CN100506844C - 新的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供诱导生长激素分泌的新的肽类化合物。肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有提高细胞内钙离子浓度的活性，至少一个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸化合物替代。

Description

新的肽
发明所属技术领域
本发明涉及以肽中的氨基酸被修饰为特征的，具有提高细胞内钙离子浓度作用或生长激素分泌诱导活性的新的肽。另外，本发明还涉及该新肽的获取方法和制造方法，编码该肽和该肽前体的遗传因子，以及使用该遗传因子的该肽和该肽前体的制造方法。进一步，涉及本发明公开的新修饰肽的结构类似物，具有与生长激素诱导化合物的受体结合提高细胞内钙离子浓度的作用或生长激素分泌诱导活性的肽类似物及其制备方法。本发明还涉及含有该肽或该肽类似物作为有效成分的药物组成物，动物生长促进剂，或该肽的抗体或其利用方法。
背景技术
生长激素(growth hormone、以下简称为GH)是在垂体前叶合成的蛋白质激素，它间接促进骨生长和脂肪细胞或软骨细胞的分化，其分泌被促生长激素释放激素(GHRH；growth hormone-releasinghormone)促进，被促生长素抑制素(somatostatin)抑制[J.Kendrew，etal.，Eds.，The Encyclopedia of Molecular Biology(Blackwell Science Ltd.，London，1994)，p.462]。GH不仅单纯促进生长，还具有在各种组织中促进蛋白质的合成，刺激贮存脂肪的移动和提高肌肉中糖原含量等作用。GH分泌低下会引起侏儒，过剩分泌会引起巨人症或末端肥大症[八杉龍一ら編，岩波生物学辞典第4版(岩波書店，東京，1997)，757頁]。
自从人GH可通过基因重组技术生产以来，GH不仅用于上述侏儒的治疗[J.O.Jorgensen，Endocr.Rev.12，189(1991)]，在其它疾病的治疗中也被使用，并可看到各种效果[J.O.Jorgensen，et al.，Horm.Res.42，235(1994)]。例如，具有在正常人中活性成骨细胞和骨的再构成[K.Brixen，et al.，Miner.Res.5，609(1990)]，在GH缺乏症成人中增强肌肉量和肌肉力量[R.C.Cuneo，et al.，J.Appl.Physiol.70，688(1991)]，提高GH缺乏症成人的运动能力[R.C.Cuneo，et al.，J.Appl.Physiol.70，695(1991)]，治疗小儿重度烧伤[D.N.Herndon，et al.，Ann.Surg.212，424(1990)]、在诱发排卵中与促性腺激素并用[R.Homburg，et al.，Clin.Endocrinol.(Oxf).32，781(1990)]，预防强的松给药引起的蛋白质代谢异常[F.F.Horber and M.W.Haymond，J.Clin.Invest.86，265(1990)]，促进重度免疫缺损症中的T细胞“教育”[W.J.Murphy，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，4481(1992)]，抑制老年性体重减少，脂肪组织扩大和皮肤萎缩的效果[D.Rudman，et al，N.Engl.J.Med.323，1(1990)]等。
在促进小儿生长，以及使缺乏GH的成人中伴随的代谢或功能缺损正常化中，使用重组GH给药是有效的，但是存在限定用量的副作用，以及不能口服和费用方面的问题[B.A.Lefker，et al.，in GrowthHormon Secretagogues in Clinical Practoce，B.B.Bercu and R.F.Walker，Eds.(Marcel Dekker，Inc.，New York，1998)，p.107-p.108]。很多成人患者，由于过剩的钠和体液贮留引起的关节痛或手根管综合征等副作用，不能继续GH给药[E.Corpas，et al.，Endocr.Rev.14，20(1993)]。这些副作用与GH给药引起的非生理方式的激素分泌相关，用GH给药不能模仿正常GH分泌的脉动性[(pulsatility)][B.A.Lefker，et al.，in Growth Hormon Secretagogues in Clinical Practoce，B.B.Bercu and R.F.Walker，Eds.(Marcel Dekker，Inc.，New York，1998)，p.107-p.108]。
生物体内GH分泌的脉动性，一般通过下丘脑由来的2种控制因子相互作用来确立的，即，GHRH与生长抑素对下垂体的作用，控制GH的分泌[G.S.Tannenbaum and N.Ling，Endocrinology 115，1952(1984)，R.G.Clark and I.C.Robinson，Endocrinology 122，2675(1988)]。正常的GH分泌形式是昼夜不同，在夜间更频繁地释放出更多的GH。GH释放的脉冲振幅，通过各种甾类激素、神经传导物质、GH和胰岛素样生长因子引起的反馈，营养状态，睡眠和运动进一步被调节[J.S.Strobl and M.J.Thomas，Pharmacol.Rev.46，1(1994)]。
为克服上述GH给药中伴随的副作用，合成了大量具有GH分泌诱导活性的化合物，作为GH分泌诱导物质(GHS；growth hormonesecretagogue)，集中精力研究了其构效关系、药理学、临床应用等。首先，合成了GHRP-6(Growth Hormone-Releasing hexapeptide)等肽，作为GH欠缺至低下引起的疾病的治疗药被开发[C.Y.Bowers，etal.，Endocrinology 114，1537-1545(1984)]。但是，这些肽化合物只有静脉注射才能发挥效果，因此开发了可口服给药的低分子量非肽类化合物[R.G.Smith，et al.，Science 260，1640-1643(1993)]，并进行到第二期临床试验阶段[A.A.Patchett，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，7001-7005(1995)]。
在细胞中，将从受体接收信号到表达功能的一连串情报的传导称为信号传导(signal transduction)，与G蛋白质共轭的信号传导按照如下的机理进行[八杉龍一ら編，岩波生物学辞典第4版(岩波書店，東京，1997)，555-556頁]。该G蛋白质共轭体系分为具有细胞膜7次贯通性受体的，产生作为第二信使的cAMP的cAMP体系和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)或二酰基甘油(DG)肌醇磷脂情报传导体系。cAMP活化cAMP依赖性激酶(A激酶)，引起功能蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，修饰活性。另一方面，IP3与小胞体上的IP3受体结合，促进钙离子的游离，DG促进C激酶的活化，激素等作用的表达。
在IP3或DG成为第二信使的信号传导体系中，提高细胞内钙离子浓度的机理如下所述[J.Kendrew，et al.，Eds.，The Encyclopediaof Molecular Biology(Blackwell Science Ltd.，London，1994)，p.136-137]。配位体一旦与受体结合，通过G蛋白磷脂酶C被活化，从PIP2生成IP3。IP3将贮存于作为细胞内颗粒的ER等小胞体中的钙离子释放到细胞质中，提高细胞质中的钙离子浓度。IP3或钙离子如果进一步存在于细胞质中，钙离子再次被小胞体摄取，细胞质中的钙离子浓度降低。即，配位体与受体的结合，可一次性提高细胞质中钙离子浓度。
GHS协同作用于GHRH引起的GH分泌和细胞内cAMP水平的提高[K.Cheng，et al.，Endocrinology 124，2791-2798(1989)]、且GHRH与受体的结合相对于作为第二信使的cAMP的产生，GHS使得细胞内钙离子浓度升高，由此暗示GHS的作用机理与GHRH不同[J.Herrington and B.Hille，Endocrinology 135，1100-1108(1994).]，假定为GHS结合的受体不同于GHRH结合的GHRH受体。实际上，从GHS结合的受体基因克隆，Northern印迹分析的结果显示GHS受体(GHS-R)在下丘脑和下垂体表达，且从猪和人的GHS-R的氨基酸序列显示90％以上的同一性[A.D.Howard，et al.，Science 273，974-977(1996)]。但是，与GHS-R结合的内在性配位体不能分离出来，该GHS-R是配位体为不明确的孤儿受体。
在蛋白质的氨基末端或构成蛋白质的氨基酸残基侧链中，键合了肉豆蔻酸、香叶基酸(ゲラニル酸)、棕榈酰基酸(パルミトイル酸)、或法呢基酸(フアルネシル酸)等脂肪酸，这些脂肪酸的任务是将这些脂肪酸修饰的蛋白质锚合(anchoring)到细胞膜上[J.Kendrew，etal.，Eds.，The Encyclopedia of Molecular Biology(Blackwell ScienceLtd.，London，1994)，p.616]。在这些脂肪酸修饰的蛋白质中，脂肪酸与半胱氨酸残基通过S-酰基键结合，如本发明公开的内在性GHS那样的通过O-酰基与丝氨酸残基结合了脂肪酸的氨基酸、含有该脂肪酸修饰的氨基酸的蛋白质和肽是完全未知的。另外，含有脂肪酸修饰的氨基酸的肽，也不知道其作为受体的配位体的功能。
发明的公开
在详细说明本发明之前，先定义以下用语。
肽是指，多个氨基酸通过肽键连接的化合物。这里氨基酸(或氨基酸残基)是指，在氨基酸的通式NH2-CH(R′)-COOH中，R′是具有天然存在取代基的天然氨基酸，并包括它的D，L-光学异构体。
天然氨基酸也会被修饰的氨基酸(或修饰的氨基酸残基)替代。修饰的氨基酸是指，上述通式中的取代基R′进一步被修饰的氨基酸，并包括其D，L-光学异构体，还包括例如上述通式中的取代基R′中，通过或不通过酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、脲或硫脲等，键合了各种取代基的非天然氨基酸。另外，还包括氨基酸的氨基上被低级烷基取代的非天然氨基酸。
肽类似物是指，肽中至少一个氨基酸被非氨基酸化合物替代的化合物，因此，该替代化合物的肽类似物中至少一个键不是肽键。
另外，将这些肽和肽类似物的氨基末端和/或羧基末端被修饰的化合物作为衍生物，将肽、肽类似物和这些衍生物总称为肽类化合物。
在SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列中，至少从氨基末端第4至第10的氨基酸序列是如下所示序列。
Gly Ser Ser Phe、
Gly Ser Ser Phe Leu、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His、或、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln。
人们需要与GHS受体结合提高细胞内钙离子浓度，或具有诱导GH分泌活性的内在性配位体，即内在性GHS表达和利用方法。另外，还需要在该内在性GHS的结构类似物中，可提高细胞内钙离子浓度或具有GH分泌诱导活性的化合物。另外，还需要含有该内在性GHS或其结构类似化合物，可通过诱导GH脉动分泌，无GH给药副作用的药物组合物或促进动物生长的组合物，以及使用该组合物的治疗方法。
本发明的发明者，着眼于配位体与GHS受体(GHS-R)结合可以将肌醇磷脂作为第二信使一次性提高细胞内钙离子浓度，将表达GHS-R的CHO细胞(CHO-GHSR62)中提高细胞内钙离子浓度的活性(Ca提高活性)作为指标，筛选各种脏器或组织萃取物。结果发现，大鼠胃萃取物具有强的Ca提高活性，从该萃取物用各种色谱纯化得到具有Ca提高活性的物质，发现该物质是脂肪酸修饰的分子量约3,000的新的肽。另外，确认该新肽可促进垂体前叶细胞的GH特异性分泌，发现该新肽是GHS-R的内在性配位体，即内在性GH分泌诱导物质(内在性GHS)。即，本申请的第1项发明是，内在性GH分泌诱导肽，和该肽的获取方法，其特征在于具有提高细胞内钙离子浓度的活性或GH分泌诱导活性，且构成氨基酸残基被脂肪酸修饰。
本发明者对该内在性GH分泌诱导肽的结构进行了详细地解析，发现该肽是SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列形成的肽，氨基末端第3位的丝氨酸侧链的羟基被脂肪酸酰化。另外，与大鼠相同，从存在强Ca提高活性的人胃萃取物中，可用大鼠的GH分泌诱导肽同样的方法纯化并进行结构分析，结果发现，人的内在性GH分泌诱导肽可从SEQID NO.：3记载的氨基酸序列形成，氨基末端第3位的丝氨酸侧链的羟基也被脂肪酸酰化。将大鼠和人的内在性GH分泌诱导肽的氨基酸序列进行比较的话，总体上显示89％的高同一性。
更详细地说，在大鼠和人中，从氨基末端到第10氨基酸序列和第13～28氨基酸序列相同，但是第11和12氨基酸不同，在大鼠中是赖氨酸、丙氨酸，在人中分别是精氨酸、缬氨酸替代。将大鼠的内在性GH分泌诱导肽用各种蛋白酶切断，测定纯化的肽片段的Ca提高活性，结果发现从氨基末端到第7氨基酸序列形成的肽是具有Ca提高活性的最小的肽。
另外，从测定化学合成肽的Ca提高活性等可知，表达Ca提高活性必须的核心序列是SEQ ID NO.：8记载的4个氨基酸形成的序列。另外，从大鼠以外的人、猪、牛分离的内在性GH分泌诱导肽(28个氨基酸)和从这些肽中缺失一个谷氨酰胺的内在性GH分泌诱导肽(27个氨基酸)中的任何一个，都保存了SEQ ID NO.：9记载的10个氨基酸形成的序列。
即，本申请的第2项发明是，含有SEQ ID NO.：8记载的氨基酸序列，优选是SEQ ID NO.：1记载的氨基酸序列，更优选是SEQ ID NO.：9记载的氨基酸序列作为表达Ca提高活性必须的核心序列的脂肪酸修饰的肽。
另外，从鸡、鳝鱼、青蛙也分离出内在性GH分泌诱导肽，可知其具有SEQ ID NO.：8记载的4个氨基酸形成的核心序列。
另一方面，从青蛙也分离出与大鼠的内在性GH分泌诱导肽类似性非常高的内在性GH分泌诱导肽。
另外，从爪蟾属、鮭属、狗也分离出了内在性GH分泌诱导肽。另外，从鮭属分离出23个氨基酸形成的Ghrelin—23和20个氨基酸形成的Ghrelin—20。
另外，鳝鱼的Ghrelin、鮭属的Ghrelin—23和Ghrelin—20的羧基末端的氨基酸被酰胺化。
另外，由于爪蟾属的内在性GH分泌诱导肽是从氨基末端的第3个氨基酸残基是苏氨酸，因此本发明也涉及含有SEQ ID NO.：8记载的氨基酸序列，优选是SEQ ID NO.：1记载的氨基酸序列，更优选是SEQ ID NO.：9记载的氨基酸序列的氨基末端第3个氨基酸残基丝氨酸转化为苏氨酸的肽，作为表达Ca提高活性必须的核心序列的脂肪酸修饰的肽。
本发明公开的具有GH分泌诱导活性的内在性脂肪酸修饰肽或由上述核心序列形成的脂肪酸修饰的肽，也提供了具有Ca提高活性化合物的设计指导。
即，本申请的第3项发明是，通过合成与该脂肪酸修饰肽结构类似的化合物，确认该结构类似化合物具有Ca提高活性，可得到具有Ca提高活性的新化合物。因此，在具有提高细胞内钙离子浓度活性的肽或肽类似物中，构成氨基酸为被修饰氨基酸或非氨基酸化合物替代的化合物当然也属于本发明。
编码内在性GH分泌诱导肽的cDNA，可用常规方法获得。如SEQID NO.：4和5记载的氨基酸序列所示，大鼠和人的cDNA都是由117个氨基酸形成的，氨基末端的第24至第51的28个氨基酸序列分别与大鼠和人的内在性GH分泌诱导肽的氨基酸序列一致。即，可知内在性GH分泌诱导肽是作为117个氨基酸形成的前体肽被合成的，氨基末端的23个氨基酸形成的信号肽被切断，且羧基末端的56个氨基酸被切除，可生成具有GH分泌诱导活性的脂肪酸修饰肽。另外，从猪也发现了编码28个氨基酸形成的内在性GH分泌诱导肽前体的cDNA。
而且，从猪也发现了编码27个氨基酸形成的内在性GH分泌诱导肽前体的cDNA。
从牛也发现了编码27个氨基酸形成的内在性GH分泌诱导肽前体的cDNA的一部分。
另外，从鳝鱼、爪蟾属、鮭属也发现了编码内在性GH分泌诱导肽前体的cDNA。另外，从鮭属分离出编码23个氨基酸形成的Ghrelin—23前体的cDNA和编码20个氨基酸形成的Ghrelin—20前体的cDNA。
因此，本申请的第4项发明是编码内在性GH分泌诱导肽前体的cDNA，以及使用该cDNA，制造作为具有Ca提高活性的脂肪酸修饰肽或肽类似物原料的肽的方法。
纯化从大鼠胃萃取物得到的28个氨基酸构成的内在性GH分泌诱导肽(Ghrelin)时，解析作为次要组分回收的肽时，发现了在第13或14位缺失一个谷氨酰胺的27个氨基酸形成的肽(Ghrelin-27)。Ghrelin-27具有与28个氨基酸形成的Ghrelin完全相同的Ca提高活性和GH分泌诱导活性，由于是内在性GH分泌诱导肽，因此该Ghrelin-27也包括在本发明内。
编码Ghrelin的第13和14位的谷氨酰胺的碱基序列是gca gca，它是引起mRNA剪接(splicing)的外显子末端的序列，通过引起不同的剪接，有可能生成2个谷氨酰胺密码子中脱落一个的cDNA。实际上，研究大鼠和人的cDNA库时，也发现了编码27个氨基酸形成的Ghrelin-27前体肽的cDNA。
即，可知，大鼠和人的Ghrelin-27肽是作为SEQ ID NO.：12或13记载的116个氨基酸形成的前体肽被合成的，氨基末端的23个氨基酸形成的信号肽被切断，且羧基末端的56个氨基酸被切除，可生成27个氨基酸形成的具有GH分泌诱导活性的脂肪酸修饰肽。
另外，从猪和牛也发现了编码Ghrelin-27肽前体的cDNA，在这些动物中也确认了Ghrelin-27和其前体的存在。
即，SEQ ID NO.：10，11，17和22记载的氨基酸序列形成的Ghrelin-27肽、和具有SEQ ID NO.：12、13、19和23记载的氨基酸序列的Ghrelin-27前体肽，以及具有SEQ ID NO.：14、15、21和24记载的碱基序列的编码该前体肽的cDNA当然也属于本发明。
本发明公开的具有Ca提高活性的脂肪酸修饰肽或具有Ca提高活性的肽类似物等肽类化合物，也可提供为治疗GH欠缺或低下引起的疾病的药物组合物。该药物组合物可用于全部GH给药有效的疾病，且可克服GH给药产生的各种副作用。另外，该药物组合物也可作为动物生长促进剂等动物用药剂使用。
由于本发明的肽类化合物，可通过脑室内给药和静脉给药增进食欲，因此可作为治疗食欲不振或绝食症的食欲增进剂使用。另外，由于具有促进运动和胃酸分泌的作用，因此可作为非溃疡性消化不良，突发性轻型胃张力弛缓，功能性消化不良和逆流性食道炎等胃功能性疾病治疗剂使用。另外，由于通过静脉给药在骨髓、十二指肠和空肠中，确认具有细胞增殖促进作用，因此可作为肠道粘膜保护剂，经静脉营养时的小肠粘膜障碍预防剂和骨质疏松症治疗剂使用。
将本发明公开的具有Ca提高活性的脂肪酸修饰肽，作为抗原制备的抗体，使用该抗体测定内在性GH分泌诱导肽的方法，以及具备该抗体的测定试剂盒也属于本发明。
另外，将相对于Ghrelin氨基末端和羧基末端的肽，制作抗体，前者可利用对修饰第3位丝氨酸的脂肪酸的特异性识别，可分别定量脂肪酸修饰的Ghrelin和脱除脂肪酸的Ghrelin的测定方法，以及组合了相对于Ghrelin氨基末端肽的抗体和相对于羧基末端肽的抗体的检查试剂盒也属于本发明。
即，本发明提供了含有称为酰化丝氨酸的新修饰氨基酸的新肽激素，并提供了以该肽的结构作为基本骨架的具有Ca提高活性化合物的新的设计指导。
另外，通过本发明公开的脂肪酸修饰肽、GH释放激素和生长抑素的GH分泌诱导机理的解释，暗示这并不限于简单地GH分泌诱导机制，也详述了其他激素分泌控制机理。本发明，公开了脂肪酸修饰肽作为循环体系和代谢体系的控制因子的各种功能，本发明的效果也涉及新的生物体控制机理的解释。
具体地说，本发明涉及
(1)肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述肽具有提高细胞内钙离子浓度活性的肽，其至少一个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，
(2)前述(1)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有氨基酸序列，该氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列或(b)具有该序列中至少从氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在该氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸，
(3)前述(2)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23记载的氨基酸序列，
(4)前述(2)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：25、26、29、30、31、32、34和35记载的氨基酸序列，
(5)肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中具有提高细胞内钙离子浓度活性或诱导生长激素分泌活性的肽的(a)构成氨基酸被修饰或不被修饰，且(b)至少一个氨基酸被非氨基酸化合物替代或不替代，
(6)前述(1)或(5)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：27、28和33记载的氨基酸序列，
(7)前述(5)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有氨基酸序列，该氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列或(b)具有该序列中至少从氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在从氨基酸末端第4至第10氨基酸的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸，
(8)前述(7)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23记载的氨基酸序列，
(9)前述(7)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：25、26、29、30、31、32、34和35记载的氨基酸序列，
(10)前述(1)或(5)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中相当于氨基末端第1至第4氨基酸序列的部分如下式所示，
A—B—C—D—
A：氨基酸、非氨基酸化合物或无；
B：氨基酸、非氨基酸化合物或无；
(其中，A+B的分子链长相当于二肽的长度)
C或D：可相同或不同，表示(a)修饰的氨基酸、或(b)具有疏水性侧链的氨基酸，
(11)前述(10)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于C是修饰的氨基酸，其向氨基酸α碳原子中导入了(a)经由或不经由具有1个以上碳原子的亚烷基、经由酯、醚、硫醚、酰胺或二硫化物键的具有1个或多个碳原子的饱和或不饱和烃基链，或(b)具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链；D是具有疏水性侧链的氨基酸。
(12)肽类化合物或其药学上可接受的盐，在一个由选自SEQ IDN O.：2、3、9、10、11、16、17、22、25、26、27、28、29、30和31记载的氨基酸序列形成的氨基酸序列中，相当于氨基末端的第1至第4氨基酸序列部分是前述(10)或(11)记载的肽类化合物，
(13)前述(1)、(2)、(3)、(5)、(7)或(8)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中修饰的氨基酸是氨基末端的第3个氨基酸，
(14)前述(13)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于修饰的氨基酸中的氨基酸是丝氨酸或半胱氨酸，
(15)前述(1)、(2)、(3)、(5)、(7)或(8)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有修饰的氨基酸，其向氨基酸α碳原子中导入了(a)经由或不经由具有1个以上碳原子的亚烷基、经由酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、或脲键的具有1个或多个碳原子的饱和或不饱和烃基链，或(b)H或具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链，
(16)前述(1)、(2)、(4)、(5)、(6)、(7)、(9)、(10)或(12)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中修饰的氨基酸是这样的一种氨基酸：其向氨基酸的α碳中导入了(a)经由或不经由具有1个以上碳原子的亚烷基、经由酯、醚、硫酯、硫醚、二硫化物、酰胺、脲或硫脲键的具有1个或多个碳原子的饱和或不饱和烃基链，或(b)具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链，
(17)前述1、2、3、5、7或8记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有通过酯键修饰的修饰氨基酸，
(18)前述(1)、(2)、(4)、(5)、(6)、(7)、(9)、(10)、(11)或(12)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有氨基酸侧链的官能基是通过形成酯键被修饰的修饰氨基酸，
(19)前述(17)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有其氨基酸侧链中的羟基与脂肪酸形成酯键的氨基酸，
(20)前述(18)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有脂肪酸与氨基酸侧链中的羟基形成酯键或与巯基形成硫酯键的氨基酸，
(21)前述(19)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有结合了碳原子数2～35的脂肪酸的氨基酸，
(22)前述(20)中的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸的碳原子数是2～35，
(23)前述(21)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有结合了选自碳原子数2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸的氨基酸，
(24)前述(22)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸是选自碳原子数2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸，
(25)前述(23)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中结合的脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(26)前述(24)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(27)前述(23)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中结合的脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(28)前述(24)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(29)肽类化合物，其特征在于，在前述(1)至(28)记载的肽类化合物的羧基末端，进一步结合了碱性氨基酸，
(30)前述(1)，(2)，(3)，(5)，(7)，(8)，(13)，(14)，(15)，(17)，(19)，(21)，(23)，(25)，(27)项记载的肽类化合物，其特征在于，N末端是被具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基或酰基修饰的和/或C末端羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基，R2和R3可相同或不同，表示选自H和低级支链或非支链烷基的基团)，
(31)前述(1)，(2)，(4)，(5)，(6)，(7)，(9)，(10)，(11)，(12)，(16)，(18)，(20)，(22)，(24)，(26)，(28)，(29)记载的肽类化合物，其特征在于，氨基末端的氨基通过导入具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基或酰基被修饰和/或羧基末端的羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基，R2和R3可相同或不同，表示选自H和低级支链或非支链烷基的基团)，
(32)肽类化合物，其特征在于在前述(30)或(31)记载的肽类化合物的羧基末端酰胺衍生物中，进一步导入碱性基团，
(33)前述(1)至(32)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有効成分的药物组合物，
(34)前述(1)至(32)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的治疗生长激素欠缺或减少引起的疾病的药物组合物，
(35)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的药物组合物，其包含非起因于生长激素欠缺或减少的疾病所涉及的治疗剂和含有前述(1)至(32)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，
(36)适用于人以外动物的前述(33)至(35)记载的药物组合物，
(37)生长激素欠缺或减少为起因的疾病的治疗方法，其中使用前述(1)至(32)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物给药，
(38)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，包括使用非起因于生长激素欠缺或减少的疾病所涉及的治疗剂和含有前述(1)至(32)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物给药，
(39)适用于人以外动物的前述(37)或(38)记载的治疗方法，
(40)DNA，是编码前述(1)至(32)记载的肽类化合物氨基酸序列的DNA，该DNA具有编码肽的碱基序列，该肽在所述DNA编码的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸能被修饰的识别序列，
(41)前述(40)记载的DNA，其中碱基序列是选自SEQ ID NO.：6、7、14、15、20、21、24、36、37、38和39记载的碱基序列中的一个碱基序列，
(42)前述(40)记载的DNA，其中碱基序列是编码氨基酸的碱基序列，其选自SEQ ID NO.：6、7、14、15、20、21、24、36、37、38和39记载的碱基序列中的一个碱基序列，
(43)具有前述(40)至(42)记载的DNA的载体，
(44)含有前述(43)记载的载体的细胞，
(45)可产生肽类化合物的细胞，具有包含前述(40)至(42)记载的DNA的载体，且具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽化合物是所述氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰，
(46)与前述(1)至(32)记载的肽类化合物相对应的抗体，
(47)前述(1)至(32)记载的肽类化合物的测定方法，其特征在于，通过前述(46)记载的抗体，检测前述(1)至(32)记载的肽类化合物，
(48)前述(1)至(32)记载的肽类化合物检测用试剂盒，其特征在于，使用前述(46)记载的抗体，检测前述(1)至(32)记载的肽类化合物，
(49)前述(1)至(32)记载的肽类化合物的制造方法，是在使用基因重组技术制造前述(1)至(32)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(40)至(42)记载的DNA的载体，将可修饰所述肽中的至少一个氨基酸侧链的宿主细胞进行转化，培养所得转化的细胞，从培养物中采集目的肽类化合物，
(50)前述(1)至(32)记载的肽类化合物的制造方法，其特征在于在使用基因重组技术制造前述(1)至(32)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(40)至(42)记载的DNA的载体将宿主细胞进行转化，培养所得转化细胞，从培养物采集目的物质后，将任意的氨基酸进行化学修饰，
(51)前述(19)至(28)记载的肽类化合物的制造方法，其特征在于在使用基因重组技术制造前述(19)至(28)记载的肽类化合物的方法中，使用具有可使脂肪酸与氨基酸侧链中的羟基形成酯键或与巯基形成硫酯键活性的细胞，
(52)前述(19)至(28)记载的肽类化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.：8记载的氨基酸序列中的丝氨酸侧链羟基与脂肪酸形成酯键的丝氨酸酰化活性的细胞，
(53)前述(19)至(28)记载的肽类化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.：28记载的氨基酸序列中的苏氨酸侧链中的羟基与脂肪酸形成酯键的酰化活性细胞，
(54)基因治疗用药物组合物，通过将含有编码前述(1)至(32)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体，插入生物体内细胞，得到具有提高细胞内钙离子浓度活性的至少具有一个修饰的氨基酸的肽，以治疗生长激素欠缺或减少导致的疾病，
(55)生长激素欠缺或减少引起的疾病的治疗方法，其特征在于，通过将具有编码前述(1)至(32)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体，插入细胞，得到具有生长激素分泌诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列，
(56)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的基因治疗用药物组合物，通过将具有编码前述(1)至(32)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体，插入生物体内细胞中，得到具有提高细胞内钙离子浓度活性的，具有至少一个氨基酸被修饰的肽，和
(57)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，其特征在于通过将具有编码前述(1)至(32)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体，插入生物体内细胞中，得到具有生长激素诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列。
更具体地说，本发明涉及
(1)肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述肽是具有提高细胞内钙离子浓度活性的肽，其至少一个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，
(2)前述(1)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有氨基酸序列，该氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列或(b)具有该序列中至少从氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在该氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸，
(3)前述(2)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22、23、25和26记载的氨基酸序列，
(4)肽类化合物或其药学上可接受的盐，是具有提高细胞内钙离子浓度活性和诱导生长激素分泌活性的肽的(a)构成氨基酸被修饰或不被修饰，且(b)至少一个氨基酸被非氨基酸化合物替代或不替代，
(5)前述(1)或(4)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：27记载的氨基酸序列，
(6)前述(4)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有氨基酸序列，该氨基酸序列具有(a)SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列或(b)具有该序列中至少从氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在从氨基酸末端第4至第10氨基酸的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸，
(7)前述(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22、23、25和26记载的氨基酸序列，
(8)前述(1)或(4)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中相当于氨基末端第1至第4氨基酸序列的部分，如下式所示，
A—B—C—D—
A：氨基酸、非氨基酸化合物或无；
B：氨基酸、非氨基酸化合物或无；
(其中，A+B的分子链长相当于二肽的长度)
C或D：可相同或不同，表示(a)修饰的氨基酸、或(b)具有疏水性侧链的氨基酸，或(c)具有碱性侧链的氨基酸，
(9)肽类化合物或其药学上可接受的盐，在一个选自SEQ ID NO.：2、3、8、9、10、11、16、17、22、25和26记载的氨基酸序列中，与氨基末端第1至第4氨基酸序列相当的部分是前述(8)记载的序列。
(10)前述(1)至(9)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，修饰的氨基酸是向氨基酸α碳原子中导入了(a)经由或不经由具有1个以上碳原子的亚烷基、经由酯、醚、硫酯、硫醚、二硫化物、酰胺、脲或硫脲键的具有1个或多个碳原子的饱和或不饱和烃基链，或(b)具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链的氨基酸，
(11)前述(1)至(10)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有氨基酸侧链的官能基通过形成酯键被修饰的修饰氨基酸，
(12)前述(11)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有氨基酸侧链的羟基或巯基与脂肪酸形成酯键的氨基酸，
(13)前述(12)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸的碳原子数是2至35，
(14)前述(12)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸是选自碳原子数2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸，
(15)前述(12)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(16)前述(12)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(17)前述(1)至(16)记载的肽类化合物，其特征在于，氨基末端的氨基通过导入具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基或酰基被修饰和/或羧基末端的羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基，R2和R3可相同或不同，表示选自H和低级支链或非支链烷基的基团)，
(18)肽类化合物，其特征在于，在前述(1)至(16)记载的肽类化合物的羧基末端，进一步结合碱性氨基酸，
(19)肽类化合物，其特征在于，在前述(1)至(16)、或(18)记载的肽类化合物的羧基末端酰胺衍生物中，进一步导入碱性基团，
(20)前述(1)至(19)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有効成分的药物组合物，
(21)前述(1)至(19)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的治疗生长激素欠缺或减少引起的疾病的药物组合物，
(22)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病治疗剂和含有前述(1)至(19)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐形成的为治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的药物组合物，
(23)适用于人以外动物的前述(20)至(22)记载的药物组合物，
(24)生长激素欠缺或减少为起因的疾病的治疗方法，其中使用前述(1)至(19)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物给药，
(25)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，包括使用非起因于生长激素欠缺或减少的疾病涉及的治疗剂和含有前述(1)至(19)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物给药，
(26)适用于人以外动物的前述(24)或(25)记载的治疗方法，
(27)DNA，是编码前述(1)至(19)记载的肽类化合物氨基酸序列的DNA，在该DNA编码的氨基酸序列中，具有编码肽的碱基序列，该肽具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列，
(28)前述(27)记载的DNA，其中碱基序列是选自SEQ ID NO.：6、7、14、15、20、21和24记载的碱基序列中的一个碱基序列，
(29)前述(27)记载的DNA，碱基序列是选自SEQ ID NO.：6、7、14、15、20、21和24记载的碱基序列中的一个碱基序列中，编码氨基酸的碱基序列，
(30)具有前述(27)至(29)记载的DNA的载体，
(31)含有前述(30)记载的载体的细胞，
(32)可产生肽类化合物的细胞，具有前述(27)至(29)记载的DNA的载体，且具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽化合物是，该氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰，
(33)与前述(1)至(19)记载的肽类化合物相对应的抗体，
(34)前述(1)至(19)记载的肽类化合物的测定方法，其特征在于，使用前述(33)记载的抗体，检测前述(1)至(19)记载的肽类化合物，
(35)前述(1)至(19)记载的肽类化合物检测用试剂盒，其特征在于，使用前述(33)记载的抗体，检测前述(1)至(19)记载的肽类化合物，
(36)前述(1)至(19)记载的肽类化合物的制造方法，是在使用基因重组技术，制造前述(1)至(19)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(27)至(29)记载的DNA的载体，将可修饰该肽中的至少一个氨基酸侧链的宿主细胞进行转化，培养所得转化的细胞，从培养物中采集目的肽类化合物，
(37)前述(1)至(19)记载的肽类化合物的制造方法，其特征在于使用基因重组技术，制造前述(1)至(19)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(27)至(29)记载的DNA的载体将宿主细胞进行转化，培养所得转化细胞，从培养物采集目的物质后，将任意的氨基酸进行化学修饰，
(38)前述(12)至(16)记载肽类化合物的制造方法，其特征在于使用基因重组技术制造前述(12)至(16)记载的肽类化合物的方法中，使用具有可使脂肪酸与氨基酸侧链中的羟基或巯基形成酯键活性的细胞，
(39)前述(12)至(16)记载的肽类化合物的制造方法，其特征在于，使用具有可使SEQ ID NO.：8记载的氨基酸序列中的丝氨酸侧链羟基与脂肪酸形成酯键的丝氨酸酰化活性的细胞，
(40)基因治疗用药物组合物，通过将含有编码前述(1)至(19)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体，插入生物体内细胞，得到具有提高细胞内钙离子浓度活性的至少具有一个修饰的氨基酸的肽，治疗生长激素欠缺或减少导致的疾病，
(41)生长激素欠缺或减少引起的疾病的治疗方法，其特征在于，通过将具有编码前述(1)至(19)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体插入生物体内细胞，得到具有生长激素分泌诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列，
(42)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的基因治疗用药物组合物，通过将具有编码前述(1)至(19)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体插入生物体内细胞中，得到具有提高细胞内钙离子浓度活性的，具有至少一个氨基酸被修饰的肽，和
(43)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，通过将具有编码前述(1)至(19)记载的肽类化合物的氨基酸序列的DNA的载体插入生物体内细胞中，得到具有生长激素诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列。
另外，具体地说，本发明涉及
(1)肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述肽具有提高细胞内钙离子浓度活性，至少一个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，
(2)前述(1)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有氨基酸SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列，或具有该序列中至少从氨基末端第4至第10氨基酸的序列，且在氨基末端第4至第10氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(3)前述(2)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23记载的氨基酸序列，
(4)肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有提高细胞内钙离子浓度活性和诱导生长激素分泌活性，(a)构成氨基酸被修饰或不被修饰，且(b)至少一个氨基酸被非氨基酸化合物替代或不替代，
(5)前述(4)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列，或具有该序列中至少从氨基末端第4至第10的氨基酸序列，且在氨基末端第4至第10氨基酸序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(6)前述(4)至(5)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有一个选自SEQ ID NO.：3、4、5、8、9、10、11、12、13、16、17、18、19、22和23记载的氨基酸序列，
(7)前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，修饰的氨基酸是从氨基末端第3个氨基酸，
(8)前述(7)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，在修饰的氨基酸中的氨基酸是丝氨酸或半胱氨酸，
(9)前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有向氨基酸α碳原子中导入了(a)经由或不经由具有1个以上碳原子的亚烷基、经由酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲键的具有1个或多个碳原子的饱和或不饱和烃基链，或(b)具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链的氨基酸，
(10)前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有通过酯键被修饰的修饰氨基酸，
(11)前述(10)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有键合了脂肪酸的氨基酸，
(12)前述(11)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有键合了碳原子数2至35的脂肪酸的氨基酸，
(13)前述(12)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有键合了选自碳原子数2、4、6、8、10、12、14、16和18的脂肪酸的氨基酸，
(14)前述(13)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中键合的脂肪酸是辛酸(octanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(15)前述(13)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中键合的脂肪酸是癸酸(decanoic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(16)前述(1)至(15)记载的肽类化合物，其特征在于，氨基末端的氨基通过具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基或酰基被修饰和/或羧基末端的羧基中的OH是OZ或NR2R3(Z表示药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基，R2和R3可相同或不同，表示选自H和低级支链或非支链烷基的基团)，
(17)前述(1)至(16)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有効成分的药物组合物，
(18)前述(1)至(16)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的治疗生长激素欠缺或减少引起的疾病的药物组合物，
(19)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病治疗剂，和含有前述(1)至(16)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐形成的为治疗该疾病的药物组合物，
(20)适用于人以外动物的前述(17)至(19)记载的药物组合物，
(21)生长激素欠缺或减少为起因的疾病的治疗方法，其中使用前述(1)至(16)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物给药，
(22)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，包括使用非起因于生长激素欠缺或减少的疾病涉及的治疗剂，和含有前述(1)至(16)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物给药，
(23)适用于人以外动物的前述(21)或(22)记载的治疗方法，
(24)DNA，是编码前述(1)至(16)记载的肽类化合物涉及的DNA，在该DNA碱基序列中，具有编码肽的碱基序列，该肽具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列，
(25)前述(24)记载的DNA，具有选自SEQ ID NO.：6、7、14、15、20、21和24记载的碱基序列中的一个碱基序列，
(26)前述(24)记载的DNA，具有选自SEQ ID NO.：6、7、14、15、20、21和24记载的碱基序列中的一个碱基序列中，编码氨基酸部分的序列，
(27)具有前述(24)至(26)记载的DNA的载体，
(28)含有前述(27)记载的载体的细胞，
(29)可产生肽类化合物的细胞，具有前述(24)至(26)记载的DNA的载体，且具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽化合物是，该氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰，
(30)与前述(1)至(16)记载的肽类化合物相对应的抗体，
(31)肽类化合物的测定方法，其特征在于，使用前述(30)记载的抗体，鉴定前述(1)至(16)记载的肽类化合物，
(32)肽类化合物检测用试剂盒，其特征在于，使用前述(30)记载的抗体，检测前述(1)至(16)记载的肽类化合物，
(33)肽类化合物的制造方法，是在使用基因重组技术，制造前述(1)至(16)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(24)至(26)记载的DNA的载体，将可修饰该肽中的至少一个氨基酸侧链的宿主细胞进行转化，培养所得转化的细胞，从培养物中采集目的肽类化合物，
(34)肽类化合物的制造方法，其特征在于使用基因重组技术制造前述(1)至(16)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(24)至(26)记载的DNA的载体将宿主细胞进行转化，培养所得转化细胞，从培养物采集目的物质后，将任意的氨基酸进行化学修饰，
(35)肽类化合物的制造方法，其特征在于使用基因重组技术制造前述(11)至(15)记载的肽类化合物的方法中，使用可产生具有可使SEQ ID NO.：8记载的氨基酸序列中的丝氨酸残基与脂肪酸键合的肽的细胞，
(36)具有提高细胞内钙离子浓度和诱导生长激素分泌活性的肽类化合物的制造方法，其特征在于，通过含有编码前述(4)至(6)记载的肽类化合物的DNA的载体将宿主细胞进行转化，培养所得转化细胞，从培养物采集目的物质，
(37)为治疗生长激素欠缺或减少导致的疾病的基因治疗用药物组合物，通过将具有编码前述(1)至(16)记载的肽类化合物的DNA的载体插入生物体内细胞，得到具有提高细胞内钙离子浓度活性的具有至少一个被修饰的氨基酸的肽，
(38)生长激素欠缺或减少引起的疾病的治疗方法，其特征在于，通过将具有编码前述(1)至(16)记载的肽类化合物的DNA的载体插入生物体内细胞，得到具有生长激素分泌诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列，
(39)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的基因治疗用药物组合物，通过将具有编码前述(1)至(16)记载的肽类化合物的DNA的载体插入生物体内细胞中，得到具有至少一个氨基酸被修饰的肽，和
(40)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，其特征在于，通过将具有编码前述(1)至(16)记载的肽类化合物的DNA的载体插入生物体内细胞中，得到具有生长激素诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列。
另外，具体地说，本发明涉及
(1)肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述肽具有提高细胞内钙离子浓度活性，至少一个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸化合物替代，
(2)前述(1)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，含有SEQ ID NO.：1记载的氨基酸序列，
(3)前述(1)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第7个氨基酸为止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(4)前述(1)记载的肽类似物或其衍生物或其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：3记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第7个氨基酸为止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(5)前述(3)记载的肽类化合物的前体肽类化合物，具有SEQ IDNO.：4记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第28个氨基酸为止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(6)前述(4)记载的肽类化合物的前体肽类化合物，具有SEQ IDNO.：5记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第28个氨基酸为止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(7)具有提高细胞内钙离子浓度活性和诱导生长激素分泌活性的肽类化合物或其药学上可接受的盐，
(8)前述(7)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，提高细胞内钙离子浓度的活性和诱导生长激素分泌的活性，至少一个氨基酸被非氨基酸化合物替代，
(9)前述(7)至(8)记载的肽类化合物或其衍生物以及其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：1记载的氨基酸序列，
(10)前述(7)至(8)记载的肽类化合物或其衍生物以及其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：2记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第7个氨基酸为止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(11)前述(7)至(8)记载的肽类化合物或其衍生物以及其药学上可接受的盐，具有SEQ ID NO.：3记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第7个氨基酸为止的序列以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(12)前述(10)记载的肽类化合物前体肽类化合物，具有SEQ IDNO.：4记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第28个氨基酸为止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(13)前述(11)记载的肽类化合物前体肽类化合物，具有SEQ IDNO.：5记载的氨基酸序列，或具有该序列中从氨基末端到第28个氨基酸为止的氨基酸以外的部分中，缺失、替代和/或附加至少一个氨基酸的氨基酸序列，
(14)前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，修饰的氨基酸是从氨基末端第3个氨基酸。
(15)前述(14)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，修饰的氨基酸中的氨基酸是丝氨酸或半胱氨酸。
(16)前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，修饰氨基酸中的修饰是，向氨基酸α碳原子中导入了(a)通过或不通过碳原子数1以上的亚烷基，通过选自酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲的键合方式键合的具有1个或多个碳原子的饱和或不饱和烃基链，或(b)H或具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链，
(17)前述(1)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有通过酯键修饰的修饰氨基酸，
(18)前述(17)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有键合了脂肪酸的氨基酸，
(19)前述(18)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，具有键合了碳原子数2至35的脂肪酸的氨基酸，
(20)前述(18)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中结合的脂肪酸是辛酸(caprylic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(21)前述(18)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中结合的脂肪酸是辛酸(caprylic acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(22)前述(18)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中结合的脂肪酸是月桂酸(lauric acid)、或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，
(23)前述(1)至(22)记载的肽类化合物，通过如下被修饰，氨基末端通过具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基或酰基被修饰和/或羧基末端是OZ或NR2R3(Z表示药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基，R2和R3可相同或不同，表示选自H和低级支链或非支链烷基的基团)，
(24)前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的治疗生长激素欠缺或减少引起的疾病的药物组合物，
(25)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病相关治疗剂，和含有前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐形成的为治疗该疾病的疾病的药物组合物，
(26)适用于人以外动物的前述(24)至(25)记载的药物组合物，
(27)生长激素欠缺或减少为起因的疾病的治疗方法，包括使用前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物给药，
(28)非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，包括使用非起因于生长激素欠缺或减少的疾病涉及的治疗剂，和含有前述(1)至(6)记载的肽类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物给药，
(29)适用于人以外动物的前述(27)至(28)记载的治疗方法，
(30)DNA，是编码前述(1)至(6)记载的肽类化合物所涉及的DNA，在该DNA序列中，DNA序列编码具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列的肽，
(31)前述(30)记载的cDNA(含有NCR)，具有SEQ ID NO.：6记载的DNA序列，
(32)前述(30)记载的cDNA(不含NCR)，具有SEQ ID NO.：6记载的DNA序列中第31至381位核苷酸的DNA序列，
(33)前述(30)记载的c DNA(含有NCR)，具有SEQ ID NO.：7记载的DNA序列，
(34)前述(30)记载的c DNA(不含NCR)，具有SEQ ID NO.：7记载的DNA序列中第34至385位核苷酸的DNA序列，
(35)具有前述(30)至(34)记载的DNA的载体，
(36)含有前述(35)记载的载体的细胞，
(37)可产生肽类化合物的细胞，具有包含前述(30)至(34)记载的DNA的载体，且具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽化合物是，具有该氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰的识别序列的肽类化合物，
(38)与前述(1)至(23)记载的肽类化合物相对应的抗体，
(39)肽类化合物的测定方法，其特征在于，使用前述(38)记载的抗体，鉴定前述(1)至(23)记载的肽类化合物，
(40)肽类化合物检测用试剂盒，其特征在于，使用前述(38)记载的抗体，检测前述(1)至(23)记载的肽类化合物，
(41)肽类化合物的制造方法，是在使用基因重组技术制造前述(1)至(6)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(30)记载的DNA的载体，将可修饰该肽中的至少一个氨基酸侧链的宿主细胞进行转化，培养所得转化的细胞，从培养物中采集目的肽类化合物，
(42)肽类化合物的制造方法，其特征在于使用基因重组技术制造前述(1)至(6)记载的肽类化合物的方法中，通过含有前述(30)记载的DNA的载体将宿主细胞进行转化，培养所得转化细胞，从培养物采集目的物质后，将任意的氨基酸进行化学修饰，
(43)肽类化合物的制造方法，其特征在于使用基因重组技术制造前述(18)至(22)记载的肽类化合物的方法中，使用可产生SEQ IDNO.：1记载的氨基酸序列中的丝氨酸残基与脂肪酸键合的肽的细胞，
(44)具有提高细胞内钙离子浓度活性和诱导成长激素分泌活性的肽类化合物的制造方法，其特征在于，通过含有编码前述(7)至(13)记载的肽类化合物的DNA的载体将宿主细胞进行转化，培养所得转化的细胞，从培养物采集目的物质，
(45)治疗生长激素欠缺或减少导致的疾病的基因治疗用药物组合物，通过将含有编码前述(1)至(6)记载的肽类化合物的DNA的载体插入生物体内细胞，得到具有提高细胞内钙离子浓度活性的具有至少一个修饰的氨基酸的肽，
(46)生长激素欠缺或减少引起的疾病的治疗方法，其特征在于，通过将具有编码前述(1)至(6)记载的肽类化合物的DNA的载体插入细胞，得到具有生长激素分泌诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列，
(47)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的基因治疗用药物组合物，通过将具有编码前述(1)至(6)记载的肽类化合物的DNA的载体插入生物体内细胞中，得到具有提高细胞内钙离子浓度活性的，具有至少一个氨基酸被修饰的肽，和
(48)治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病的治疗方法，通过将具有编码前述(1)至(6)记载的肽类化合物的DNA的载体插入生物体内细胞中，得到具有生长激素诱导活性的肽，该细胞可产生肽，该肽是具有被该DNA编码的氨基酸序列的肽，它具有至少一个氨基酸被修饰的识别序列。
在本发明中，氨基酸是指包括L—氨基酸、D—氨基酸、α—氨基酸、β—氨基酸、γ—氨基酸、天然氨基酸、合成氨基酸等所有氨基酸。
在本发明中，修饰的氨基酸是指，上述氨基酸的任意基团被化学修饰的氨基酸。特别优选，α—氨基酸中α碳原子被化学修饰的修饰氨基酸。即，修饰氨基酸是用式(I)表示的α—氨基酸时
R′、R＂是H或任意的取代基，总之是将天然氨基酸进行化学修饰后的任何产物就都可以。另外，R′、R＂的任意一方可以是H。
作为R′、R＂所示的取代基，将天然氨基酸中存在的取代基，用天然氨基酸或与之对应的D—氨基酸中不存在的取代部分取代的氨基酸称为修饰氨基酸。
作为这样的取代部分，例如，可以将天然存在的氨基酸侧链中含有—OH、—SH、—NH—或—NH2时，将这些基团酰化形成的基团作为优选例子列举。
作为这样的酰基，可列举例如，从有机羧酸、有机磺酸、有机磷酸化合物除去羟基形成的基团。
作为有机羧酸，更具体地可列举脂肪酸，其碳原子数优选2～35，更优选6～18，最优选8～16。作为这样的脂肪酸，具体可列举，八碳酸(优选辛酸)、十碳酸(优选，正癸酸)、十二酸(优选月桂酸)、其单烯或多烯脂肪酸等。
对于有机磺酸或有机磷酸化合物，也优选碳原子数2～35的化合物。
另外，进一步修饰的氨基酸可以是上述R′或/和R＂所示基团被例如下式所示取代的氨基酸。
-(CH2)n-P-Q
(式中、n是0～10的整数、P是
Figure C00810440D00421
Figure C00810440D00422
或-CO-NH-CO-、Q是H或C1-35、优选C1-20的烷基)
另外，P也可以是—CO—。
P也可以是—S—S—、或—NH—CS—。另外，在上述所有—NH—中，H可被C1～35的饱和或不饱和烷基、C6～20的芳基、C7～ 13的芳烷基取代。
α—氨基酸用上述式(1)表示时，R′或R＂被上述—(CH2)n—P—Q取代的修饰氨基酸是优选的实施方案。特别是，氨基酸为丝氨酸的α碳原子与上述式—(CH2)n—P—Q所示取代基键合的式
(式中、n、P或Q定义同上。)
所示修饰的丝氨酸是优选的。
下面就通过或不通过碳原子数1以上的烷基的选自酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲的键合方式进行说明。
例如，氨基酸是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或羟基脯氨酸时，该氨基酸在侧链中有羟基。氨基酸是半胱氨酸时，该氨基酸在侧链中有巯基。氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、脯氨酸或羟基脯氨酸时，在侧链中有氨基或亚氨基。
这些羟基、巯基、氨基、亚氨基可被化学修饰。即，羟基或巯基可被醚化、酯化、硫醚化或硫酯化。亚氨基可被亚氨醚化、亚氨硫醚化、烷基化。氨基可被酰胺化、硫代酰胺化或脲化。
另外，巯基可被二硫化物化，亚氨基可被酰胺化、或硫代酰胺化，氨基可被烷基化或硫脲化。
这样被化学修饰的羟基或巯基可用下式表示
Figure C00810440D00441
或
Figure C00810440D00442
酰胺化或硫代酰胺化的氨基或亚氨基可用下式表示
Figure C00810440D00443
或
醚化的羟基或巯基可用下式表示
—O—Z3、或
—S—Z3
作为亚氨醚化或亚氨硫醚化的亚氨基可用下式表示
或
Figure C00810440D00452
作为烷基化的氨基可用下式表示
Figure C00810440D00453
作为烷基化的亚氨基可用下式表示
作为脲化或硫脲化的亚氨基可用下式表示
Figure C00810440D00455
或
Figure C00810440D00456
二硫化物化的巯基可用下式表示
—S—S—Z8。
上述式中，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7和Z8可以是不违背本发明精神的，为进行任何化学修饰的取代基，由于是在药物领域常用的或用于肽化学修饰的取代基在专利文献或学术文献中公知的，在本发明中也可采用这些本身公知的用于修饰的取代基，且化学修饰可按照其以前公知的方法进行。
在上述式中，Z1可以是氢原子或直链、支链或环状烷基，这些烷基可以是饱和或不饱和的。碳原子数通常为C1-50，优选为C6-20。
Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7或Z8可以是氢原子或直链、支链或环状烷基，这些烷基可以是饱和或不饱和的。碳原子数通常为C1-10，优选为C1-6。
该Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7或Z8所表示的烷基，可以被例如，羟基、氨基、卤素、硝基、C1-3烷氧基等通常用于肽化学修饰中的取代基取代。
上述中，
Figure C00810440D00461
为脂肪酸
Figure C00810440D00462
的残基时，是键合了脂肪酸的氨基酸的一个例子。此时，作为脂肪酸，可列举例如辛酸、正癸酸、十二(烷)酸、丁酸、己酸、十一烷酸、十六烷酸、癸酸、十九烷酸、二十二烷酸、褐煤酸、或三十二(烷)酸等饱和脂肪酸，例如丙烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、或アアテアロ—ル酸等不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸可以是单烯，也可以是多烯。
另外，修饰的氨基酸可以是与α—氨基酸中的α碳原子键合构成肽键的羧基和氨基以外的基团被氢原子或饱和或不饱和烷基取代形成的α—氨基酸。
另外，本发明中修饰的氨基酸可以是，氨基酸的氨基被碳原子数1至6的饱和或不饱和烷基取代形成的氨基酸。
本发明中的非天然氨基酸，是在分子两端具有氨基和羧基的物质，例如可列举，NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-COOH、NH2-(CH2)4-COOH、NH2-C(CH3)2-(CH2)3-COOH、或NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH等。这些中的任何一个，分子链长相当于二肽的长度，当然也包括分子链长相当于肽长的物质。
另外，本发明中的非氨基酸化合物，包括例如，NH2-CH(CH2OH)-CH3、CH3-CH(R)-COOH、CH3-CH(R)-CH3(每一个的分子链长与肽长相当)，或NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-CH3、NH2-(CH2)3CH(R)-CH3(每一个的分子链长与二肽长相当)等。
这里，R是表示天然氨基酸的侧链或上述修饰氨基酸的α碳原子的取代基。
附图简要说明
图1是显示从大鼠胃萃取物得到的Ghrelin的纯化图，由CHO-GHSR62细胞中细胞内钙离子浓度上升引起的荧光强度变化，用黑柱表示。a图显示，从40g大鼠胃制备的SP-III组分，用Sepahdex G-50(精制)凝胶过滤的结果，显示的活性组分是分子量约3,000道尔顿的物质。b图显示，第2次CM-离子交换HPLC的结果，第55～56分钟洗脱出的活性组分，用逆相HPLC进一步纯化。
图2显示，确认Ghrelin中的正辛酰基修饰。a是显示，天然型Ghrelin(上段)、和合成Ghrelin和合成脱酰基化Ghrelin(下段)、分别取2μg，用逆相HPLC的分析结果图。b是显示，天然型Ghrelin(实线)、合成Ghrelin(小虚线)和合成脱酰基化Ghrelin(大虚线)引起的CHO-GHSR62细胞中细胞内钙离子浓度的变化图。
图3是显示，Ghrelin对于CHO-GHSR62细胞的特异性相互作用的图，图中，在箭头所示的点，添加试样。a是显示，Ghrelin、GHRP-6和GRF(GHRH)引起的CHO-GHSR62细胞中细胞内钙离子浓度的变化图。b是显示，添加(○)或不添加(●)作为GHS-R特异性抑制剂的[D-Lys-3]-GRP-6时，Ghrelin引起的CHO-GHSR62细胞中细胞内钙离子浓度的变化图，也显示GRF(GHRH)引起的细胞内钙离子浓度变化(黑三角)。
图4显示，从大鼠和人得到的Ghrelin前体的氨基酸序列、和研究这些前体在各种组织的表达的结果图。a是大鼠和人的Ghrelin前体氨基酸序列比较图，图中，相同氨基酸结网，虚线表示信号肽，黑三角表示信号肽的切断点，三角表示羧基末端侧的切断点，框中表示成熟型Ghrelin部分、*表示用正辛酸修饰。b显示的是用Northern印迹分析的大鼠各种组织中Ghrelin的表达的结果图。
图5显示，在体外和体内，Ghrelin对下垂体激素分泌的影响效果图。a是显示，在大鼠下垂体初期培养细胞中细胞内钙离子浓度变化引起的荧光强度的变化图，实线表示添加Ghrelin的情况，虚线表示添加脱酰化Ghrelin的情况。b是显示，Ghrelin引起的下垂体激素分泌的图，图中，黑柱表示添加Ghrelin时，白柱表示不添加时的下垂体激素浓度。c是显示用Ghrelin对雄性大鼠静脉注射后血浆中的下垂体激素浓度随时间的变化图。在图b和图c中，GH表示生长激素，ACTH表示促肾上腺皮质激素，FSH表示促卵泡激素，LH表示促黄体激素，PRL表示催乳激素，TSH表示促甲状腺激素。
图6显示的是，用Ghrelin对脑室内给药时的促进进食的效果图，表示用Ghrelin给药后2小时的摄饵量(平均值±标准误差)。a表示，对于Ghrelin的效果误差范围不足0.0001的情况。
图7显示、在尿烷麻醉的大鼠中，对给药引起的胃酸分泌的效果图，A是使用大鼠Ghrelin(rGhrelin)，B是使用组胺(Histamine)给药时的结果。各符号表示的是，用4例大鼠的平均值，标准误差用误差框(error bar)表示。作为对照，使用生理盐水(Saline)给药。在箭头指的时间点用药剂给药。
图8显示，在尿烷麻醉的大鼠中，大鼠Ghrelin对于胃运动的作用图，A表示，使用生理盐水(Saline)和大鼠Ghrelin(rGhrelin)给药时的典型胃运动波形，B是显示，4例大鼠的平均值和标准误差值的图。在箭头指的时间点给药(Drug)。
图9显示的是，放射免疫测定标准曲线和抗体交叉反应性图，a显示各种Ghrelin对用125I标识的大鼠Ghrelin与N端抗体结合的抑制图，b显示，各种Ghrelin对用125I标识的大鼠Ghrelin与C端抗体结合的抑制图。图的横轴表示的是，各种Ghrelin在每个反应管的添加量，纵轴表示，相对于无各种Ghrelin存在下的大鼠Ghrelin结合量(B0)的在各种Ghrelin存在下的结合量(B)的百分比(％)。图中符号分别表示，大鼠Ghrelin(○)、人Ghrelin(●)、大鼠Ghrelin-27(□)、[Ser3(癸酰基)]-大鼠Ghrelin(◇)、[Ser3(己酰基)]-大鼠Ghrelin(△)和脱脂肪酸大鼠Ghrelin(
Figure C00810440D0049164320QIETU
)。
发明实施的最佳方案
对于形成GHS受体(GHS-R)的内在性配位体的肽，可通过向表达GHS-R的细胞中添加各种脏器或组织萃取物，测定细胞内钙离子浓度，得知该内在性配位体在脏器·组织间的分布。
作为表达GHS-R的细胞，已知一直表达GHS-R的的下丘脑和脑垂体，以及从这些组织得到的细胞株，但是优选对GHS-R基因合适的细胞，例如，向CHO细胞中导入·表达的转化细胞。
在本发明的内在性GHS肽中，不仅在表达该肽的下丘脑和脑垂体，而且在作为消化系统脏器的胃萃取物中确认有强的Ca提高活性。因此，为了寻找目的孤儿·受体的内在性配位体，不仅要在表达该受体的组织·脏器中寻找，而且需要在其他组织·脏器中广泛寻找。
测定细胞内钙离子浓度的方法可使用公知的方法，优选利用钙离子浓度变化引起的Fluo-4 AM(Molecular Probe社)的荧光强度变化的FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader，Molecular Devices社)。
为了从已确认Ca提高活性的组织·脏器的萃取物中，生成目的内在性GHS肽，可使用公知的纯化方法。
作为肽的纯化方法，用各种分离方法分离后，凝胶过滤通过单独或组合使用离子交换和和逆相色谱有效进行，不一定需要拘泥于通过该色谱纯化，可利用在肽纯化中有效的任何手段。
另外，从组织·脏器分离·纯化肽时，为了防止组织·脏器中存在的蛋白酶的作用引起的目的肽的分解，最好将组织·脏器在沸水中热处理使蛋白质失活。热处理后将组织·脏器用冰冷却除去，在目的肽的萃取·纯化中也是有效的。
纯化的具有Ca提高活性的肽，为确认其在体外和体内的GH分泌诱导活性，可利用公知的方法。
例如，在体外，分泌GH，添加到确认表达GHS-R的脑垂体细胞中，细胞培养液中分泌的GH，可通过使用抗GH抗体的放射免疫测定法测定。另外，在上述放射免疫测定法中，如果使用对于其他激素的抗体代替抗GH抗体，也可测定该激素的分泌量。
为确认体内GH分泌诱导活性，可将具有Ca提高活性的肽注射到动物的末梢静脉后，测定血清中的GH浓度。
纯化的肽的结构解析可使用公知的方法。
为了鉴定肽的氨基酸序列的方法有，通过爱德曼氏分解法从羧基末端依次将氨基酸残基游离，将该游离氨基酸通过高效液相色谱(HPLC)测定氨基酸的方法，和将该方法自动化的通过氨基酸定序器的方法。
另外，还有通过GC-MASS测定离子化片段的分子量，鉴定氨基酸序列的方法。
含有本发明的一个修饰氨基酸的肽的情况，在鉴定上述氨基酸序列时，修饰的氨基酸被识别为“未知氨基酸”。
此时，将该修饰肽分解为氨基酸单元后，将修饰氨基酸分离·纯化，通过常用化合物的结构测定法，鉴定修饰氨基酸的结构，可知道整个肽的结构。另外，化学合成具有从编码修饰肽的cDNA得到的该肽的氨基酸序列的肽，从该合成非修饰肽和修饰肽的分子量或物理性质等推定修饰基团的结构。
确定结构的肽中的，提高Ca活性必须部分的氨基酸序列(核心序列)，可通过测定将该肽用蛋白酶切断后生成的肽片段的Ca提高活性来明确。
所用蛋白酶，可使用切断肽的氨基酸序列中特异性高的蛋白酶，但是即使使用特异性低，但在部分分解条件进行反应，也可制备该肽的各种肽片段。
通过测定这样制备的肽片段的Ca提高活性，可得知提高Ca活性必须的核心序列。
内在性GH分泌诱导肽，氨基末端的第3个丝氨酸被脂肪酸酰化，但具有内在性GH分泌诱导肽的一部分氨基酸序列的肽片段和该肽片段的丝氨酸侧链与脂肪酸形成酯键的脂肪酸修饰的肽，可通过化学合成。
通过该合成肽片段，可对内在性GH分泌诱导肽进行详细的解析。同时，通过比较各种脂肪酸修饰的肽片段，可判定提高Ca活性必须的脂肪酸的种类。
例如，爪蟾属等种，内在性GH分泌诱导肽，其氨基末端的第3个氨基酸残基不是丝氨酸而是苏氨酸，该苏氨酸被脂肪酸酰化，而对于该肽类化合物可合成，由此可详细解析该化合物。
另外，通过比较脊椎动物中具有GH分泌诱导活性的肽的氨基酸序列，可发现在脊椎动物广泛保存的领域，从该领域的氨基酸序列可发现GH分泌诱导活性必须的核心序列。
具有从内在性GH分泌诱导肽的氨基酸序列推定的碱基序列的DNA进行化学合成，将该DNA作为探针，筛选从表达该肽的细胞的mRNA制备的cDNA库，可得到编码该肽的cDNA。
但是，由于与氨基酸对应的密码子简并，从肽的氨基酸序列推定的碱基序列很多，从这样多种碱基序列得到的合成DNA作为探针的筛选是很困难的。
在这种情况下，与该肽氨基酸序列一致的序列，存在于从序列数据库中公开的表达DNA片段(EST；Expressed Sequence Tag)的碱基序列推定的氨基酸序列中时，可从该EST部分碱基序列合成得到DNA，用于上述cDNA库的筛选。
另外，从cDNA获得染色体组DNA，可用常规方法进行。
从这样取得的cDNA碱基序列，可明确内在性GH分泌诱导肽的前体多肽的氨基酸序列。
通过解析该氨基酸序列，可明确信号肽、内在性GH分泌诱导肽和其他肽部分，以及这些肽的切断点，并可明确内在性GH分泌诱导肽的生成原理。
另外，作为本发明之一的内在性GH分泌诱导肽的一部分氨基酸序列，该肽的前体多肽的氨基酸序列和编码该多肽的DNA的碱基序列，在国际申请公开WO 98/42840中被公开，但是该申请公开的肽是具有胃动素(motilin)样活性的14个氨基酸形成的肽，没有记载本发明公开的Ca浓度提高活性或GH分泌诱导活性。
本发明涉及的肽类化合物是指，具有提高细胞内钙离子浓度的活性，在下式(2)所示结构中，至少一个氨基酸被修饰氨基酸替代的肽，或至少一个氨基酸被非氨基酸替代的肽类似物，以及其氨基末端和/或羧基末端被修饰的肽衍生物。
在本发明中，上述肽、肽类似物和肽衍生物统称为肽类化合物。
另外，在该肽类化合物中，可以是多个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸替代。在本发明中，SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列中，通常是氨基末端第1～10，优选氨基末端第1～4或1～5的氨基酸中的1个或多个被修饰氨基酸和/或非氨基酸替代。其中，优选第1～5个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸替代的物质。
另外，在SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列中，在氨基末端第1～4个以外的部分，优选第1～6个以外的部分，更优选第1～10个以外的部分的氨基酸，可缺失或附加1个或多个氨基酸。
本发明的肽类化合物，优选是具有提高细胞内钙离子浓度活性和诱导生物体内生长激素分泌的肽，是至少一个氨基酸被修饰氨基酸和/或非氨基酸化合物替代的化合物。
即，本发明的肽类化合物，是具有提高细胞内钙离子浓度活性或/和诱导生物体内生长激素分泌的作用，肽链中的氨基酸被修饰氨基酸或/和非氨基酸化合物替代的肽类化合物。
作为这样的化合物的具体例，可列举SEQ ID NO.：1、2或3所示肽中第3个氨基酸Ser的羟基被酰化的化合物，SEQ ID NO.：4或5所示肽中第25个氨基酸Ser的羟基被酰化的化合物或其药学上可接受的盐。
另外，作为其他的具体例，可列举SEQ ID NO.：10、11、16或17所示肽中第3个氨基酸Ser的羟基被酰化的化合物或其药学上可接受的盐。
作为其他的具体例，可列举SEQ ID NO.：22、25、26或27所示肽中第3个氨基酸Ser的羟基被酰化的化合物或其药学上可接受的盐。
另外，作为其他的具体例，可列举SEQ ID NO.：29、30或31所示肽中第3个氨基酸Ser的羟基被酰化的化合物或其药学上可接受的盐。
另外，可列举SEQ ID NO.：28所示肽中第3个氨基酸Thr的羟基被酰化的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明中通过酰化向羟基中导入的酰基，例如可以是从有机羧酸、有机磺酸、有机磷酸化合物除去羟基形成的基团。
作为有机羧酸，更具体地说，可列举碳原子数优选2～35左右，更优选6～18左右，最优选8～16左右的脂肪酸。作为这样的脂肪酸，具体可列举，八碳酸(优选辛酸)、十碳酸(优选正癸酸)、十二碳酸(优选十二烷酸)、它们的单烯或多烯脂肪酸等。
作为有机磺酸、有机磷酸化合物，优选其碳原子数是2～35左右的化合物。
含有第3个Ser的羟基被酰化的SEQ ID NO.：1的氨基酸序列的任何肽类化合物或其药学上可接受的盐也是本发明的优选实施方案。
即，本申请的第2项发明是，含有SEQ ID NO.：8中记载的氨基酸序列、优选SEQ ID NO.：1中记载的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO.：9中记载的氨基酸序列中第3个Ser的羟基被酰化的脂肪酸修饰肽的任何肽类化合物或其药学上可接受的盐也是本发明的优选实施方案。
另外，含有将SEQ ID NO.：8中记载的氨基酸序列、优选SEQ IDNO.：1中记载的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO.：9中记载的氨基酸序列从氨基末端第3个氨基酸的丝氨酸转换为苏氨酸的氨基酸序列中第3个Thr的羟基被酰化的脂肪酸修饰肽的任何肽类化合物或其药学上可接受的盐也是本发明的优选实施方案。
另外，本发明优选的实施方案是下述通式(2)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
X—A A1—A A2—A A3—Y    (2)
[式中，X相当于氨基末端氨基酸的氨基的氢原子部分，表示H或碳原子数1或多数的饱和或不饱和烷基或酰基。Y相当于羧基末端氨基酸的α—羧基的羟基部分，表示OH、OZ或NR6R7(Z表示药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基，R6或R7表示H或低级支链或非支链烷基，R6和R7可相同或不同。)]
这里，A A1是下式所示结构
Figure C00810440D00561
(式中、n表示1或2，R1和R1’可相同或不同，表示氢或取代基。)。
其中，n为2时，两个取代基的R1可相同或不同。或，R1’也同样。
作为取代基的具体例，可列举(1)通过或不通过碳原子数1以上烷基链，通过选自酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺或脲的键键合的具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链，(2)H或具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链，或(3)天然氨基酸的侧链等。
另外，也可以是通过或不通过碳原子数1以上的烷基链，通过二硫化物或硫脲键键合的具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链。
A A2是下式
Figure C00810440D00571
(式中、R1和R1’定义同前。R2表示H或碳原子数1至6的饱和或不饱和烷基。)
或表示—CH2—CH(R1)—CH2—、或—CH2—CH(R1)—CO—(R1定义同前)。
A A3是下式
(式中、m表示1以上的整数，R1、R1’或R2定义同前。)
其中，m是2以上的整数时，其两个取代基的R1可相同或不同。或R1’R2也同样。
作为X所示的具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基，具体优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、n—戊基、正己基、n—癸基、乙烯基、丙烯基或己烯基等C1-20的烷基。
作为X所示的酰基，可列举甲酰基、乙酰基、丙酰基、或苯甲酰基等C1-10羧酸酰基；或苯磺酰基，萘磺酰基等C7-13的磺酸酰基。
R1或R1’所示的基团，优选列举的是，式(2)所示基团
—(CH2)n—P—Q    (2)
(式中、n是0～10的整数、P是
Figure C00810440D00581
Figure C00810440D00582
—NH—CO—或—CO—NH—CO—，Q表示H或上述X所示的C1-20烷基。)另外，P可以是—CO—。
另外，P也可以是—S—S—、或—NH—CS—。另外，在上述所有—NH—中，H可被C1～35的饱和或不饱和烷基、C6～20的芳基、C7～13的芳烷基取代。
更优选，P是
Figure C00810440D00583
—CO—NH—、—NH—CO—或
Figure C00810440D00584
另外，R1或R1’所示的基团也可以是不通过P，—(CH2)n与Q键合的基团。
作为Z、R6或R7所示的低级烷基，优选例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、正戊基或正己基等C1-6的烷基。
下面表示本发明涉及的肽类化合物的优选方案。
(1)AA1的优选方案；(①)氨基酸或肽。例如，可列举例如，Ser、Gly-Ser或-NH-(CH2)3CH(CH2OH)CO-(2个氨基酸残基之间的肽键部分是-(CH2)2-时)等。(②)一级胺。例如，-NH-(CH2)3CH(CH2OH)CH2-(2个氨基酸残基之间的肽键部分是-(CH2)2-时)、-NH-(CH2)3CH(R1)CH2-(2个氨基酸残基之间的肽键部分是-(CH2)2-时)[R1定义同前]、-NH-CH(CH2OH)CH2-等。
另外，(①)作为氨基酸或肽，还可列举NH2-(CH2)4-COOH、NH2-C(CH3)2-(CH2)3-COOH、或NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH。
(2)AA2的优选方案；(①)氨基酸。例如，可列举，Ser、高Ser、Cys、高Cys、Asp、Glu、Lys、Ala、Val、Leu、高Leu，Ile、高Ile，鸟氨酸、氨基己二酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、丁硫氨酸、或S—甲基半胱氨酸等，特别优选Ser。(②)氨基酸残基以外的结构；可列举-CH2-CH(R1)-CO-、-CH2-CH(R1)-CH2-等(R1定义同前)。
特别优选，(a)具有疏水性侧链的亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、高亮氨酸、高异亮氨酸、萘基丙氨酸類、色氨酸、苯基丙氨酸、环己基丙氨酸等、或它们的N-甲基氨基酸。而且，(b)侧链中具有可被酰基、烷基、链烯基或芳烷基修饰的官能基的、丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、己二酸、赖氨酸、鸟氨酸等，和它们的N-甲基氨基酸。
这些(b)的氨基酸侧链中，可通过酯、酰胺、二硫化物、醚、硫醚、硫酯，脲或硫脲键，键合酰基、烷基、链烯基或芳烷基。另外，氨基酸的α碳原子也可键合烷基、芳烷基。
(3)AA3的优选方案；氨基酸或肽。例如，Phe或具有SEQ ID NO.：2或3记载的氨基酸序列中，从氨基末端第4个Phe到第28个Arg的氨基酸序列的肽或该序列的羧基末端侧的氨基酸是SEQ ID NO.：2或3记载的氨基酸序列中，从氨基末端到第5个Leu为止缺失一个氨基酸的肽。
作为AA3的例子可列举，例如、
Phe Leu、
Phe Leu Ser、
Phe Leu Ser Pro、
Phe Leu Ser Pro Glu、
Phe Leu Ser Pro Glu His、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu SerLys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro Ala、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro Ala Lys、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro Ala Lys Leu、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro Ala Lys Leu Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro Ala Lys Leu Gln Pro、或、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser LysLys Pro
Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg。
另外，在AA3的示例中，不用说，氨基酸可以是L-氨基酸也可以是D-氨基酸。另外，在AA3的上述示例中，例如1～数个氨基酸(优选氨基酸序列的约3分之1左右)可被非天然氨基酸或非氨基酸单元，例如
—NH—(CH2)3CH(CH2OH)—
—NH—(CH2)3CH(CH2OH)CO—
—NH—CH(CH2OH)CH2—
—NH—(CH2)3CH(R1)CH2—
—CH2—CH(R1)—CO—、或
—CH2—CH(R1)—CH2—
(上述式中R1定义同前)
取代。上述所示基团在AA3中有多个，而且R1所示基团是多个时，它们可相同或不同。
另外，AA3示例中各氨基酸中的任何一个都可具有上述R1所示取代基。在AA3所示基团中，存在多个R1时，它们可相同或不同。
下面表示构成肽的氨基酸在侧链中具有羟基、巯基、亚氨基或氨基时的优选侧链的例子。另外，下面的R8表示具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链。该烷基链可与X所示的上述烷基链定义相同。
①)Ser的侧链；-CH2-O-CO-R8或-CH2-O-R8、
②)高Ser的侧链；-CH2-CH2-O-CO-R8或-CH2-CH2-O-R8、
③)Cys的侧链；-CH2-S-CO-R8或-CH2-S-R8、
④)高Cys的侧链；-CH2-CH2-S-CO-R8或-CH2-CH2-S-R8、
⑤)Asp的侧链；-CH2-COO-R8或-CH2-CO-NH-R8、
⑥)Glu的侧链；-CH2-CH2-COO-R8或-CH2-CH2-CO-NH-R8
⑦)Lys的侧链；-(CH2)4-NH-CO-R8、
⑧)氨基己二酸的侧链；-CH2-CH2-CH2-COO-R8或-CH2-CH2-CH2-CO-NH-R8、
⑨)鸟氨酸的侧链；-(CH2)3-NH-CO-R8
⑩)对于侧链是烷基链的氨基酸如Ala、Val、Leu、高亮氨酸、Ile、高异亮氨酸、S—甲基半胱氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、或丁硫氨酸等，同样地，其烷基可以是上述式(2)所示的修饰的烷基。
另外，本发明作为优选实施方案含有，具有SEQ ID NO.：2或3的氨基酸序列中，从氨基末端到第13、14或15个氨基酸形成的部分肽的细胞内钙离子浓度提高剂或GH分泌诱导剂。此时，构成部分肽的各氨基酸单元，不一定被化学修饰。
另外，本发明优选的实施方案是下列肽类化合物。
另外，Ghrelin衍生物是指天然型Ghrelin的化学结构一部分被改变的肽类化合物，短链Ghrelin是指27至28个氨基酸形成的天然型Ghrelin的一部分氨基酸缺失，由比27至28更少的氨基酸形成的肽。另外，n位的氨基酸残基是指从氨基末端的第n个氨基酸残基。
Ghrelin、或其短链Ghrelin衍生物氨基末端的氨基酸，如果该氨基酸的α氨基如果没被保护，可以是任何氨基酸(在天然型Ghrelin中氨基末端的氨基酸是甘氨酸)、另外，可以是D—构型、L—构型中的任何一个、但是优选，丙氨酸、缬氨酸、氨基异丁酸等。
2位残基可以是任何氨基酸(在天然型Ghrelin中是丝氨酸)、但是优选具有小侧链的丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、正缬氨酸或非氨基酸化合物等。
1位和2位残基可以是相当于氨基酸2个残基的δ—氨基酸、例如实施例所示的5—氨基戊酸或、5—氨基—5—二甲基戊酸、2、5—二氨基戊酸等。
在3位和4位可选择的氨基酸残基，可以是D—构型或L—构型中的任何一个，也可以是D—或L—N—甲基氨基酸，可以是这些的任意组合。其中优选3位是L—构型、或3位、4位都是L—构型的组合。
在3位和4位可选择的氨基酸残基的立体构型，可根据1位和2位的氨基酸序列适当选择。即，优选天然Ghrelin的1位和2位的氨基酸序列，Gly-Ser与3位和4位都是L—构型，但是其他的氨基酸序列，例如，Aib-His等时，也可以与3、4位都是D—构型。另外，1、2位相当于2个残基长的δ—氨基酸、例如氨基戊酸时，3、4位可以是L—构型或D—构型中的任何一个。
3位和4位中可选择的氨基酸残基，优选，D—构型或L—构型的亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、高亮氨酸、高异亮氨酸、萘基丙氨酸類、色氨酸、苯基丙氨酸、环己基丙氨酸、以及这些D—、或L—N—甲基氨基酸。
特别是，3位和4位中可选择的氨基酸残基，更优选，在上述疏水性氨基酸中，例如、萘基丙氨酸类、色氨酸、苯基丙氨酸、环己基丙氨酸等芳香族疏水性氨基酸。
另外，作为3位和4位中可选择的氨基酸残基，优选赖氨酸、精氨酸或组氨酸等碱性氨基酸。其中优选赖氨酸。
通过这些碱性氨基酸，Ghrelin分子呈碱性，可进一步提高Ca提高活性。
3位和4位中可选择的氨基酸残基，优选在侧链中具有可被酰基(烷酰基、链烯酰基或芳基烷酰基等)、烷基、或芳烷基修饰的官能基的，丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、己二酸、赖氨酸、鸟氨酸等。
这些侧链中具有反应性的氨基酸，可以是D—构型或L—构型的任何一个，也可以是对应的D—或L—N—甲基氨基酸，但其中优选，3位是L—构型、或3位、4位都是L—构型的组合。
另外，在氨基酸侧链中，可通过氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、酯、酰胺、二硫化物、醚、硫醚或硫酯键等，与酰基、例如烷酰基(碳原子数2～35、优选6～18、更优选8～12)、链烯酰基(碳原子数2～35、优选6～18、更优选8～12)、芳基烷酰基(苯甲酰基、苯乙酰基、苯基丁酰基、萘甲酰基、萘乙酰基或萘基丙酰基等)；烷基(碳原子数2～35、优选6～18、更优选8～12)；或、芳烷基(苄基、苯乙基、苯基丙基、苯基丁基、苯基戊基、萘基甲基等)键合。另外，不通过键，3位和4位的α碳原子也可与上述烷基、芳烷基键合。
作为3位和4位中可选择的氨基酸残基的组合，优选3位氨基酸残基具有疏水性侧链，4位的氨基酸是疏水性氨基酸的物质。
作为具有疏水性侧链的3位氨基酸残基，优选在氨基酸的α碳原子上，(a)经由或不经由具有1个以上碳原子的亚烷基、经由酯、醚、硫醚、酰胺或二硫化物键导入碳原子数1或多数的饱和或不饱和烷基链、或导入(b)具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基链的修饰氨基酸。特别优选，在氨基酸的α碳原子中导入碳原子数1以上的饱和烷基链的修饰氨基酸。
4位氨基酸的羧基也可以是酰胺、甲基酰胺或乙基酰胺等烷基酰胺、或苄基酰胺、金刚烷酰胺或金刚烷烷基酰胺等芳烷基酰胺。
另外，在烷基酰胺或芳烷基酰胺中，可键合氨基或胍基等碱性基。作为该碱性基团，可列举例如，—CONH—CH2CH2—NH2、—CONH—CH2NHCH3，—CONH—CH2CH2CH2—NH—C(NH2)＝NH、—CONHCH2Ph—NH2等。
在4位氨基酸的羧基中，可附加精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸，这些碱性氨基酸可以是D—构型、L—构型或外消旋体、或D—或L—N—甲基氨基酸中的任何一个。
这些氨基酸的羧基，如上所述，可以是烷基酰胺或芳烷基酰胺。另外，在烷基酰胺或芳烷基酰胺中，可键合氨基、胍基等碱性基团。作为该碱性基团可列举上述的碱性基团。
5位以后的氨基酸序列，以人Ghrelin、大鼠Ghrelin的5位亮氨酸为基点，到28位为止，可在4位氨基酸上附加任意长的序列。
优选可列举Ghrelin(1—5)、Ghrelin(1—6)，Ghrelin(1—7)，Ghrelin(1—8)，Ghrelin(1—9)，Ghrelin(1—10)、Ghrelin(1—11)。另外，Ghrelin(m-n)是指，具有Ghrelin的氨基末端从第m到第n的氨基酸序列的肽。特别优选Ghrelin(1—5)。
其羧基末端优选是上述的烷基酰胺、或芳烷基酰胺。
另外，烷基酰胺或芳烷基酰胺中，可进一步结合氨基或胍基等碱性基团。作为该碱性基团，可列举上述的碱性基团等。
另外，在Ghrelin(1—4)羧基末端部分附加了从5位以后到28位为止的任意氨基酸序列的羧基末端部分缺失的Ghrelin衍生物的羧基末端氨基酸中，可附加精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸。
这些碱性氨基酸可以是D—构型、L—构型或外消旋体、或D—或L—N—甲基氨基酸。
另外，这些碱性氨基酸的羧基可以是上述的烷基酰胺、或芳烷基酰胺。烷基酰胺或芳烷基酰胺，可进一步与氨基或胍基等碱性基团结合。作为该碱性基团，可列举上述碱性基团等。
作为特别优选的方案，可列举Ghrelin(1—5)、Ghrelin(1—6)，Ghrelin(1—7)的羧基末端氨基酸是D—构型、L—构型、或对应的D—或L—N—甲基氨基酸的情况。
另外，5，6，7位的残基中可附加精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸，这些氨基酸可以是D一构型、L—构型或外消旋体、或D—、或L—N—甲基氨基酸。
另外，这些碱性氨基酸的羧基可以是，上述的烷基酰胺、或芳烷基酰胺。烷基酰胺或芳烷基酰胺中可进一步结合氨基或胍基等碱性基团。作为该碱性基团，例如、可列举上述碱性基团等。
本发明涉及的肽类化合物，如上所述，羧基末端是烷基酰胺或芳烷基酰胺时，可以是该烷基或芳烷基进一步结合氨基的酰胺衍生物，这是本发明的一个优选方案。具体地说，可列举羧基末端是氨基乙酰胺的情况。
如上所述，羧基末端是酰胺体或酰胺衍生物的本发明涉及的肽类化合物，在生物体内拮抗羧基肽酶类引起的酶分解中也是有用的化合物。
同样地，含有N-甲基氨基酸的本发明的肽类化合物，由于具有酶拮抗性，因此也是有用的化合物。
本发明的肽类化合物，可用常规方法得到。例如，上述的从天然原料分离，或通过重组DNA技术和/或化学的合成制造。另外，在需要对氨基酸残基修饰(例如，酰化)时，可按照本身公知的方法进行修饰反应。
本发明的肽类化合物，更具体地说，通过具有编码本发明肽的DNA表达载体，培养转化的宿主细胞，从该培养物收集目的肽，可得到本发明涉及的肽类化合物。
通过选择该宿主细胞，可得到在该细胞内，目的肽被酰化等修饰的化合物。另外，在该肽未被修饰时，可按照公知的方法，进行酰化等修饰反应。在酰化反应中可使用脂肪酶等酶。
作为编入基因的载体，可列举例如，大肠杆菌载体(pBR322、pUC18、pUC19等)、枯草杆菌载体(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母载体(YEp型、YRp型、YIp型)、或动物细胞载体(反转录病毒、牛痘病毒等)等，其他的载体，只要在宿主细胞内可稳定地保持基因，都可以使用。该载体导入到适当的宿主细胞。作为将目的基因编入质粒的方法或导入宿主细胞的方法，可使用例如，MolecularCloninng(Sambrook et al.，1989)中记载的方法。
为了在上述质粒中表达目的肽基因，在该基因上游连接启动子使之具有机能。
作为在本发明中使用的启动子，只要是相对于表达目的基因所用的宿主细胞合适的启动子都可以。例如，转化宿主细胞是埃希氏杆菌属(Escherichia属)时，可使用lac启动子、trp启动子，1pp启动子、λPL启动子，recA启动子等；是芽胞杆菌属(Bacillus属)时，可使用SPO1启动子、SPO2启动子等；是酵母时，可使用GAP启动子，PHO5启动子、ADH启动子等；是动物细胞时，可使用SV40由来的启动子、反转录病毒由来的启动子等。
使用含有如上得到的目的基因的载体，将宿主细胞进行转化。作为宿主细胞，可使用细菌(例如、埃希氏杆菌属(Escherichia属)、芽胞杆菌属(Bacillus属)等)、酵母(酵母属(Saccharomyces属)、Pichia属、念珠菌属(Candida属)等)、动物细胞(CHO细胞、COS细胞等)等。作为培养时的培养基，液体培养基是合适的，特别优选该培养基中含有培养转化细胞的生长发育所必须的碳源、氮源等。可根据需要添加维生素类、生长促进因子、血清等。
为了直接制造脂肪酸修饰肽，优选，具有可在适当位置切断该肽前体多肽的处理·蛋白酶活性，具有酰化该肽中的丝氨酸残基活性的细胞。具有这样的处理·蛋白酶活性和酰化丝氨酸活性的宿主细胞，用含有编码该前体多肽的cDNA的表达载体，对该宿主细胞进行转化，通过确认该转化细胞产生具有Ca提高活性或GH分泌诱导活性的脂肪酸修饰肽，可进行选拔。
培养后，可用常规方法从培养物分离纯化本发明涉及的肽。例如，从培养菌体或细胞萃取目的物质时，可在培养后，收集菌体或细胞，将其悬浮于含有蛋白质变性剂(盐酸胍等)缓冲液中，用超声波等将菌体或细胞破碎后，进行离心分离。然后，从上清液纯化目的物质，可根据目的物质的分子量、溶解度、电荷(等电点)、亲和性等，适当组合使用凝胶过滤、超滤、透析、SDS-PAGE、各种色谱等分离纯化方法进行。
本发明涉及的肽类化合物可用常规方法化学合成。例如，通过将带有保护基的氨基酸用液相法和/或固相法缩合，延长肽链，用酸除去保护基，将所得粗产物用上述纯化方法纯化得到。用酰化酶或酰基转移酶可选择性地将目的位置的氨基酸侧链酰化。
关于肽的制造方法，以前已经充分建立各种方法，本发明的肽类化合物的制造也可按照其本身公知的方法容易地制造。例如，可按照古典的肽合成法，也可按照固相法进行。
下面举例说明，并用重组DNA技术和化学合成的本发明肽类化合物的制造方法。
化学合成氨基末端肽的活性酯，例如、(1)Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Osu、(2)Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Osu、或(3)Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu，分别与通过重组DNA技术生产的羧基末端肽(4)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR、(5)LSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR、或(6)SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR结合，即，(1)与(4)、(2)与(5)和(3)与(6)结合，可得到28个氨基酸形成的肽类化合物。更具体地说，将XXXXZSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR在大肠菌表达，用Boc2(O)保护氨基，得到Boc-XXXXZSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR。然后，将氨基酸Z的羧基末端用选择性酶切出，转换为NH2-SPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR。将该化合物与Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu在中性至弱碱性水溶液中混合，将所得BocGlySer(Bu)Ser(R10)FLSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR用三氟乙酸处理，可得到目的物。
上述氨基酸的一文字标记是按照1997年12月10日，株式会社牛顿出版社发行的“细胞的分子生物学第3版”的记载。
另外，Boc表示叔丁氧羰基，Osu表示N—羟基琥珀酰亚胺的羟基的脱氢物质，Bu表示丁基，R10表示上述本发明涉及的修饰氨基酸的取代基。
作为本发明肽类化合物的盐，优选药学上可接受的盐，可列举例如与无机碱形成的盐，与有机碱形成的盐，与无机酸形成的盐，与有机酸形成的盐，与碱性或酸性氨基酸形成的盐。
作为与无机碱形成的盐的优选例子，可列举，例如钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；以及铝盐、铵盐等。
作为与有机碱形成的盐的优选例子，可列举与例如三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N，N′-二苄基亚乙基二胺等形成的盐。
作为与无机酸形成的盐的优选例子，可列举与例如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。
作为与有机酸形成的盐的优选例子，可列举与例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等形成的盐。
作为与碱性氨基酸形成的盐的优选例子，可列举与例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐，作为与酸性氨基酸形成的盐的优选例子，可列举与例如天门冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。
这些盐中，最优选钠盐、钾盐。
本发明的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其毒性低，具有GH分泌诱导作用，可直接或与本身公知的药学上允许的载体、赋形剂、增量剂等混合对哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、马、猪、猴等)使用。给药量为，成人静脉注射时1天0.01～5mg/kg，优选0.04～1.5mg/kg。该量优选1天分1次～3次给药。本发明的肽类化合物，与药学上可接受的载体混合，可以片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂等固体制剂；或糖浆剂、注射剂等液体制剂的形式口服或非口服给药。
作为药学上可接受的载体，可使用作为制剂原料惯用的各种有机或无机载体物质，在固体制剂中可混合赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂；在液体制剂中可混合溶剂、溶解助剂、悬浮化试剂、等渗化试剂、缓冲剂、无痛化试剂等。
另外，根据需要，还可使用防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等制剂添加物。
作为赋形剂的优选例子，可列举，例如乳糖、白糖、D-甘露糖醇、淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐等。作为润滑剂的优选例子，可列举，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶体二氧化硅等。
作为粘合剂的优选例子，可列举，例如结晶纤维素、白糖、D-甘露糖醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
作为崩解剂的优选例子，可列举，例如淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、クロスカルメロ—ス钠、羧甲基淀粉钠等。
作为溶剂的优选例子，可列举例如，注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等。
作为溶解助剂的优选例子，可列举例如，聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄基酯、乙醇、三氨基甲烷、胆甾醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。
作为悬浮化试剂的优选例子，可列举例如，十八烷基三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、氯化新洁尔灭、氯化苄甲乙氧铵、单硬脂酸甘油酯等表面活性剂；例如聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等亲水性高分子等。
作为等渗化试剂的优选例子，可列举例如，氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。
作为缓冲剂的优选例子，可列举例如，磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等缓冲液。
作为无痛化试剂的优选例子，可列举例如，苄基醇等。
作为防腐剂的优选例子，可列举例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苄基醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
作为抗氧化剂的优选例子，可列举例如，亚硫酸盐，抗坏血酸等。
上述药物组合物，可得到与GH给药效果同等以上的效果，并可减低GH给药引起的各种副作用。
该药物组合物可适用的疾病或其效果，作为与GH缺损或低下有关的，可列举例如、活化侏儒、正常人的成骨细胞和骨再构成，增强GH缺乏症成人的肌肉量和肌肉力量，提高GH缺乏症成人的运动能力，治愈小儿重度烧伤，在诱发排卵中与促性腺激素并用，预防强的松给药引起的蛋白质代谢异常，促进重度免疫缺损症中T细胞“教育”，抑制老年性体重减少，脂肪组织扩大和皮肤萎缩等效果，但是并不限于这些。
另外，与GH缺损或低下无直接关系的疾病或效果，如实施例7中记载的，由于该药物组合物具有增加脉动量的效果，因此在心脏器质性病变等心脏病的治疗中是有效的。
该药物组合物不仅仅对人有效果。即，对于动物的生长促进，食肉中脂肪的降低等，与GH给药具有同等以上的效果。
另外，如实施例13中记载的那样，由于本发明的药物组合物通过脑内给药和静脉给药，具有增进食欲的作用，因此可作为治疗食欲不振或绝食症的食欲增进剂使用。
另外，如实施例14中记载的那样，本发明的药物组合物具有促进胃运动和胃酸分泌的作用，因此可用作非溃疡性消化不良，突发性轻度胃张力缺乏、功能性消化不良和逆流性食道炎等胃功能性疾病的治疗剂。
另外，如实施例15中记载的那样，通过使用本发明的药物组合物静脉给药，可确认对骨髄、十二指肠和空肠中的细胞，起增殖促进作用，因此可作为肠道粘膜保护剂、静脉营养时小肠粘膜障碍预防剂和骨质疏松治疗剂使用。
另外，上述药物组合物对以下疾病的治疗或改善身体状态是有效的。
例如，在高龄者中刺激处理生长激素的释放，预防糖质肾上腺皮质激素的异化副作用，预防和治疗骨质疏松，刺激免疫系统，促进损伤治愈，促进骨折修复，治疗生长迟缓，治疗生长迟缓引起的肾衰竭或功能不全，治疗与包括缺乏生长激素的儿童的生理学上不足状态和慢性疾病相关的不足状态，治疗肥胖和与肥胖相关的生长迟缓，治疗与プラ—ダ——ヴイリ综合征和特纳氏综合征相关的生长迟缓，促进烧伤患者的恢复和减少住院，治疗子宫内发育迟缓，骨格形成异常、高肾上腺皮质激素症和柯兴氏综合征，诱导脉动性生长激素释放，代用紧张患者中的生长激素，治疗软骨形成异常，ヌ—ナン综合征、精神分裂症、忧郁症、阿而茨海默氏病，治愈延迟损伤和治疗心理社会的剥夺，治疗肺功能不全和呼吸器官依赖症，减少大手术后的蛋白质异化反应，减少癌症或艾滋病(AIDS)等慢性疾病引起的蛋白质损失和恶液质，治疗包括胰岛细胞症的高胰岛素血症，为诱发排卵的佐剂疗法，刺激胸腺发育和预防随年龄增长的胸腺功能衰退，治疗免疫抑制患者，提高肌肉强度、运动性，维持高龄者的皮肤厚度、代谢永恒性、肾永恒性，刺激成骨细胞、骨再造形和软骨生成等。
另外，在动物中可期待以下的效果。可列举例如，增加动物的生长速度、增加动物的产乳或产毛、刺激宠物动物的免疫系统、治疗宠物动物的高龄疾病、促进家畜的生长以及促进绵羊产毛等。
将本发明的具有Ca提高活性或GH分泌诱导活性的脂肪酸修饰肽作为抗原的抗体，可用公知的方法获得。该抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，它们的获得可使用公知的方法。另外，使用这些抗体的脂肪酸修饰肽的測定方法和利用该测定方法的测定试剂盒的制作也可使用已知的方法。
另外，如实施例17中记载的那样，制备相对于Ghrelin的氨基末端侧和羧基末端侧肽的抗体，利用前者对修饰3位丝氨酸的脂肪酸的特异性识别，可分别定量在脂肪酸上修饰的Ghrelin和脱脂肪酸的Ghrelin。
与该Ghrelin氨基末端侧相对的抗体或与羧基末端侧肽相对的抗体，可用公知的方法取得，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
同样地，对于氨基末端第3位置具有修饰氨基酸的本发明的肽类化合物或其药学上可接受的盐，可制备特异性地识别第3位氨基酸残基侧链(优选为脂肪酸)与肽的氨基末端侧结合的抗体。另外，同样地，对于本发明涉及的肽类化合物或其药学上可接受的盐，也可制备与具有修饰氨基酸的肽特异性结合的抗体。
如上所述，包含如下抗体的检测试剂盒也包括在本发明中：特异性识别修饰氨基酸侧链的抗体和，识别修饰氨基酸或/和非氨基酸化合物以外的氨基酸或不含它们的肽的抗体，优选针对于本发明涉及的肽类化合物或其药学上可接受的盐的羧基末端侧肽的抗体。
另外，使用检查试剂盒，将修饰氨基酸，优选具有酰化的氨基酸的本发明肽类化合物或其药学上可接受的盐与，不含修饰氨基酸的本发明肽类化合物或其药学上可接受的盐分别检出的测定方法，也包括在本发明中。
关于上述测定方法或检查试剂盒，具体方案如下所述。但是，本发明并不限于下列方案。
即，作为上述测定方法，可列举例如(i)被检液中本发明肽类化合物的定量法，其特征在于，使针对于本发明肽类化合物等的抗体与被检液中的被检物质和标识化的本发明肽类化合物等竞争反应，测定与该抗体结合的标识化的本发明肽类化合物等的比例，和(ii)被检液中本发明蛋白质等的定量法，其特征在于，在被检液和载体上不溶化的本发明抗体和标识化的其它本发明抗体同时或连续反应中，测定不溶化载体上的标识剂活性或/和不溶化载体上未捕捉的标识剂的活性。在上述(i)和(ii)的定量法中，优选为，一种抗体是识别本发明蛋白质等氨基末端侧的抗体，另外抗体是与本发明蛋白质等羧基末端侧反应的抗体。
另外，作为本发明肽类化合物等的测定方法，除了使用对该化合物的单克隆抗体(以下、有时称为抗蛋白质抗体)定量对本发明蛋白质等以外，也可通过组织染色等进行检测。
在这些目的中，可使用抗体分子本身，另外，也可使用抗体分子的F(ab’)2、Fab’、或Fab组分。
对于使用上述抗体的本发明肽类化合物等的定量法，没有特别的限制，只要是可通过化学或物理手段检测出与被测定液中的抗原量(例如，蛋白质量)相应的抗体、抗原或抗体—抗原复合体的量，将其通过使用含有已知量抗原的标准液制做的标准曲线计算的测定方法都可以。优选使用例如，肾测定法、竞争法、免疫测定法和夹心法，但是从灵敏度、特异性方面考虑，特别优选使用后述的夹心法。
本发明测定方法中使用标识物质的测定法中，作为使用的标识剂，可使用例如，放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。
作为放射性同位素，可使用例如、125I、131I、3H或14C等。
作为上述酶，优选稳定的相对活性大的酶，可列举例如、β—半乳糖苷酶、β—糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化酶、苹果酸脱氢酶等。
作为荧光物质，可使用例如，荧光胺、异硫氰酸荧光素等。
作为发光物质，可使用例如，鲁米诺、鲁米诺衍生物、虫荧光素、光泽精等。
另外，在抗体或抗原与标识剂结合中，可使用生物素—抗生物素蛋白类。
下面用实施例对本发明进行详细描述。分子生物学的手法没有特别限定，依照Molecular Cloninng(Sambrook et al.，1989)。
实施例1.制作表达GHS-R的细胞株和测定Ca提高活性
为了测定由GH分泌诱导因子(GHS)与GHS受体(GHS-R)结合产生的细胞内钙离子浓度的提高(Ca提高活性)，如下制作表达大鼠GHS-R的细胞株。大鼠GHS-R的全长cDNA是以大鼠脑的cDNA为模板，通过RT-PCR(逆转录酶—聚合酶链反应)得到的。从公知的大鼠GHS-R碱基序列[K.K.Mckee，et al，Molecular Endocrinology11，415-423(1997).]，合成了以下碱基序列形成的有义和反义引物。
有义引物：5’-ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3’
反义引物：5’-ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3’
将扩增的cDNA接于载体pcDNAIII(Invitrogen社)，制做表达载体GHSR-pcDNAIII。用该表达载体将CHO细胞转化，在含有1μg/ml的G418培养基上选择稳定表达GHS-R的转化细胞。选择的细胞株CHO-GHSR62对10-10～10-9M的GHRP-6(促生长激素释放的六肽(Growth Hormone-Releasing hexapeptide))应答。用FLIPR系统(Molecular Device社)测定细胞内钙离子浓度的变化(Ca提高活性)。测定前，将4 x 104的CHO-GHSR62细胞植入壁面黑色的96孔微量培养板(Corning社)中，培养12～15小时。将细胞与4μM的荧光色素Fluo4(Molecular Probe社)一起保持1小时，用含有20mM Hepes(〔N-2-羟乙基〕-哌嗪-N-〔2-乙磺酸〕)和2.5mM羧苯磺丙胺的Hank’sBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤4次，通过添加试样，测定荧光的变化，由此测定Ca提高活性。
实施例2.内在性GH分泌诱导肽的纯化
使用实施例1中记载的CHO-GHSR62细胞，对大鼠的各种组织·脏器调查Ca提高活性，结果发现，在大鼠胃的肽萃取物即使是0.5mg时，也具有强的Ca提高活性。因此，使用多种色谱，从大鼠胃萃取物按照以下方法纯化具有Ca提高活性的肽。
为了使混在其中的蛋白酶失活，将新鲜大鼠胃40g在5倍量的沸腾水中煮沸5分钟。冷却后，将煮沸的试样调到于1M AcOH-20mMHCl中，用ポリトロン·混合器萃取肽。将萃取液在11,000rpm离心30分钟，上清液用蒸发器浓缩至约40ml。向浓缩液中加入丙酮达到66％，进行丙酮沉淀，除去生成的沉淀后，蒸发上清液中的丙酮。将上清液加到用0.1％TFA(三氟乙酸)平衡化的10g Sep-Pak C18筒(Waters社制)中，用10％CH3CN/0.1％TFA洗净后，用60％CH3CN/0.1％TFA洗脱。蒸发洗脱液的溶剂后，进行冷冻干燥。将试样溶解于1M AcOH，吸附于用1M AcOH平衡化的SP-Sephadex C-25(H+型)。通过用1M AcOH、2M吡啶和2M吡啶-AcOH(pH5.0)梯度洗脱，分别得到SP-I、SP-II和SP-III3个组分。将SP-III组分放在Sephadex G-50凝胶过滤柱上，对各个组分的一部分，使用CHO-GHSR62细胞测定Ca提高活性。Sephadex G-50柱色谱的结果如图1所示，将相当于分子量约3,000的活性组分(图1a中，馏分43-48)用TSK CM-2SW柱(4.6 x 250mm、Tosoh社制)在pH6.4，通过CM-离子交换的HPLC(高效液相色谱)分馏。将用CM-HPLC得到的活性组分，使用同一柱，在pH4.8进行二次CM-HPLC分馏(图1b)。将活性组分(图1b中、洗脱时间55-56分)用μBondasphere C-18柱(3.9 x 150mm、Waters社制)在逆相HPLC纯化至单一组分。从40g大鼠纯化出16μg具有Ca提高活性的肽，命名为Ghrelin。
实施例3.Ghrelin的结构解析
将纯化的大鼠的Ghrelin氨基酸序列用肽定序器(ABI494、AppliedBiosysytems社)测定。Ghrelin是由Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu HisGln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu GlnPro Arg(Xaa是未鉴定氨基酸)序列形成的28个氨基酸残基构成的肽。Xaa在大鼠cDNA的碱基序列中是Ser，了解到在该肽中Ser可接受任何修饰。
因此，用肽合成机(ABI433A、Applied Biosystems社)化学合成氨基末端第3个丝氨酸未被修饰的非修饰Ghrelin。由于非修饰合成Ghrelin的逆相HPLC的洗脱时间与天然型Ghrelin有很大差异(图2a)，因此可知非修饰合成Ghrelin比天然型Ghrelin有显著的亲水性。
从以上结果可知，天然型Ghrelin氨基末端第3个丝氨酸(丝氨酸3)是被疏水性残基修饰的。
为了明确丝氨酸3的修饰基团，用电喷离子化质谱分析仪(ESI-MS)分析，纯化的Ghrelin。观察的天然型Ghrelin的分子量(3314.9±0.7)比从cDNA碱基序列得到的非修饰Ghrelin肽的分子量(3188.5)大126。从以上结果可知，天然型Ghrelin是丝氨酸3的羟基被正辛酰(C8:0)脂肪酸修饰。
为确认此事，化学合成正辛酰(C8:0)Ghrelin肽，用逆相HPLC调查洗脱时间。正辛酰(C8:0)肽的化学合成是通过将丝氨酸3的羟基以外的所有官能基被保护的肽，用肽合成机(ABI 433A、AppliedBiosystems社)，使用Fmoc固相法合成，丝氨酸3的羟基在4-(二甲基氨基)吡啶存在下，用正辛酸和乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺酰化合成。合成的正辛酰肽与纯化的天然型Ghrelin具有同样的洗脱时间(图2a)。而且，将合成正辛酰肽和天然型Ghrelin通过糜蛋白酶处理得到的从氨基末端到第4个为止的肽片段(Gly1—Phe4)，在逆相HPLC中显示同样的洗脱时间。
从以上结果可得到，大鼠的天然型Ghrelin具有SEQ ID NO.：2中记载的氨基酸序列，是丝氨酸3的羟基被正辛酸(辛酸)酰化的结构(图2c)的结论。
另外，从人胃萃取物纯化人Ghrelin，可知其结构是具有SEQ IDNO.：3记载的氨基酸序列，是从氨基末端第3个丝氨酸侧链的羟基被正辛酸(辛酸)酰化的结构(图4a)。
另外，上述大鼠和人的Ghrelin的结构，是图1b中活性组分中最初的峰组分(洗脱时间55-56分)纯化的产物的结构，但是将图1b其它活性组分纯化后，用上述同样的方法进行结构解析，结果可知，修饰丝氨酸3的脂肪酸除辛酸(C8:0)以外，还有辛酸的单烯酸(C8:1)、癸酸(C10:0)及其单烯酸(C10:1)、和十二烷酸(C12:0)及其单烯酸(C12:1)。
另外，将鸡、鳝鱼和青蛙的Ghrelin与实施例2同样从胃萃取物中纯化，进一步与实施例3同样进行结构解析。可知其结构是，鸡的Ghrelin具有SEQ ID NO.：25记载的氨基酸序列、鳝鱼的Ghrelin具有SEQ ID NO.：26记载的氨基酸序列、青蛙的Ghrelin具有SEQ ID NO.：27记载的氨基酸序列，每一个都是从氨基末端第3个的丝氨酸侧链的羟基被正辛酸(辛酸)酰化的结构。
另外，将爪蟾属、鮭属和狗的Ghrelin与实施例2一样从胃萃取物纯化，进一步与实施例3同样进行结构解析。
可知其结构是，爪蟾属的Ghrelin具有SEQ ID NO.：28记载的氨基酸序列、鮭属的Ghrelin具有SEQ ID NO.：29和30记载的氨基酸序列、狗的Ghrelin具有SEQ ID NO.：3l记载的氨基酸序列，每一个都是从氨基末端第3个的丝氨酸侧链或苏氨酸侧链的羟基被正辛酸(辛酸)酰化的结构。
另外，从鮭属可得到SEQ ID NO.：29记载的23个氨基酸残基形成的Ghrelin—23和，SEQ ID NO.：30记载的20个氨基酸残基形成的Ghrelin—23。
实施例4.Ghrelin的Ca提高活性
天然型Ghrelin和正辛酰修饰的合成Ghrelin具有Ca提高活性，但是非修饰合成Ghrelin没有显著的显示Ca提高活性(图2b)。另外，由于正辛酸或正辛酸与非修饰的合成Ghrelin的混合物不显著地显示Ca提高活性，因此可知天然型Ghrelin的正辛酸基是Ca提高活性的重要结构。以后，Ghrelin是指[O-正辛酰-丝氨酸3]-Ghrelin(图2c)。
Ghrelin、在CHO-GHSR62细胞中，比GHRP-6显示更高的提高细胞内钙离子浓度的活性(Ca提高活性)，但是GHRH(GH释放激素、在图3a是GRF)不显示Ca提高活性(图3b)。从10-11M可确认Ghrelin的Ca提高活性，EC50是2.5nM。在GHS-R的特异性拮抗剂[D-Lys 3]-GHRP-6[R.G.Smith，et al.，Science260，1640-1643(1993)]10-4M的存在下，Ghrelin对Ca的提高活性被抑制，在高浓度的Ghrelin，无拮抗剂存在下恢复Ca提高活性(图3b)。以上结果显示，Ghrelin的Ca提高活性被GHS-R的特异性拮抗剂拮抗性抑制。
实施例5.Ghrelin前体cDNA和其在各种脏器的表达
Ghrelin的氨基酸序列都不显示与公知的任何肽氨基酸序列相同性，但是在GenBank数据库进行同种性检索时，确认与大鼠EST(Expressed Sequence Tag)序列的一个(GenBank受理序号AI549172)相同。以该EST序列为基础合成以下的PCR引物。
有义引物：5’-TTGAGCCCAGAGCACCAGAAA-3’
反义引物：5’-AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3’
以大鼠胃的cDNA为模板，使用上述2个引物进行RT-PCR。PCR的条件是，1个周期是在98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 1分，进行35个周期。将扩增的DNA片段作为探针，筛选大鼠胃cDNA库。筛选约2 x 105个重组噬菌体，得到编码大鼠由来的Ghrelin全长cDNA。
大鼠GhrelincDNA是由SEQ ID NO.：6记载的501碱基形成，编码由117个氨基酸(图4a)形成的前原Ghrelin(prepro-ghrelin)。Ghrelin前体的氨基末端的23个氨基酸残基具备信号肽的性质。Ghrelin是从甘氨酸24开始，成熟型Ghrelin的最后2个氨基酸(Pro-Arg)被蛋白酶切断的序列。
使用大鼠GhrelincDNA，在低严格条件下筛选人胃cDNA库，得到全长人GhrelincDNA。人胃cDNA库是从人胃poly(A)+RNA(Clontech社)，使用cDNA合成试剂盒(Pharmacia社)制做的。所得的全长人Ghrelin cDNA是由SEQ ID NO.：7记载的511个碱基形成，编码从117个氨基酸(图4a)形成的人前原Ghrelin(prepro-ghrelin)。大鼠和人的Ghrelin前体的氨基酸序列显示82.9％的同一性，由此可判明Ghrelin在生物种间高度保守。
为了弄清Ghrelin的组织间分布，解析从大鼠的各种组织分离的poly(A)+RNA(图4b)。根据大鼠组织的Northern印迹分析，在胃中可确认0.62kb的Ghrelin前体mRNA。虽然在心室(Ventricle)中也确认了2条微弱带，但它们是6.2kb和1.2kb的mRNA，比胃的mRNA大，推定是与胃不同的mRNA的剪接。从以上的结果可知，Ghrelin的主要表达部位是胃。
实施例6.Ghrelin对下垂体激素分泌的効果
在体外和体内研究Ghrelin是否具有GH分泌诱导活性。首先，作为体外测定，调查Ghrelin对下垂体前叶初期培养细胞的効果。从4周龄的雄性SD大鼠采取下垂体前叶，用胶原酶处理分散后，收集细胞，用含有10％FCS(胎牛血清)和抗生物质的DMEM(Dulbecco’smodified Eagle’s Medium)培养基洗涤2次，悬浮于DMEM培养基中，配制下垂体前叶初期培养细胞。将5 x 104个细胞植入用聚-D-赖氨酸涂层的96孔细胞培养板，培养3～4天。将培养液用含有0.1ml试样的DMEM培养基交换，在37℃保持15分钟。采集培养液的一部分，通过放射免疫测定，测定培养液中各种下垂体激素的浓度。下垂体激素中，GH、FSH、LH、PRL、TSH使用Biotrak/Amersham社制的试剂盒，ACTH使用Peninsula Laboratories社制的高灵敏度EIA试剂盒。
如果将Ghrelin添加到下垂体前叶初期培养细胞中，可确认细胞内钙离子浓度的提高，非修饰合成Ghrelin虽然弱但可确认具有Ca提高活性(图5a)。该结果显示，Ghrelin和非修饰合成Ghrelin对垂体细胞直接作用。接着，使用垂体前叶初期培养细胞调查Ghrelin的GH分泌诱导活性时，通过添加10-6M的Ghrelin，培养液中只有GH浓度以浓度依赖性增加，确认其它的下垂体激素(FSH、LH、PRL、TSH)的浓度不增加(图5b)。
在体内调查Ghrelin的GH分泌诱导活性。将合成Ghrelin 10μg对雄性大鼠(250g)静脉注射后，直到60分钟为止按时间采取血样，通过上述放射免疫测定来测定血浆中的垂体激素浓度。垂体激素中，只有GH向血液中释放，Ghrelin静脉注射后5～10分钟达到最高值。从该结果可知，从胃释放到血液中的Ghrelin作用于垂体前叶细胞，向血液中释放GH，可确认Ghrelin是未鉴定的特异性的内在性GH分泌诱导物质。
实施例7.大鼠心脉动量的增加
使用麻醉大鼠，调查对心血管系统急性给药Ghrelin的効果。使用体重220-250g的Wistar系雄性大鼠(ケアリ—)，为研究对心血管系统急性给药Ghrelin的効果，将大鼠随机分为4组(10，1，0.5，0.2μg给药组)。Ghrelin用生理盐水稀释，对1只大鼠的给药量调整为10、1、0.5、0.2μg，为测定心输出量，从插入右总静脉中的注射管(PE50)急性给药120ul。
作为动力学指标，测定全身血压、心输出量，进一步算出末梢血管抵抗值。将大鼠用戊巴比妥麻醉后，背位固定。为测定平均血压，在右大腿动脉插入装满肝素的聚乙烯插管(PE50)。心输出量的測定使用热稀释式心输出量计(CARDIOTHER M500R)测定。在右总静脉插入装满生理盐水的注射管(PE50)，留在右心室内。从右总动脉插入微型导管，留在大动脉起始部位。注入液使用室温(25℃)的生理盐水100μl。按下热稀释式心输出量計的MEASURE开关的同时，注入注入液(生理盐水100μl)，测定心输出量。测定进行5次，取其平均值作为心输出量。测定Ghrelin给药前，给药后1、5、15、30分钟的平均血压和心输出量值。末梢血管抵抗用平均血压除心输出量来计算出。
表1
Figure C00810440D00841
表中、SEM表示平均值的标准误差(Standard Error Means)。
表2
表中、SEM表示平均值的标准误差(Standard Error Means)。
在Ghrelin1μg给药组(表1)和Ghrelin 10μg给药组(表2)中，在给药后1分钟和5分钟确认了心输出量的增加。
实施例8.各种起源的Ghrelin和Ghrelin-27的分离
从大鼠胃萃取物，按照实施例2记载的方法，以Ca提高活性为指标，纯化Ghrelin。将二次CM-HPLC的活性组分(图1b中、洗脱时间59分钟)用μBondasphere C-18柱(3.9 x 150mm、Waters社制)的逆相HPLC纯化至单一组分。将该组分用电喷离子化质谱分析机(ESI-MS)分析的结果，观测到分子量(3187.2±0.9)的峰，但是该值比28个氨基酸形成的辛酸(C8)修饰的天然型Ghrelin小约126。用肽·定序器(ABI494、Applied Biosysytems社)确定该肽的氨基酸序列时，为Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg LysGlu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg(Xaa为未鉴定氨基酸)的序列形成的27个氨基酸残基构成的肽。即，是28个氨基酸构成的Ghrelin从氨基末端第13或14谷氨酰胺缺失1个的氨基酸序列形成的。因该肽的Ca提高活性，如实施例9所示，与28个氨基酸的Ghrelin一样，命名为Ghrelin-27。与大鼠的情况相同，从人的胃萃取物也分离出人·Ghrelin-27，确认是SEQ ID NO.：11记载的氨基酸序列形成的。另外，将上述用二次CM-HPLC的64-65分钟的峰组分纯化，用电喷离子化质谱分析机(ESI-MS)分析的结果，观测到分子量(3341.4±0.9)的峰。由于该脂肪酸修饰肽是28个氨基酸形成的，因此可知是从Ghrelin(28个氨基酸)的氨基末端第3个的丝氨酸被癸酸(C10)修饰的产物。
编码Ghrelin27前体的cDNA，可从实施例5制做的大鼠胃cDNA库，用实施例5制做的PCR扩增DNA片段作为探针，用噬菌斑杂交法克隆。以确定cDNA的碱基序列，确认编码Ghrelin-27前体的物质。所得Ghrelin-27前体cDNA，是由SEQ ID NO.：14记载的碱基序列形成的，编码具有SEQ ID NO.：12记载的氨基酸序列的由116个氨基酸形成的Ghrelin-27前体。另外，用与上述完全相同的方法，克隆人·Ghrelin-27前体cDNA，可知是由SEQ ID NO.：15记载的碱基序列形成的，编码具有SEQ ID NO.：13记载的氨基酸序列的由116个氨基酸形成的人·Ghrelin-27前体。
编码猪由来的Ghrelin和Ghrelin-27前体的cDNA，可从猪cDNA库按照实施例5记载的方法，使用实施例5记载的PCR扩增DNA片段作为探针，用噬菌斑杂交法克隆。以确定所得cDNA克隆的碱基序列，确认编码猪·Ghrelin前体或猪·Ghrelin-27前体的物质。所得猪·Ghrelin前体cDNA是由SEQ ID NO.：20记载的碱基序列形成的，编码具有SEQ ID NO.：18记载的氨基酸序列的由118个氨基酸形成的Ghrelin前体。另外，猪·Ghrelin-27前体cDNA是由SEQ ID NO.：21记载的碱基序列形成的，编码具有SEQ ID NO.：19记载的氨基酸序列的由117个氨基酸形成的Ghrelin-27前体。因此，猪·Ghrelin(28个氨基酸)和猪·Ghrelin-27(27个氨基酸)，分别由SEQ ID NO.：16和17记载的氨基酸序列形成。
编码鳝鱼、爪蟾属或鮭属由来的Ghrelin前体的cDNA，可从各种cDNA库按照实施例5记载的方法，使用实施例5记载的PCR扩增DNA片段作为探针，用噬菌斑杂交法克隆。从确定所得cDNA克隆的碱基序列，确认编码Ghrelin前体的物质。
所得鳝鱼·Ghrelin前体cDNA是由SEQ ID NO.：36记载的碱基序列形成的，爪蟾属·Ghrelin前体cDNA是由SEQ ID NO.：37记载的碱基序列形成的，鮭属·Ghrelin前体cDNA是由SEQ ID NO.：38或39记载的碱基序列形成的。
另外，从鮭属得到编码SEQ ID NO.：38记载的Ghrelin—23前体的cDNA和编码SEQ ID NO.：39记载的Ghrelin—20前体的cDNA。
从上述cDNA的碱基序列可知，鳝鱼·Ghrelin前体具有SEQ IDNO.：32记载的氨基酸序列，爪蟾属·Ghrelin前体具有SEQ ID NO.：33记载的氨基酸序列，鮭属·Ghrelin前体具有SEQ ID NO.：34或35记载的氨基酸序列。
另外，可知从鮭属，可得到SEQ ID NO.：34记载的Ghrelin—23前体的氨基酸序列和SEQ ID NO.：35记载的Ghrelin—20前体的氨基酸序列。
牛·Ghrelin前体cDNA用PCR法克隆。即，将具有大鼠、人和猪由来的Ghrelin和Ghrelin-27的保守氨基酸序列为基础设计的碱基序列的合成DNA作为引物，以牛胃cDNA库为模板进行PCR。扩增的DNA片段具有SEQ ID NO.：24记载的碱基序列，编码SEQ ID NO.：23记载的牛·Ghrelin-27前体的一部分。因此，牛·Ghrelin-27具有SEQID NO.：22记载的氨基酸序列。另外，在以牛胃cDNA库为模板的上述PCR扩增的DNA片段中，不是编码Ghrelin(28个氨基酸)前体的DNA。
大鼠、人和猪的Ghrelin、和大鼠、人、猪和牛的Ghrelin-27的氨基酸非常近似，特别是从氨基末端到第10个的氨基酸序列，上述7钟Ghrelin完全一致。
实施例9.各种Ghrelin衍生物的活性比较
通过比较大鼠和人由来的Ghrelin，从用各种蛋白酶部分分解的肽片段、或化学合成的肽的Ca提高活性，求出Ca提高活性必须的核心·氨基酸序列和修饰脂肪酸的链长的最佳值。用显示Ca提高活性最大值的50％活性的Ghrelin的浓度(EC50，nM)表示。因此，EC50值越低，活性越高。
表3 各种Ghrelin衍生物的活性比较
Figure C00810440D00881
Ghrelin的Ca提高活性存在于氨基末端侧。从氨基末端到第4个氨基酸为止的肽具有充分的Ca提高活性，但如果是从氨基末端到第10个氨基酸为止的肽，由于与天然型Ghrelin接近，具有强的Ca提高活性。另外，对于修饰脂肪酸的链长，即使是C：2(乙酰基)也具有充分的活性，但是C：8(辛酰基)的Ca提高活性最高，其后即使脂肪酸的碳原子数为C：10(癸酰基)、C：16增加，強的Ca提高活性也没有变化。即，修饰氨基末端第3个丝氨酸的脂肪酸，如果是碳原子数8以上的，Ca提高活性最强。
实施例10.各种Ghrelin衍生物化合物的合成
(1)肽衍生物合成
Fmoc-DSer(C8H17)和Fmoc-Ser(C8H17)以外的氨基酸衍生物和合成试剂从パ—キンェルマ—社、ノバビオケム社或渡边化学株式会社购入。肽链的延长主要使用パ—キンェルマ—社制的アプライドバイオシステム433A合成仪，按照Boc法、或Fmoc法构建保护的肽衍生物-树脂。用Boc法得到的保护肽树脂，在p—甲酚存在下，用无水氟化氢(HF)脱保护，游离肽，用于纯化。用Fmoc法得到的保护肽树脂，用三氟乙酸(TFA)、或用含有各种清除剂的稀释TFA脱保护，纯化游离的肽。纯化用C4或C18的逆相HPLC实施。纯化品，在逆相HPLC确认其纯度，用氨基酸组成分析和质谱分析确认构造。
本发明的肽可用通常的肽合成法制造。例如可用「生化学実験講座1蛋白质的化学」第4卷第2章、第3章(東京化学同人)、或[続医薬品的開発14肽合成」(廣川書店)等的成书中记载的方法制造。因此，本发明肽的代表性合成例如下所示。具体地说，是酰化肽的合成例和烷基化肽的合成例。另外，人由来的Ghrelin(以下、简称为hGhrelin)或大鼠由来的Ghrelin(以下、简称为rGhrelin)用胰蛋白酶、或糜蛋白酶、或两酶依次作用，制备以下的Ghrelin片段(19.Ghrelin(16-28)、20.hGhrelin(1-15)、21.rGhrelin(1-15)、23.hGhrelin(1-11)、24.rGhrelin(1-11)、25.Ghrelin(1-10)、26.Ghrelin(1-9)、27.Ghrelin(1-8)、30.Ghrelin(1-4))，供于分析用HPLC，测定分离产物的活性。41.[N-乙酰]-Ghrelin(1-10)是按照常规方法，将Ghrelin(1-10)用N-乙酰基琥珀酰亚胺处理制备。化合物序号2.大鼠Ghrelin使用天然物，10.[Ser3(丁酰基)]-rGhrelin、11.[Ser3(己酰基)]-rGhrelin、12.[Ser3(癸酰基)]-rGhrelin、13.[Ser3(十二烷酰)]-rGhrelin、14.[Ser3(十六烷酰)]-rGhrelin，用与化合物1hGhrelin的合成中使用的同样方法合成，用于活性測定。
〔主要缩写〕
HMP树脂；4-羟甲基-苯氧甲基树脂
Fmoc酰胺树脂；4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酰氨基-乙基树脂
PAM树脂；苯基乙酰氨基甲基树脂
HBTU；2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸盐
TBTU；2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸盐
HOBt；1-羟基苯并三唑
DCC；二环己基碳化二亚胺
DIPCI；二异丙基碳化二亚胺
TFA；三氟乙酸
DIPEA；二异丙基乙基胺
TIPS；三异丙基硅烷
Fmoc；芴基甲氧羰基
Boc；叔丁氧羰基
Trt；三苯甲基
But；叔丁基
Pmc；2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基
Prl；丙酰基
PhPrl；苯基丙酰基
Bzl；苄基
Bom；苄氧甲基
Tos；甲苯磺酰基
Cl-Z；2-氯-苄氧羰基
Pis；2-苯基异丙基
Mtt；4-甲基三苯甲基
DMF；N，N-二甲基甲酰胺
NMP；N-甲基吡咯烷酮
DMAP；4-二甲基氨基吡啶
HOSu；N-羟基琥珀酰亚胺
Adod；2-氨基十二碳酸
Aib；2-氨基异丁酸
Ape；5-氨基戊酸
Cha；环己基丙氨酸
Dap；2，3-二氨基丙酸
Nal；萘基丙氨酸
Nle；正亮氨酸
〔合成中使用的保护氨基酸〕
Fmoc法：
Boc-Gly，Fmoc-Gly，Fmoc-Ser(But)，Fmoc-Ser(Trt)，Fmoc-Glu(OBut)，Fmoc-His(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Arg(Pmc)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Pro，Fmoc-Leu，Fmoc-Ala，Fmoc-Val，Fmoc-Phe，Fmoc-DPhe，Fmoc-Ser(n-C8H17)，Fmoc-DSer(n-C8H17)，Fmoc-Cys(n-C8H17)，Fmoc-Asp(OPis)，Fmoc-Ser(Bzl)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Dap(辛酰基)，
Fmoc-2-LNal，Fmoc-2-DNal，Fmoc-Nle，Fmoc-Lys(Mtt)，Fmoc-Aib-OH，Fmoc-Asp(O-C7H15)
Boc法：
Boc-Gly，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Ser(Ac)，Boc-Ser(Prl)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-His(Bom)，Boc-Gln，Boc-Arg(Tos)，Boc-Lys(Cl-Z)，Boc-Pro，Boc-Leu，Boc-Ala，Boc-Val，Boc-Phe，Boc-Cys(n-C8H17)，Boc-Ape Boc-Ser(n-C8H17)
〔使用的仪器〕
(a)分析用HPLC系统
仪器；島津LC-10A系统
柱；YMC PROTEIN-RP(4.6mm φ x 150mm)
柱温度；40℃
洗脱液；在0.1％三氟乙酸中、乙腈浓度在20分钟从0％到50％直线变化。
流速；1mL/分
检测；UV(210nm)
注入量；10～100μl
(b)分取用HPLC系统
仪器；Waters 600 Multisolvent Delivery System
柱；YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm x 250mm)
YMC-Pack-PROTEIN-RP(5μm，C4，10mm x 250mm)
YMC-Pack PROTEIN-RP(5μm，C4，20mm x 250mm)
YMC PROTEIN-RP(4.6mm φ x 150mm)
洗脱液；在0.1％三氟乙酸中、直线变化适当的乙腈浓度。
流速；10mL/分(内径20mm柱用)、3mL/分(内径10mm柱用)、1mL/分(内径4.6mm柱用)
检测；210nm，260nm
注入；10～2000μl，2000μL以上用泵注入。
(c)质谱分析仪
仪器；フイニガンMAT TSQ700
离子源；ESI
检测离子方式；正(positive)
喷淋电压；4.5kV
キャピラリ—温度；250℃
移动相；0.2％乙酸·甲醇混合液(1：1)
流速；0.2mL/分
扫描范围；m/z 300～1,500
(d)氨基酸序列分析
仪器；パ—キンェルマ—社制アプライドバイオ系统477A、492型定序器
(e)氨基酸组成分析
仪器；日立製作所製L-8500型氨基酸分析計
试样；没有特别记载，封管中、用6M盐酸在110℃、水解24小时。
(2)具有酰化丝氨酸或酰化苏氨酸的衍生物的合成例(Fmoc法、羧基末端羧酸)
化合物1hGhrelin：GSS(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
将Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-树脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，重复该操作，构建Fmoc-Ser(But)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-树脂。最后，用DCC/HOBt导入Boc-Gly后，所得保护肽树脂(1.3g)用1％TFA-5％TIPS-二氯甲烷溶液(15mL)处理30分钟。过滤收集肽树脂，用二氯甲烷(30mL)洗涤数次后，用5％DIEA(10mL)，接着用二氯甲烷(30mL)洗净。所得脱Trt肽树脂(约1.3g)用NMP(10mL)泡胀，在DMAP(61.1mg，0.5mmol)存在下，加入辛酸(144.2mg，1.0mmol)、DIPCI(126.2mg，1.0mmol)反应8小时。过滤收集树脂，用NMP、二氯甲烷洗净，减压干燥，得到3位丝氨酸侧链被辛酰化的保护肽树脂约1.2g。向该物质中，加入88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％ H2O形成的脱保护试剂(10mL)，在室温搅拌2小时。滤除树脂，浓缩滤液后，向剩余物中加入醚进行沉淀。过滤收集沉淀，干燥，得到粗肽约550mg。将本品200mg溶于水10mL中，加入到YMC-PackPROTEIN-RP(C4，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中从乙腈0％到54％进行60分钟的线性梯度洗脱(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到120mg目的物。
(3)具有酰化丝氨酸或酰化苏氨酸的衍生物的合成例(Fmoc法、羧基末端酰胺体)
化合物3 Ghrelin(1-9)-NH2；GSS(CO-C7H15)FLSPEH-NH2
将Fmoc—酰胺树脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，重复该操作，构建Fmoc-Ser(But)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(But)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-树脂。最后，向DCC/HOBt导入Boc-Gly之后，所得保护肽树脂(约550mg)用1％TFA-5％TIPS-二氯甲烷溶液(10mL)处理30分钟。过滤收集肽树脂，用二氯甲烷(30mL)洗涤数次后，用5％DIEA(10mL)，接着用二氯甲烷(30mL)洗净。所得脱Trt肽树脂(约750mg)用NMP(10mL)泡胀，在DMAP(61.1mg，0.5mmol)存在下，加入辛酸(144.2mg，1.0mmol)、DIPCI(126.2mg，1mmol)反应4小时。过滤收集树脂，用NMP、二氯甲烷洗净，减压下干燥，得到3位丝氨酸侧链被辛酰化的保护肽树脂约800mg。向该物质中加入TFA(10mL)，在室温搅拌30分钟。滤除树脂，浓缩滤液后，向剩余物中加入醚进行沉淀。过滤收集沉淀，干燥，得到粗肽250mg。将本品约200mg溶于30％乙酸水10mL中，加入到YMC-PackPROTEIN-RP(C4，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，从乙腈0％到54％为止进行60分钟的线性梯度洗脱(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到150mg的目的物。
(4)具有酰化丝氨酸或酰化苏氨酸的衍生物的合成例(Boc法)
化合物9[Ser3(丙酰基)]-rGhrelin(1-28)；
GSS(CO-CH2CH3)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
通过Boc-Arg(Tos)-Pam树脂(0.75g，0.5mmol)，用生物化学构建保护大鼠Ghrelin树脂(4—28)后，在其半量1.4g中，缩合Boc-Ser(CO-CH2CH3)-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Gly-OH。将所得树脂1.5g用HF：p—甲酚(8.5mL：1.5mL)在0℃处理1小时后，减压蒸除HF。向剩余物中加入醚，得到671mg粗肽。将该物质溶于50％乙酸(AcOH)中，添加到分取用柱YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm x 250mm)中，在10mL/min，用含有0.1％TFA的溶液，乙腈浓度在75分钟内从0至95％为止变化洗脱。将含有目的物的组分冷冻干燥，得到粗肽135.8mg。将其中一部分0.5mg添加到YMC-A-302柱(C18，4.6mm x 150mm)中，在流速1mL/min，乙腈浓度从15％到19％变化，进行洗脱。重复该纯化操作，合并目的组分，得到目的物0.41mg。
下面的具有酰化丝氨酸或酰化苏氨酸的肽衍生物，可按照上述化合物3或化合物9的制造方法同样制造。
下面，汇集具有酰化丝氨酸或酰化苏氨酸的肽衍生物的质谱分析、氨基酸组成分析结果。
化合物1.hGhrelin
ESI-MS 3371.0(理论值3370.9)，氨基酸组成比：Ser；3.53(4)，Glx；5.91(6)，Gly；1.02(1)，Ala；1.00(1)，Val；0.96(1)，Leu；2，Phe；1.06(1)，Lys；3.90(4)，His；0.97(1)，Arg；2.87(3)，Pro；3.87(4)
化合物3.Ghrelin(1-9)-酰胺
Figure C00810440D00951
ESI-MS[M+H]；1085.7(理论值1085.2)，氨基酸组成比：Ser；2.45(3)，Glx；0.98(1)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)，His；1.08(1)，Pro；0.97(1)
化合物4.[Ser2(辛酰基)，Ser3]-Ghrelin(1-9)-酰胺
Figure C00810440D00952
ESI-MS[M+H]；1085.8(理论值1085.2)，氨基酸组成比：Ser；2.46(3)，Glx；0.98(1)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，His；1.09(1)，Pro；0.97(1)
化合物5.[Ser2(辛酰基)]-Ghrelin(1-9)-酰胺
ESI-MS[M+H]；1211.7(理论值1211.4)，氨基酸组成比：Ser；2.48(3)，Glx；1.00(1)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，His；1.11(1)，Pro；0.98(1)
化合物8.[Ser3(乙酰基)]-rGhrelin
ESI-MS 3231.0(理论值3230.7)，氨基酸组成比：Ser；3.50(4)，Glx；5.90(6)，Gly；0.98(1)，Ala；2.00(2)，Leu；2，Phe；1.01(1)，Lys；4.97(5)，His；0.99(1)，Arg；1.99(2)，Pro；3.99(4)
化合物9.[Ser3(丙酰基)]-rGhrelin
ESI-MS 3245.0(理论值3242.8)，氨基酸组成比：Ser；3.42(4)，Glx；5.93(6)，Gly；1.00(1)，Ala；2.00(2)，Leu；2，Phe；1.10(1)，Lys；4.97(5)，His；0.99(1)，Arg；1.99(2)，Pro；3.83(4)
化合物15.[Ser3(3-苯基丙酰基)]-hGhrelin
ESI-MS 3377.0(理论值3376.9)，氨基酸酸组成比：Ser；3.06(4)，Glx；5.92(6)，Gly；0.93(1)，Ala；0.98(1)，Val；0.99(1)，Leu；2，Phe；1.13(1)，Lys；4.03(4)，His；1.08(1)，Arg；3.00(3)，Pro；3.76(4)
化合物16.[Ser3(3-辛烯酰基)]-hGhrelin
ESI-MS 3369.0(理论值3368.9)，氨基酸组成比：Ser；3.59(4)，Glx；5.91(6)，Gly；1.00(1)，Ala；1.02(1)，Val；0.99(1)，Leu；2，Phe；1.15(1)，Lys；3.97(4)，His；0.98(1)，Arg；2.93(3)，Pro；3.88(4)
化合物28.Ghrelin(1-8)-酰胺
ESI-MS[M+H]948.5(理论值948.1)，氨基酸组成比：Ser；2.45(3)，Glx；0.97(1)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；0.97(1)
化合物29.Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]819.6(理论值819.0)，氨基酸组成比：Ser；2.52(3)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.02(1)，Pro；1.09(1)
化合物30.Ghrelin(1-6)-酰胺
Figure C00810440D00962
ESI-MS[M+H]；722.4(理论值721.8)，氨基酸组成比：Ser；2.47(3)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)
化合物31.Ghrelin(1-5)
Figure C00810440D00963
ESI-MS[M+H]636.5(理论值635.8)，氨基酸组成比：Ser；1.78(2)，Gly；0.99(1)，Leu；1，Phe；1.02(1)
化合物32.Ghrelin(1-5)-酰胺
Figure C00810440D00964
ESI-MS[M+H]635.4(理论值634.8)，氨基酸组成比：Ser；1.67(2)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，
化合物33-2.Ghrelin(1-4)-酰胺
Figure C00810440D00965
ESI-MS[M+H]522.2(理论值521.6)，氨基酸组成比：Ser；1.65(2)，Gly；0.99(1)，Phe；1
化合物34.Ghrelin(1-3)-酰胺
Figure C00810440D00966
ESI-MS[M+H]375.2(理论值374.4)，氨基酸组成比：Ser；1.66(2)，Gly；1
化合物35.[Lys8]-Ghrelin(1-8)-酰胺
ESI-MS[M+H]947.9(理论值947.1)，氨基酸组成比：Ser；2.70(3)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Lys；0.99(1)，Pro；1.00(1)
化合物36.[Arg8]-Ghrelin(1-8)-酰胺
ESI-MS[M+H]975.8(理论值975.2)，氨基酸组成比：Ser；2.70(3)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Arg；0.99(1)，Pro；1.00(1)
化合物37.[Lys6]-Ghrelin(1-6)-酰胺
Figure C00810440D00973
ESI-MS[M+H]763.6(理论值762.9)，氨基酸组成比：Ser；1.80(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Lys；1.00(1)
化合物38.[Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺
ESI-MS[M+H]650.5(理论值649.8)，氨基酸组成比：Ser；1.79(2)，Gly；0.99(1)，Phe；1，Lys；0.99(1)
化合物39.[DPhe4，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺
Figure C00810440D00974
ESI-MS[M+H]650.5(理论值649.8)，氨基酸组成比：Ser；1.79(2)，Gly；0.99(1)，Phe；1，Lys；0.99(1)
化合物40.[N-氨基戊酰基]-Ghrelin(3-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]774.7(理论值774.0)，氨基酸组成比：Ser；1.80(2)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Pro；1.00(1)
化合物43.[N-甘氨酰基]-Ghrelin(3-7)-酰胺
Figure C00810440D00976
ESI-MS[M+H]；732.7(理论值731.9)，氨基酸组成比：Ser；1.80(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.01(1)，Pro；1.00(1)
化合物44.[Leu2]-Ghrelin(1-7)-酰胺
Figure C00810440D00977
ESI-MS[M+H]；845.7(理论值845.1)，氨基酸组成比：Ser；1.80(2)，Gly；1.01(1)，Leu；2，Phe；1.02(1)，Pro；0.99(1)
化合物45.[His2]-Ghrelin(1-7)-酰胺
Figure C00810440D00978
ESI-MS[M+H]；869.7(理论值869.0)，用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；1.02(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，His；0.95(1)，Pro；0.99(1)
化合物46.[Lys2]-Ghrelin(1-7)-酰胺
Figure C00810440D00979
ESI-MS[M+H]；860.7(理论值860.1)，用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；1.04(2)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Lys；1.00(1)，Pro；1.00(1)
化合物47.[Gly2]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；789.5(理论值788.9)，用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；1.14(2)，Gly；2.01(2)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；1.00(1)
化合物59.[Thr3(辛酰基)]-hGhrelin
ESI-MS M；3384.0(理论值3384.9)氨基酸组成比：Ala；1.02(1)，Arg；2.99(3)，Glx；5.91(6)，Gly；1.02(1)，His；1.00(1)，Leu；2(2)，Lys；4.05(4)，Phe；1.00(1)，Pro；4.06(4)，Ser；2.66(3)，Thr；0.94(1)，Val；0.96(1)
化合物60.[Leu2，Thr3(辛酰基)]-hGhrelin
ESI-MS M；3410.0(理论值3411.0)氨基酸组成比：Ala；1.01(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.01(1)，His；1.01(1)，Leu；3(3)，Lys；4.02(4)，Phe；1.01(1)，Pro；4.00(4)，Ser；1.81(2)，Thr；0.96(1)，Val；0.97(1)
化合物69.[Ser3(4-甲基戊酰基)]-hGhrelin
ESI-MS M；3343.0(理论值3342.9)氨基酸组成比：Ala；1.00(1)，Arg；2.97(3)，Glx；5.86(6)，Gly；1.02(1)，His；1.01(1)，Leu；2，Lys；4.00(4)，Phe；1.01(1)，Pro；3.99(4)，Ser；3.54(4)，Val；0.98(1)
化合物75.[Lys7]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；850.5(理论值850.0)，氨基酸组成比：Ser；2.67(3)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Lys；1.00(1)
(5)氨基末端酰化衍生物的合成例
化合物6.[N-辛酰基，Ser3]-Ghrelin(1-9)-酰胺；
C7H15CO-GSSFLSPEH-NH2
将Fmoc-酰胺树脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，重复该操作，构建Fmoc-Gly-Ser(But)-Ser(But)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-树脂。哌嗪处理后，将所得肽树脂(550mg)用NMP洗净，在HOBt(135.1mg，1mmol)存在下，加入DIPCI(126.2mg，1mmol)和辛酸(144.2mg，1.0mmol)反应4小时。过滤收集树脂，用NMP、二氯甲烷洗净，减压干燥，得到氨基末端Gly氨基被辛酰化的保护肽树脂约600mg。用TFA(10mL)脱保护(处理30分钟)，得到粗肽200mg。全部加入YMC-Pack PROTEIN-RP(5μm，C4，20mm x 250mm)，用0.1％三氟乙酸中，从乙腈0％至54％线性梯度洗脱60分钟(流速：10mL/mL)。得到约180mg的目的物。
測定值ESI-MS[M+H]；1085.6(理论值1085.2)、氨基酸组成比：Ser；2.47(3)，Glx；0.98(1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.02(1)，His；1.09(1)，Pro；0.96(1)
(6)含有侧链烷基丝氨酸的衍生物的合成例
化合物50.[Ser3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺；GSS(C8H17)FLSP-NH2
Fmoc-Ser(C8H17)
在冰冷却下，向Boc-Ser(12.3g，53.9mmol)的DMF(300ml)溶液中加入氢化钠(3.19g，133mmol)，在室温搅拌1.5小时。向其中加入碘化辛烷(11.0ml，60.9mmol)，在室温搅拌16小时。在冰冷却下，向反应液中滴加入水(40ml)后，减压蒸除溶剂。所得残查用硅胶柱色谱(硅胶；Merck社制Art9385、洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇：乙酸＝120：10：1)纯化，得到Boc-Ser(C8H17)6.88g(收率36.2％)，为淡黄色油状物。在冰冷却下，向该Boc-Ser(C8H17)(6.88g，21.7mmol)中，加入三氟乙酸(120ml)，在室温搅拌0.5小时。减压蒸除三氟乙酸后，将所得残查溶解于乙醚(120ml)，加入4N盐酸-二氧杂环己烷(22ml)，在冰冷却下，搅拌1小时。过滤收集析出的结晶，得到H-Ser(C8H17)·HCl为无色结晶，5.23g(收率96.3％)。向该H-Ser(C8H17)·HCl(2.54g，10.0mmol)的10％碳酸氢钠(50ml)悬浮液中加入三乙胺(1.40ml，10mmol)后，向其中用10分钟滴加入Fmoc-OSu(5.00g，14.8mmol)的1，2-二甲氧乙烷(20ml)溶液，在室温搅拌16小时。过滤不溶物，向滤液中加入二氯甲烷，分离有机层后，用13％食盐水洗净。用无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂。所得残查用硅胶柱色谱(硅胶；富士シリシア社制BW-300、洗脱溶剂；二氯甲烷：甲醇＝93∶7)纯化，得到Fmoc-Ser(C8H17)为无色结晶2.75g(收率62.6％)。Rf＝0.45(CHCl3:MeOH＝9:1，硅胶60F254，MERCK)Fmoc-DSer(C8H17)：Rf＝0.45(CHCl3:MeOH＝9:1，硅胶60F254，MERCK)
将Fmoc-酰胺树脂(ABI社制、400mg，0.25mmol)用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，重复该操作，构建Fmoc-Ser(But)-Ser(C8H17)-Phe-Leu-Ser(But)-Pro树脂。最后，通过DCC/HOBt导入Boc-Gly后，从所得保护肽树脂取出250mg，用TFA(10mL)处理30分钟。滤除树脂，浓缩滤液后，向剩余物中加入醚进行沉淀，得到粗肽约120mg。将本品溶于5％AcOH(10mL)中，添加到YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，乙腈从0％至60％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到40mg目的物。
化合物84.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-苄基酰胺；
H-Ape-Ser(C8H17)-Phe-Leu-NH-CH2-Ph
将肟树脂(230mg/0.25mmol、Novabiochem製)装入带有玻璃过滤器的反应容器中，加入预先溶于二氯甲烷(DCM)中用MgSO4干燥过的Boc-Leu-OH·H2O(190mg，0.75mmol)、DCC(160mg，0.75mmol)、和DCM5mL，整夜振荡。分别用适量的DCM、DCM/EtOH＝1:1、DCM依次洗涤数次。导入Leu后，①加入25％TFA/DCM10mL振荡30分钟后，用DCM、异丙醇(iPrOH)、DCM、DMF分别洗涤数次，②在三角烧瓶中，将Boc氨基酸0.75mmol(3当量)、TBTU0.75mmol(3当量)、HOBt0.75mmol(3当量)溶解于DMF5mL中，加入DIPEA1.25mmol(5当量)搅拌得到的物质装入反应容器振荡1小时，重复该操作，依次缩合氨基酸。最终得到Boc-NH-(CH2)4-CO-Ser(C8H17)-Phe-Leu-肟树脂370mg。将其悬浮于DMF约5mL中，加入苄胺盐酸盐(180mg，1.25mmol)、三乙胺(173μL，1.25mmol)、乙酸72μL(1.25mmol)搅拌。24小时后，滤除树脂，减压蒸除滤液，用1N HCl 10mL析出Boc保护体。用水洗涤，干燥后，加入TFA 5mL反应30分钟进行脱Boc。减压蒸除TFA，用醚(Et2O)沉淀，得到目的物[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-苄基酰胺110mg。用同样的方法合成来化合物82、83、85。
下面的具有烷基丝氨酸的肽衍生物，除了化合物82～85，可用与上述化合物50的制造方法相同的方法制造。
下面汇集具有烷基丝氨酸的肽衍生物的质谱分析、氨基酸组成分析结果。
化合物17.[Ser3(辛基)]-hGhrelin
ESI-MS；3357.0(理论值；3356.9)、氨基酸组成比：Ser；2.92(3+1)，Glx；5.94(6)，Gly；1.00(1)，Ala；0.98(1)，Val；0.99(1)，Leu；2，Phe；1.13(1)，Lys；4.04(4)，His；1.09(1)，Arg；3.01(3)，Pro；3.89(4)
化合物50.[Ser3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；805.5(理论值805.0)、用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；0.86(2+1)，Gly；1.01(1)，Leu；1，Phe；1.06(1)，Pro；0.95(1)
化合物51.[Ser3(辛基)，DPhe4]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；805.4(理论值805.0)、用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；0.97(2+1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.05(1)，Pro；1.16(1)
化合物52.[DSer3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；805.4(理论值805.0)、用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；1.51(2+1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；1.00(1)
化合物53.[DSer3(辛基)，DPhe4]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；805.5(理论值805.0)、用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；1.51(2+1)，Gly；1.00(1)，Leu；1，Phe；1.00(1)，Pro；1.01(1)
化合物67.[Ser3(Bzl)]-hGhrelin
ESI-MS M；3335.0(理论值3334.8)氨基酸组成比：Ala；1.00(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.00(1)，His；1.0l(1)，Leu；2(2)，Lys；4.00(4)，Phe；1.02(1)，Pro；4.08(4)，Ser；3.58(4)，Val；0.98(1)
化合物76.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)，Lys5]-Ghrelin(3-5)-酰胺
ESI-MS[M+H]；591.5(理论值590.8)，氨基酸组成比：Ser；0.45(1)，Phe；1，Lys；1.00(1)
化合物77.[N-氨基戊酰基，DSer3(辛基)，DPhe4，Lys5]-Ghrelin(3-5)-酰胺
ESI-MS[M+H]；591.5(理论值590.8)，氨基酸组成比：Ser；0.45(1)，Phe；1，Lys；1.01(1)
化合物78.[Aib1，His2，Ser3(辛基)，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺
ESI-MS[M+H]；714.6(理论值713.9)，氨基酸组成比：Ser；0.45(1)，Phe；1，His；1.0l(1)，Lys；1.00(1)
化合物79.[Aib1，His2，DSer3(辛基)，DPhe4，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺
ESI-MS[M+H]；714.5(理论值713.9)，氨基酸组成比：Ser；0.44(1)，Phe；1，His；1.00(1)，Lys；1.01(1)
化合物81.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-酰胺
ESI-MS[M+H]；576.5(理论值575.8)，氨基酸组成比：Ser；0.49(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)
化合物82.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-甲基酰胺
ESI-MS[M+H]；590.6(理论值589.8)，氨基酸组成比：Ser；0.49(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)
化合物83.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-乙基酰胺
ESI-MS[M+H]；604.3(理论值603.8)，氨基酸组成比：Ser；0.50(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)
化合物84.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-苄基酰胺
ESI-MS[M+H]；666.5(理论值665.9)，氨基酸组成比：Ser；0.46(1)，Leu；1，Phe；0.98(1)
化合物85.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)-氨基乙基酰胺
ESI-MS[M+H]；619.6(理论值618.9)，氨基酸组成比：Ser；0.47(1)，Leu；1，Phe；0.99(1)
(7)含有侧链烷基半胱氨酸衍生物的合成例
化合物48.[Cys3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-NH2；GSC(C8H17)FLSP-NH2
将Fmoc-酰胺树脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，重复该操作，构建Fmoc-Ser(But)-Cys(C8H17)-Phe-Leu-Ser(But)-Pro树脂。最后，用DCC/HOBt导入Boc-Gly后，将所得保护肽树脂(550mg)用TFA(10mL)处理30分钟。滤除树脂，浓缩滤液后，向剩余物中加入醚进行沉淀，得到粗肽120mg。将本品溶于5％乙酸(AcOH)10mL中，添加至YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，乙腈从0％至60％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥、得到44mg目的物。
化合物68.[Cys3(Trt)]-hGhrelin；
GSC(C-Ph3)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
将Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-树脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，重复该操作，构建Fmoc-Ser(But)-Cys(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP树脂。最后，用DCC/HOBt导入Boc-Gly后，得到保护肽树脂(1.4g)。向其中400mg中，加入TFA(15mL)，在室温搅拌1小时。过滤除去树脂，浓缩滤液后，加入醚进行沉淀。将约90mg溶于水40mL中，添加到YMC-PackPROTEIN-RP(C4，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中，乙腈从0％至54％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到60mg目的物。
下面的具有烷基半胱氨酸的肽衍生物，可用与上述化合物48或化合物68同样的制造方法制造。
下面汇集具有烷基半胱氨酸的肽衍生物的质谱分析、氨基酸组成分析结果。
化合物18.[Cys3(辛基)]-rGhrelin
ESI-MS；3317.0(理论值；3316.9)、氨基酸组成比：Ser；2.69(3)，Glx；5.90(6)，Gly；1.00(1)，Ala；1.99(2)，Leu；2，Phe；1.02(1)，Lys；4.97(5)，His；0.99(1)，Arg；1.98(2)，Pro；3.87(4)
化合物48.[Cys3(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；821.7(理论值821.1)、用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；0.60(2)，Gly；1.08(1)，Leu；1，Phe；1.06(1)，Pro；0.96(1)
化合物49.[Cys3(辛基)，DPhe4]-Ghrelin(1-7)-酰胺
ESI-MS[M+H]；821.6(理论值821.1)、用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的氨基酸组成比：Ser；0.58(2)，Gly；1.02(1)，Leu；1，Phe；1.06(1)，Pro；0.97(1)
化合物68.[Cys3(Trt)]-hGhrelin
ESI-MS 3503.0(理论值3503.1)，氨基酸酸组成比：Ser；2.42(3)，Glx；5.77(6)，Gly；1.00(1)，Ala；1.01(1)，Val；0.94(1)，Leu；2，Phe；0.99(1)，Lys；3.94(4)，His；0.99(1)，Arg；2.92(3)，Pro；3.81(4)
(8)含有N-甲基氨基酸的肽衍生物的合成例
化合物86.[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)，MePhe4，MeLeu5]-Ghrelin(3-5)-酰胺；NH2-(CH2)4-CO-Ser(C8H17)-MePhe-MeLeu-NH2
将Fmoc-酰胺树脂(0.40g，0.25mmol)装入带有玻璃过滤器的反应容器，加入20％哌啶/NMP 15mL，振荡20分钟，除去Fmoc基。之后，加入NMP 15mL、Fmoc-MeLeu-OH 1.0mmol(4当量)、TBTU 1.0mmol(4当量)、HOBt 1.0mmol(4当量)、DIPEA 1.0mmol(4当量)，振荡1小时，缩合Fmoc-MeLeu。之后，用20％哌啶，除去Fmoc基，并在DIPEA 2.25mmol(9当量)存在下，通过溴代三吡咯烷基鏻-六氟化磷酸盐(3当量)，缩合Fmoc-氨基酸(3当量)，反复该操作，延长肽链。通过将少量树脂用TFA脱保护，并通过HPLC和质谱分析(MS)，确认缩合反应的结束。得到Boc-NH-(CH2)4-CO-Ser(O-C8H17)-MePhe-MeLeu-树脂后，将其用TFA处理30分钟，进行切出并脱保护，减压蒸除TFA，用醚(Et2O)洗净，得到NH2-(CH2)4-CO-Ser(C8H17)-MePhe-MeLeu-NH2 120mg。将其添加到YMC-PackODS-A(C18，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从0％至54％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到70mg目的物。将该衍生物用丙酸·盐酸(50/50)，在150℃水解2小时后，在氨基酸分析机上检出的氨基戊酸的峰面积相对于氨基戊酸10nmol的面积比，定量肽量。
ESI-MS[M+H]；604.5(理论值603.8)、用丙酸·盐酸(50/50)在150℃水解2小时后的检出氨基酸：Ser、Ape
(9)混合二硫化物衍生物的合成
化合物57.[Cys3(S-庚基)]-hGhrelin；
GSC(S-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
向用化合物58的化合物3的制造方法合成得到的肽-HMP树脂(1g)中，加入从88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％H2O形成的脱保护试剂(15mL)，在室温搅拌2小时。滤除树脂，浓缩滤液后，向剩余物中加入醚，得到粗[Cys3]-hGhrelin粉末约550mg。将其添加到YMC-PackODS-A(C18，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从0％至54％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到300mg的[Cys3]-hGhrelin(1-28)。之后，将40mg(11.4μmol)溶解于水(20mL)中，加入4，4’-二硫二吡啶(7.5mg、34.2μmol)的乙腈溶液1mL，放置1小时。确认反应完成后，将反应液用氯仿洗涤数次，除去多余的4，4’-二硫二吡啶和吡啶酮衍生物。将含有[硫代吡啶基Cys3]-hGhrelin(1-28)的水层(10mL)，用5％NH3水调至pH7.4，加入1-庚硫醇(4.5mg、34.2μmol)的乙腈溶液2mL。1小时后，将反应液添加到YMC-Pack ODS-A(C18，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从0％至54％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：l0mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到15mg目的物。
化合物57.[Cys3(S-庚基)]-hGhrelin
ESI-MS 3391.0(理论值3391.0)，氨基酸酸组成比：Ser；2.76(3)，Glx；5.81(6)，Gly；0.99(1)，Ala；1.01(1)，Val；0.95(1)，Leu；2，Phe；0.99(1)，Lys；3.95(4)，His；0.99(1)，Arg；2.93(3)，Pro；3.84(4)
(10)3位侧链中含有酰胺、逆向酯的衍生物的合成例
化合物55.[Asp3(NH-庚基)]-hGhrelin；
GSD(NH-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
将Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-树脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)，用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，重复该操作，构建Fmoc-Ser(But)-Asp(OPis)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP树脂。最后，通过DCC/HOBt导入Boc-Gly后，将所得保护肽树脂(1.3g)，用4％TFA-二氯甲烷溶液(15mL)处理15分钟。过滤收集肽树脂，用二氯甲烷(30mL)洗涤数次后，用4％DIEA(10mL)、接着用二氯甲烷(30mL)洗净。
将所得脱Pis肽树脂(约1.3g)，用NMP(10mL)泡胀，加入水溶性碳化二亚胺盐酸盐(191.7mg，1.0mmol)、HOBt(135.2mg，1.0mmol)、正庚胺(115.2mg，1.0mmol)，反应8小时。
过滤收集树脂，用NMP、二氯甲烷洗净，减压下干燥，得到3位Asp侧链被庚基酰胺化的保护肽树脂约1.2g。向其中加入88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％H2O形成的脱保护试剂(10mL)，在室温搅拌2小时。滤除树脂，浓缩滤液后，向剩余物中加入醚进行沉淀。过滤收集沉淀，干燥，得到粗肽约550mg。
将本品200mg溶于水10mL，将其添加到YMC-Pack PROTEIN-RP(C4，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从0％至54％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：10mL/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到120mg的目的物。
化合物61.[Lys3(辛酰基)]-hGhrelin；
GSK(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
将Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-树脂(ABI社制、403mg，0.25mmol)用20％哌嗪处理20分钟后，依次进行用HBTU/HOBt导入Fmoc-氨基酸和用哌嗪脱Fmoc，反复该操作，构建Boc-Gly-Ser(tBu)-Lys(Mtt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut)-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Ser(But)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP树脂。将约300mg的保护肽树脂，用1％TFA-5％TIPS-二氯甲烷溶液(15mL)处理60分钟。
过滤收集肽树脂，用二氯甲烷(30mL)洗涤数次后，用10％DIEA(10mL)、然后用二氯甲烷(30mL)洗净。将所得脱Mtt肽树脂(约300mg)用NMP(2mL)泡胀，在HOBt(34mg，0.25mmol)存在下，加入辛酸(40μl，0.25mmol)、DCC(52mg，0.25mmol)反应一夜。
过滤收集树脂，用NMP、二氯甲烷洗净，减压干燥，得到3位赖氨酸侧链被辛酰化的保护肽树脂约300mg。向其中，加入88％TFA-5％苯酚-2％TIPS-5％H2O形成的脱保护试剂(5mL)，在室温搅拌2小时。滤除树脂，浓缩滤液后，向剩余物中加入醚进行沉淀。过滤收集沉淀，干燥，得到粗肽约234mg。
将本品溶于乙酸6mL中，加入到YMC-Pack ODS-A(5μm，20mmx 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从0％至60％为止线性梯度洗脱(流速：10mL/min)60分钟。分取目的组分后，冷冻干燥，得到100mg粉末。将该物质溶于2ml 50％乙酸，添加到YMC-PackPROTEIN-RP(5μm，C4，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从0％至60％为止线性梯度洗脱(流速：10mL/min)60分钟。分取目的组分后，冷冻干燥，得到52mg的粉末。
下面的化合物，可按照与上述化合物55或化合物61同样的制造方法制造。
另外，下面汇集了用Fmoc常规方法合成的肽衍生物的质谱分析、氨基酸组成分析结果。
化合物54.[Asp3(O-庚基)]-hGhrelin(1-28)
ESI-MS 3371.0(理论值3370.9)，氨基酸酸组成比：Asx；0.99(1)，Ser；2.70(3)，Glx；5.87(6)，Gly；1.01(1)，Ala；1.01(1)，Val；0.94(1)，Leu；2，Phe；1.00(1)，Lys；4.02(4)，His；1.00(1)，Arg；2.98(3)，Pro；3.84(4)
化合物55.[Asp3(NH-庚基)]-hGhrelin(1-28)
ESI-MS3370.0(理论值3369.9)，氨基酸酸组成比：Asx；0.88(1)，Ser；2.95(3)，Glx；5.97(6)，Gly；1.21(1)，Ala；1.03(1)，Val；0.98(1)，Leu；2，Phe；1.00(1)，Lys；3.94(4)，His；0.92(1)，Arg；2.91(3)，Pro；3.99(4)
化合物56.[Dap3(辛酰基)]-hGhrelin
ESI-MS M；3370.0(理论值3369.9)氨基酸组成比：Ala；1.02(1)，Arg；2.94(3)，Glx；5.94(6)，Gly；1.00(1)，His；0.91(1)，Leu；2(2)，Lys；3.93(4)，Phe；0.99(1)，Pro；4.01(4)，Ser；2.88(3)，Val；0.98(1)，Dap；N.D.
化合物58.[Adod3]-hGhrelin(1-28)
ESI-MS M；3355.0(理论值3355.0)氨基酸组成比：Ala；1.01(1)，Arg；2.91(3)，Glx；5.95(6)，Gly；1.01(1)，His；0.91(1)，Leu；2(2)，Lys；3.94(4)，Phe；0.99(1)，Pro；4.02(4)，Ser；2.88(3)，Val；0.96(1)
化合物61.[Lys3(辛酰基)]-hGhrelin
ESI-MS M；3412.0(理论值3412.0)氨基酸组成比：Ala；1.05(1)，Arg；3.05(3)，Glx；6.02(6)，Gly；1.00(1)，His；1.00(1)，Leu；2(2)，Lys；5.11(5)，Phe；0.97(1)，Pro；4.20(4)，Ser；2.68(3)，Val；1.00(1)
化合物62.[Trp3]-hGhrelin
ESI-MS M；3343.0(理论值3343.9)，氨基酸组成比：Ala；1.00(1)，Arg；3.03(3)，Glx；5.94(6)，Gly；1.01(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；4.00(4)，Phe；0.99(1)，Pro；3.96(4)，Ser；2.60(3)，Trp；N.D.，Val；0.98(1)
化合物63.[Phe3]-hGhrelin
ESI-MS M；3305.0(理论值3304.8)，氨基酸组成比：Ala；0.99(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.86(6)，Gly；1.00(1)，His；1.00(1)，Leu；2(2)，Lys；3.98(4)，Phe；2.01(2)，Pro；3.99(4)，Ser；2.67(3)，Val；0.98(1)
化合物64.[Cha3]-hGhrelin
ESI-MS M；3411.0(理论值3410.9)，氨基酸组成比：Ala；1.02(1)，Arg；3.01(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.01(1)，His+Cha；2.01(1+1)，Leu；2(2)，Lys；4.02(4)，Phe；1.01(1)，Pro；4.03(4)，Ser；2.72(3)，Val；0.97(1)
化合物65.[2-LNal3]-hGhrelin
ESI-MS M；3354.0(理论值3354.9)，氨基酸组成比：Ala；1.00(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.87(6)，Gly；1.02(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；3.98(4)，Phe；1.01(1)，Pro；3.94(4)，Ser；2.73(3)，Val；0.97(1)，Nal；N.D.(1)
化合物66.[2-DNal3]-hGhrelin
ESI-MS M；3355.0(理论值3354.9)，氨基酸组成比：Ala；1.02(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.96(6)，Gly；1.00(1)，His；0.92(1)，Leu；2(2)，Lys；3.94(4)，Phe；0.99(1)，Pro；4.02(4)，Ser；2.91(3)，Val；0.98(1)，Nal；N.D.(2)
化合物70.[Leu3]-hGhrelin
ESI-MS M；3270.0(理论值3270.8)，氨基酸组成比：Ala；0.99(1)，Arg；2.95(3)，Glx；5.88(6)，Gly；1.01(1)，His；1.00(1)，Leu；3(3)，Lys；3.96(4)，Phe；1.00(1)，Pro；3.89(4)，Ser；2.65(3)，Val；0.97(1)
化合物71.[Ile3]-hGhrelin
ESI-MS M；3270.0(理论值3270.8)，氨基酸组成比：Ala；0.98(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.87(6)，Gly；0.99(1)，His；1.01(1)，Ile；0.98(1)，Leu；2(2)，Lys；3.97(4)，Phe；1.00(1)，Pro；3.97(4)，Ser；2.65(3)，Val；0.98(1)
化合物72.[Lys3(辛酰基)]-hGhrelin
ESI-MS M；3286.0(理论值3285.8)，氨基酸组成比：Ala；1.02(1)，Arg；2.94(3)，Glx；5.95(6)，Gly；0.99(1)，His；0.92(1)，Leu；2(2)，Lys；4.92(5)，Phe；0.99(1)，Pro；4.02(4)，Ser；2.91(4)，Val；0.99(1)
化合物73.[N1e3]-hGhrelin
ESI-MS M；3270.0(理论值3270.8)，氨基酸组成比：Ala；1.01(1)，Arg；2.98(3)，Glx；5.92(6)，Gly；1.02(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；4.01(4)，Phe；1.01(1)，Pro；4.01(4)，Ser；2.71(3)，Val；0.98(1)，Nle；N.D.(1)
化合物74.[Val3]-hGhrelin
ESI-MS M；3256.0(理论值3256.8)，氨基酸组成比：Ala；0.98(1)，Arg；2.96(3)，Glx；5.84(6)，Gly；1.00(1)，His；1.01(1)，Leu；2(2)，Lys；3.97(4)，Phe；0.99(1)，Pro；3.94(4)，Ser；2.64(3)，Val；1.97(2)
化合物80.[Aib1，His2，DNal3，DPhe4，Lys5]-Ghrelin(1-5)-酰胺；Ipamorelin
ESI-MS[M+H]；712.5(理论值711.9)，氨基酸组成比：Phe；1，His；1.00(1)，Lys；1.00(1)
实施例11 Ghrelin衍生物肽类化合物的活性比较
对于实施例10中合成的Ghrelin衍生物肽类化合物和天然型Ghrelin肽，按照实施例1所示方法，测定Ca提高活性。
(1)3位丝氨酸侧链的修饰
①.辛酰基的位置
Ghrelin显著的结构上特征是3位丝氨酸羟基的辛酰基。首先，调查辛酰化的丝氨酸的位置在3位时对表达活性是否有利。使用表达大鼠GSH受体的CHO细胞，将细胞内钙提高作用作为指标。
以EC50值保持在5.4nM的短链Ghrelin衍生物Ghrelin(1—9)酰胺为基础，合成[丝氨酸2(辛酰)，丝氨酸3]-Ghrelin(1—9)酰胺、[丝氨酸2(辛酰)]-Ghrelin(1—9)酰胺、和[Nα—辛酰，丝氨酸3]-Ghrelin(1—9)酰胺，研究细胞内钙提高活性。
结果汇集于表4。
表4 Ghrelin衍生物的活性1
 
化合物结构 Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
1.人GhrelinGSS(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1.3
2.大鼠GhrelinGSS(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 1.5
3.Ghrelin(1-9)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH<sub>2</sub> 5.4
4.[Ser<sup>2</sup>(辛酰基)，Ser<sup>3</sup>]-Ghrelin(1-9)-酰胺H-Gly-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH<sub>2</sub> 1,100
5.[Ser<sup>2</sup>(辛酰基)]-Ghrelin(1-9)-酰胺H-Gly-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH<sub>2</sub>                                    1,400
6.[N-辛酰基，Ser<sup>3</sup>]-Ghrelin(1-9)-酰胺C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>CO-Gly-Leu-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-NH<sub>2</sub> >10,000
如果将人Ghrelin的辛酰基从3位移至2位丝氨酸，活性降低至约1/200(EC50＝1,100nM)。
2位和3位都有辛酰基的衍生物，同样也是活性降低了(EC50＝1,400nM)。
另外，只有氨基末端氨基被N—辛酰化时，活性变得较弱(EC50>10,000nM)。
从该结果可判断，用辛酰基修饰的氨基酸的位置，特别优选在Ghrelin分子的3位。
②.脂肪酸链长
将除去大鼠Ghrelin3位丝氨酸侧链的辛酰基的脱—辛酰体的细胞内钙提高活性，从辛酰体的2.6nM降低至3,500nM，因此可知，3位丝氨酸侧链的辛酰基在表现活性中起极其重要的作用。
因此，使用各种饱和脂肪酸，调查大鼠Ghrelin中的丝氨酸侧链酰基的碳原子数与活性的关系。即，求出用乙酰基(CH3CO-)、丙酰基(CH3CH2CO-)、丁酰基(CH3(CH2)2CO-)、己酰基(CH3(CH2)4CO-)、癸酰基(CH3(CH2)8CO-)、十二烷酰基(CH3(CH2)10CO-)、和十六烷酰基(CH3(CH2)14CO-)，将3位丝氨酸羟基酰化的Ghrelin衍生物的细胞内钙提高活性。
结果汇集于表5。
表5 Ghrelin衍生物的活性2
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
7.[Ser<sup>3</sup>]-大鼠GhrelinGSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 3,500
8.[Ser<sup>3</sup>(乙酰基)]-rGhrelinGSS(CO-CH<sub>3</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 780
9.[Ser<sup>3</sup>(丙酰基)]-rGhrelinGSS(CO-C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR n.t.
10.[Ser<sup>3</sup>(丁酰基)]-rGhrelinGSS(CO-C<sub>3</sub>H<sub>7</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 280
11.[Ser<sup>3</sup>(己酰基)]-rGhrelinGSS(CO-C<sub>5</sub>H<sub>11</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 16
12.[Ser<sup>3</sup>(癸酰基)]-rGhrelinGSS(CO-C<sub>9</sub>H<sub>19</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 1.7
13.[Ser<sup>3</sup>(十二烷酰)]-rGhrelinGSS(CO-C<sub>11</sub>H<sub>23</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 2.4
14.[Ser<sup>3</sup>(十六烷酰)]-rGhrelinGSS(CO-C<sub>15</sub>H<sub>31</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 6.5
表中，n.t.表示未进行试验。
脂肪酸链长对活性的影响是，用乙酰基(C2)，EC50值是780nM、用丁酰基(C4)，EC50值是280nM，有显著提高，用己酰基(C7)，EC50值是16nM，Ca提高活性进一步提高，用辛酰基(Ghrelin)，EC50值是1.5nM，达到Ca提高活性的高峰。即使用癸酰基(C10)，EC50也是1.7nM，Ca提高活性与Ghrelin保持同等水平，进一步用十二烷酰基(C12)，EC50值是2.4nM，用十六烷酰基(C16)，EC50值是6.5nM，即使延长脂肪酸链长，也是保持Ca提高活性。
③.各种酰基取代
代替饱和脂肪酸，制作以3—苯基丙酸(HO-CO-CH2CH2Ph)作为芳香族脂肪酸的代表例与3位丝氨酸羟基上形成酯键的人Ghrelin衍生物、和与作为不饱和脂肪酸代表例的3—辛烯酸(CH3(CH2)3CH＝CH-CH2COOH)、与作为支链状脂肪酸代表例的4—甲基戊酸((CH3)2CH-CH2CH2CO2H)形成酯键的人Ghrelin衍生物，评价活性。
④.对烷基的取代
如果将化学不稳定的酯键转化为更稳定的醚、硫醚键等，可制成化学稳定的Ghrelin衍生物。但是，不用说，前提条件是保持活性。
因此，对人Ghrelin的3位丝氨酸被辛基(C8H17)化的人Ghrelin的醚衍生物，和大鼠Ghrelin的3位丝氨酸被半胱氨酸取代，同样被辛基化的大鼠Ghrelin的硫醚体，进行活性调查。
另外，制备人Ghrelin的3位丝氨酸被苄基化(-CH2Ph)的衍生物，和人Ghrelin的3位丝氨酸被半胱氨酸替代后三苯甲基化(-C(Ph)3)的衍生物。
结果汇集于表6。另外，对于人Ghrelin的3位丝氨酸被苄基化(-CH2Ph)的衍生物、和人Ghrelin的3位丝氨酸被半胱氨酸替代后三苯甲基化(-C(Ph)3)的衍生物的Ca提高活性，在表13中作为化合物67、68记载结果。另外，对于4—甲基戊酸((CH3)2CH-CH2CH2CO2H)与3位丝氨酸羟基形成酯键的人Ghrelin衍生物的Ca提高活性，也在表13中，作为化合物69记载结果。
表6 Ghrelin衍生物的活性3
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
15.[Ser<sup>3</sup>(3-苯基丙酰基)]-hGhrelinGSS(CO-CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>Ph)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR       1.4
16.[Ser<sup>3</sup>(3-辛烯酰基)]-hGhrelinGSS(CO-CH<sub>2</sub>CH＝CH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>CH<sub>3</sub>))FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR     1.7
17.[Ser<sup>3</sup>(辛基)]-hGhrelinGSS(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1.2
18.[Cys<sup>3</sup>(辛基)]-rGhrelinGSC(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 5.4
即使将作为不饱和脂肪酸的3—辛烯酰基导入3位丝氨酸的侧链，也具有与辛酰基同样的Ca提高活性(EC50＝1.7nM)。
有趣的是，即使导入苯基丙酰基，EC50＝1.4nM，仍然保持Ca提高活性，另外，即使导入相当于C6的支链脂肪酸4—甲基戊酰基，EC50值是4.4nM，保持了Ca提高活性(表13，化合物69)，因此可知3位丝氨酸侧链的酰基不一定是直链烷酰基。
另外，可期待化学安定性的3位丝氨酸或半胱氨酸被辛基化的醚和硫醚体的EC50值，分别保持1.2nM、5.4nM，因此可知，3位氨基酸残基侧链不一定是酰基。
另外，3位被Ser(Bz1)〔人Ghrelin的3位丝氨酸被苄基化(-CH2Ph)的衍生物〕、或Cys(Trt)〔人Ghrelin的3位丝氨酸被半胱氨酸替代后三苯甲基化(-C(Ph)3)的衍生物〕取代的Ghrelin，EC50值分别是7.6nM、20nM，保持了Ca提高活性(表13，化合物67、68)。
(2)活性领域的检索
含有羧基末端部分的Ghrelin(16—28)在细胞内Ca提高活性较低(EC50>10，000nM)，另一方面，含有氨基末端部分的人Ghrelin(1—15)和大鼠人Ghrelin(1—15)的EC50值分别是7.0nM、8.6nM，保持了细胞内Ca提高活性，因此可知，Ghrelin的活性部位存在于氨基末端部分(表7)。
表7 Ghrelin衍生物的活性4
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
19.Ghrelin(16-28)H-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-pro-Ala-lysLeu-Gln-Pro-Arg-OH                                                    >10,000
20.hGhrelin(1-15)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-OH                                 7.0
21.rGhrelin(1-15)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Ala-Gln-Gln-Arg-OH                                8.6
22.[des Gln<sup>14</sup>]-rGhrerinGSS(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR 1.5
另外，在Ghrelin(1—15)中，由于人型和大鼠型的活性基本相同，11位和12位的氨基酸残基(在人中是—精氨酰—缬氨酰—、在大鼠中是—赖氨酰—丙氨酰—)不限于这些氨基酸。
这样在人Ghrelin、或大鼠Ghrelin得到的结构活性相关的结果，分别可适用于大鼠Ghrelin或人Ghrelin。
另外，除去14位的谷氨酰胺的[脱-谷氨酰胺14]-大鼠Ghrelin，确认具有与大鼠Ghrelin同等的Ca提高活性(EC50＝1.5nM)，因此，Ghrelin分子中央部分的氨基酸可缺失。
(3)肽链长和向羧基末端导入碱性基团
以活性较强的Ghrelin(1—15)为基础，制备适当缺失羧基末端侧氨基酸残基的衍生物，评价活性。
羧基末端是羧酸的短链衍生物和羧基末端是酰胺化的短链衍生物的活性如表8所示。
表8 Ghrelin衍生物的活性5
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
23.hGhrelin(1-11)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-OH                                              15
24.rGhrelin(1-11)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-OH                                              15
25.Ghrelin(1-10)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-OH                                                   19
26.Ghrelin(1-9)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-OH 38
27.Ghrelin(1-8)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-OH 100
28.Ghrelin(1-8)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-NH<sub>2</sub> 13
29.Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 2.6
30.Ghrelin(1-6)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-NH<sub>2</sub> 4.8
31.Ghrelin(1-5)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-OH 68
32.Ghrelin(1-5)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-NH<sub>2</sub> 6.2
33-1.Ghrelin(1-4)H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-OH 480
33-2.Ghrelin(1-4)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-NH<sub>2</sub> 160
34.Ghrelin(1-3)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-NH<sub>2</sub> >10,000
Ghrelin(1—3)酰胺的Ca提高活性较低(EC50>10,000nM)。用苯基丙氨酸延长的Ghrelin(1—4)的EC50值是480nM、其羧基末端酰胺体是160nM，Ca提高活性显著提高。
另外，附加了亮氨酸酰胺的Ghrelin(1—5)酰胺体的活性比(1—4)酰胺体的活性提高约26倍(EC50＝6.2nM)，显示与天然品同水平的Ca提高活性。
在Ghrelin(1—7)酰胺体中看到最强的Ca提高活性，其EC50值是2.6nM，与天然品几乎相等。
从以上结果可知，表达Ghrelin活性必须的结构要点集中在氨基末端部分4个残基的序列，但是通过在5位附加亮氨酸等残基，可大大提高与Ghrelin受体的亲和性，或信号转导，因此优选在5位附加亮氨酸等残基。
另外，如上述结果表明的那样，通过将羧基末端羧酸酰的胺化，可看到Ca提高活性的提高倾向。
例如，在Ghrelin(1—9)，通过酰胺化，EC50值从38nM变为5.4nM，提高Ca提高活性约7倍，在Ghrelin(1—4)，EC50值从480nM变为160nM，提高Ca提高活性约3倍。另外，在除去Ghrelin(1—9)酰胺的9位碱性残基组氨酸残基的Ghrelin(1—8)酰胺中，EC50值从5.4nM变为13nM，降低了Ca提高活性，另一方面，在除去作为酸性氨基酸的8位谷氨酸的Ghrelin(1—7)酰胺中，相反EC50值从13nM变为2.6nM，提高了Ca提高活性。
酰胺化的効果之一是羧酸的负电荷被中和，上述结果显示，在短链衍生物中羧基末端氨基酸的碱性，对于提高活性起了很大作用。
根据该结果，以所得高活性的Ghrelin(1—7)酰胺为中心，制备羧基末端部分附加了碱性残基的衍生物，调查其活性。
结果如表9所示。
表9 Ghrelin衍生物的活性6
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
35.[Lys<sup>8</sup>]-Ghrelin(1-8)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Lys-NH<sub>2</sub> 1.1
36.[Arg<sup>8</sup>]-Ghrelin(1-8)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Arg-NH<sub>2</sub> 1.1
37.[Lys<sup>6</sup>]-Ghrelin(1-6)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Lys-NH<sub>2</sub> 12
38.[Lys<sup>5</sup>]-Ghrelin(1-5)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Lys-NH<sub>2</sub> 10
39.[<sup>D</sup>Phe<sup>4</sup>，Lys<sup>5</sup>]-Ghrelin(1-5)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-<sup>D</sup>Phe-Lys-NH<sub>2</sub> 1,700
向Ghrelin(1—5)的羧基末端部分导入赖氨酸的[赖氨酸6]—Ghrelin(1—6)酰胺的EC50值，从4.8nM变为12nM，Ca提高活性有些降低，但是在Ghrelin(1—4)，通过向羧基末端附加赖氨酸，EC50值从480nM变为10nM，Ca提高活性提高约50倍。另外，向Ghrelin(1—7)羧基末端部分附加精氨酸或赖氨酸的酰胺衍生物的活性，与Ghrelin(1—7)酰胺(EC50＝2.6nM)相比，都是1.1nM，显示极强的细胞内钙提高活性。
在以上，几乎所有的例子中，通过掩蔽羧基末端部分的酸性和导入碱性基团，都可提高活性。
(4)氨基末端甘氨酸和2位丝氨酸残基
以确认活性的Ghrelin(1—7)酰胺(EC50＝2.6nM)〔表8化合物29〕、或Ghrelin(1—9)酰胺(EC50＝5.4nM)〔表4化合物3〕为基础，调查氨基末端甘氨酸和2位丝氨酸对活性的影响。
结果汇集于表10。
表10 Ghrelin衍生物的活性7
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
40.[N-氨基戊酰基]-Ghrelin(3-7)-酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 3.4
41.[N-乙酰基]-Ghrelin(1-10)CH<sub>3</sub>CO-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-OH                                              >10,000
42.[N-Tyr]-rGhrelinYGSS(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 120
43.[N-甘氨酰基]-Ghrelin(3-7)-酰胺H-Gly-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 380
44.[Leu<sup>2</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Leu-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 42
45.[His<sup>2</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-His-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 35
46.[Lys<sup>2</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Lys-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 24
47.[Gly<sup>2</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Gly-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 78
氨基末端的氨基被封端的Nα—乙酰基—Ghrelin(1—10)的活性较弱(EC50>10，000nM)。另外，如前所述，[Nα—辛酰，丝氨酸3]-Ghrelin(1—9)酰胺(表1化合物6)的活性也较弱(EC50>10,000nM)，因此，在表达Ca提高活性中，优选氨基末端氨基为被封端的。
另一方面，由于氨基末端的甘氨酸和2位丝氨酸被相当于2个残基长度的5—氨基—正戊酸(NH2-(CH2)4-CO-)取代的Nα—氨基戊酰基—Ghrelin(3—7)酰胺的Ca提高活性基本被保持(EC50＝3.4nM)，且2位丝氨酸缺损的[Nα—甘氨酰]—Ghrelin(3—7)酰胺的Ca提高活性降低(EC50＝380nM)，氨基末端带有酪氨酸残基的[N-酪氨酰]-大鼠Ghrelin的Ca提高活性降低(EC50＝120nM)等，因此，为获得更强的活性，优选氨基末端氨基的位置是，从3位的辛酰基丝氨酸残基开始，在氨基末端方向存在相当于2个氨基酸残基的部分。
另外，在Ghrelin(1—7)酰胺中，2位丝氨酸被亮氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸替代的衍生物的EC50值分别是42nM、78nM、35nM、24nM，与Ghrelin(1—7)酰胺相比，Ca提高活性稍微降低。
从该结果可知，2位丝氨酸残基-NH-CH(CH2OH)-CO-可被氨基戊酸的部分结构-CH2-CH2-CO-取代，由此至少2位丝氨酸残基与Ghrelin氨基末端的氨基从3位辛酰基开始保持一定的距离起到间隔区的作用。另外，用5—氨基戊酸取代保持了活性，这是因为通过导入烷基胺结构提高氨基末端的碱性。
从上述可认为，氨基末端部分的甘氨酸残基由于具有该氨基，赋予Ghrelin分子的氨基末端碱性，表达Ghrelin的活性，因此优选氨基末端部分的氨基未被封端。
另外，由于考虑到2位丝氨酸残基与氨基末端氨基从3位辛酰基开始保持一定的距离，起到间隔区的作用，因此，可被具有相对体积小的侧链的氨基酸或非氨基酸化合物替代。即，在Ghrelin分子中规定了以氨基末端氨基为基点的辛酰基的位置，该位置关系形成Ghrelin活性结构的一部分。
即，2位氨基酸侧链，与体积大的结构相比，到不如优选像丝氨酸、丙氨酸、正缬氨酸那样，侧链较小的，对附近残基的自由度无束缚的氨基酸残基。另外，由于Nα—氨基戊酰基—Ghrelin(3—7)酰胺的Ca提高活性基本被保持(EC50＝3.4nM)，因此2位丝氨酸可被非氨基酸化合物替代。
(5)3位、和4位氨基酸残基的光学活性
以Ghrelin(1—7)酰胺的结构为基础，制备3位丝氨酸和4位苯基丙氨酸分别从L—构型转化为D—构型的衍生物，研究3位和4位氨基酸的光学活性对活性的影响。具体地说，以保持良好活性的[丝氨酸3(辛基)]-Ghrelin(1—7)酰胺(EC50＝5.8nM)〔表11化合物50〕、或[半胱氨酸3(辛基)]-Ghrelin(1—7)酰胺(EC50＝7.4nM)〔表11化合物48〕为基础，将3位丝氨酸和4位苯基丙氨酸分别替代为其对应的的L—构型、D—构型，制备衍生物。
结果汇集于表11。从该结果可知，3位和4位的氨基酸优选都是L—构型。
表11 Ghrelin衍生物的活性8
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
48.[Cys<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-Cys(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 7.4
49.[Cys<sup>3</sup>(辛基)，<sup>D</sup>Phe<sup>4</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-Cys(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-<sup>D</sup>Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 3,000
50.[Ser<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 5.8
51.[Ser<sup>3</sup>(辛基)，<sup>D</sup>Phe<sup>4</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-<sup>D</sup>Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> 2.200
52.[<sup>D</sup>Ser<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-<sup>D</sup>Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> >10.000
53.[<sup>D</sup>Ser<sup>3</sup>(辛基)，<sup>D</sup>Phe<sup>4</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-<sup>D</sup>Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-<sup>D</sup>Phe-Leu-Ser-Pro-NH<sub>2</sub> >10,000
(6)3位侧链的结合方式
为了使3位的侧链链长与Ghrelin链长(-CH2-O-CO-C7H15)一样，将原来的酯键用逆向的酯(化合物序号54)、酰胺(化合物序号55，56)、二硫化物(化合物序号57)、亚甲基(化合物序号58)取代，制备衍生物。同时，制备β碳原子上具有立体障碍的酯衍生物(化合物序号59、60)、亚甲基是3个单元部分延长形的酰胺衍生物(化合物序号61)。结果汇集于表12。
表12 Ghrelin衍生物的活性9
 
化合物结构   Ca提高活性  
54.[Asp<sup>3</sup>(O-庚基)]-hGhrelinGSD(O-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 5.1
55.[Asp<sup>3</sup>(NH-庚基)]-hGhrelinGSD(NH-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 11
56.[Dap<sup>3</sup>(辛酰基)]-hGhrelinGS-NH-<sup>L</sup>CH(CH<sub>2</sub>NHCO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-CO-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR  2.6
57.[Cys<sup>3</sup>(S-庚基)]-hGhrelinGSC(S-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1.4
58.[Adod<sup>3</sup>]-hGhrelinGS-NH-CH(n-C<sub>10</sub>H<sub>21</sub>)-CO-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 0.91
59.[Thr<sup>3</sup>(辛酰基)]-hGhrelinGST(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 10
60.[Leu<sup>2</sup>，Thr<sup>3</sup>(辛酰基)]-hGhrelinGLT(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 46
61.[Lys<sup>3</sup>(辛酰基)]-hGhrelinGSK(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 32
3位侧链全部被亚甲基取代的化合物58的活性最强，EC50值在1nM以下。另外，根据键的种类不同，活性的高低有些变化，但是可确认3位氨基酸侧链的结合方式对活性没有很大影响。
(7)3位侧链的疏水性
将3位的Ser(辛酰基)基，以天然氨基酸为中心，用疏水性氨基酸替代，制备衍生物，调查其活性。结果汇集于表13。
表13 Ghrelin衍生物的活性10
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
62.[Trp<sup>3</sup>]-hGhrelinGSWFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 31
63.[Phe<sup>3</sup>]-hGhrelinGSFFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 2,000
64.[Cha<sup>3</sup>]-hGhrelinGS-Cha-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 19
65.[2-<sup>L</sup>Nal<sup>3</sup>]-hGhrelinGS-<sup>L</sup>Nal-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 8.2
66.[2-<sup>D</sup>Nal<sup>3</sup>]-hGhrelinGS-<sup>D</sup>Nal-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR >10,000
67.[Ser<sup>3</sup>(Bzl)]-hGhrelinGSS(CH<sub>2</sub>-C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 7.6
68.[Cys<sup>3</sup>(三苯甲基)]-hGhrelinGSC(C-Ph<sub>3</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 20
69.[Ser<sup>3</sup>(4-甲基戊酰基)]-hGhrelinGSS(CO-CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH(CH<sub>3</sub>)<sub>2</sub>)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 4.4
70.[Leu<sup>3</sup>]-hGhrelinGSLFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 4,400
71.[Ile<sup>3</sup>]-hGhrelinGSIFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR >10,000
72.[Lys<sup>3</sup>]-hGhrelinGSKFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 120
73.[Nle<sup>3</sup>]-hGhrelinGS-N1e-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 2,800
74.[Val<sup>3</sup>]-hGhrelinGSVFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1,600
在3位具有色氨酸、环己基丙氨酸、萘基丙氨酸等芳香族疏水性氨基酸的衍生物的EC50值分别是31nM，19nM，8.2nM，保持了Ca提高活性。意外的是将苯基丙氨酸导入3位时，Ca提高活性有些降低，但是将提高疏水性的Ser(Bz1)，Cys(三苯甲基)导入3位，同样可看到Ca提高活性被保持，因此确认，在活性表达中，更优选3位侧链是疏水性的。
另一方面，如果在3位导入亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸等脂肪族疏水性氨基酸，与导入芳香族氨基酸的情况相比，虽然稍微低一些，但是全都保持了Ca提高活性。与在3位具有正亮氨酸的化合物73的活性EC50＝2,800nM相比，在正亮氨酸侧链中附加了氨基的6-氨基-正亮氨酸(赖氨酸；化合物72)的活性为EC50值是120nM，被提高了，与前述的在羧基末端优选碱性的情况相同，确认在3位侧链中也优选带有碱性。
(8)短链Ghrelin衍生物
从Ghrelin的活性在氨基末端部分1—4显著地表达，通过在5位附加亮氨酸可被增强，优选3位氨基酸残基是具有疏水性侧链的，导入碱性残基可提高活性，和1位和2位的氨基酸残基被δ—氨基酸等相当于2个残基长的非氨基酸化合物替代等结果，制备了如表14或15表的化合物序号从76到87所示的，以氨基末端部分(1—5)序列为基础，制备各种短链Ghrelin衍生物，调查其活性。结果汇集于表14或15。
另外，化合物80是已知的(Ipamorerin；K.Raum等、Eur.J.ofEndocrino1.，139卷，552～561页、1998年)。
表14 Ghrelin衍生物的活性11
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
75.[Lys<sup>7</sup>]-Ghrelin(1-7)-酰胺H-Gly-Ser-Ser(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)-Phe-Leu-Ser-Lys-NH<sub>2</sub> 11
76.[N-氨基戊酰基，Ser<sup>3</sup>(辛基)，Lys<sup>5</sup>]-Ghrelin(3-5)-酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>                  12
77.[N-氨基戊酰基，<sup>D</sup>Ser<sup>3</sup>(辛基)，<sup>D</sup>Phe<sup>4</sup>，Lys<sup>5</sup>]-Ghrelin(3-5)-酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-<sup>D</sup>Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-<sup>D</sup>Phe-Lys-NH<sub>2</sub>       1,600
78.[Aib<sup>1</sup>，His<sup>2</sup>，Ser<sup>3</sup>(辛基)，Lys<sup>5</sup>]-Ghrelin(1-5)-酰胺H-Aib-His-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>                   34
79.[Aib<sup>1</sup>，His<sup>2</sup>，<sup>D</sup>Ser<sup>3</sup>(辛基)，<sup>D</sup>Phe<sup>4</sup>，Lys<sup>5</sup>]-Ghrelin(1-5)-酰胺H-Aib-His-<sup>D</sup>Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-<sup>D</sup>Phe-Lys-NH<sub>2</sub>                         38
80.[Aib<sup>1</sup>，His<sup>2</sup>，<sup>D</sup>Nal<sup>3</sup>，<sup>D</sup>Phe<sup>4</sup>，Lys<sup>5</sup>]-Ghrelin(1-5)-酰胺H-Aib-His-<sup>D</sup>Nal-<sup>D</sup>Phe-Lys-NH<sub>2</sub>                          2.5
已知化合物80的Ca提高活性是2.5nM，很高，调查在化合物80中3位2-D-萘基丙氨酸被D-辛基丝氨酸替代的化合物79的活性时，其EC50值是38nM，保持了活性。1位和2位的氨基酸结构不同，但是与化合物79一样，在3位和4位具有D-辛基丝氨酸和D-苯基丙氨酸的化合物77的活性是1,600nM，降低了，合并考虑这两方面，与1位和2位对应的氨基酸的序列或结构对于表达活性重要的3位和4位的氨基酸侧链的立体构型有影响。
即，将1，2位用氨基戊酸替代时，即使将3位的2-D-萘基丙氨酸和4位D-苯基丙氨酸分别用其相应的L-氨基酸替代，活性也是34nM，被保持(化合物78)，由此Ghrelin的1位和2位的氨基酸序列Gly-Ser要求3位和4位中是L—立体构型，但是通过导入其他的氨基酸序列，例如，导入Aib-His等，3，4位即使是D-立体构型，活性也是显著的。或，在1，2位导入氨基戊酸时，3，4位是L-，D-中的任一种立体构型，都可确认表达活性。
表15 Ghrelin衍生物的活性12
 
化合物结构   Ca提高活性EC<sub>50</sub>(nM)  
81.[N-氨基戊酰基，Ser<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(3-5)-酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-NH<sub>2</sub>            11
82.[N-氨基戊酰基，Ser<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(3-5)-甲基酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-NH-CH<sub>3</sub>             12
83.[N-氨基戊酰基，Ser<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(3-5)-乙基酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-NH-C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>            22
84.[N-氨基戊酰基，Ser<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(3-5)-苄基酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-NH-CH<sub>2</sub>-C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>        98
85.[N-氨基戊酰基，Ser<sup>3</sup>(辛基)]-Ghrelin(3-5)-氨基乙基酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-Phe-Leu-NH-(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-NH<sub>2</sub> 3.5
86.[N-氨基戊酰基，Ser<sup>3</sup>(辛基)，MePhe<sup>4</sup>，MeLeu<sup>5</sup>]-Ghrelin(3-5)-酰胺NH<sub>2</sub>-(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>-CO-Ser(C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>)-MePhe-MeLeu-NH<sub>2</sub>       82
87.[<sup>D</sup>Leu<sup>5</sup>]-hGhrelinGSS(CO-C<sub>7</sub>H<sub>15</sub>)F-<sup>D</sup>L-SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 220
使用Ghrelin的氨基末端部分(1—5)序列为基础的[N-氨基戊酰基，Ser3(辛基)]-Ghrelin(3-5)，调查羧基末端部分的结构活性相关性。将5位亮氨酸的羧基末端用酰胺、甲基酰胺、乙基酰胺、苄基酰胺修饰时，活性虽然被保持了，其EC50值分别是11nM，12nM，22nM，98nM，可看到依次递减的倾向。另一方面，将乙基酰胺换为氨基乙酰胺时，EC50为3.5nM，活性提高了，因此可知，优选Ghrelin分子中的羧基末端部分带有碱性的物质。
这些各种羧基末端酰胺衍生物，在拮抗生物体内羧基肽酶类引起的酶分解中也是有用的化合物。同样地，含有N-甲基氨基酸的化合物86(EC50＝86nM)，在具有酶拮抗性方面也是有用的化合物。
实施例12 大鼠中Ghrelin衍生物的GH释放活性
(1)大鼠中各种长链Ghrelin衍生物的GH释放活性
对于戊巴比妥钠麻醉下的IGS-SD系大鼠(约7周龄)，使用化合物17；[Ser3(辛基)]-hGhrelin18nmol/kg，化合物18；[Cys3(辛基)]-rGhrelin30nmo1/kg，化合物65；[2-LNal3]-hGhrelin 100nmol/kg，或化合物15；[Ser3(3-苯基丙酰基)]-hGhrelin18nmol/kg急速静脉给药(各n＝3)。给药15分后，采取血浆，通过放射免疫法(Biotrak/Amersham社)测定GH浓度。作为对照，0.2％牛血清白蛋白(BSA)-生理盐水、和分别给药6nm01/kg的rGhrelin、hGhrelin、80nmo1/kg的Ipamorelin(化合物80)，比较给药后15分的血浆中GH浓度(各n＝3)。
结果如表13所示。化合物17；[Ser3(辛基)]-hGhrelin、化合物18；[Cys3(辛基)]-rGhrelin和化合物15；[Ser3(3-PhPr1)]-hGhrelin都显示强的GH释放活性，可看到[2-LNal3]-hGhrelin的GH释放活性也与细胞内Ca提高活性有良好的相关性。
表16 各种长链Ghrelin衍生物的GH释放活性
(2)[Cys3(辛基)]-大鼠Ghrein给药引起的血浆中GH浓度推移
对戊巴比妥钠麻醉下的Wistar系大鼠雄性(约260～280g)，使用化合物18；[Cys(辛基)]-大鼠Ghrelin 5μg/只静脉给药时，测定释放到血中的GH。作为对照，使用生理盐水、和大鼠Ghrelin(5μg/只)给药，与本品比较。
如表17～19所示，[Cys3(辛基)]-大鼠Ghrein的GH分泌促进活性，分泌的GH的Cmax与天然型大鼠Ghrelin相同(都约1,100ng/ml)，进一步显示分泌时间被延长的倾向。本品的细胞内Ca提高活性EC50值是5.4nM。
表17 [Cys3(辛基)]-大鼠Ghrein给药引起的血浆中GH浓度推移
Figure C00810440D01291
表18 生理盐水给药引起的血浆中GH浓度推移
Figure C00810440D01292
表19 大鼠Ghrelin给药引起的血浆中GH浓度推移
Figure C00810440D01301
实施例13 Ghrelin的食欲增进作用
(1)脑室内给药引起的食欲增进作用
使用溶解有各种浓度大鼠Ghrelin的生理盐水，对体重从300g到325g的雄性ウイスタ—(Wistar)系大鼠(一组16至20只)，在早晨8点45分进行脑室内给药。作为对照，使用不含Ghrelin的生理盐水对脑室内给药。给药后，使之自由摄饵，测定给药后2小时的摄饵量。如图6所示，用50pmol脑室内给药可确认摄饵量的增加，在200pmol和500pmol可确认依存于给药量的摄饵量的增加，但是用2nmol给药时，摄饵量的增加降低。由于通常大鼠在夜间摄饵，因此早晨是吃饱的，基本不摄饵(参见图6作为对照的生理盐水组)、通过Ghrelin脑室内给药，摄饵量增加，显示Ghrelin有食欲增进作用。
(2)静脉给药引起的食欲增进作用
对于9个月月龄的雌性SD(Sprague-Dawley)系大鼠(5只)和ウイスタ—系大鼠(4只)，使用大鼠Ghrelin50μg/kg尾静脉给药，测定给药后2小时的摄饵量(在傍晚16:00～19:00评价)。如表20所示，与对其他日子的同时刻、同一个体调查的非大鼠Ghrelin给药时的摄饵量相比，通过Ghrelin静脉给药，摄饵量明显增加。即，Ghrelin即使通过静脉给药，也可显示食欲增进作用。
表20
Figure C00810440D01311
实施例14.Ghrelin引起的胃机能亢进
为调查Ghrelin给药引起的对胃机能的効果，进行如下试验。使用雄性SD系大鼠(体重200～280g、7～8周龄)，该大鼠在试验前20小时以上绝食。通过对大鼠用尿烷(1.25g/kg)腹腔内给药麻醉，使用加温垫和加温光进行保温。插入气管内插管，进一步将食道用丝线结扎，实施下述测定胃酸分泌或胃运动用的手术。觉醒下的试验是，在吸入醚引起的轻度麻醉下，实施下述测定胃酸分泌或胃运动用的手术。
尿烷麻醉下的胃酸分泌试验是按照Ohno等的方法[Ohno，T.，etal.，Jpn.J.Pharmacol.43，429-439(1987)]进行的手术。即，在仰卧位，将腹部正中切开，露出胃和十二指肠。从胃前部插入聚乙烯管，制作急性胃瘘。将另一根聚乙烯管通过十二指肠的切开部插入胃内，结扎幽门部周围，固定。胃内灌流在注水池内调至pH7.0加热至37℃的生理盐水。流速为1.0ml/min。使用pH固定装置(Hiranuma，Comitite-8)和100mM的NaOH液滴定，使灌流液为pH7.0。确认基础胃酸分泌量稳定后，使用被试验药物静脉给药，每隔5分钟测定胃酸分泌速度。各组使用4例动物。
觉醒下的试验，是在吸入醚引起的轻度麻醉下实施同样的手术后，在侧腹部加个小切口，将灌流用管导出体外。将露出的胃和十二指肠收回腹腔，缝合开口，将动物伏卧位固定于ボ—ルマン型大鼠用固定支架内，确认从麻醉觉醒后用于试验。另外，虽然食道被结扎，但是未插入气管插管。
尿烷麻醉下的胃运动测定试验，按照Takeuchi & Nobuhara的方法[Takeuchi，K.and Nobuhara，Y.，Digestive Diseases and Sciences 30，1181-1188(1985)]，使用微型气球法。即，将填充了水的气球和支持用导管从前胃部切口插入胃中。横于胃的腺部分固定，导管的一端与压力传感器(压トランス·デユ—サ—)(日本光電株式会社制、LPU-0.1-350-0-II)连接。确认胃运动稳定后，被试验药物以60分钟间隔累积静脉给药。胃运动通过10分钟间隔，测定其具有20cmH2O以上振幅的收缩运动的胃内压振幅和收缩反应数。每组使用4例动物。觉醒下的试验，在吸入醚引起的轻度麻醉下实施同样的手术后，缝合切开部分，将动物伏卧位固定于ボ—ルマン型大鼠用固定支架内，确认从麻醉觉醒后用于试验。
将大鼠Ghrelin和组胺2盐酸盐溶解于生理盐水中，从尾静脉以1ml/kg的容量给药。为调查Ghrelin的作用与迷走神经活动是否相关，在Ghrelin给药30分钟前，皮下给药硫酸阿托品，或将两侧的颈部迷走神经束切断。为进一步调查Ghrelin的作用与组胺H2受体的关系，在Ghrelin给药30分钟前，使用フアモチジン(ガスタ
Figure C00810440D0132144102QIETU
、山之内製薬株式会社制)皮下给药。结果用平均值±标准误差值表示。统计学解析，使用Dunnett的多重比较法进行。P值<0.05判定为统计学上有意义。
如图7A和表21所示，如果在尿烷麻醉下，以大鼠Ghrelin0.8～20μg/kg的用量静脉给药时，以用量依存方式促进胃酸分泌。
在麻醉下，Ghrelin给药前，几乎看不到胃的自发运动。在该状态，如果以大鼠Ghrelin0.8～20μg/kg的用量静脉给药，如图8A、B和表21所示，胃运动的振幅和频度都亢进。可确认该反应在大鼠Ghrelin给药后迅速出现。用20μg/kg给药时，胃酸分泌增多，20分以内达到最大值后，直到给药后90分钟为止慢慢衰减。大鼠Ghrelin20μg/kg引起的胃酸分泌促进作用的最大反应的最高点，如图7A、B所示，与使用组胺3mg/kg静脉给药时引起的反应基本相当。对于胃运动振幅的亢进作用，各用量都在10分钟内达到最大反应，使用20μg/kg给药时，直到50分钟后才慢慢衰减。
另外，如表21所示，用大鼠Ghrelin 20μg/kg给药引起的胃酸分泌促进作用，通过阿托品或切除两侧颈部迷走神经的前处理，几乎完全被抑制，对于作为组胺H2受体拮抗剂的ファモチジン1mg/kg皮下给药的前处理完全没有影响。另外，大鼠Ghrelin给药引起的胃运动亢进作用，也被阿托品或两侧颈部迷走神经切除术的前处理完全抑制。由此可确认，Ghrelin的胃机能亢进作用，不是组胺类机序引起的，是由活化迷走神经引起的。
另一方面，在觉醒大鼠中，与上述尿烷麻醉下相同，如果用大鼠Ghrelin(4和20μg/kg)静脉给药，可促进胃酸分泌。另外，觉醒下的大鼠与麻醉下大鼠相比，在被检药物给药前发生胃的自发运动，即使在该状态使用大鼠Ghrelin0.8～20μg/kg的用量静脉给药，胃运动在振幅和频度上都亢进。以上的结果可确认，在尿烷麻醉下和觉醒下的任一种情况下，都可确认通过Ghrelin静脉给药，可引起胃酸分泌的促进和胃运动的亢进。
表21
表中记号如下所示，
＊1 p<0.01 ＊2 p<0.05 ＊3 p<0.01
NT未试验
实施例15.Ghrelin和Ghrelin衍生物的细胞增殖促进作用
为调查Ghrelin给药引起的细胞增殖促进作用，进行以下试验。使用大鼠Ghrelin或硫醚型大鼠Ghrelin(化合物18[Cys3(辛基)]-hGhrelin)20μg/kg，对wistar系雄性大鼠(7.5周龄)的尾静脉给药。给药17小时后，使用3H-胸腺嘧啶核甙(3H-thymidine)尾静脉给药，1小时后，摘出十二指肠、空肠和骨髓。测定这些组织中收入DNA组分中的3H-胸腺嘧啶核甙的量，调查Ghrelin和Ghrelin衍生物的细胞增殖促进作用。将组织切细后，用聚トロン匀浆器进行匀浆，其离心分离上清液用三氯乙酸沉淀，得到DNA组分。用液体闪烁计数器测定DNA组分的放射能。
如表22所示，通过使用大鼠Ghrelin或硫醚型大鼠Ghrelin静脉给药，促进了这些组织中或脏器中的DNA中3H-胸腺嘧啶核甙的摄取，因此确认Ghrelin在十二指肠、空肠和骨髄显示细胞增殖促进作用。
Ghrelin静脉给药后的细胞增殖促进作用的时间花费，与GHRH(生长激素释放激素)给药引起的相同，被认为是Ghrelin的细胞增殖促进作用主要是通过下垂体分泌的GH(生长激素)进行的。可认为，GH分泌调节，使用作为生理因子的Ghrelin担当，对于生物体调节不是没有道理的，而且很少有GH引起的副作用。
表22
 
比较例 大鼠Ghrelin 硫醚型Ghrelin
骨髄(组织中) 100.0±17.8％ 141.7±30.1％ 144.5±16.5％
十二指肠(DNA组分中) 100.0±14.2％ 136.0±17.8％ 114.0±11.7％
空肠(DNA组分中) 100.0±6.8％ 159.0±7.5％ 151.0±23.6％
数值表示，将比较例(生理盐水给药组)的3例的平均值作为基准时，放射能的收入量的比率(％)。
实施例16 以抗Ghrelin抗体定量Ghrelin
使用大鼠Ghrelin的氨基末端侧和羧基末端侧的肽作为抗原制备抗体，通过放射免疫测定(RIA)，定量各种生物体组织中的Ghrelin。
以[C-Cys]-大鼠Ghrelin[1-11](具有大鼠Ghrelin氨基末端侧第1至第11的氨基酸序列的肽的羧基末端与半胱氨酸结合的肽)和[C-Cys]-大鼠Ghrelin[13-28](具有大鼠Ghrelin氨基末端侧第13至第28的氨基酸序列的肽的羧基末端与半胱氨酸结合的肽)作为抗原，免疫兔子，制备N端侧抗体(抗[C-Cys]-大鼠Ghrelin[1-11]抗体)和C端侧抗体(抗[C-Cys]-大鼠Ghrelin[13-28]抗体)。
如图9a所示，在放射能标识的大鼠Ghrelin和N端侧抗体的结合中，大鼠Ghrelin的IC50(半数抑制量)，每种反应液为3.1fmol。该N端侧抗体，与化学合成的人Ghrelin和大鼠Ghrelin的100％显示出交差反应性，但是与3位丝氨酸被正己酰基修饰的正己酰基大鼠Ghrelin和3位丝氨酸被正癸酰基修饰的正癸酰基大鼠Ghrelin，分别只显示0.3％和20％的交差反应性。另外，N端侧抗体与脱脂肪酸的Ghrelin完全不反应。
对于大鼠Ghrelin(28氨基酸)、人Ghrelin(28氨基酸)和从人或大鼠等可看到的Ghrelin-27(27个氨基酸形成的Ghrelin)，N端侧抗体显示同等的亲和性。因此，可确认N端侧抗体对3位丝氨酸被正辛酰基修饰的天然型Ghrelin可特异性识别。
如图9b所示，在与放射能标识的大鼠Ghrelin的C端侧抗体相对的结合中，正辛酰基修饰的天然型大鼠Ghrelin和脱除正辛酰基的大鼠Ghrelin的IC50，每种反应液是44fmol，是相同的。即，可确认脂肪酸修饰的Ghrelin与脱除脂肪酸的Ghrelin显示同等的亲和性。
基于以上结果可判断，对于生物体内各组织中存在的Ghrelin，通过N端侧抗体，可对3位丝氨酸被正辛酰基修饰的Ghrelin进行定量，通过C端侧抗体，可对脂肪酸修饰的Ghrelin和脱除脂肪酸的Ghrelin两者进行定量。
表23显示的是，调查实际生物体各组织中，脂肪酸修饰的Ghrelin的含量、和脂肪酸修饰的Ghrelin和脱离脂肪酸的Ghrelin两者含量的结果。
表23
Figure C00810440D01371
表中、C—RIA表示的是使用C端侧抗体的放射免疫测定法得到的定量结果，N—RIA表示的是使用N端侧抗体的放射免疫测定法得到的定量结果。
另外，表中的数值表示的是“值±标准偏差”。
实施例17 通过半合成法的大鼠Ghrelin(1-28)的制造
合成路线
下面显示分别通过遗传学方法和化学合成方法制备rGhrelin(6-28)和Ghrelin(1-7)，然后从两个Ghrelin片段制造rGhrelin的例子。
具体地说，将具有在β-半乳糖苷酶97S和rGhrelin(6-28)之间有V8蛋白酶和KexII蛋白酶切断部位的氨基酸序列(-QFE-SRHRR-)的融合蛋白，β-半乳糖苷酶97S-(QFE-SRHRR)-rGthrelin(6-28)在大肠菌中表达。将该融合蛋白用V8蛋白酶处理，切出SRHRR-rGhrelin(6-28)。然后，将SRHRR-rGhrelin(6-28)的全氨基用Boc基保护后，用KexII蛋白酶处理，得到新的6位Ser的氨基末端氨基游离的[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)。将该保护片段和用化学合成法得到的[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)-Osu，进行片断缩合，通过酸处理所得[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin，制造rGhrelin。
在本实施例，虽然显示的是rGhrelin的半合成例，但也可用该方法合成人型的产品。
另外，在本实施例中实施的是将(1—5)和(6—28)进行片段缩合，但是也可将例如化学合成的氨基末端片段(1—2)，(1—3)、或(1—7)分别与，通过遗传工程方法制备的，从28位到3位为止的具有任意长度的Ghrelin的羧基末端片段和融合蛋白质形成的羧基末端片段(3—28)、(4—28)、或(8—28)缩合等。在减少化学合成的工序数时，用(1—2)和(3—28)或(1—3)和(4—28)缩合是有利的。另外，从完全防止由于缩合引起的消旋化的观点考虑，特别优选，利用7位Pro的(1—7)和(8—28)的缩合。
表达载体pG97s rGR的构建和Ghrelin(6-28)融合蛋白的表达
基于大鼠Ghrelin的cDNA基因序列，使用全合成寡聚体的退火法，得到在前期领域中具有氨基酸序列QFE-SRHRR的rGhrelin(6-28)的DNA片段。
为将该DNA片段插入pG97SnPPH34(特开平9—296000)，首先，将pG97SnPPH34用SalI和SmaI处理，使得人甲状旁腺激素前体基因缺失。将该物质用碱性磷脂酶处理后，与预先用SalI处理，然后激酶处理过的rGhrelin衍生物基因片段通过T4连接酶连接。连接成的质粒转化大肠杆菌DH5α株，得到质粒pG97s rGR。
将所得pG97s rGR转化大肠菌M25(ompT)株，所得转化株在3个200ml的Terrific Bloth液体培养基(1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.4％葡萄糖)中接种，在37℃振荡培养。在菌体浓度达到OD660＝0.8时，添加异丙基1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖昔(IPTG)，达到最终浓度2mM，表达rGhrelin(6-28)融合蛋白质。进一步培养4小时后，离心分离，回收菌体。大鼠Ghrelin(6-28)融合蛋白质的构成如下所示。
大鼠Ghrelin6-28融合蛋白：(β—半乳糖苷酶-97S)—QFE—SRHRR—rGhrelin(6-28)
rGhrelin6-28融合蛋白质的处理和[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的纯化
将所得菌体20ml悬浮于TE缓冲液中后，通过French Press将菌体破碎。之后，在3000rpm、离心分离15分钟，回收包涵体，再次悬浮于10ml TE缓冲液和去离子水，通过离心分离将包涵体洗净。用去离子水稀释包涵体达到OD660的值为50.0，加入Tris-HCl(pH8.2)使最终浓度达到50mM，通过尿素(最终浓度3.5M)将包涵体溶解。向在30℃保温的该溶液中，加入rV8蛋白酶衍生物V8D5(以下记为V8D5)(特开平9-47291)达到最终浓度10μg/ml，在30℃用酶处理20分钟。加入3％乙酸(AcOH)停止反应。
向含有切出的[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的V8D5酶反应停止液中，加入1.5倍量的去离子水，用5N NaOH调至pH5.0，沉淀β半乳糖苷酶衍生物片段，在5000rpm离心分离10分钟除去。
将含有[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的上清液，添加到用0.1％TFA平衡化的TSK-ODS 80Ts柱(粒径20μm、50mmI.D.x 100mm、TOSOH社制)中。使用从缓冲液A[0.8ml/min、1％乙腈、0.1％TFA]100％到缓冲液B[50％乙腈、0.095％TFA]100％的浓度梯度，用5柱容量完成程序，进行洗脱。分取含有目的肽[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的组分(约50mg)。
[Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)的制备
向含有约50mg(15μmol)[SRHRR]-rGhrelin(6-28)的50％乙腈水溶液中，加入二碳酸二叔丁基酯6当量摩尔(19.2mg，6 x 15μmol)，用三乙胺调至pH9，在室温放置15分钟。向反应液中加入乙酸，使最终浓度达到0.5％，蒸除乙腈后，将其加入到用含有0.1％TFA的10％乙腈平衡化的EMPORE-辛基(C8)HD4mm/1ml药筒(cartridge)中，用平衡化液洗净后，用含有0.095％TFA的90％乙腈，洗脱出[Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)。蒸除乙腈，得到含约30mg的目的物溶液6mL。
从质谱分析结果可知，与Boc化前(测定分子量＝3396、理论分子量＝3398)相比，Boc化后主要存在分子量多500的物质(测定分子量3395)和、多600的物质(測定分子量＝3995)两种。
用Kex2蛋白酶将[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)切出和纯化
向所得[Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)水溶液(30mg，6mL)中加入氯化钙溶液、Tris-HCl pH8.2，分别使最终浓度达到0.3mM、20mM。添加Kex2蛋白酶(特开平10—229884)溶液，使其达到1 x 105unit/ml后，在30℃用蛋白酶处理60分钟。
在HPLC上，[Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)的峰消失，[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)的峰在更具疏水性的一侧出现，并可观察到与Boc-SRHRR相对应的亲水性峰。
确认原料消失后，反应液用乙酸水调至pH3.5，添加至用含有1％乙酸的1.0％乙腈平衡化的逆相色谱柱ODS-80Ts(1.66cc柱容积、粒径20um，TOSOH社制)中。用5柱容积的平衡化液洗净后，使用从含有l％乙酸的1.0％乙腈到90.0％乙腈的浓度梯度洗脱，进行5柱容积完成程序，洗脱出[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)。将主组分冷冻干燥，得到目的保护肽6.2mg。
片段缩合和脱保护
向Ghrelin(1-5)(190mg，0.0301mmol，化合物31)的三氟乙醇(TFE)溶液(6.00ml)中加入三乙胺(51.0μl，0.366mmol)、二碳酸二叔丁基酯(78.0mg，0.0356mmol)的TFE溶液(4.00ml)，在室温搅拌13小时。减压蒸除溶剂，向所得残渣中加入醚(20.0ml)，得到[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)180.5mg。
然后，向[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)(22.0mg，0.0301mmol)的DMF(1.00ml)溶液中加入HOSu(5.20mg，0.0452mmol)后，在—30℃浴中加入DIPCI(7.30μl，0.0466mmol)。在—30℃浴搅拌1小时，在室温搅拌18小时后，减压蒸除溶剂，所得残查用醚形成粉末，得到[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)的琥珀酰亚胺酯体[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)-Osu14.1mg。
然后，向通过重组法制备的[Lys(Boc)11，16，19，20，24]-rGhrelin(6-28)(6.10mg，2.18μmol)的DMF(0.6ml)溶液中，加入[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)-OSu(3.3mg，3.96μmol)、三乙胺(2.5μ1，17.9μmol)，在室温搅拌24小时。减压蒸除溶剂，向所得残查中，在冰冷却下，直接加入TFA(2.00ml)，在室温搅拌1.5小时。减压蒸除TFA后，向残渣中加入醚，得到含有rGhrelin(1-28)的粗肽6.2mg。
将本品溶于5％乙酸(AcOH)2ml中，添加到YMC-Pack-ODS-A(5μm，20mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从0％至95％为止线性梯度洗脱60分钟(流速：10ml/min)。分取目的组分后冷冻干燥，再添加至YMC-Pack PROTEIN-RP(C4，10mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从7.5％至21.3％为止线性梯度洗脱30分钟(流速：4.7ml/min)。
分取目的组分后，冷冻干燥，进一步添加至YMC-PackPROTEIN-RP(C4，10mm x 250mm)中，用0.1％三氟乙酸中的乙腈从7.5％至21.3％为止线性梯度洗脱30分钟(流速：4.7ml/min)。分取目的组分后，冷冻干燥，得到rGhrelin(1-28)2.1mg。得到rGhrelin(1-28)2.1mg。该物质与在分析用HPLC中的标准品rGhrelin(1-28)保留时间一致，细胞内钙提高活性是EC50＝1.5nM，与天然品相同。
ESI-MS 3315.0(理论值3314.8)，氨基酸组成比：Ser；3.74(4)，Glx；5.69(6)，Gly；1.18(1)，Ala；2.05(2)，Leu；2，Phe；0.98(1)，Lys；4.98(5)，His；1.03(1)，Arg；1.96(2)，Pro；4.01(4)
化合物87[Dleu5]-rGhrelin(1-28)
另外，作为[Nα-Boc]-rGhrelin(1-5)的琥珀酰亚胺酯化、或片段缩合时的副反应物，得到[Dleu5]-rGhrelin(1-28)0.8mg。该物质的细胞内钙提高活性是EC50＝220nM。
ESI-MS 3315.0(理论值3314.8)，氨基酸组成比：Ser；3.80(4)，Glx；5.92(6)，Gly；1.23(1)，Ala；2.07(2)，Leu；2，Phe；0.97(1)，Lys；4.92(5)，His；1.02(1)，Arg；1.97(2)，Pro；4.11(4)
D2O/DCl水解后的亮氨酸的GC-MS分析：L-Leu；1.17(1)，D-Leu；0.83(1)
产业上的可利用性
本发明的新肽类化合物或其药学上可接受的盐，通过对人或动物给药，诱导GH的分泌，不伴有实质的副作用，作为改善小儿生长促进和成人的GH欠缺引起的代谢机能缺损的药物，以及其抗体在GH欠缺引起的疾病的诊断和作为学术研究领域的研究工具，可达到优秀的作用效果。
序列表
<110>寒川贤治(Kangawa，Kenji)
<120>新的肽(New Peptides)
<130>DS03F216(CN)
<150>JP 11-210002
<151>1999-7-23
<150>JP 11-338841
<151>1999-11-29
<150>JP 2000-126623
<151>2000-4-26
<160>39
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<223>生长激素促分泌素内源肽的核心区的氨基酸序列
<400>1
<210>2
<211>28
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<223>生长激素促分泌素的大鼠内源肽的氨基酸序列
<400>2
Figure C00810440D01442
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<223>生长激素促分泌素的人内源肽的氨基酸序列
<400>3
Figure C00810440D01451
<210>4
<211>117
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<223>生长激素促分泌素的大鼠内源肽的前原形式的氨基酸序列
<400>4
Figure C00810440D01452
<210>5
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<223>生长激素促分泌素的人内源肽的前原形式的氨基酸序列
<400>5
Figure C00810440D01461
<210>6
<211>501
<212>cDNA
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(31)...(381)
<223>编码生长激素促分泌素的大鼠内源肽前原形式的cDNA碱基序列
<400>6
Figure C00810440D01462
Figure C00810440D01471
<210>7
<211>511
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(34)...(384)
<213>智人(Homo sapiens)
<223>编码生长激素促分泌素的人内源肽前原形式的cDNA的碱基序列
<400>7
Figure C00810440D01472
Figure C00810440D01481
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<223>生长激素促分泌素内源肽的核心区的氨基酸序列
<400>8
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<223>生长激素促分泌素内源肽的核心区的氨基酸序列
<400>9
Figure C00810440D01483
Figure C00810440D01491
<210>10
<211>27
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<223>生长激素促分泌素的大鼠内源肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>10
Figure C00810440D01492
<210>11
<211>27
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<223>生长激素促分泌素的人内源肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>11
<210>12
<211>116
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<223>生长激素分泌素的大鼠内源肽(27个氨基酸)前原形式的氨基酸序列
<400>12
Figure C00810440D01494
<210>13
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<223>生长激素促分泌素的人内源肽(27个氨基酸)前原形式的氨基酸序列
<400>13
Figure C00810440D01502
<210>14
<211>498
<212>cDNA
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(31)...(378)
<223>编码生长激素促分泌素的大鼠内源肽(27个氨基酸)前原形式的cDNA碱基序列
<400>14
Figure C00810440D01511
<210>15
<211>508
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(34)...(381)
<213>智人(Homo sapiens)
<223>编码生长激素促分泌素的人内源肽(27个氨基酸)前原形式的cDNA的碱基序列
<400>15
Figure C00810440D01521
Figure C00810440D01531
<210>16
<211>28
<212>PRT
<213>猪(Sus scrofa)
<223>生长激素促分泌素的猪内源肽的氨基酸序列
<400>16
Figure C00810440D01532
<210>17
<211>27
<212>PRT
<213>猪(Sus scrofa)
<223>生长激素促分泌素的猪内源肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>17
Figure C00810440D01533
<210>18
<211>118
<212>PRT
<213>猪(Sus scrofa)
<223>生长激素促分泌素的猪内源肽前原形式的氨基酸序列
<400>18
Figure C00810440D01534
Figure C00810440D01541
<210>19
<211>117
<212>PRT
<213>猪(Sus scrofa)
<223>生长激素促分泌素的猪内源肽(27个氨基酸)前原形式的氨基酸序列
<400>19
Figure C00810440D01542
<210>20
<211>494
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(9)...(362)
<213>猪(Sus scrofa)
<223>编码生长激素促分泌素的猪内源肽的前原形式的cDNA的碱基序列
<400>20
Figure C00810440D01551
<210>21
<211>491
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(9)...(359)
<213>猪(Sus scrofa)
<223>编码生长激素促分泌素的猪内源肽(27个氨基酸)前原形式的cDNA的碱基序列
<400>21
Figure C00810440D01561
<210>22
<211>27
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<223>生长激素促分泌素的牛内源肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>22
Figure C00810440D01571
<210>23
<211>89
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<223>生长激素促分泌素的牛内源肽(27个氨基酸)前原形的部分氨基酸序列
<400>23
<210>24
<211>267
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(267)
<213>牛(Bos taurus)
<223>编码生长激素促分泌素的牛内源肽(27个氨基酸)前原形式的cDNA的碱基序列
<400>24
<210>25
<211>24
<212>PRT
<213>鸡(Gallus domesticus)
<223>生长激素促分泌素的鸡内源肽的氨基酸序列
<400>25
Figure C00810440D01582
<210>26
<211>21
<212>PRT
<213>Anguilla japonica
<220>
<221>酰胺化
<222>21
<223>生长激素促分泌素的鳗内源肽的氨基酸序列
<400>26
Figure C00810440D01591
<210>27
<211>28
<212>PRT
<213>Rana cafesbeiana
<223>生长激素促分泌素的青蛙内源肽的氨基酸序列
<400>27
Figure C00810440D01592
<210>28
<211>27
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus laevis)
<223>生长激素促分泌素的爪蟾内源肽的氨基酸序列
<400>28
Figure C00810440D01593
<210>29
<211>23
<212>PRT
<213>Oncorhynchus mykiss
<220>
<221>酰胺化
<222>23
<223>生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源肽(23个氨基酸)的氨基酸序列
<400>29
<210>30
<211>20
<212>PRT
<213>Oncorhynchus mykiss
<220>
<221>酰胺化
<222>20
<223>生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源肽(20个氨基酸)的氨基酸序列
<400>30
Figure C00810440D01602
<210>31
<211>28
<212>PRT
<213>Canisfamiliaris
<223>生长激素促分泌素的狗内源肽的氨基酸序列
<400>31
Figure C00810440D01603
Figure C00810440D01611
<210>32
<211>108
<212>PRT
<213>Anguilla japonica
<223>生长激素促分泌素的鳗内源肽的前原形式的氨基酸序列
<400>32
<210>33
<211>114
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus laevis)
<223>生长激素促分泌素的爪蟾内源肽的氨基酸序列
<400>33
Figure C00810440D01613
Figure C00810440D01621
<210>34
<211>82
<212>PRT
<213>Oncorhynchus mykiss
<223>生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源肽(23个氨基酸)的前原形式的氨基酸序列
<400>34
Figure C00810440D01622
<210>35
<211>99
<212>PRT
<213>Oncorhynchus mykiss
<223>生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源肽(20个氨基酸)的前原形式的氨基酸序列
<400>35
Figure C00810440D01623
Figure C00810440D01631
<210>36
<211>503
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(66)...(389)
<213>Anguilla japonica
<223>编码生长激素促分泌素的鳗内源肽的前原形式的cDNA的碱基序列
<400>36
Figure C00810440D01632
Figure C00810440D01641
<210>37
<211>484
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(47)...(388)
<213>爪蟾(Xenopus laevis)
<223>编码生长激素促分泌素的爪蟾内源肽的前原形式的cDNA的碱基序列secretagogue
<400>37
Figure C00810440D01642
Figure C00810440D01651
<210>38
<211>462
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(12)...(257)
<213>Oncorhynchus mykiss
<223>编码生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源肽(23个氨基酸)的前原形式的cDNA的碱基序列
<400>38
Figure C00810440D01661
<210>39
<211>453
<212>DNA
<220>
<221>CDS
<222>(12)...(308)
<213>Oncorhynchus mykiss
<223>编码生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源肽(20个氨基酸)的前原形式的cDNA的碱基序列
<400>39
Figure C00810440D01662
Figure C00810440D01671

Claims (60)

1.肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
(a)其中氨基端的第二或第三个氨基酸残基是修饰的氨基酸，其中含有1到35个碳原子的饱和或不饱和烃基链经由酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、脲、硫脲或二硫化物连接和经由或不经由含有1到10个碳原子的亚烷基被引入到氨基酸的α碳原子上，或其中含有1到35个碳原子的饱和或不饱和烃基链被引入到氨基酸的α碳原子上，
(b)其包括一种氨基酸序列，选自SEQ ID NOs：1、2、3、5、8、9、10、11、16、17、22、25、26、27、28、29、30和31中所示的氨基酸序列，或其中有一个至数个氨基酸被缺失、替代和/或添加的氨基酸序列，其中氨基端的第二或第三个氨基酸用该修饰的氨基酸替代，其中在所述氨基酸序列中氨基端第一到第四个氨基酸处，所述的一个到数个氨基酸没有被缺失、替代和/或添加，除了氨基端第二或第三个氨基酸用所述修饰的氨基酸替代，和
(c)其具有提高细胞内钙离子浓度的活性。
2.肽类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
(a)其中氨基端的第二或第三个氨基酸残基是选自下列的修饰的氨基酸：
(i)丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或羟基脯氨酸，其中侧链羟基被转化为下列基团—OCO-Z1，-OCS-Z1或-O-Z3，或
(ii)半胱氨酸，其中侧链巯基被转化为-SCO-Z1，-SCS-Z1，S-Z3或-S-S-Z8，或
(iii)赖氨酸或精氨酸，其中侧链氨基被转化为-NH-CO-Z2，-NH-CS-Z2，-N(Z5)(Z6)，-NH-CO-NH-Z7或-NH-CS-NH-Z7，或
(iv)组氨酸或色氨酸，其中侧链亚氨基被转化为下列通式所示的基团：
Figure C00810440C00032
或
Figure C00810440C00033
其中Z1是氢或含有1到50个碳原子的饱和或不饱和的烃基链，Z2，Z3，Z4，Z5，Z6，Z7和Z8是相同或不同的，并代表H或饱和或不饱和的含有1到10个碳原子的烃基链，
(b)其包括一种氨基酸序列，选自SEQ ID NOs：1、2、3、5、8、9、10、11、16、17、22、25、26、27、28、29、30和31中所示的氨基酸序列，或其中有一个至数个氨基酸被缺失、替代和/或添加的氨基酸序列，其中氨基端的第二或第三个氨基酸用该修饰的氨基酸替代，其中在所述氨基酸序列中氨基端第一到第四个氨基酸处，所述的一个到数个氨基酸没有被缺失、替代和/或添加，除了氨基端第二或第三个氨基酸用所述修饰的氨基酸替代，和
(c)其具有提高细胞内钙离子浓度的活性。
3.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中修饰的氨基酸是
(i)丝氨酸，其侧链羟基被转化为下列基团—OCO-Z1，-OCS-Z1或-O-Z3，或
(ii)半胱氨酸，其侧链巯基被转化为-SCO-Z1，-SCS-Z1，S-Z3或-S-S-Z8，其中Z1是氢或含有1到50个碳原子的饱和或不饱和的烃基链，而Z3和Z8是相同或不同的，并代表H或饱和或不饱和的含有1到10个碳原子的烃基链。
4.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中修饰的氨基酸是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或羟基脯氨酸，其中侧链羟基被转化为基团-OCO-Z1，其中Z1是H或含有1到50个碳原子的饱和或不饱和的烃基链。
5.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中修饰的氨基酸残基中脂肪酸通过酯键结合到侧链羟基或通过硫酯键结合到侧链巯基。
6.权利要求5的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸的碳原子数是2～35。
7.权利要求6的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸是选自含有2、4、6、8、10、12、14、16或18个碳原子的脂肪酸。
8.权利要求7的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸选自辛酸或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸。
9.权利要求7的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中脂肪酸选自癸酸或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸。
10.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，包括一种氨基酸序列，选自SEQ ID NOs：1、2、3、5、8、9、10、11、16、17、22、25、26、27、28、29、30和31中所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列中氨基端第三位的丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基用含有2到35个碳原子的酰基酰化。
11.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，包括SEQ ID NOs：1、2、3、5、8、9、10、11、16、17、22、25、26、27、28、29、30或31中所示的氨基酸序列，或其氨基端第三位的丝氨酸被转化为苏氨酸的氨基酸序列，其中氨基端第三位的丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基用含有2到35个碳原子的酰基酰化。
12.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，包括SEQ ID NOs：3或11中所示的氨基酸序列，其中氨基端第三位的丝氨酸的侧链羟基用辛酰基酰化。
13.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，包括SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列，其中氨基端第三位的丝氨酸的侧链羟基用n-辛酰基酰化。
14.具有提高细胞内钙离子浓度的活性的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中权利要求1到13任一项的肽类化合物的氨基端1到4位氨基酸用下列通式替代：
A—B—C—D—
其中
A—B—是NH2-(CH2)4-CO-，和C是丝氨酸，其羟基被辛酰基或辛基修饰，
D代表苯丙氨酸或甲基苯丙氨酸。
15.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物另外具有诱导分泌生长激素的活性。
16.权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受盐，其包括与羧基末端结合的碱性氨基酸。
17.权利要求1或2任一项的肽类化合物或其药学上可接受盐，其中氨基末端是被具有1个以上碳原子的饱和或不饱和烃基或酰基修饰的，和/或羧基末端处羧基中的OH是OZ或被NR2R3替代，其中Z表示药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基，而R2和R3可相同或不同，表示选自H或低级支链或直链烷基的基团。
18.肽类化合物，包括在权利要求17的肽类化合物的羧基末端酰胺衍生物中导入碱性基团。
19.与权利要求1或2的肽类化合物相对应的抗体。
20.权利要求1或2的肽类化合物的测定方法，其包括利用权利要求21的抗体检测权利要求1或2的肽类化合物。
21.权利要求1或2的肽类化合物的检测用试剂盒，其包括利用权利要求19的抗体检测权利要求1或2的肽类化合物。
22.包含权利要求1或2的肽类化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分的药剂或药物组合物。
23.权利要求22的药物组合物，用于治疗生长激素欠缺或减少引起的疾病。
24.权利要求22的药物组合物，用于治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病。
25.权利要求22的药物组合物，用于治疗心脏病。
26.权利要求22的药剂，其是食欲促进剂。
27.权利要求22的药剂，其是用于治疗胃功能性疾病的治疗剂。
28.权利要求22的药剂，用于保护肠粘膜或防止小肠粘膜在静脉营养中免受损伤。
29.权利要求22的药剂，其是治疗骨质疏松的治疗剂。
30.权利要求22的药剂，用于降低慢性病引起的恶病质。
31.权利要求22的药剂，其是用于治疗肺功能不全的治疗剂。
32.适用于人以外动物的权利要求24至33任一项的药物组合物，药剂或治疗剂。
33.基因治疗用药物组合物，包括的载体含有编码权利要求1或2的肽类化合物的氨基酸序列的DNA。
34.权利要求33的药物组合物，用于治疗起因于生长激素欠缺或减少的疾病。
35.权利要求33的药物组合物，用于治疗非起因于生长激素欠缺或减少的疾病。
36.权利要求33的药物组合物，用于治疗心脏病。
37.权利要求33的药物组合物，用于显现食欲促进作用。
38.权利要求33的药物组合物，用于治疗胃功能性疾病。
39.权利要求33的药物组合物，用于保护肠粘膜或防止小肠粘膜在静脉营养中免受损伤。
40.权利要求33的药物组合物，用于治疗骨质疏松。
41.权利要求33的药物组合物，用于降低慢性病引起的恶病质。
42.权利要求33的药物组合物，用于治疗肺功能不全。
43.DNA，其编码选自SEQ ID NOs：1-3，8-11，16-17，22，和25-31的氨基酸序列，或其中除了氨基端第一至第四个氨基酸位置之外有一个至数个氨基酸被缺失，替代和/或添加的氨基酸序列。
44.含有权利要求43的DNA的载体。
45.含有权利要求44的载体的细胞。
46.使用基因重组技术制备权利要求1或2的肽类化合物的方法，包括将权利要求44所述的载体转化到能够修饰所述肽中至少一个氨基酸的侧链的宿主细胞，然后培养所得的转化细胞，并从培养物中收集权利要求1或2所述的目的肽类化合物。
47.使用基因重组技术制备权利要求1或2的肽类化合物的方法，包括将权利要求44所述的载体转化到宿主细胞，然后培养所得的转化细胞并从培养物采集目的肽类化合物，接着修饰其任意的氨基酸。
48.制备权利要求1或2的肽类化合物的方法，包括将具有修饰的氨基酸且通过化学合成获得的氨基端肽的活化酯结合到通过基因重组方法获得的羧基端肽。
49.使用基因重组技术制备权利要求5的肽类化合物的方法，包括使用细胞，所述细胞具有将脂肪酸通过酯键连接到肽类化合物中氨基酸侧链羟基上或通过硫酯键连接到氨基酸侧链巯基上的活性。
50.权利要求49的方法，包括使用具有可使SEQ ID NO.：8所示的氨基酸序列中的丝氨酸侧链的羟基与脂肪酸形成酯键的丝氨酸酰化活性的细胞。
51.权利要求49的方法，包括使用具有可使SEQ ID NO.：28所示的氨基酸序列中的苏氨酸侧链中的羟基与脂肪酸形成酯键的苏氨酸酰化活性的细胞。
52.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由生长激素缺乏或减少引起的疾病的药物组合物中的应用。
53.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗非生长激素缺乏或减少引起的疾病的药物组合物中的应用。
54.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗心脏病的药物组合物中的应用。
55.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于促进食欲的药物组合物中的应用。
56.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗胃功能性疾病的药物组合物中的应用。
57.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于保护肠粘膜或防止小肠粘膜在静脉营养中免受损伤的药物组合物中的应用。
58.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗骨质疏松的药物组合物中的应用。
59.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于降低慢性病引起的恶病质的药物组合物中的应用。
60.权利要求1-18任一项的肽类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗肺功能不全的药物组合物中的应用。
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