation). Nachdem bestätigt wurde, daß die Magenmotilität stabil war, wurde die Testchemikalie akkumulativ bei 60-Minuten-Intervallen intravenös verabreicht. Für die Magenmotilität wurden die Amplitude des Innendrucks im Magen und die Anzahl an Schrumpfreaktionen der Schrumpfmotilität mit einer Amplitude von 20 cm H₂O oder mehr bei 10-Minuten-Intervallen gemessen. Vier Tiere wurden in jeder Gruppe verwendet. In dem Experiment unter Verwendung von Tieren bei Bewußtsein wurden die Ratten derselben Operation unter leichter Anästhesie durch Inhalation von Ether unterzogen, und nachdem die exzidierte Stelle vernäht war, wurde das Tier in Bauchlage in einem Ballman-Ratten-Fixierkäfig festgebunden. Nachdem bestätigt wurde, daß sich die Ratte von der Anästhesie erholt hatte, wurde das Tier dem Experiment unterzogen.
Ratten-Ghrelin und Histamindihydrochlorid wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und in einer Dosis von 1 ml/kg in die Schwanzvene verabreicht. Zur Untersuchung, ob die Vagusnervwirkung in die Wirkung von Ghrelin involviert ist, wurde Atropinsulfat subkutan 30 Minuten vor der Verabreichung von Ghrelin verabreicht, oder die Nackenvagusnervenbündel wurden bilateral durchtrennt. Um die Beteiligung des Histamin-H₂-Rezeptors an der Wirkung von Ghrelin zu untersuchen, wurde Famotidin (Gaster^®, hergestellt von Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.) subkutan 30 Minuten vor der Verabreichung von Ghrelin verabreicht. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler gezeigt. Die statistische Analyse wurde mittels multipler Vergleichstests von Dunnett durchgeführt. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant beurteilt.
Wie in 7A und in Tabelle 21 gezeigt, wurde die Sekretion von Magensäure in einer dosisabhängigen Weise bei intravenöser Verabreichung von Ratten-Ghrelin in einer Dosis von 0,8 bis 20 μg/kg an die Ratte unter Urethananästhesie gefördert.
Bei der Ratte unter Anästhesie war vor der Verabreichung von Ghrelin kaum eine Spontanmotilität des Magens zu beobachten. Wenn Ratten-Ghrelin in einer Dosis von 0,8 bis 20 μg/kg an die Ratte unter dieser Bedingung intravenös verabreicht wurde, wurden sowohl die Amplitude als auch die Frequenz der Magenmotilität gefördert, wie in 8A & B und in Tabelle 21 gezeigt wird. Diese Reaktionen wurden unmittelbar nach der Verabreichung von Ratten-Ghrelin beobachtet. Durch Verabreichung von 20 μg/kg wurde die Sekretion von Magensäure erhöht und erreichte einen maximalen Gehalt innerhalb 20 Minuten und verringerte sich allmählich innerhalb 90 Minuten nach der Verabreichung. Wie in 7A & B gezeigt, war die maximale Reaktion der Magensäuresek retion-fördernden Wirkung durch Verabreichung von 20 μg/kg Ratten-Ghrelin beinahe mit der Reaktion, die durch intravenöse Verabreichung von 3 mg/kg Histamin induziert wurde, vergleichbar. Die Wirkung der Förderung der Amplitude der Magenmotilität erreichte die maximale Reaktion innerhalb von 10 Minuten bei jeder Dosis, und durch die Verabreichung von 20 μg/kg Ghrelin verringerte sich die Wirkung bis 50 Minuten nach der Verabreichung allmählich.
Ferner wurde, wie in Tabelle 21 gezeigt, die Wirkung der Förderung der Magensekretion, induziert durch die Verabreichung von 20 μg/kg Ratten-Ghrelin, durch die Vorbehandlung mit Atropin oder bilaterale zervikale Vasotomie beinahe vollständig inhibiert, aber diese Wirkung wurde durch die Vorbehandlung mit subkutaner Verabreichung von 1 mg/kg Famotidin, d. h. eines Histamin-H₂-Rezeptorantagonisten, nicht beeinflußt. Ferner wurde die Wirkung der Förderung der Magenmotilität, induziert durch Verabreichung von Ratten-Ghrelin, durch die Vorbehandlung mit Atropin oder bilaterale zervikale Vagotomie vollständig inhibiert. Diese Ergebnisse bestätigten, daß die fördernde Wirkung von Ghrelin auf die Magenfunktionen nicht über den histaminergen Mechanismus erfolgt, sondern über die Aktivierung des Vagusnervensystems.

Durch intravenöse Verabreichung von Ratten-Ghrelin (4 und 20 μg/kg) wurde die Sekretion von Magensäure in der Ratte bei Bewußtsein in derselben Weise wie bei der Ratte unter Urethananästhesie gefördert. Im Vergleich zu der Ratte unter Anästhesie wies die Ratte bei Bewußtsein spontane Magenmotilität vor der Verabreichung der Testchemikalie auf, und selbst unter dieser Bedingung wurde durch Verabreichen von 0,8 bis 20 μg/kg Ratten-Ghrelin an die Ratte die Magenmotilität zusammen mit ihrer Amplitude und Frequenz gefördert. Das obige Ergebnis bestätigte, daß durch intravenöse Verabreichung von Ghrelin die Förderung der Magensäuresekretion und die Förderung der Magenmotilität nicht nur bei der anästhetisierten Ratte, sondern auch bei der Ratte bei Bewußtsein auftritt. Tabelle 21

Behandlung		Magensäuresekretion (μ Äquivalent/60 min)	Magenmotilität
Behandlung		Magensäuresekretion (μ Äquivalent/60 min)	Frequenz (Zeiten/60 min)	Amplitude (cm H₂O/60 min)
physiologische Ko	chsalzlösung	17,6 ± 1,2	1,3 ± 1,0	1,7 ± 1,0
Ratten-Ghrelin	0,8 μg/kg i. v. Injektion	24,5 ± 2,2	35,5 ± 18,1	6,7 ± 4,4
	4 μg/kg i. v. Injektion	23,5 ± 2,6	60,8 ± 25,6	11,1 ± 5,3
	20 μg/kg i.v. Injektion	43,3 ± 4,6 (*1)	100,5 ± 20,4 (*1)	21,8 ± 2,5 (*1)
intravenöse Injektion von 20 μg/kg Ratten-Ghrelin	+ Atropin 1 mg/kg subkutane Verabreichung	26,1 ± 3,9 (*2)	0 (*3)	0 (*3)
	+ Entfernung des Vagusnervs	18,4 ± 3,7 (*3)	0 (*3)	0 (*3)
	+ Famotidin 1 mg/kg subkutane Verabreichung	43,0 ± 4,2	NT	NT

Symbole in der Tabelle zeigen:

*1, p < 0,01; *2, p < 0,05 und *3, p < 0,01
NT: nicht getestet.

Beispiel 15. Fördernde Wirkung von Ghrelin und Ghrelinderivaten auf das Zellwachstum
Um die Wirkung von verabreichtem Ghrelin auf die Förderung des Zellwachstums zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. 20 μg/kg Ratten-Ghrelin oder Ratten-Ghrelin vom Thioether-Typ (Verbindung 18 [Cys³(Octyl)]-hGhrelin) wurden in die Schwanzvenen männlicher Wister-Ratten (7,5 Wochen alt) verabreicht. 17 Stunden nach der Verabreichung wurde ³H-Thymidin in die Schwanzvenen verabreicht und 1 Stunde danach wurden der Zwölffingerdarm, der Leerdarm und das Knochenmark exzidiert. Die Einführung von ³H-Thymidin in DNA-Fraktionen dieser Gewebe wurde gemessen, um die Zellwachstums-fördernde Wirkung von Ghrelin und Ghrelin-Derivaten zu untersuchen. Die Gewebe wurden dünn geschnitten und unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators homogenisiert, und nach der Zentrifugation wurde der Überstand mit Trichloressigsäure ausgefällt, wodurch eine DNA-Fraktion erhalten wurde. Die Radioaktivität der DNA-Fraktion wurde durch einen Flüssigszintillationszähler gemessen.
Wie in Tabelle 22 gezeigt, wurde die Einführung von ³H-Thymidin in diese Gewebe oder Organe durch intravenöse Verabreichung von Ratten-Ghrelin oder Ratten-Ghrelin vom Thioether-Typ erhöht, und es wurde bestätigt, daß Ghrelin eine Zellwachstums-fördernde Wirkung im Zwölffingerdarm, Leerdarm und dem Knochenmark zeigt.

Der Zeitverlauf der Zellwachstums-fördernden Wirkung nach der intravenösen Verabreichung von Ghrelin war ähnlich dem nach der Verabreichung von GHRH (Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor), was darauf schließen läßt, daß die Zellwachstums-fördernde Wirkung von Ghrelin über GH (Wachstumshormon), das hauptsächlich aus der Hypophyse sekretiert wird, erfolgt. Daraus wurde gefolgert, daß die Regulierung der GH-Sekretion durch Ghrelin als physiologischer Faktor für die Organismusregulierung verantwortlich ist, und es wenige Nebenerwirkungen gibt, die bei der GH-Verabreichung auftreten könnten. Tabelle 22

	Vergleichsbeispiel	Ratten-Ghrelin	Ghrelin vom Thioether-Typ
Knochenmark (in Geweben)	100,0 ± 17,8%	141,7 ± 30,1%	144,5 ± 16,5%
Zwölffimgerdarm (in DNA-Fraktion)	100,0 ± 14,2%	136,0 ± 17,8%	114,0 ± 11,7%
Leerdarm (in DNA-Fraktion)	100,0 ± 6,8%	159,0 ± 7,5%	151,0 ± 23,6%

Zahlenwerte zeigen das Verhältnis (%) der Einführung des Radioisotops in bezug auf den Mittelwert (in dreifacher Ausfertigung) des Vergleichsbeispiels (d. h. die Gruppe erhielt physiologische Kochsalzlösung).
Beispiel 16. Quantifikation von Ghrelin durch Anti-Ghrelin-Antikörper
Unter Verwendung der Antikörper, die gegen amino- und carboxyl-terminales Ratten-Ghrelinpeptid als Antigene hervorgerufen werden, wurde Ghrelin in verschiedenen lebenden Geweben durch Radioimmunoassay (RIA) quantifiziert.
Kaninchen wurden mit [C-Cys]-Ratten-Ghrelin[1-11] (Ratten-Ghrelinpeptid der Aminosäuren 1 bis 11 am Aminoende mit Cystein, das an das Carboxylende davon gebunden ist) und [C-Cys]-Ratten-Ghrelin[13-28] (Rat ten-Ghrelinpeptid der Aminosäuren 13 bis 28 am Aminoende mit Cystein, das an das Carboxylende davon gebunden ist) als Antigene immunisiert, um den aminoterminalen Antikörper (Anti-[C-Cys]-Ratten-Ghrelin[1-11]Antigen) beziehungsweise den carboxylterminalen Antikörper (Anti-[C-Cys]-Ratten-Ghrelin[13-28]Antigen) zu bilden.
Wie in 9a gezeigt, betrug der IC₅₀ (50% Inhibitorkonzentration) von Ratten-Ghrelin 3,1 fmol bei der Bindung zwischen isotopenmarkiertem Ratten-Ghrelin und dem aminoterminalen Antikörper. Obgleich der aminoterminale Antikörper 100%ige Kreuzreaktivität mit chemisch synthetisiertem Menschen-Ghrelin und Ratten-Ghrelin zeigt, zeigte er nur 0,3% Kreuzreaktivität mit n-Hexanoyl-Ratten-Ghrelin, bei dem das 3. Serin mit einer n-Hexanoylgruppe modifiziert war, und 20% Kreuzreaktivität mit n-Decanoyl-Ratten-Ghrelin, bei dem das 3. Serin mit einer n-Decanoylgruppe modifiziert war. Ferner reagierte der aminoterminale Antikörper nicht mit Ghrelin, aus dem Fettsäure freigesetzt wurde.
Der aminoterminale Antikörper zeigte eine ähnliche Affinität für Ratten-Ghrelin (28 Aminosäuren), Menschen-Ghrelin (28 Aminosäuren) und Ghrelin-27 (Ghrelin, bestehend aus 27 Aminosäuren), das im Mensch und in der Ratte zu finden ist. Folglich wurde bestätigt, daß der aminoterminale Antikörper natürliches Ghrelin spezifisch erkennt, bei dem das 3. Serin mit einer n-Octanoylgruppe modifiziert ist.
Wie in 9b gezeigt, zeigten natürliches Ratten-Ghrelin, das mit einer n-Octanoylgruppe modifiziert ist, und Ratten-Ghrelin, das durch Entfernen von n-Octanoyl aus dem natürlichen Ratten-Ghrelin modifiziert ist, einen ähnlichen IC₅₀-Wert von 44 fmol beim Binden zwischen radioisotopenmarkiertem Ratten-Ghrelin und dem carboxylterminalen Antikörper. Das heißt, es wurde bestätigt, daß der carboxylterminale Antikörper dieselbe Affinität für Ghrelin, das mit Fettsäure modifiziert ist, und für Ghrelin, aus dem Fettsäure freigesetzt wurde, aufweist.
Diese Ergebnisse offenbaren, daß in bezug auf Ghreline, die in verschiedenen Geweben in einem lebenden Körper vorkommen, Ghrelin, bei dem das 3. Serin mit einer n-Octanoylgruppe modifiziert ist, durch den aminoterminalen Antikörper quantifiziert werden kann, während sowohl Ghrelin, das mit Fettsäure modifiziert ist, als auch Ghrelin, aus dem Fettsäure freigesetzt war, durch den carboxylterminalen Antikörper quantifiziert werden kann.

Tabelle 23 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Gehalte von Fettsäure-modifiziertem Ghrelin und die Gehalte von sowohl Fettsäure-modifiziertem Ghrelin als auch Ghrelin, aus dem Fettsäure freigesetzt war, in verschiedenen Geweben in einem lebenden Körper.

Gewebe	Menge an Ratten-Ghrelin, die mit Antikörper reagiert (fmol/mg Gewebe)
Gewebe	C-RIA	N-RIA
Hypothalamus	1,8 ± 0,3	< 0,05
Hirnanhangdrüse	8,5 ± 3,1	< 0,05
Schilddrüse	3,5 ± 2,0	< 0,05
Unterkieferdrüse	8,8 ± 1,3	< 0,05
Thymusdrüse	3,5 ± 0,4	< 0,05
Nebenniere	3,1 ± 0,4	< 0,05
Herzvorhof	2,3 ± 0,2	0,07 ± 0,01
Herzkammer	2,1 ± 0,1	< 0,05
Aorta	2,4 ± 0,7	0,14 ± 0,03
Lunge	3,1 ± 0,4	< 0,05
Leber	2,8 ± 0,5	< 0,05
Bauchspeicheldrüse	2,6 ± 0,6	0,15 ± 0,05
Magen	1779,8 ± 533,9	377,31 ± 55,83
Zwölffingerdarm	106,7 ± 7,3	20,57 ± 0,69
Leerdarm	60,2 ± 17,2	10,73 ± 5,44
Krummdarm	20,5 ± 5,1	0,16 ± 0,08
Blinddarm	15,1 ± 2,5	1,70 ± 5,44
Dickdarm	10,4 ± 0,7	< 0,05
Niere	5,4 ± 0,3	< 0,05
Keimdrüse	2,8 ± 0,2	< 0,05
Plasma (1 ml)	219,6 ± 71,8	4,02 ± 1,91

In der Tabelle gibt C-RIA das Ergebnis der Quantifikation durch Radioimmunoassay unter Verwendung des carboxylterminalen Antikörpers an, während N-RIA das Ergebnis der Quantifikation durch den aminoterminalen Antikörper angibt.
Die Zahlenwerte in der Tabelle geben die "Mittelwert ± Standardabweichung" an.
Beispiel 17. Herstellung von Ratten-Ghrelin(1-28) durch ein Semisyntheseverfahren
Syntheseschema
In diesem Beispiel wurde rGhrelin aus Fragmenten von rGhrelin(6-28) und Ghrelin(1-7), die zuvor durch ein gentechnisches Verfahren bzw. eine chemische Synthese hergestellt wurden, folgendermaßen hergestellt.
Speziell wurde β-Galactosidase 97S-(QFE-SRHRR)-rGhrelin(6-28), das heißt, ein Fusionsprotein von β-Galactosidase 97S und rGhrelin(6-28), zwischen denen eine Aminosäuresequenz(-QFE-SRHRR-) mit einer Stelle, die durch V8-Protease und KexII-Protease gespalten wird, vorkommt, in E. coli exprimiert. Dieses Fusionsprotein wurde mit V8-Protease behandelt, um SRHRR-rGhrelin(6-28) abzuschneiden. Dann wurden alle Aminogruppen von SRHRR-rGhrelin(6-28) mit Boc-Gruppen geschützt, und das resultierende Peptid wurde mit KexII-Protease behandelt, wodurch [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28) erhalten wurde, aus dem die aminoterminale Aminogruppe von Ser 6 isoliert worden ist. Dieses geschützte Fragment wurde mit [N^α-Boc]-rGhrelin(1-5)-Osu, das durch chemische Synthese erhalten wurde, kondensiert, und das resultierende [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin wurde mit einer Säure behandelt, wodurch rGhrelin hergestellt wurde.
In diesem Beispiel wurde die Semisynthese von rGhrelin beschrieben, aber hGhrelin kann durch dieses Verfahren auch synthetisiert werden.
Ferner wurde in diesem Beispiel das Fragment (1-5) mit Fragment (6-28) kondensiert, aber chemisch synthetisierte aminoterminale Fragmente (1-2), (1-3) und (1-7) können jeweils mit mit carboxylterminalen Fragmenten (3-28), (4-28) und (8-28) mit einer beliebigen Länge, bestehend aus Aminosäuren an der 28. Stelle bis zu der 3. Stelle, konstruiert durch gentechnische Mittel, kondensiert werden, um Ghrelin als ein Fusionsprotein herzustellen. Um die Anzahl von Schritten der chemischen Synthese zu verringern, ist die Kondensation zwischen (1-2) und (3-28) oder zwischen (1-3) und (4-28) vorteilhaft. Aus der Sicht der vollständigen Verhinderung der Razemisierung, die durch Kondensation hervorgerufen wird, ist die Kondensation zwischen (1-7) und (8-28) unter Verwendung von Pro 7 besonders bevorzugt.
Konstruktion des Expressionsvektors pG97s rGR und Expression von Ghrelin(6-28) als Fusionsprotein
Auf der Grundlage der Nukleotidesequenz von Ratten-Ghrelin-cDNA wurde ein DNA-Fragment für rGhrelin(6-28) mit einer Aminosäuresequenz QFE-SRHRR in der Präpro-Region durch Annealing unter Verwendung eines vollständigen synthetischen Oligomers erhalten.
Um dieses DNA-Fragment in pG97SnPPH34 ( JP-A 9-296000 ) einzuführen, wurde pG97SnPPH34 mit SalI und SmaI behandelt, wodurch sein menschliches Nebenschilddrüsenhormon-Präkursorgen deletiert wurde. Das Produkt wurde mit Alkaliphosphatase behandelt und durch T4-Ligase an das rGhrelin-Derivat-Genfragment, das zuvor mit SalI und Kinase behandelt wurde, ligiert. Das ligierte Plasmid wurde in den E.-coli-DH5-Stamm transformiert, wodurch das Plasmid pG97s rGR erhalten wurde.
Das resultierende Plasmid pG97s rGR wurde in E.-coli-M25 (ompT) transformiert, und die resultierende Transformante wurde auf 3 Schalen, jeweils enthaltend 200 ml flüssiges Terrific-Broth-Medium (1,2% Trypton, 2,4% Hefeextrakt, 0,4% Glucose), kultiviert und unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Als die Konzentration (OD₆₆₀) der Bakterienzelle 0,8 erreichte, wurde Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) mit einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben, um das rGhrelin-(6-28)-Fusionsprotein zu exprimieren. Ferner wurde die Bakterienzelle für 4 Stunden kultiviert und dann durch Zentrifugation gesammelt. Die Struktur des rGhrelin-(6-28)-Fusionsproteins lautet folgendermaßen:
rGhrelin-6-28-Fusionsprotein: (β-Galactosidase-97S)-QFE-SRHRR-rGhrelin(6-28)
Prozessierung des rGhrelin-6-28-Fusionsproteins und Reinigung des [SRHRR]-rGhrelins(6-28)
20 ml der resultierenden Bakterienzelle wurden in TE-Puffer suspendiert, und die Bakterienzelle wurde durch eine French-Presse aufgespalten. Danach wurde der Einschlußkörper durch Zentrifugation bei 3000 U/min für 15 Minuten gesammelt, erneut in 10 ml TE-Puffer und deionisiertem Wasser suspendiert, und zentrifugiert, wodurch der Einschlußkörper gewaschen wurde. Der Einschlußkörper wurde mit deionisiertem Wasser verdünnt, so daß sein OD₆₆₀ auf 50,0 verringert wurde, und Tris-HCl (pH 8,2) wurde mit einer Endkonzentration von 50 mM zugegeben, und der Einschlußkörper wurde in Harnstoff (Endkonzentration: 3,5 M) gelöst. Zu dieser Lösung, die bei 30°C gehalten wurde, wurde das rV8-Proteasederivat V8D5 (hierin nachstehend mit V8D5 abgekürzt) (JP-A9-47291) mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben, und die Lösung wurde mit dem Enzym bei 30°C für 20 Minuten behandelt. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 3%iger Essigsäure (AcOH) beendet.
Deionisiertes Wasser wurde in 1,5fachem Überschuß zu der terminierten V8D5-Enzymreaktionslösung, die das [SRHRR]-rGhrelin(6-28) enthält, zugegeben, dann wurde diese Lösung auf pH 5,0 mit 5N NaOH eingestellt, wodurch das β-Galactosidasederivatfragment ausfiel, das dann durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 10 Minuten entfernt wurde.
Der Überstand, der [SRHRR]-rGhrelin(6-28) enthielt, wurde auf eine TSK-ODS-80Ts-Säule (Harzteilchendurchmesser 20 um, 50 mm Innendurchmesser × 100 mm, TOSOH Co., Ltd.), die zuvor mit 0,1% TFA äquilibriert wurde, aufgebracht. Das gewünschte Peptid wurde durch einen linearen Gradienten von 100% Puffer A [0,8 ml/min, 1% Acetonitril, 0,1% TFA] bis 100% Puffer B [50% Acetonitril, 0,095% TFA] eluiert, der auf ein Endvolumen von 5 Säulen programmiert war. Die Fraktionen, die das gewünschte Peptid [SRHRR]-rGhrelin(6-28) enthielten, wurden gesammelt (etwa 50 mg).
Reinigung von [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrel(6-28)
6 Äquivalent-mol (19,2 mg, 6 × 15 μmol) von Di-t-butylbicarbonat wurden zu 50%iger wässeriger Acetonitrillösung, enthaltend etwa 50 mg (15 μmol) [SRHRR]-rGhrelin(6-28), zugegeben, dann auf pH 9 mit Triethylamin eingestellt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. Essigsäure wurde mit einer Endkonzentration von 0,5% zu der Reaktionslösung zugegeben, und nachdem das Acetonitril eingedampft war, wurde die Lösung zu einer EMPORE-Octyl (C8) HD 4 mm/1 ml-Patrone, zuvor äquilibriert mit 10% Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, zugegeben, und nachdem die Säule mit der Äquilibrierungslösung gewaschen war, wurde [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28) mit 90% Acetonitril, enthaltend 0,095% TFA, eluiert. Das Acetonitril wurde eingedampft und 6 ml Lösung, enthaltend etwa 30 mg des gewünschten Peptids, wurden erhalten.
Die Massenspektrometrie zeigte hauptsächlich zwei Peptide, deren Molekulargewicht nach der Boc-Modifikation um 500 (ermitteltes Molekulargewicht 3895) oder um 600 (ermitteltes Molekulargewicht 3995) höher war als das Molekulargewicht (ermitteltes Molekulargewicht = 3396, theoretisches Molekulargewicht = 3398) vor der Boc-Modifikation.
Spaltung von [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28) durch Kex2-Protease und dessen Reinigung.
Eine Calciumchloridlösung und Tris-HCl, pH 8,2, wurden mit Endkonzentrationen von 0,3 mM bzw. 20 mM zu der resultierenden wässerigen Lösung aus [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28) (30 mg, 6 ml) zugegeben. Nachdem eine Lösung aus Kex2-Protease ( JP-A 10-229884 ) bei einer Konzentration von 1 × 10⁵ Einheiten/ml zugegeben worden war, wurde die Probe mit der Protease bei 30°C für 60 Minuten behandelt.
Bei der HPLC verschwand ein Peak von [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28), wurde ein Peak von [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28) zu der Seite von Hydrophobie verschoben, und wurde ein Peak eines hydrophilen Fragments, das Boc-SRHRR entspricht, beobachtet.
Nachdem das Verschwinden des Ausgangsmaterials bestätigt war, wurde die Reaktionslösung auf einen pH von 3,5 mit wässeriger Essigsäure eingestellt und auf Umkehrphasen-Chromatographiesäule ODS-80Ts (Säulenvo lumen 1,66 cm³, Harzteilchendurchmesser 20 μm, TOSOH Co., Ltd.), zuvor äquilibriert mit 1,0% Acetonitril, enthaltend 1% Essigsäure, aufgebracht. Nachdem die Säule mit der Äquilibrierungslösung in einem Volumen von 5 Säulen gewaschen wurde, wurde [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28) mit einen linearen Gradienten von 1,0% Acetonitril bis 90,0% Acetonitril, jeweils enthaltend 1% Essigsäure, eluiert, der auf ein Endvolumen von 5 Säulen programmiert war. Die Hauptfraktionen wurden lyophilisiert, wodurch 6,2 mg des gewünschten geschützten Peptids erhalten wurden.
Fragmentkondensation und Entschützung
Triethylamin (51,0 μl, 0,366 mmol) und eine Lösung aus Di-t-butylbicarbonat (78,0 mg, 0,0356 mmol) in TFE (4,00 ml) wurden jeweils zu einer Lösung aus Ghrelin(1-5) (190 mg, 0,0301 mmol, Verbindung 31) in Trifluorethanol (TFE) (6,00 ml) zugegeben und bei Raumtemperatur 13 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und Ether (20,0 ml) wurde zu den resultierenden Rückständen gegeben, wobei 180,5 mg [N^α-Boc]-rGhrelin(1-5) erhalten wurden.
Dann wurde HOSu (5,20 mg, 0,0452 mmol) zu einer Lösung aus [N^α-Boc)-rGhrelin(1-5) (22,0 mg, 0,0301 mmol) in DMF (1,00 ml) gegeben, und DIPCI (7,30 μl, 0,0466 mmol) wurden dazu in einem Bad bei –30°C 5 gegeben. Nachdem das Gemisch in dem Bad bei –30°C für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel eingedampft und die resultierenden Rückstände wurden mit Ether in Pulver umgewandelt, wodurch 14,1 mg [N^α-Boc)-rGhrelin(1-5)-OSu als ein Succinimidester von [N^α-Boc]-rGhrelin(1-5) erhalten wurden.
Dann wurden [N^α-Boc]-rGhrelin(1-5)-OSu (3,3 mg, 3,96 μmol) und Triethylamin (2,5 μl, 17,9 μmol) zu einer Lösung in DMF (0,6 ml) aus [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGhrelin(6-28) (6,10 mg, 2,18 μmol) zugegeben, hergestellt durch das rekombinante Verfahren, und bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft, und TFA (2,00 ml) wurde direkt zu den resultierenden Rückständen unter Kühlung auf Eis zugegeben und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Die TFA wurde eingedampft und Ether wurde zu den Rückstanden zugegeben, wobei 6,2 mg rohes Peptid, das Ghrelin(1-28) enthielt, erhalten wurden.
Dieses Produkt wurde in 2 ml 5%iger Essigsäure (AcOH) gelöst und auf YMC-Pack-ODS-A (5 μm, 20 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min) von 0 bis 95% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 60 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt, lyophilisiert, auf YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 10 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 4,7 ml/min) von 7,5 bis 21,3% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 30 Minuten eluiert.
Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt, lyophilisiert und auf YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 10 mm × 250 mm) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten (Fließgeschwindigkeit: 4,7 ml/min) von 7,5 bis 21,3% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure für 30 Minuten eluiert. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 2,1 mg rGhrelin(1-28) erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte eine Retentionszeit, die mit der von Standard-rGhrelin(1-28) in analytischer HPLC übereinstimmt, und wies eine intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität von EC₅₀ = 1,5 nM auf, die zu der von natürlichem Ghrelin äquivalent war.

ESI-MS 3315,0 (theoretisch: 3314,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 3,74 (4), Glx; 5,69 (6), Gly; 1,18 (1), Ala; 2,05 (2), Leu; 2, Phe; 0,98 (1), Lys; 4,98 (5), His; 1,03 (1), Arg; 1,96 (2), Pro; 4,01 (4)

Verbindung 87 [^DLeu⁵]-rGhrelin(1-28)
Als ein Nebenprodukt der Succinimidveresterung von [N^α-Boc]-rGhrelin(1-5) oder der Kondensation der Fragmente wurden 0,8 mg [^Dleu⁵]-rGhrelin(1-28) erhalten. Seine intrazelluläre Ca-freisetzende Aktivität betrug EC₅₀ = 220 nM.

ESI-MS 3315,0 (theoretisch: 3314,8), Aminosäurezusammensetzung: Ser; 3,80 (4), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,23 (1), Ala; 2,07 (2), Leu; 2, Phe; 0,97 (1), Lys; 4,92 (5), His; 1,02 (1), Arg; 1,97 (2), Pro; 4,11 (4) GC-MS-Analyse von Leucin nach der Hydrolyse in D₂O/DCl: L-Leu; 1,17 (1), D-Leu; 0,83 (1)

Industrielle Anwendbarkeit
Bei der Verabreichung der neuen peptidartigen Verbindung der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon an Menschen oder Tiere zeigt diese eine ausgezeichnete Wirkung als ein pharmazeutisches Präparat zur Förderung des Wachstums von Kinder und Linderung des Fehlers von Stoffwechselfunktionen, die durch GH-Mangel verursacht werden, durch Induzieren der GH-Sekretion, ohne beträchtliche Nebenwirkungen zu verursachen, und ihr Antikörper zeigt eine ausgezeichnete Wirkung als ein Mittel zur Diagnose von Krankheiten, die dem GH-Mangel zuzuschreiben sind, und als ein Forschungsinstrument auf wissenschaftlichem Gebiet. SEQUENZPROTOKOLL

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Claims

Peptidartige Verbindung, (a) in der der zweite oder dritte Aminosäurerest am Aminoende eine modifizierte Aminosäure ist, in der eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, die 1 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, am α-Kohlenstoffatom der Aminosäure über eine Ester-, Ether-, Thioether-, Thioester-, Amid-, Carbamid-, Thiocarbamid- oder Disulfidbindung und entweder über oder nicht über eine Alkylengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen eingeführt ist, oder bei der eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, am α-Kohlenstoffatom der Aminosäure eingeführt ist, wobei H an das α-Kohlenstoffatom der modifizierten Aminosäure gebunden ist, (b) die eine Aminosäuresequenz enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, wie in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 angegeben, oder eine Aminosäuresequenz, bei der mindestens eine Aminosäure deletiert, ersetzt und/oder zugefügt sein kann, wobei die zweite oder dritte Aminosäure am Aminoende durch die modifizierte Aminosäure ersetzt ist, wobei die mindestens eine Aminosäure nicht deletiert, ersetzt und/oder zugefügt ist bei der ersten bis vierten Aminosäure am Aminoende in der Aminosäuresequenz außer, dass Aminosäure 2 oder 3 am Aminoende durch die modifizierte Aminosäure ersetzt ist und (c) die eine Aktivität zur Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration hat als Ergebnis der Bindung an Wachstumshormon-Secretagogue-Rezeptor, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung, (a) in der der zweite oder dritte Aminosäurerest am Aminoende eine modifizierte Aminosäure ist ausgewählt aus (i) Serin, Threonin, Tyrosin oder Oxyprolin, worin die Hydroxygruppe der Seitenkette in eine Gruppe umgewandelt ist, die dargestellt wird durch -OCO-Z₁, -OCS-Z₁ oder -O-Z₃ oder (ii) Cystein, wobei die Mercaptogruppe der Seitenkette in -SCO-Z₁, -SCS-Z₁, -S-Z₃ oder -S-S-Z₈ umgewandelt ist oder (iii) Lysin oder Arginin, worin die Aminogruppe der Seitenkette umgewandelt ist in -NH-CO-Z₂, -NH-CS-Z₂, -N(Z₅)(Z₆), -NH-CO-NH-Z₇ oder -NH-CS-NH-Z₇ oder (iv) Histidin oder Tryptophan, worin die Iminogruppe der Seitenkette in eine Gruppe der folgenden Formel umgewandelt ist:
worin Z₁ Wasserstoff oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, Z₂, Z₄, Z₆, Z₇ und Z₈ gleich oder verschieden sind und H oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten, Z₃ eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, Z₅ eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, (b) die eine Aminosäuresequenz enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 angegeben sind, oder eine Aminosäuresequenz, worin mindestens eine Aminosäure deletiert, ersetzt und/oder zugefügt sein kann, wobei die zweite oder dritte Aminosäure am Aminoende ersetzt ist durch die modifizierte Aminosäure, wobei die mindestens eine Aminosäure nicht deletiert, ersetzt und/oder zugefügt ist bei der ersten bis vierten Aminosäure am Aminoende dieser Aminosäuresequenz, außer, dass die Aminosäure 2 oder 3 am Aminoende durch die modifizierte Aminosäure ersetzt ist und (c) die eine Aktivität hat zur Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration als Ergebnis der Bindung an einen Wachstumshormon-Secretagogue-Rezeptor, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die modifizierte Aminosäure (i) Serin ist, dessen Seitenketten-Hydroxygruppe in eine Gruppe umgewandelt ist, die dargestellt wird als -OCO-Z₁, -OCS-Z₁ oder -O-Z₃ oder (ii) Cystein, dessen Seitenketten-Mercaptogruppe umgewandelt ist in -SCO-Z₁, -SCS-Z₁, -S-Z₃ oder -S-S-Z₈, wobei Z₁, Z₃ und Z₈ die gleiche Bedeutung haben, wie in Anspruch 2 definiert.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die modifizierte Aminosäure Serin, Threonin, Tyrosin oder Oxyprolin ist, wobei die Seitenketten-Hydroxygruppe in eine Gruppe umgewandelt ist, dargestellt durch -OCO-Z₁, wobei Z₁ H oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylkette mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die modifizierte Aminosäure ein Aminosäurerest ist, bei dem eine Fettsäure an die Seitenketten-Hydroxygruppe über eine Esterbindung gebunden ist oder an die Seitenketten-Mercaptogruppe über eine Thioesterbindung, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 5, wobei die Fettsäure 2 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 6, wobei die Fettsäure ausgewählt ist aus Fettsäuren mit 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 7, wobei die Fettsäure ausgewählt ist aus Octansäure, einer Monoenfettsäure davon und einer Polyenfettsäure davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 7, wobei die Fettsäure ausgewählt ist aus Decansäure, einer Monoenfettsäure davon und einer Polyenfettsäure davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1, die eine Aminosäuresequenz enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresequenzen, wie in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 angegeben, worin die Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin oder Threonin an der dritten Position am Aminoende in der Aminosäuresequenz mit einer Acylgruppe acyliert ist, die 2 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1, die eine Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr. 1, 8 oder 9 angegeben, oder eine Aminosäuresequenz, in der das Serin an der dritten Position am Aminoende in der Aminosäuresequenz in Threonin umgewandelt ist, wobei die Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin oder Threonin an der dritten Position am Aminoende mit einer Acylgruppe acyliert ist, die 2 bis 35 Kohlenstoffatome enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1, die eine Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr. 3 oder 11 angegeben, worin die Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin an der dritten Position am Aminoende mit Octanoyl acyliert ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1, die eine Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr. 3 angegeben, worin die Seitenketten-Hydroxygruppe des Serins an der dritten Position am Aminoende mit n-Octanoyl acyliert ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung zusätzlich eine Aktivität hat, um die Sekretion von Wachstumshormon zu induzieren.
Peptidartige Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die eine basische Aminosäure gebunden an das Carboxyende enthält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidartige Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Aminoende mit einer gesättigten oder ungesättigten Alkyl- oder Acylgruppe, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome enthält, modifiziert ist, und/oder bei der die Hydroxygruppe in der Carboxylgruppe am Carboxyende OZ ist oder durch NR2R3 ersetzt ist, worin Z ein pharmazeutisch annehmbares Kation oder eine niedrige verzweigte oder lineare Alkylgruppe ist und R2 und R3 gleich oder verschieden sind und H oder eine niedrige verzweigte oder lineare Alkylgruppe bedeuten, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Antikörper gegen eine peptidartige Verbindung, wie in den Ansprüchen 1 bis 16 beschrieben, der spezifisch das aminoterminale Teilpeptid mit der modifizierten Aminosäure, wie in einem der Ansprüche 1 bis 16 definiert, erkennt, wobei das aminoterminale Teilpeptid ein aminoterminales Teilpeptid der peptidartigen Verbindung ist, wie in den Ansprüchen 1 bis 16 beschrieben.
In-vitro-Verfahren zum Nachweis einer peptidartigen Verbindung, wie in den Ansprüchen 1 bis 16 beschrieben, das umfasst, dass ein Antikörper verwendet wird, wie in Anspruch 17 beschrieben, um die peptidartige Verbindung, die in den Ansprüchen 1 bis 16 beschrieben ist, nachzuweisen.
Kit zum Nachweis einer peptidartigen Verbindung, wie in den Ansprüchen 1 bis 16 beschrieben, das den in Anspruch 17 beschriebenen Antikörper enthält.
Mittel oder pharmazeutische Zusammensetzung, das/die eine peptidartige Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 16 beschrieben, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als aktiven Inhaltsstoff enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20 zur Behandlung von Krankheiten, die einem Defekt oder einem Mangel von Wachstumshormon zuzuschreiben sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20 zur Behandlung von Herzkrankheiten.
Mittel nach Anspruch 20, das ein Appetit förderndes Mittel ist.
Mittel nach Anspruch 20, das ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Magenfunktionskrankheiten ist.
Mittel nach Anspruch 20 zum Schutz der das Intestinum auskleidenden Schleimhaut oder zur Verhütung einer Schädigung der den Dünndarm auskleidenden Schleimhaut während intravenöser Ernährung.
Mittel nach Anspruch 20, das ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Osteoporose ist.
Mittel nach Anspruch 20, um die durch chronische Krankheiten verursachte Kachexie zu verringern.
Mittel nach Anspruch 20, das ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Pulmonalinsuffizienz ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, Mittel oder therapeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 20 bis 28 zur Anwendung für andere Wesen als Menschen.
Verfahren zur Herstellung einer peptidartigen Verbindung, wie in den Ansprüchen 1 bis 16 beschrieben, das umfasst, dass ein aktivierter Ester des aminoterminalen Peptids, der durch chemische Synthese erhalten wurde, an ein carboxyterminales Peptid gebunden wird, das durch genetische Rekombinationstechnologie erhalten wurde.
Verfahren zur Herstellung einer peptidartigen Verbindung, wie in einem der Ansprüche 5 bis 14 beschrieben, durch genetische Rekombinationstechnologie, das umfasst, dass Zellen verwendet werden mit einer Serinacylierungsaktivität zur Bindung von Octansäure über eine Esterbindung an eine Seitenketten-Hydroxygruppe von Serin in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 8 angegeben ist.