PT1197496E

PT1197496E - Novos péptidos

Info

Publication number: PT1197496E
Application number: PT00946453T
Authority: PT
Inventors: Kenji Kangawa; Masayasu Kojima; Hosoda Hiroshi; Matsuo Hisayuki; Minamitake Yoshiharu
Original assignee: Kenji Kangawa
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2007-08-29
Also published as: EP2119785B1; US9573986B2; BRPI0012688B8; DE60035502D1; AU2006201580B2; IL147652A0; DK1197496T3; IL147652A; US9938332B2; AU2006201580A1; ES2335235T3; EP2119785A1; KR100827973B1; CY1109714T1; ES2288151T3; ES2401939T3; KR20020026543A; EP1795598B1; US7385026B1; US20090170763A1

Description

DESCRIÇÃO "NOVOS PÉPTIDOS"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um novo péptido tendo a acção de aumentar a concentração intracelular de cálcio ou a actividade de indução da secreção da hormona do crescimento, em que é modificado um aminoácido no péptido. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para a obtenção do referido novo péptido e a um método para a produção do mesmo e a um método para a produção do referido péptido ou de um precursor do referido péptido, pela utilização do um gene codificando o referido péptido ou um precursor do referido péptido. Além disso, é aqui descrito um análogo estrutural do novo péptido modificado divulgado na presente invenção, o qual se liga a um receptor para um composto indutor da secreção da hormona do crescimento apresentando, deste modo, a acção de aumentar a concentração intracelular de cálcio ou a actividade de indução da secreção da hormona do crescimento, assim como um método para a produção do mesmo. Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica ou a um promotor do crescimento para animais, compreendendo o referido péptido ou o referido análogo do péptido, sob a forma de um ingrediente activo, assim como um anticorpo contra o referido péptido ou um método de utilização do mesmo. 1 Técnica Anterior A hormona do crescimento (seguidamente, aqui abreviada como GH) é um hormona proteica sintetizada na adeno-hipófise e, indirectamente, promove o crescimento ósseo e a diferenciação de adipócitos e condrócitos e a sua secreção é promovida pela hormona de libertação da hormona do crescimento (GHRH) e inibida pela somatostatina [J. Kendrew, et al., EdS., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., Londres, 1994), p. 4 62] . A GH não tem apenas uma acçâo promotora do crescimento mas, também, acções tais como a promoção da síntese proteica em vários tecidos, o estímulo da transferência de gorduras armazenadas e o aumento do conteúdo em glicogénio dos músculos e uma redução da secreção da GH induz nanismo, enquanto que a sua secreção excessiva induz gigantismo ou acromegalia [Iwanami's Dictionary of Biology, quarta edição, editada por Ryuichi Yasugi, et al. (Iwanami Syoten, Tóquio, 1997), p. 757].

Desde que a GH humana tem sido produzida por engenharia genética, a GH é utilizada não apenas no tratamento do nanismo [J. 0. Jorgensen, Endocr. Rev. 12, 189 (1991)], mas também no tratamento de outras doenças e foram determinados os seus vários efeitos [J. 0. Jorgensen, et al., Horm. Res. 42, 235 (1994)]. Esses efeitos incluem, por exemplo, a activação da reconstituição de osteoblastos e osso nos normais [K. Brixen, et al., Miner. Res. 5, 609 (1990)], aumento da força muscular e quantidade muscular em adultos deficientes em GH [R. C. Cuneo, et al., J. Appl. Physiol. 70, 688 (1991)], melhoria da motilidade em adultos deficientes em GH [R. C. Cuneo, et al., J. Appl. Physiol. 70, 695 (1991)], tratamento de queimaduras graves em crianças [D. N. Herndon, et al., Ann. Surg. 212, 424 (1990)], a sua utilização combinada com gonadotropinas na indução da 2 ovulação [R. Homburg, et al., Clin. Endocrinol. (Oxf). 32, 781 (1990)], prevenção dos distúrbios metabólicos por administração de prednisona [F. F. Horber e M. w. Haymond, J. Clin. Invest. 86, 265 (1990)], promoção da "educação" das célula T em distúrbios imunitários graves [W. J. Murphy, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89, 4481 (1992)] e o efeito de inibição da redução do peso corporal dos idosos e o efeito de aumento de tecidos gordos adiposos e prevenção da atrofia dérmica [D. Rudman et al., N. Engl. J. Med. 323, 1 (1990)]. A administração de GH recombinante é eficaz na promoção do crescimento em crianças e na normalização de defeitos no metabolismo e em funções que acompanham adultos deficientes em GH, mas verificam-se problemas, pois a GH tem efeitos secundários restrictivos da dose, não pode ser administrada oralmente e é dispendiosa [B. A. Lefker, et al., em Growth Hormone Secretagogues in Clinicai Practice, B. B. Bercu e R. F. Walker, Eds. (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1998), pp. 107-108] . Muitos doentes adultos sofrem de efeitos secundários, tais como artralgia e uma síndrome do túnel cárpico considerada como sendo atribuível a uma acumulação de excesso de sódio e de humor, de forma a que a administração da GH não possa ser continuada [E. Corpas, et al., Endocr. Rev. 14, 20 (1993)]. Estes efeitos secundários estão correlacionados com um padrão não-fisiológico de secreção hormonal pela administração de GH e na administração de GH, não podendo a pulsatibilidade da secreção normal da GH ser imitada [B. A. Lefker, et al., em Growth Hormone Secretagogues in Clinicai Practice, B. B. Bercu e R. F. Walker, Eds. (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1998), pp. 107-108]. 3 A pulsatibilidade da secreção da GH in vivo é estabelecida, basicamente, pela interacção entre dois factores de regulação derivados do hipotálamo; ou seja, a GHRH e a somatostatina actuam na glândula pituitária de forma a regular a secreção da GH [G. S. Tannenbaum e N. Ling, Endocrinology 115, 1952 (1984), R. G. Clark e I. C. Robinson, Endocrinology 122, 2675 (1988)]. 0 padrão normal de secreção da GH difere durante o dia e a noite e, durante a noite, é libertada mais frequentemente uma maior quantidade de GH. A amplitude do pulso de libertação da GH é, adicionalmente, regulada por retroalimentação através de várias hormonas esteróides, neurotransmissores, GH e factor de crescimento semelhante à insulina, pelo estado nutritivo, sono e motilidade [J. S. Strobl e M. J. Thomas, Pharmacol. Rev. 46, 1 (1994)] .

Para superar os efeitos secundários causados pela administração de GH, foi sintetizado um grande número de compostos tendo uma acção de indução da secreção da GH e, como o secretagogo da hormona do crescimento (GHS), a correlação da sua actividade estrutural, a sua farmacologia e aplicações clinicas foram amplamente estudadas. Em primeiro lugar, foram sintetizados e desenvolvidos péptidos, tais como o GHRP-6 (Hexapéptido de Libertação da Hormona do Crescimento) , como agentes terapêuticos para o tratamento de distúrbios atribuíveis a deficiência ou redução da GH [C. Y. Bowers, et al., Endocrinology 114, 1537-1545 (1984)]. No entanto, dado que estes compostos peptidicos podem, apenas, demonstrar o seu efeito através da injecção intravenosa, foram desenvolvidos compostos não-peptidicos tendo baixo peso molecular, com capacidade de administração oral [R. G. Smith, et al., Science 260, 1640-1643 (1993)] e alguns destes avançaram para um ensaio clinico de 4 fase II [A. A. Patchett, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92, 7001-7005 (1995)].

Uma série de transferências de informação, desde a recepção de sinal pelo receptor até à expressão funcional, é designada transdução de sinal e o sistema de transdução de sinal ligado à proteina G decorre com o mecanismo seguinte [Iwanami's Dictionary of Biology, quarta edição, ed. por Ryuichi Yasugi, et al., pp. 555-556 (Iwanami Syoten, Tóquio, 1997)]. Este sistema ligado à proteina G tem um receptor com sete domínios transmembranares e é dividido num sistema de AMPc para a produção do AMPc como um segundo mensageiro e no sistema de transdução do ácido inositol-1,4,5-trifosfórico (IP3) e do diacilglicerol (DG), para informação sobre o fosfolípido de inositol. 0 AMPc activa a cinase dependente de AMPc (cinase A), de forma causar a fosforilação dos resíduos de serina e treonina na proteína funcional, para modificar a sua actividade. Por outro lado, ο IP3 liga-se ao receptor do IP3 no retículo endoplasmático, para a promoção da libertação de iões de cálcio, enquanto que o DG activa a cinase C para a promoção da acção de hormonas, etc. 0 mecanismo de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio no sistema de transdução de sinal com IP3 ou DG como segundo mensageiro [J. Kendrew, et al., Eds., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., Londres, 1994), p. 136-137] é como se segue: Quando um ligando se liga ao receptor, a fosfolipase C é activada através da proteína G, para converter PIP2 em IP3. Através do IP3, os iões de cálcio acumulados no retículo endoplasmático (ER), sob a forma de grânulos intracelulares são libertados no citoplasma, aumentando, deste modo, os níveis de iões de cálcio no citoplasma. Se estiverem 5 presentes IP3 ou iões de cálcio no citoplasma, o cálcio é novamente incorporado no retículo endoplasmático, baixando deste modo os níveis de iões de cálcio no citoplasma. Ou seja, a ligação do ligando ao receptor causa um aumento transiente nos níveis dos iões de cálcio no citoplasma.

Uma vez que a GHS actua sinergicamente sobre a secreção da GH e no aumento dos níveis intracelulares de AMPc pela GHRH [K. Cheng, et al., Endocrinology 124, 2791-2798 (1989)] e que a ligação da GHRH ao receptor induz a produção de AMPc como segundo mensageiro, enquanto que a GHS induz um aumento na concentração intracelular de iões de cálcio, foi sugerido que o mecanismo de funcionamento da GHS seja diferente do da GHRH [J. Herrington e B. Hille, Endocrinology 135, 1100-1108 (1994)] e era suposto que a GHS se ligasse a um receptor diferente do receptor da GHRH. De facto, foi clonado um gene de um receptor ao qual a GHS se liga e, a partir do resultado da análise de Northern, foi verificado que o receptor da GHS (GHS-R) é expresso no hipotálamo e na glândula pituitária cerebral e que se verifica uma homologia de 90% ou superior entre as sequências de aminoácidos de receptores da GHS derivados de porco e de humano [A. D. Howard, et al., Science 273, 974-977 (1996)]. No entanto, não foi isolado um ligando endógeno que se ligasse ao GHS-R e este GHS-R era um receptor órfão cujo ligando não era evidente.

Em alguns casos, os ácidos gordos, tais como ácido mirístico, ácido gerânico, ácido palmitoílico ou ácido farnesílico, encontram-se ligados ao terminal amina de uma determinada proteína ou às cadeias laterais dos seus resíduos de aminoácidos e o papel destes ácidos gordos consiste na ancoragem dessas proteínas modificadas com ácidos gordos à membrana 6 celular [J. Kendrew, et al., Ed., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., Londres, 1994), p. 616]. Nessa proteína modificada com ácidos gordos, o ácido gordo liga-se a um resíduo de cisterna, através de uma ligação S-acilo e não são conhecidos, quer aminoácidos tendo um ácido gordo ligado ao resíduo de serina através da ligação O-acilo, tal como a GHS endógena divulgada na presente invenção, quer proteínas ou péptidos contendo esse aminoácido modificado com um ácido gordo. Também não é conhecido que o péptido contendo esse aminoácido modificado com um ácido gordo funcione como um ligando para qualquer receptor.

Divulgação da Invenção

Antes da presente invenção ser descrita detalhadamente, os termos são definidos como se segue: 0 termo "péptido" refere-se a um composto compreendendo vários aminoácidos aí ligados através de ligações peptídicas. Neste caso, o aminoácido (também designado como um resíduo de aminoácido) inclui aminoácidos de ocorrência natural representados pela fórmula: NH2-CH (R' ) -COOH, em que R' é um grupo substituinte de ocorrência natural, assim como os seus isómeros ópticos D, L, etc.

Existe, também, um péptido, em que determinado aminoácido de ocorrência natural é substituído por um aminoácido modificado (também designado como um resíduo de aminoácido modificado). 0 aminoácido modificado inclui os aminoácidos da fórmula acima, em que o grupo substituinte R' é, adicionalmente, modificado, o seus isómeros ópticos D, L e aminoácidos não naturais em que, 7 e. g., vários grupos substituintes são ligados ao grupo substituinte R' da fórmula acima, através ou não de uma ligação éster, éter, tioéster, tioéter, amida, carbamida ou tiocarbamida. 0 aminoácido modificado inclui, também, aminoácidos não naturais, cujos grupos amina estão substituídos por grupos alquilo inferiores.

Os termos "análogo de um péptido" referem-se a um composto em que, pelo menos, um aminoácido num péptido é substituído por um composto não-aminoácido e, deste modo, pelo menos uma ligação entre o referido composto substituinte e o análogo de um péptido não é uma ligação peptídica.

Além disso, os compostos derivados destes péptidos e análogos de péptidos, por modificação do seu terminal amina e/ou terminal carboxilo são designados como derivados. E os péptidos, análogos de péptidos e seus derivados são designados, colectivamente, como "composto do tipo peptídico".

Na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2, uma sequência de aminoácidos do Io ao 4o aminoácidos refere-se a Gly Ser Ser Phe, uma sequência de aminoácidos do 1° ao 5o aminoácidos refere-se a Gly Ser Ser Phe Leu, uma sequência de aminoácidos do 1° ao 6o aminoácidos refere-se a Gly Ser Ser Phe Leu Ser, uma sequência de aminoácidos do 1° ao 7o aminoácidos refere-se a Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro, 8 uma sequência de aminoácidos do 1° ao 8 o aminoácidos refere-se a Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu, uma sequência de aminoácidos do 1° ao 9 o aminoácidos refere-se a Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His, e uma sequência de aminoácidos do 1° ao 10° aminoácidos refere-se a Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin. Tem sido desejada a descoberta de um ligando endógeno (GHS endógena), o qual se ligue ao receptor da GHS, que apresente uma actividade para aumentar a concentração intracelular de iões de cálcio ou para induzir a secreção da GH, em conjunto com um método de utilização da mesma. Além disso, tem sido desejado um composto, o qual seja um análogo estrutural da referida GHS endógena e que tenha uma actividade para aumentar a concentração intracelular de iões de cálcio ou para induzir a secreção da GH. Além disso, tem sido pretendida uma composição farmacêutica ou uma composição para a promoção do crescimento dos animais, a qual compreenda que a referida GHS endógena ou o seu análogo estrutural induzam a secreção pulsátil da GH, eliminando, deste modo, os efeitos secundários da administração da GH, assim como uma aplicação terapêutica, utilizando a referida composição.

Os presentes requerentes concentraram a sua atenção no facto da ligação do ligando ao receptor da GHS (GHS-R) causar um aumento transiente na concentração intracelular de iões de cálcio com o fosfolípido de inositol como segundo mensageiro e estes rastrearam extractos de vários órgãos e tecidos, pela utilização da actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio (actividade de libertação de Ca) como um 9 indicador em células CHO (CHO-GHSR62) expressando GHS-R. Consequentemente, os requerentes verificaram que os extractos de estômago do rato têm uma actividade de libertação de Ca forte e purificaram, com sucesso, uma substância tendo uma actividade de libertação de Ca forte, a partir dos extractos acima, através de vários tipos de cromatografia e verifcaram que a referida substância é um novo péptido modificado com um ácido gordo, tendo um peso molecular de, cerca de 3000. Além disso, estes confirmaram que o referido novo péptido promove a secreção especifica de GH a partir de células da glândula pituitária anterior e determinaram que o referido novo péptido é um ligando endógeno para o GHS-R ou seja, um secretagogo da GH endógena (GHS endógena). Ou seja, o primeiro aspecto da presente invenção é dirigido a um péptido indutor da secreção da GH endógena, tendo a actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio ou a actividade de indução da secreção da GH, em que determinados resíduos de aminoácidos constituintes são modificado com um ácido gordo, assim como um método para a preparação do referido péptido.

Os presentes requerentes analisaram, precisamente, a estrutura do péptido indutor da secreção da GH endógena e verificaram que o referido péptido é um péptido consistindo na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2, em que o grupo hidroxilo da cadeia lateral da 3a serina do terminal Amina foi acilado com um ácido gordo. Além disso, foi também purificado um péptido indutor da secreção da GH derivado de humano, a partir do extracto de estômago humano, tendo uma actividade significativa de libertação de Ca semelhante à do extracto de estômago de rato e este foi analisado para a sua estrutura, da mesma forma que o péptido indutor da secreção da GH derivado de rato e, consequentemente, os requerentes 10 verificaram que o péptido indutor da secreção da GH endógena derivado de humano consiste na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 3, em que o grupo hidroxilo da cadeia lateral da 3 a serina do terminal amina foi acilado com um ácido gordo. A comparação entre as sequências de aminoácidos de péptidos indutores da secreção da GH endógena, derivados de rato e de humano, revelou uma homologia tão elevada quanto 89%, na globalidade.

Especificamente, os péptidos derivados de rato e de humano são idênticos em termos de sequência de aminoácidos, do Io ao 10° aminoácidos, a partir do terminal amina e numa sequência de aminoácidos do 13° ao 28° aminoácidos do terminal amina, mas são diferentes do 11° ao 12° aminoácidos, os quais são lisina e alanina no péptido de rato, os quais são substituídos, respectivamente, por arginina e valina, no péptido humano. O péptido indutor da secreção da GH endógena derivado de rato foi quebrado com várias proteases e foi medida a actividade de libertação de Ca dos seus fragmentos peptídicos purificados e, em consequência disso, o menor péptido tendo actividade de libertação de Ca, foi um péptido consistindo no Io ao 7o aminoácidos do terminal amina.

Os requerentes verificaram, pela medição da actividade de libertação de Ca de péptidos sintetizados quimicamente, que a sequência nuclear, essencial para a promoção da actividade de libertação de Ca, é uma sequência consistindo em 4 aminoácidos, estabelecida na SEQ ID N°: 8. Além disso, a sequência consistindo em 10 aminoácidos, estabelecida na SEQ ID N°: 9, era conservada em péptidos indutores da secreção da GH endógena de não-rato (consistindo, cada um, em 28 aminoácidos) , distintos, de humano, porcino e bovino, assim como em péptidos indutores da 11 secreção da GH endógena (consistindo, cada um, em 27 aminoácidos) em que foi eliminada uma glutamina dos péptidos acima.

Isto é, o segundo aspecto da presente invenção é dirigido a um péptido modificado com um ácido gordo compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 8, de um modo preferido, a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 1 e, de um modo mais preferido, a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 9, como a sequência nuclear, essencial para a promoção da actividade de libertação de Ca.

Foram, também, isolados péptidos indutores da secreção da GH endógena, a partir de galinha, enguia e rã e estes péptidos demonstraram ter uma sequência nuclear consistindo em 4 aminoácidos, estabelecida na SEQ ID N°: 8.

Além disso, foi, também, isolado um péptido indutor da secreção da GH endógena, muito semelhante a um péptido indutor da secreção da GH endógena de rato, a partir de rã.

Além disso, foram, também, isolados péptidos indutores da secreção da GH endógena a partir de Xenopus laevís, truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e cão. A grelina-23, consistindo em 23 aminoácidos e a grelina-20, consistindo em 20 aminoácidos foram isoladas, respectivamente, a partir da truta arco-íris. O aminoácido do terminal carboxilo da grelina da enguia, grelina-23 e grelina-20 da truta arco-íris encontrava-se amidado. 12

Dado que um resíduo de aminoácido na 3a posição do terminal amina no péptido indutor da secreção da GH endógena de Xenopus laevis é treonina, a presente invenção refere-se, também, a um péptido modificado com um ácido gordo, o qual contém, como a sequência nuclear essencial para apresentar actividade de libertação de Ca, um péptido em que o resíduo de aminoácido 3a serina foi substituído por treonina, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 8, de um modo preferido, a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 1 e, de um modo mais preferido, a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 9. 0 péptido endógeno modificado com um ácido gordo tendo actividade indutora da secreção da GH ou o péptido modificado com um ácido gordo, consistindo na referida sequência nuclear, divulgada na presente invenção proporciona, também, uma orientação para concepção de um composto tendo actividade de libertação de Ca.

Ou seja, no terceiro aspecto da presente invenção, é obtido um novo composto tendo actividade de libertação de Ca, pela síntese de um análogo estrutural do referido péptido modificado com um ácido gordo, confirmando a actividade de libertação de Ca do análogo estrutural resultante. Consequentemente, a presente invenção abrange, também, um péptido ou análogo de um péptido, como definido nas reivindicações, tendo a actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio, em que um determinado aminoácido constituinte é substituído por um aminoácido modificado ou por um composto não-aminoácido.

Foi obtido um ADNc codificando o péptido indutor da secreção da GH endógena, de uma forma habitual. Cada um dos ADNc 13 de rato e de humano consiste em 117 aminoácidos, como mostrado nas sequências de aminoácidos das SEQ ID N°: 4 e 5 e as sequências de aminoácidos de péptidos indutores da secreção da GH endógena de rato e de humano eram idênticas numa sequência de 28 aminoácidos, respectivamente, da 24a à 51a posições do terminal amina. Ou seja, foi divulgado que o péptido indutor da secreção da GH endógena é sintetizado sob a forma de um péptido precursor consistindo em 117 aminoácidos, seguidamente, é excisado um péptido sinal consistindo em 23 aminoácidos do terminal amina e são excisado 56 aminoácidos adicionais do terminal carboxilo, pelo que, é formado o péptido modificado com um ácido gordo tendo actividade indutora da secreção da GH. Além disso, foi, também, encontrado em porcinos um ADNc codificando um precursor do péptido indutor da secreção da GH endógena, consistindo em 28 aminoácidos.

Além disso, foi encontrado em porcinos um ADNc codificando um precursor do péptido indutor da secreção da GH endógena, consistindo em 27 aminoácidos.

Além disso, foi encontrado em bovinos um ADNc parcial codificando um precursor do péptido indutor da secreção da GH endógena consistindo em 27 aminoácidos.

Além disso, foi também encontrado em enguia, Xenopus laevis e truta arco-íris, um ADNc codificando um precursor do péptido indutor da secreção da GH endógena. Foram isolados, respectivamente, um ADNc codificando um precursor da grelina-23, consistindo em 23 aminoácidos e um ADNc codificando um precursor da grelina-20, de 20 aminoácidos, a partir da truta arco-íris,. 14

Consequentemente, o quarto aspecto da presente invenção reside num método de produção de um péptido como um material de partida do péptido modificado com um ácido gordo ou análogo de um péptido, tendo actividade de libertação de Ca, o qual compreende a utilização do ADNc codificando um precursor do péptido indutor da secreção da GH endógena.

Na purificação do péptido indutor da secreção da GH endógena (grelina), composto por 28 aminoácidos, proveniente do extracto de estômago de rato, foi analisado um péptido recuperado, sob a forma de uma fracção menor e, em consequência disso, foi encontrado um péptido consistindo em 27 aminoácidos (grelina-27), o qual é um péptido da grelina do qual a 13a ou 14a glutamina foi eliminada. A grelina-27 tem, completamente, a mesma actividade de libertação de Ca e actividade de indução da secreção da GH do que a grelina consistindo em 28 aminoácidos e a grelina-27 é um péptido indutor da secreção da GH endógena e, deste modo, a grelina-27, também, se situa dentro do âmbito da presente invenção. A sequência nucleotídica codificando a 13a e 14a glutamina na grelina é gca gca, a qual é uma sequência terminal de um exão a ser submetida a processamento do ARNm, sugerindo, deste modo, a possibilidade de formação de um ADNc a partir do qual foram eliminados dois codões para resíduos de glutamina por processamento diferente. De facto, foi encontrado um ADNc codificando um péptido precursor da grelina-27, consistindo em 27 aminoácidos, no rastreio bibliotecas de ADNc de rato e de humano.

Ou seja, foi divulgado que o péptido da grelina-27 de rato e humano seja sintetizado, sob a forma de um péptido precursor 15 consistindo em 116 aminoácidos, estabelecido na SEQ ID N°: 12 ou 13, seguidamente, é excisado um péptido sinal, consistindo em 23 aminoácidos do terminal amina e são excisados 56 aminoácidos adicionais do terminal carboxilo, pelo que, é formado um péptido modificado com um ácido gordo, consistindo em 27 aminoácidos, tendo actividade indutora da secreção da GH (grelina-27).

Além disso, foi encontrado um ADNc codificando um precursor do péptido da grelina-27 em porcinos e bovinos e foi confirmada a presença da grelina-27 e do seu precursor nestes animais.

Ou seja, a presente invenção abrange, também, o péptido da grelina-27, como definido nas reivindicações, consistindo numa sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID N°: 10, 11, 17 e 22. É aqui descrito um péptido precursor da grelina-27 tendo uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID N°: 12, 13, 19 e 23 e um ADNc codificando o referido péptido precursor, o qual compreende a sequência nucleotídica estabelecida nas SEQ ID N°: 14, 15, 21 e 24. 0 péptido modificado com um ácido gordo tendo actividade de libertação de Ca e o composto do tipo peptidico, tal como um análogo de um péptido tendo actividade de libertação de Ca, como divulgado na presente invenção, proporciona, também, uma composição farmacêutica no tratamento de doenças atribuíveis a defeito ou diminuição da GH. A referida composição farmacêutica pode ser utilizada no tratamento de qualquer doença contra a qual a administração GH é eficaz e podem ser superados vários efeitos secundários causados pela administração da GH. Além disso, a referida a composição farmacêutica pode, também, ser utilizada como um fármaco para animais tal como um agente promotor do crescimento de animais. 16

Dado que o composto do tipo peptídico da presente invenção tem uma acção promotora do apetite por administração ventricular e administração intravenosa e, deste modo, este pode ser utilizado como um agente promotor do apetite no tratamento da perda do apetite ou sitofobia. Além disso, o presente composto do tipo peptídico tem uma acção promotora da motilidade gástrica e da secreção de ácido gástrico e, deste modo, pode ser, também, utilizado como um agente no tratamento de doenças funcionais do estômago, tais como indigestão não-ulcerosa, atonia gástrica leve súbita, indigestão funcional e refluxo esofágico. Além disso, o presente composto do tipo peptídico apresenta uma acção de promoção do crescimento celular da medula óssea, duodeno e jejuno, por administração intravenosa e, deste modo, pode ser utilizado como um agente de protecção da membrana mucosa no tracto intestinal, um agente para a prevenção de lesões da membrana mucosa no intestino delgado, durante a nutrição intravenosa e um agente para o tratamento da osteoporose. A presente invenção abrange, também, um anticorpo, como definido nas reivindicações, preparado pela utilização do péptido modificado com um ácido gordo tendo actividade de libertação de Ca, divulgado na presente invenção, como um antigénio, um método de medição do péptido indutor da secreção da GH endógena, pela utilização do referido anticorpo e um kit de medição compreendendo o referido anticorpo.

Além disso, a presente invenção abrange um método de ensaio para a separação e quantificação da grelina modificada com um ácido gordo e a grelina a partir da qual o ácido gordo foi eliminado, o qual compreende a utilização de dois anticorpos produzidos contra péptidos do terminal N e carboxilo da grelina, 17 tendo este anticorpo capacidade para reconhecer a 3a serina modificada com um ácido gordo, assim como um kit de ensaio compreendendo uma combinação dos anticorpos contra os péptidos do terminal N e carboxilo da grelina.

Ou seja, a presente invenção proporciona uma nova hormona peptídica, tendo um novo aminoácido modificado, i. e., serina acilada e proporciona, também, uma orientação para uma nova concepção de um composto tendo actividade de libertação de Ca, com a estrutura do referido péptido como uma estrutura base fundamental.

Além disso, a elucidação do mecanismo da indução da secreção da GH pelo péptido modificado com um ácido gordo divulgado na presente invenção ou pela hormona da libertação da GH e somatostatina, parece ser extensível não, apenas, ao mecanismo da indução da secreção da GH mas, também, ao mecanismo de regulação da secreção de outras hormonas. A presente invenção divulga várias funções do péptido modificado com um ácido gordo, como um factor regulador do sistema circulatório e do sistema metabólico e o efeito da presente invenção estende-se à elucidação de um novo mecanismo biológico regulador.

Especificamente, a presente invenção refere-se a: 1) Um composto do tipo peptídico, (a) no qual o segundo ou o terceiro resíduo de aminoácido do terminal amina é um aminoácido modificado, no qual é introduzida uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 35 átomos de carbono, no átomo de carbono α do aminoácido, através de um éster, éter, tioéter, tioéster, amida, carbamida, tiocarbamida ou ligação persulfureto e através ou não de um 18 grupo alquileno contendo 1 a 10 átomos de carbono ou no qual uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 20 átomos de carbono é introduzida no átomo de carbono α do aminoácido, em que H é ligado ao átomo de carbono α do referido aminoácido modificado, (b) o qual compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID N°: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 ou uma sequência de aminoácidos em que, pelo menos, um aminoácido pode ser eliminado, substituído e/ou adicionado, no qual o segundo ou terceiro aminoácido do terminal amina é substituído pelo referido aminoácido modificado, em que o referido, pelo menos, um aminoácido não é eliminado, substituído e/ou adicionado, do primeiro ao quarto aminoácido do terminal amina na referida sequência de aminoácidos, excepto por o aminoácido 2 ou 3 do terminal amina ser substituído pelo referido aminoácido modificado e (c) o qual tem uma actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio em consequência da ligação ao receptor do secretagogo da hormona do crescimento ou a um seu sal farmaceuticamente aceitável; (2) Um composto do tipo peptídico, (a) no qual o segundo ou terceiro resíduo de aminoácido do terminal amina é um aminoácido modificado seleccionado de (i) serina, treonina, tirosina ou oxiprolina, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral é convertido num grupo representado por -OCO-Zi, -OCS-Zi ou -0-Z3 ou (ii) cisteína, na qual o grupo mercapto da cadeia lateral é convertido em -SCO-Ζχ, -SCS-Zi, -S-Z3 ou -S—S—Z8 ou (iii) lisina ou arginina, nas quais o grupo amina 19 da cadeia lateral é convertido em -NH-CO-Z2, -NH-CS-Z2, -N(Z5)(Z6), -NH-CO-NH-Z- ou -NH-CS-NH-Z7 ou (iv) histidina ou triptofano, nas quais o grupo imina da cadeia lateral é convertida num grupo representado pela fórmula:

em que Zi é hidrogénio ou uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 50 átomos de carbono, Z2, Z41 Z6, Z7 e Z8 são iguais ou diferentes e representam H ou uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 10 átomos de carbono, Z3 representa uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 10 átomos de carbono, Z5 representa uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 10 átomos de carbono, (b) o qual compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID N°: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 ou uma sequência de aminoácidos em que, pelo menos, um aminoácido pode ser eliminado, substituído e/ou adicionado, na qual o segundo ou terceiro aminoácido do terminal amina é substituído pelo referido aminoácido modificado, em que o referido, pelo menos, um aminoácido não é eliminado, substituído e/ou adicionado entre o primeiro ao quarto aminoácido do terminal amina, na referida sequência 20 de aminoácidos, excepto por o aminoácido 2 ou 3 do terminal amina ser substituído pelo referido aminoácido modificado e (c) o qual tem uma actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio, em consequência da ligação ao receptor do secretagogo da hormona do crescimento ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (3) 0 composto do tipo peptídico de acordo com o item (1) ou (2), em que o aminoácido modificado é (i) serina, cujo grupo hidroxilo da cadeia lateral é convertido num grupo representado por -OCO-Zi, -OCS-Zi ou -O-Z3 ou (ii) cisteína cujo grupo mercapto da cadeia lateral é convertido em -SCO-Zi, -SCS-Zi, -S-Z3 ou -S-S-Z8, em que Zi, Z3 e Z8 têm o mesmo significado que o definido no item (2); (4) Um composto do tipo peptídico de acordo com o item (1) ou (2), em que o aminoácido modificado é serina, treonina, tirosina ou oxiprolina, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral é convertido num grupo representado por -OCO-Zi-, em que Zi, é H ou uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 50 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (5) O composto do tipo peptídico de acordo com o item (1) ou (2), em que o aminoácido modificado é um resíduo de aminoácido no qual é ligado um ácido gordo ao grupo hidroxilo da cadeia lateral, através de uma ligação éster ou ao grupo mercapto da cadeia lateral, através de uma ligação tioéster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; 21 (6) 0 composto do tipo peptídico de acordo com o item (5), em que o ácido gordo contém 2 a 35 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (7) 0 composto do tipo peptídico de acordo com o item (6), em que o ácido gordo é seleccionado de ácidos gordos contendo 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (8) O composto do tipo peptídico de acordo com o item (7), em que o ácido gordo é seleccionado de ácido octanóico, um seu ácido gordo monoeno e um seu ácido gordo polieno ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (9) O composto do tipo peptídico de acordo com o item (7), em que o ácido gordo é seleccionado de ácido decanóico, um seu ácido gordo monoeno e um seu ácido gordo polieno ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (10) Um composto do tipo peptídico de acordo com o item (1), o qual compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID N°: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 e 30, nas quais o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina ou da treonina na terceira posição a partir do terminal amina na referida sequência de aminoácidos se encontra acilado com um grupo acilo contendo 2 a 35 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (11) Um composto do tipo peptídico de acordo com o item (1), o qual compreende uma sequência de aminoácidos 22 estabelecida nas SEQ ID N°: 1, 8 ou 9 ou uma sequência de aminoácidos, na qual a serina na terceira posição do terminal amina na referida sequência de aminoácidos é convertida em treonina, na qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina ou da treonina na terceira posição do terminal amina é acilada com um grupo acilo contendo 2 a 35 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (12) Um composto do tipo peptidico de acordo com o item (1), o qual compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID N°: 3 ou 11, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina na terceira posição do terminal amina é acilada com octanoilo ou com um seu sal farmaceuticamente aceitável; (13) Um composto do tipo peptidico de acordo com o item (1), o qual compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 3, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina na terceira posição do terminal amina é acilada com n-octanoilo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (14) Um composto do tipo peptidico de acordo com o item (1), em que o composto tem, adicionalmente, uma actividade de indução da secreção da hormona do crescimento; (15) Um composto do tipo peptidico de acordo com qualquer dos itens (1) a (14), o qual compreende um aminoácido básico ligado ao terminal carboxilo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; 23 (16) 0 composto do tipo peptídico de acordo com qualquer itens (1) a (15), em que o terminal amina é modificado com um grupo alquilo ou acilo, saturado ou não saturado, contendo um ou mais átomos de carbono e/ou o grupo hidroxilo do grupo carboxilo do terminal carboxilo é OZ ou é substituído por NR2R3, em que Z é um catião farmaceuticamente aceitável ou um grupo alquilo inferior, linear ou ramificado e R2 e R3 são iguais ou diferentes e representam H ou um grupo alquilo inferior, linear ou ramificado ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (17) Um anticorpo contra um composto do tipo peptídico descrito nos itens (1) a (16) , o qual reconhece, especificamente, o péptido parcial do terminal amina que tem o aminoácido modificado, como definido em qualquer dos itens (1) a (16), em que o referido péptido parcial do terminal amina é um péptido parcial do terminal amina do composto do tipo peptídico descrito nos itens (1) a (16); (18) Um método de ensaio de um composto do tipo peptídico descrito nos itens (1) a (16) , o qual compreende a utilização do anticorpo descrito no item 17, para a detecção do composto do tipo peptídico descrito nos itens (D a (16); (19) Um kit para a detecção de um composto do tipo peptídico descrito nos itens (1) a (16), o qual compreende a utilização do anticorpo descrito no item (17) para a detecção do composto do tipo peptídico descrito nos itens (D a (16); 24 (20) Um agente ou uma composição farmacêutica, a qual compreende um composto do tipo peptidico descrito nos itens (1) a (16) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável como um ingrediente activo; (21) Uma composição farmacêutica de acordo com o item (20) para o tratamento de doenças atribuíveis a um defeito ou uma diminuição na hormona do crescimento; (22) Uma composição farmacêutica de acordo com o item (20) para o tratamento de doenças cardíacas; (23) Um agente de acordo com o item (20) , o qual é um agente promotor do apetite; (24) Um agente de acordo com o item (20), o qual é um agente terapêutico para o tratamento de doenças funcionais do estômago; (25) Um agente de acordo com o item (20) para proteger a túnica mucosa do intestino, para a prevenção de lesões da mucosa do intestino delgado, durante a nutrição intravenosa; (26) Um agente de acordo com o item (20) , o qual é um agente terapêutico para o tratamento da osteoporose; (27) Um agente de acordo com o item (20) para a redução da cachexia causada por doenças crónicas; 25 (28) Um agente de acordo com o item (20) , o qual é um agente terapêutico para o tratamento da insuficiência pulmonar; (29) Uma composição farmacêutica, agente ou agente terapêutico, de acordo com qualquer dos itens (20) a (28), os quais se destinam à aplicação a animais para além dos seres humanos; (30) Um método para produção de um composto do tipo peptidico descrito nos itens (1) a (16), o qual compreende a ligação de um éster activado do péptido do terminal amina, o qual é obtido por síntese química, a um péptido do terminal carboxilo, o qual é obtido pela tecnologia de recombinação genética; (31) Um método para produção de um composto do tipo peptidico descrito nos itens (5)-(14) pela tecnologia de recombinação genética, o qual compreende utilização de células tendo actividade de acilação da serina, por ligação de ácido octanóico a um grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 8, através de uma ligação éster.

Na presente invenção, o aminoácido abrange qualquer aminoácido, tais como L-aminoácido, D-aminoácido, a-aminoácido, β-aminoácido, γ-aminoácido, aminoácido natural e aminoácido sintético ou semelhantes.

Na presente invenção, o aminoácido modificado refere-se a um aminoácido em que um seu grupo arbitrário é quimicamente modificado. Em particular, é preferido um aminoácido modificado, 26 modificado quimicamente no átomo de carbono α de um α-aminoácido. Ou seja, quando o α-aminoácido é representado pela fórmula (1) : R' i

H2N-C-COOH R' e R" no aminoácido quimicamente modificado podem ser H ou um grupo como definido nas reivindincações; em resumo, o aminoácido modificado pode ser qualquer aminoácido natural quimicamente modificado. Quer R', quer R" são H.

Um aminoácido em que o grupo substituinte representado por R' e R", um grupo substituinte presente no aminoácido natural, é substituído por um grupo substituinte não presente no aminoácido natural ou no seu D-aminoácido correspondente, é designado como aminoácido modificado.

Quando o aminoácido de ocorrência natural contém, e. g., OH, -SH, -NH ou -NH2 como um grupo substituinte numa sua cadeia lateral, um grupo formado por acilação desse grupo substituinte é referido como um exemplo preferido do grupo substituinte referido acima. 0 grupo acilo, para esse fim, inclui, e. g., grupos formados pela remoção de um grupo hidroxilo de um ácido carboxílico orgânico, ácido sulfónico orgânico e ácido fosfórico orgânico. 27 0 ácido carboxílico orgânico inclui, e. g., ácidos gordos e o seu número de átomos de carbono é, de um modo preferido, 2 a 35, de um modo mais preferido, 6 a 18 e, de um modo muito preferido, 8 a 16. Esses ácidos gordos incluem, e. g., ácido octanóico (de um modo preferido, ácido caprilico), ácido decanóico (de um modo preferido, ácido cáprico) e ácido dodecanóico (de um modo preferido, ácido láurico), assim como seus ácidos gordos de monoeno ou polieno.

No ácido sulfónico orgânico ou no ácido fosfórico orgânico, o seu número de átomos de carbono é, de um modo preferido, de 2 a 35.

Além disso, o aminoácido modificado pode ser um aminoácido em que o grupo representado por R' e/ou R" é substituído, por exemplo, por:

-(CH2)n-P-Q (em que n é um número inteiro de 0 a 10, P é -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -CS-S-, -S-CO-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO- ou -CO-NH-CO-, Q é H ou Ci-35, de um modo preferido, C1-20, alquilo) . Além disso, P pode ser -CO-.

Além disso, P pode ser -S-S- ou -NH-CS-. Em cada -NH-descrito acima, H pode ser substituído por um grupo alquilo C1-35 saturado ou não saturado, um grupo arilo C6-2o ou um grupo aralquilo C7-i3.

No caso em que o α-aminoácido é representado pela fórmula (1) acima, o aminoácido modificado, em que R' ou R" é substituído pelo grupo acima - (CH2) n-P-Q, é uma forma de 28 realização preferida. Em particular, o referido aminoácido modificado é, de um modo preferido, serina modificada, em que um grupo substituinte representado pela fórmula acima -(CH2)n-P_Q é ligado ao carbono α da serina, como mostrado na fórmula:

(CH2 )n -p-Q

H2N-Ç-COOH

H em que η, P e Q têm os mesmos significados, como definido acima. É descrito, mais detalhadamente, o modo da ligação, seleccionado do grupo consistindo em éster, éter, tioéster, tioéter, amida e carbamida, através ou não de um grupo alquilo, contendo um ou mais átomos de carbono.

Por exemplo, se o aminoácido é serina, treonina, tirosina ou oxiprolina, o aminoácido tem um grupo hidroxilo na cadeia lateral. Se o aminoácido para cisteina, o aminoácido tem um grupo mercapto na cadeia lateral. Se o aminoácido é lisina, arginina, histidina, triptofano, prolina ou oxiprolina, este tem um grupo amina ou um grupo imino na cadeia lateral. 0 grupo hidroxilo, o grupo mercapto, o grupo amina e o grupo imino descritos acima podem ter sido quimicamente modificados. Ou seja, o grupo hidroxilo ou o grupo mercapto podem ter sido eterificados, esterificados, tioeterificados ou tioesterifiçados. 0 grupo imino pode ter sido iminoeterificado, 29 iminotioeterifiçado ou alquilado. 0 grupo amina pode ter sido amidado, tioamidado ou carbamidado.

Além disso, o grupo mercapto pode ter sido persulfatado, o grupo imino pode ter sido amidado ou tioamidado e o grupo amina pode ter sido alquilado ou tiocarbamidado.

Deste modo, o grupo hidroxilo ou o grupo mercapto, modificados quimicamente, podem ser representados, por exemplo, por:

O

II O-C—Zi s

0 II

—S—C—Z s —0~C—Zj » ou

1 z 0 grupo amina ou o grupo imino, amidado ou tioamidado, podem ser representados por: 30

OU οιι•NH-C— ζ 2 \ -NH-C—Zj % I oI ιι“N—C—Z2 . —N —C“Z0 O grupo hidroxilo ou o grupo mercapto eterificado pode ser representado por: -0-Z3, ou -S-Z3 0 grupo imina iminoeterifiçado ou iminotioeterifiçado pode ser representado por:

O —N—C-O—Z„ 31 ou

S

II —N—C-O—Z4 0 grupo amina alquilado pode ser representado por:

—N /\ z5z, 0 grupo imina alquilado pode ser representado por: — n—z6 0 grupo imina carbamidado ou tiocarbamidado pode ser representados por: ? —NH—C-NH ~Z1 ou Í —NH—C-NH ~~Ζη 0 grupo mercapto persulfatado pode ser representado por: -s-s-z8 32

Nas fórmulas acima, Zi, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7 e Z8 podem ser quaisquer qrupos substituintes para modificação química, desde que estes não estejam contra o espírito da presente invenção, mas, dado que os grupos substituintes utilizados convencionalmente no campo farmacêutico ou na modificação química de péptidos são bem conhecidos nas literaturas de patentes ou nas literaturas científicas, esses grupos substituintes conhecidos para a modificação podem ser utilizados e, de acordo com esses métodos conhecidos, pode ser realizada a modificação química na presente invenção.

Nas formulas acima, Zi pode ser um átomo de hidrogénio ou uma cadeia linear, grupo alquilo ramificado ou cíclico e esse grupo alquilo pode ser saturado ou não saturado. 0 seu número de átomos de carbono é, normalmente, C1-50, de um modo preferido, Cg-20· Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7 ou Z8 podem ser um átomo de hidrogénio ou uma cadeia linear, ramificada ou um grupo alquilo cíclico e esse grupo alquilo pode ser saturado ou não saturado. 0 seu número de átomos de carbono é, normalmente, C1-10, de um modo preferido, Ci-6.

Os grupos de alquilo representados por Zi, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7 ou Z8 podem ser substituídos com grupos substituintes, tais como grupo hidroxilo, grupo amina, halogéneo, grupo nitro e grupo alcoxilo C1-3, os quais são utilizados convencionalmente para a modificação química de péptidos.

No acima, se Zi-CO- é um resíduo do ácido gordo Zi-COOH este é um exemplo do aminoácido ao qual um ácido gordo estava ligado. Neste caso, o ácido gordo inclui, e. g., um ácido gordo 33 saturado, tais como ácido caprilico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido butirico, ácido capróico, ácido undecilico, ácido palmitico, ácido decanóico, ácido nonadecanóico, ácido beénico, ácido montânico e ácido lacérico e ácido gordo não saturado, tais como ácido acrílico, ácido oleico, ácido linólico, ácido linolénico e ácido aatearólico. 0 ácido gordo não saturado pode ser um monoeno ou um polieno.

Além disso, o aminoácido modificado pode ser, também, um α-aminoácido formado pela substituição de um grupo (excluindo um grupo carboxilo e um grupo amina constituindo uma ligação peptídica) ligado ao átomo de carbono α do α-aminoácido por um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, saturado ou não saturado.

Na presente invenção, o aminoácido modificado pode ser, também, um aminoácido formado pela introdução de um grupo alquilo Ci~6 saturado ou não saturado no grupo amina do aminoácido. 0 aminoácido não natural na presente invenção é o que têm um grupo amina e um grupo carboxilo em ambos os terminais da molécula e inclui, e. g., NH2- (CH2) 3CH (CH2OH) -COOH, NH2- (CH2)4-COOH, NH2-C(CH3)2-(CH2)3-COOH e NH2-CH (CH3) - (CH2) 2-CH (CH3) -COOH. 0 comprimento da sua cadeia molecular corresponde ao comprimento de um dipéptido, mas 0 aminoácido não natural na presente invenção inclui, também, os que têm o comprimento de um péptido.

Além disso, o composto não-aminoácido na presente invenção inclui, e. g., NH2-CH (CH2OH) -CH3, CH3-CH (R) -COOH, CH3-CH (R) -CH3, em que o comprimento da sua molécula corresponde ao comprimento 34 de um péptido ou NH2- (CH2) 3CH (CH2OH) -CH3 e NH2- (CH2) 3CH (R) -CH3, em que o comprimento da sua molécula corresponde ao comprimento de um dipéptido.

Aqui, R representa um grupo substituinte de uma cadeia lateral do aminoácido natural ou no carbono α no aminoácido modificado, acima referido.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 mostra a purificação da grelina a partir do extracto de estômago de rato e a modificação da intensidade da fluorescência, por aumento da concentração intracelular de iões de cálcio em células CHO-GHSR62, é mostrada pela barra preta. A Fig. la mostra um perfil de filtração em gel em Sephadex G-50 (fino) de uma fracção SP-III preparada a partir de 40 g de estômago de rato, para indicar que o peso molecular das fracções activas é de cerca de 3000 Dalton. A Fig. lb é um gráfico que mostra um perfil de HPLC de permuta iónica com CM secundário e as fracções activas foram eluidas nos tempos de retenção de 55 a 56 minutos foram, adicionalmente, purificadas por HPLC de fase reversa. A Fig. 2 mostra que foi identificada a modificação da grelina com n-octanoilo. A Fig. 2a mostra o resultado da análise de 2 pg de cada uma de grelina natural (superior) e grelina sintética e grelina sintética desacilada (inferior) por HPLC de fase reversa. A Fig. 2b é um gráfico mostrando modificações na concentração intracelular de iões de cálcio em células CHO-GHSR62 pela grelina natural (linha sólida), 35 grelina sintética (linha tracejada pequena) e grelina sintética desacilada (linha sólida grossa). A Fig. 3 é um gráfico mostrando a interacção especifica da grelina com células CHO-GHSR62 e foi adicionada grelina no ponto assinalado com uma seta. A Fig. 3a é um gráfico mostrando, respectivamente, modificações na concentração intracelular de iões de cálcio em células CHO-GHSR62 pela grelina, GHRP-6 e GRF (GHRH). A Fig. b é um gráfico mostrando modificações na concentração intracelular de iões de cálcio em células CHO-GHSR62 pela grelina, na presença (o) ou na ausência (·) de [D-Lys-3]-GRP-6 e é, também, mostrada uma modificação na concentração intracelular de iões de cálcio por GRF (GHRH) (triângulo preto). A Fig. 4 mostra as sequências de aminoácidos de precursores da grelina derivada de rato e de humano, assim como o resultado da análise da expressão destes precursores em vários tecidos. A Fig. 4a mostra a comparação entre as sequências de aminoácidos da precursores da grelina derivada de rato e de humano, em que o mesmo aminoácido é sombreado, um péptido sinal é indicado por uma linha tracejada, um local de quebra do péptido sinal é indicado por um triângulo sombreado, um local de quebra no lado do terminal carboxilo é indicado por um triângulo, uma parte grelina amadurecida encontra-se dentro de uma caixa e uma modificação com ácido n-octanóico é indicada por*. A Fig. 4b mostra o resultado da análise da expressão da grelina por transferência de Northern, numa ampla variedade de tecidos de rato. 36 A Fig. 5 é um gráfico mostrando o efeito da grelina na secreção in vitro e in vivo das hormonas pituitárias. A Fig. 5a é um gráfico mostrando uma alteração na intensidade de fluorescência por alteração da concentração intracelular de iões de cálcio em células cultivadas da glândula pituitária de rato, numa fase inicial, em gue a modificação após a adição da grelina é indicada pela linha sólida e a modificação após a adição da grelina desacilada, é indicada pela linha tracejada. A Fig. 5b é um gráfico mostrando a secreção de hormonas pituitárias, em que a barra preta e a barra branca mostram as concentrações dos niveis de hormona pituitárias, respectivamente, na presença e na ausência da grelina. A Fig. 5c é um gráfico mostrando a evolução ao longo do tempo da concentração da hormona pituitária no plasma, após ter sido injectada intravenosamente grelina a ratos do sexo masculino. Na Fig. 5b e 5c, GH é hormona do crescimento, ACTH é adrenocorticotropina, FSH é hormona estimulante do foliculo, LH é hormona luteinizante, PRL é prolactina e TSH é hormona estimulante da tiróide. A Fig. 6 mostra a promoção do apetite após administração da grelina no ventrículo, em que é mostrada a quantidade de alimento (média ± erro padrão), durante 2 horas após a administração da grelina. A Fig. 6a mostra que a gama de erro para o efeito da grelina é inferior a 0,0001. A Fig. 7 mostra o efeito de um fármaco administrado a um rato sob anestesia uretano, sobre a secreção de ácido gástrico, em que A e B mostram, respectivamente, os resultados da administração da grelina de rato (rGrelina) e histamina. Cada símbolo indica um valor médio de 4 ratos e o erro padrão é mostrado através de uma barra de erro. Foi 37 administrado soro fisiológico como controlo. 0 fármaco foi administrado no ponto assinalado com uma seta. A Fig. 8 é um gráfico mostrando a acção da grelina de rato sobre a motilidade do estômago, num rato sob anestesia com uretano. A Fig. 8A mostra as ondas típicas da motilidade do estômago após a administração de soro fisiológico e grelina de rato (rGrelina) e a Fig. B é um gráfico mostrando um valor médio de 4 ratos, juntamente com o erro padrão. 0 fármaco foi administrado no ponto assinalado com uma seta. A Fig. 9 é um gráfico mostrando uma curva padrão em radioimunoensaios e reactividade cruzada com o anticorpo. A Fig. 9a é um gráfico mostrando a inibição da ligação de grelina de rato, marcada com 125I, a um anticorpo contra um fragmento do terminal amina da grelina, por várias grelinas e a Fig. 9b é um gráfico mostrando a inibição da ligação da grelina de rato marcada, com 125I, a um anticorpo contra um fragmento do terminal carboxilo da grelina, por várias grelinas. A quantidade das várias grelinas/tubo de reacção é mostrada na abscissa, enquanto que a proporção (%) entre a quantidade (B) da grelina de rato ligada na presença de várias grelinas e a sua quantidade (B0) na ausência de várias grelinas é mostrada na ordenada. Os símbolos nos gráficos são como se segue: Grelina de rato (o); grelina humana (·); grelina-27 de rato (□); [Ser3(decanoil)]-grelina de rato (O); [Ser3 (hexanoil) ] -grelina de rato (δ); e grelina de rato sem ácido gordo (▼) . 38

Melhor Forma de Realização da Invenção

Para um péptido que funciona como um ligando endógeno para o receptor da GHS (GHS-R), a distribuição do ligando endógeno em órgãos ou tecidos pode ser conhecida pela adição de um extracto de vários órgãos ou tecidos, a células expressando GHS-R e pela medição da concentração intracelular de iões de cálcio.

As células expressando GHS-R incluem estirpes derivadas do hipotálamo e da glândula pituitária, conhecidas por expressarem GHS-R constantemente e os seus tecidos, mas as células são, de um modo preferido, células transformadas tendo um gene da GHS-R introduzido em células adequadas, tais como células CHO e expressando o gene. A forte actividade de libertação de Ca do péptido da GHS endógena da presente invenção foi detectada, não no hipotálamo e na glândula pituitária expressando o péptido, mas num extracto do estômago, como um orgão no sistema de orgãos digestivos. É, consequentemente, necessário examinar não apenas os tecidos e os órgãos expressando o referido receptor mas, também, uma ampla variedade de outros tecidos e órgãos, de forma a encontrar o ligando endógeno pretendido para o receptor órfão. A concentração intracelular de iões de cálcio pode ser medida através de qualquer método conhecido na técnica, de um modo preferido, através de FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices Co, Ltd.), utilizando a alteração da intensidade da fluorescência do Fluo-4 AM (Molecular Probe Co, Ltd.), causada por uma alteração da concentração de iões de cálcio. 39

Para obter o péptido da GHS endógena pretendido, a partir de tecidos e órgãos confirmados como possuidores de actividade de libertação de Ca, pode ser utilizado qualquer método de purificação conhecido na técnica.

Como o método de purificação do péptido, este é eficaz, utilizado individualmente ou em combinação com filtração em gel, permuta iónica e técnicas cromatográficas de fase reversa, após uma ampla variedade de métodos de fraccionamento ou utilizados separadamente, mas é possível utilizar não, apenas, essas técnicas cromatográficas mas, também, qualquer meio eficaz para a purificação do péptido.

Para isolamento e purificação do péptido a partir dos tecidos e órgãos, é desejável a inactivação das proteases nos tecidos e órgãos, pelo seu tratamento térmico em água em ebulição, para prevenir a degradação do péptido pretendido pela acção das proteases. 0 tratamento térmico e a remoção dos tecidos e órgãos, sob arrefecimento em gelo, são também eficazes para a extracção e purificação do péptido pretendido.

Pode ser utilizado um método conhecido, para confirmar que o péptido purificado tendo a actividade de libertação de Ca tem uma actividade de indução da secreção da GH in vitro e in vivo.

Por exemplo, a GH segregada num meio de cultura de células da glândula pituitária confirmadas como segregando GH e expressando GHS-R, pode ser medida in vitro em radioimunoensaios, pela adição de anticorpo anti-GH às células. A quantidade da referida hormona segregada pode ser, também, medida, pela utilização de um anticorpo contra outra hormona em lugar do anticorpo anti-GH em radioimunoensaios. 40

Além disso, a actividade de indução da secreção da GH in vivo pode ser confirmada pela injecção do péptido tendo a actividade de libertação de Ca, numa veia periférica de um animal e, seguidamente, pela medição da concentração de GH no soro.

Pode ser utilizado um método conhecido, para analisar a estrutura do péptido purificado.

Para determinação da sequência de aminoácidos do péptido, existe um método em que os resíduos de aminoácido são libertados, sequencialmente, a partir do terminal carboxilo, por degradação de Edman, seguida pela identificação dos aminoácidos libertados por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC), assim como por uma sua versão automatizada através de um sequenciador de aminoácidos.

Existe, também, um método para determinação da sua sequência de aminoácidos pela medição dos pesos moleculares dos seus fragmentos ionizados por GC-MASS.

Para o péptido contendo aminoácidos modificados, num aspecto da presente invenção, o aminoácido modificado é identificado como "aminoácido desconhecido" após a determinação da sequência de aminoácidos.

Neste caso, o péptido modificado é decomposto em unidades de aminoácido a partir das quais o aminoácido modificado é separado e purificado e a estrutura do aminoácido modificado é determinada de uma forma normal para determinação da estrutura do composto, através da qual pode ser conhecida a estrutura 41 completa do péptido. Alternativamente, existe um método em que o péptido é obtido a partir de um ADNc codificando o péptido modificado, seguidamente, é sintetizado quimicamente um péptido tendo a sequência de aminoácidos do péptido, resultante, e o peso molecular e as propriedades físicas do péptido não modificado sintético são comparadas com as do péptido modificado, de forma estimar a estrutura do grupo modificado. É revelada uma sequência de aminoácidos parcial (sequência nuclear), a qual, no péptido, deste modo, estruturalmente determinado, é essencial para a actividade de libertação de Ca, pela medição da actividade de libertação de Ca de cada fragmento peptídico formado, pela quebra do referido péptido com uma protease. A protease utilizada deverá ser uma protease altamente específica para a sequência de aminoácidos do péptido a ser quebrado, mas pode ser, também, utilizada uma protease de baixa especificidade, sob condições de digestão parcial, para preparar vários fragmentos peptídicos a partir do referido péptido.

Pode ser determinada uma sequência nuclear, essencial para a actividade de libertação de Ca, pela medição da actividade de libertação de Ca de cada fragmento peptídico preparado deste modo.

No péptido indutor da secreção da GH endógena, a 3a serina do terminal amina foi acilada com um ácido gordo e é, também, possível ser sintetizado, quimicamente, um fragmento peptídico tendo uma parte da sequência de aminoácidos do péptido indutor da secreção da GH endógena, assim como um péptido modificado com um ácido gordo compreendendo um ácido gordo ligado através de 42 uma ligação éster à cadeia lateral da serina no referido fragmento peptídico. 0 péptido indutor da secreção da GH endógena pode ser analisado, detalhadamente, utilizando o referido fragmento peptídico. Simultaneamente, o tipo de ácido gordo necessário para a actividade de libertação de Ca pode ser determinado pela comparação dos fragmentos peptídicos modificados com vários ácidos gordos.

Por exemplo, no péptido indutor da secreção da GH endógena derivado de algumas espécies de Xenopus laevis, o resíduo de aminoácido na 3a posição do terminal amina não é serina mas treonina e essa treonina foi acilada com um ácido gordo e este composto do tipo peptídico pode ser, também, sintetizado e o referido composto pode ser analisado detalhadamente.

Pela comparação das sequências de aminoácidos dos péptidos que têm uma actividade de indução da secreção da GH em vertebrados, pode ser determinada uma região amplamente conservada em vertebrados e, a partir da sequência de aminoácidos da referida região, pode ser determinada uma sequência nuclear, essencial para a actividade de indução da secreção da GH. É sintetizado quimicamente um ADN tendo uma sequência nucleotídica deduzida a partir da sequência de aminoácidos do péptido indutor da secreção da GH endógena e este ADN é utilizado como uma sonda no rastreio de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de ARNm de células expressando o referido péptido, pelo que, pode ser obtido um ADNc codificando o referido péptido. 43

No entanto, um codão correspondente a um aminoácido é degenerado, aumentando, deste modo, o número de sequências nucleotídicas deduzidas a partir da sequência de aminoácidos do péptido, de modo que o rastreio, utilizando um determinado ADN sintético consistindo em vários tipos dessas sequências nucleotídicas como uma sonda, pode ser difícil.

Neste caso, se uma sequência de acordo com a sequência de aminoácidos do referido péptido estiver presente em sequências de aminoácidos deduzidas a partir da sequência nucleotídica de uma marcação de sequência expressa (EST) divulgada numa base de dados de sequências, pode ser sintetizado um ADN consistindo numa parte da sequência nucleotídica do EST e utilizado para rastrear a biblioteca de ADNc acima.

Além disso, pode ser obtido um ADN genómico, de uma forma normal, a partir do ADNc. A sequência de aminoácidos de um polipéptido precursor do péptido indutor da secreção da GH endógena é revelada a partir da sequência nucleotídica de ADNc, deste modo, obtido.

Pela análise da referida sequência de aminoácidos, são revelados um péptido sinal, o péptido indutor da secreção da GH endógena, outras partes de péptido e os locais de quebra destes péptidos, revelando, deste modo, o mecanismo de formação do péptido indutor da secreção da GH endógena.

Na Divulgação do Pedido Internacional WO 98/42840 são divulgados outros aspectos da presente invenção, ou seja, uma sequência de aminoácidos parcial do péptido indutor da secreção 44 da GH endógena, a sequência de aminoácidos de um polipéptido precursor do referido péptido e a sequência nucleotidica de um ADN codificando o referido polipéptido, mas o péptido ai divulgado é um péptido consistindo em 14 aminoácidos tendo uma actividade semelhante à motilina e não existe ai qualquer descrição da actividade de aumento da concentração de Ca e da actividade de indução da secreção da GH, divulgada na presente invenção. 0 composto do tipo peptidico da presente invenção refere-se a um péptido tendo a actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio, a qual é representada pela fórmula (2) abaixo, em que, pelo menos, um aminoácido é substituído por um aminoácido modificado; um seu análogo peptidico, em que, pelo menos, um aminoácido é substituído por um não-aminoácido; e um seu derivado peptidico em que o terminal amina e/ou o terminal carboxilo são modificados.

Na presente invenção, o péptido, o análogo do péptido e o derivado peptidico descritos acima são designados, colectivamente, como o composto do tipo peptidico.

No composto do tipo peptidico, vários aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos modificados e/ou não-aminoácidos. Na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2, é preferido, na presente invenção, que, normalmente, um ou mais aminoácidos do Io ao 10° aminoácidos do terminal amina, de um modo preferido, o Io ao 4o aminoácidos ou o Io ao 5o aminoácidos do terminal amina, são substituídos por aminoácidos modificados e/ou não-aminoácidos. É, particularmente, preferido que o Io ao 5o aminoácidos sejam substituídos por aminoácidos modificados e/ou não-aminoácidos. 45

Na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2, podem ser adicionados ou eliminados um ou mais aminoácidos, para além do Io ao 4o aminoácidos, de um modo preferido, o Io ao 6o aminoácidos e, de um modo mais preferido, o Io ao 10° aminoácidos do terminal amina. 0 composto do tipo peptidico da presente invenção é, de um modo preferido, um composto peptidico tendo a actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio e indução da secreção da hormona do crescimento in vivo, em que, pelo menos, um aminoácido é substituído por um aminoácido modificado e/ou um composto não-aminoácido.

Ou seja, o composto do tipo peptidico da presente invenção é um composto do tipo peptidico tendo a actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio e/ou a acção de indução da secreção da hormona do crescimento in vivo, em que um aminoácido na cadeia peptídica é substituído por um aminoácido modificado e/ou um composto não-aminoácido.

Os exemplos do composto incluem os compostos em que, no péptido apresentado na SEQ ID N°: 1, 2 ou 3, se encontra acilado um grupo hidroxilo do aminoácido Ser 3, os compostos em que, no péptido apresentado na SEQ ID N°: 4 ou 5, se encontra acilado um grupo hidroxilo do 25° aminoácido Ser ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Outros exemplos incluem os compostos em que no péptido apresentado na SEQ ID N°: 10, 11, 16 ou 17, se encontra acilado um grupo hidroxilo do aminoácido Ser 3 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 46

Ainda outros exemplos incluem os compostos em que, no péptido apresentado na SEQ ID N°: 22, 25, 26 ou 27, se encontra acilado um grupo hidroxilo do aminoácido Ser 3 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Ainda outros exemplos incluem os compostos em que, no péptido apresentado na SEQ ID N°: 29 ou 30, se encontra acilado um grupo hidroxilo do aminoácido Ser 3 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Ainda outros exemplos incluem os compostos em que, no péptido apresentado na SEQ ID N°: 28, se encontra acilado um grupo hidroxilo do aminoácido Thr 3 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 0 grupo acilo introduzido num grupo hidroxilo por acilação na presente invenção é um grupo formado pela remoção de um grupo hidroxilo de, e. g., um ácido carboxílico orgânico, um ácido sulfónico orgânico ou um ácido fosfórico orgânico. 0 ácido carboxílico orgânico inclui, e. g., ácidos gordos e o seu número de átomos de carbono é, de um modo preferido cerca de 2 a 35, de um modo mais preferido cerca de 6 a 18 e de um modo muito preferido cerca de 8 a 16. Esses ácidos gordos incluem, e. g., ácido octanóico (de um modo preferido, ácido caprílico), ácido decanóico (de um modo preferido, ácido cáprico) e ácido dodecanóico (de um modo preferido, ácido laurílico [sic: ácido láurico]), assim como os seus ácidos gordos monoeno ou polieno. 47

No ácido sulfónico orgânico ou no ácido fosfórico orgânico, o seu número de átomos de carbono é, de um modo preferido cerca de 2 a 35.

Qualquer composto do tipo peptidico ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, incluindo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 1, em que se encontra acilado um grupo hidroxilo da 3a Ser, constituem, também, formas de realização preferidas da presente invenção.

Ou seja, no segundo aspecto da presente invenção, quaisquer compostos do tipo peptidico ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, incluindo péptidos modificados com ácidos gordos, em que se encontra acilado um grupo hidroxilo da 3a Ser, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 8, de um modo preferido, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 1 e, de um modo mais preferido, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 9, constituem, também, formas de realização preferidas da presente invenção.

Além disso, qualquer composto peptidico ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, incluindo péptidos modificados com ácidos gordos, em que se encontra acilado um grupo hidroxilo da Thr 3, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 8, de um modo preferido, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 1 e, de um modo mais preferido, uma sequência de aminoácidos em que, na sequência de aminoácidos estabelecida estabelecida na SEQ ID N°: 9, o resíduo de aminoácido serina na 3a posição a partir do terminal amina é convertido em treonina, constituem, também, formas de realização preferidas da presente invenção. 48

Além disso, uma forma de realização preferido da presente invenção consiste num composto ou sais farmaceuticamente aceitáveis representados pela fórmula (2): X-AA1-AA2-AA3-Y (2) em que X é uma parte correspondente a um átomo de hidrogénio num grupo amina do aminoácido do terminal amina e representa H ou um alquilo saturado ou não saturado ou um grupo acilo contendo um ou mais átomos de carbono; Y é uma parte correspondente a um grupo hidroxilo num grupo carboxilo α do aminoácido do terminal carboxilo e representa OH, OZ ou NR6R7, no qual Z é um catião farmaceuticamente aceitável ou um grupo alquilo linear ou ramificado inferior; e R6 e R7 podem ser iguais ou diferentes e representam H ou um grupo alquilo linear ou ramificado inferior.

Aqui, AA1 representa:

Jn em que n é 1 ou 2, Ri e Ri' podem ser iguais ou diferentes e representarem hidrogénio ou um grupo substituinte, contanto que, quando n é 2, os dois grupos substituintes Ri possam ser iguais ou diferentes; isto aplica-se, também, a Ri' .

Os exemplos do grupo substituinte incluem (1) uma cadeia alquilo saturada ou não saturada, contendo um ou mais átomos de carbono, os quais se ligam num modo da ligação seleccionado do 49 grupo consistindo em éster, éter, tioéster, tioéter, amida e carbamida, através ou não de uma cadeia alquilo contendo um ou mais átomos de carbono, (2) H ou uma cadeia alquilo saturada ou não saturada, contendo um ou mais átomos de carbono e (3) uma cadeia lateral do aminoácido natural.

Além disso, o grupo substituinte pode ser uma cadeia alquilo saturada ou não saturada, contendo um ou mais átomos de carbono, a qual é ligada através de uma ligação persulfureto ou tiocarbamida, através ou não de uma cadeia alquilo contendo um ou mais átomos de carbono. AA2 representa:

em que Ri e Ri' têm os mesmos significados, como definido acima e R2 representa H ou um grupo alquilo saturado ou não saturado contendo 1 a 6 átomos de carbono ou AA2 representa -CH2-CH (Ri)-CH2- ou -CH2-CH (Ri)-C0-, no qual Ri tem o mesmo significado como definido acima. 50 ΑΑ3 representa:

em que m é um número inteiro de 1 ou mais e Ri, Ri' e R2 têm os mesmos significados, como definido acima, contanto que, quando m é um número inteiro de 2 ou mais, os dois grupos substituintes Ri possam ser iguais ou diferentes; isto aplica-se, também, a Ri' e r2. 0 alquilo saturado ou não saturado contendo um ou mais átomos de carbono, que é representado por X, é, de um modo preferido, alquilo Ci-2o, tais como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, n-heptilo, n-hexilo, n-decilo, vinilo, propanilo ou hexenilo. 0 acilo representado por X inclui o acilo de ácido carboxilico Ci-io, tais como formilo, acetilo, propionilo ou benzoilo ou acilo de ácido sulfónico C7-i3, tais como benzenossulfonilo, naftaleno, sulfonilo ou semelhantes. 0 grupo representado por R3 ou Ri' é, de um modo preferido, um grupo representado por, e. g., a fórmula (2): -(CH2)n-P-Q (2) (em que n é um número inteiro de 0 a 10, Pé -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -CS-S-, -S-CO-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO- ou 51 -CO-NH-CO-, Q é H ou alquilo C i 20, representado por X, descrito acima). Além disso, P pode ser, também, -C0-.

Além disso, P pode ser -S-S- ou -NH-CS-. Em cada -NH-descrito acima, H pode ser substituído por um grupo alquilo C1-35 saturado ou não saturado, um grupo arilo C6-2o ou um grupo aralquilo C7-13·

De um modo mais preferido, P é: -C0-0-, -C0-, -0-, -S-, -S-S-, -CO-S-, -CO-NH-, -NH-CO- ou -NH-CS- . 0 grupo representado por Ri ou Ri' pode ser um grupo tendo Q ligado directamente a -((¾)^ não através de P. É preferido que o grupo alquilo inferior representado por Z, R6 ou R7 seja alquilo Ci-6, tais como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, i-butilo, n-pentil ou n-hexilo.

Seguidamente, são descritas as formas de realização preferidas dos compostos peptídicos de acordo com a presente invenção. (1) Formas de realização preferidas de AA1: (A) aminoácidos ou péptidos, tais como Ser, Gly-Ser ou -NH- (CH2) 3CH (CH20H) C0-, em que uma parte de ligação peptídica entre dois resíduos de aminoácido é -(CH2)2- e (B) aminas primárias, por exemplo, -NH- (CH2) 3CH (CH20H) CH2-, em que uma parte de ligação peptídica entre dois aminoácidos é -(CH2)2-; -NH- (CH2) 3CH (Ri) CH2-, em que uma parte de ligação peptídica entre dois aminoácidos é -(CH2)2-, em que R2 tem os mesmos significados, como definido acima; e -NH-CH (CH20H) CH2-. 52

Como (A) aminoácidos ou péptidos, NH2- (CH2) 4-COOH, NH2-C(CH3)2-(CH2)3-COOH e NH2-CH (CH3) - (CH2) 2-CH (CH3)-COOH podem ser, também, exemplificados. (2) Formas de realização preferidas de AA2: (A) aminoácidos, tais como Ser, homoSer, Cys, homoCys, Asp, Glu, Lys, Ala, Vai, Leu, homoLeu, Ile, homolle, ornitina, ácido aminoadipico, metionina, etionina, butionina e S-metilcisteina, entre os quais a Ser é, particularmente, preferida e (B) estruturas para além de resíduos de aminoácido; por exemplo, podem ser referidas -CH2-CH(Ri)-C0-, -CH2-CH(Ri)-CH2-, etc., em que Ri tem os mesmos significados, como definido acima.

Em particular, são preferidos os aminoácidos (a) com uma cadeia lateral hidrofóbica, tais como leucina, valina, norleucina, homoleucina, homoisoleucina, naftilalanina ou os seus análogos, triptofano, fenilalanina, ciclo-hexilalanina, etc. ou os seus N-metilaminoácidos. Além disso, são preferidas os aminoácidos (b) com uma cadeia lateral tendo um grupo funcional com capacidade de modificação com um grupo acilo, grupo alquilo, grupo alquenilo ou grupo aralquilo, tais como serina, homoserina, treonina, cisteína, homocisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido adípico, lisina, ornitina, etc. e os seus N-metilaminoácidos.

Um grupo acilo, grupo alquilo, grupo alquenilo ou grupo aralquilo, etc., estão ligados a cadeias laterais dos aminoácidos (b) através de uma ligação éster, amida, persulfureto, éter, tioéter, tioéster, carbamida ou tiocarbamida. Além disso, podem ser ligados um grupo alquilo ou aralquilo ao carbono α do aminoácido. 53 (3) Formas de realização preferidas de AA3: Aminoácidos ou péptidos, tais como Phe ou um péptido tendo uma sequência de aminoácidos da 4 a Phe à 28a Arg do terminal amina, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2 ou 3 ou péptidos tendo uma sequência de aminoácidos, em que, na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2 ou 3, um aminoácido é eliminado sequencialmente, iniciando no aminoácido do terminal carboxilo até à 5a Leu do terminal amina. Por exemplo, AA3 inclui:

Phe Leu,

Phe Leu Ser,

Phe Leu Ser Pro,

Phe Leu Ser Pro Glu,

Phe Leu Ser Pro Glu His,

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin,

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Arg,

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala,

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin,

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin,

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg, 54

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys : Leu, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys : Leu ( Gin, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys : Leu ( Gin Pro, e 55

Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg.

Obviamente, os aminoácidos exemplificados como AA3 podem ser L-aminoácidos ou D-aminoácidos. Além disso, um a vários aminoácidos (de um modo preferido, até cerca de 1/3 da sequência de aminoácidos), nas sequências de aminoácidos exemplificadas como AA3, podem ser substituídos por unidades de aminoácido não naturais ou unidades de não-aminoácido, por exemplo: -NH-(CH2)3CH(CH2OH)- -NH- (CH2) 3CH (CH2OH) C0- -NH-CH (CH2OH) CH2- -NH- (CH2)3CH(Ri)CH2- -CH2-CH (Ri)-C0-, ou -CH2-CH(Ri)-CH2-em que R2 tem os mesmos significados, como definido acima. Quando AA3 contém vários grupos representados pelas formulas acima e vários grupos representados por R2, estes grupos são iguais ou diferentes.

Além disso, qualquer aminoácido exemplificado como AA3 pode ter grupos substituintes representados por R2, descritos acima. Quando estão presentes vários grupos R2 num grupo representado por AA3, estes grupos R2 podem ser iguais ou diferentes. 56 São apresentados abaixo exemplos preferidos dessas cadeias laterais, quando os aminoácidos que constituem o péptido têm um grupo hidroxilo, grupo mercapto, grupo imina ou grupo amina nas suas cadeias laterais. Nos exemplos seguintes, R8 é um grupo alquilo saturado ou não saturado contendo um ou mais átomos de carbono. Essa cadeia alquilo pode ter os mesmos significados, como definido para a cadeia alquilo descrita acima representada por X. A) Cadeia lateral de Ser; -CH2-0-C0-R8 ou -CH2-0-R8, B) Cadeia lateral de homoSer; -CH2-CH2-0-C0-R8 ou -CH2-CH2-0-R8, C) Cadeia lateral de Cys; -CH2-S-CO-R8 ou -CH2-S-R8, D) Cadeia lateral de homoCys; -CH2-CH2-S-CO-R8 ou -CH2-CH2-S-R8, E) Cadeia lateral de Asp; -CH2-COO-R8 ou -CH2-CO-NH-R8, F) Cadeia lateral de Glu; -CH2-CH2-COO-R8 ou -CH2-CH2-CO-NH-R8 G) Cadeia lateral de Lys; -(CH2) 4-NH-CO-R8, H) Cadeia lateral do ácido aminoadípico; -CH2-CH2-CH2-COO-R8 OU CH2-CH2-CH2-CO-NH-R8, I) Cadeia lateral da ornitina; -(CH2) 3-NH-CO-R8. 57 J) Uma cadeia lateral alquilo num aminoácido, tais como Ala, Vai, Leu, homoleucina, Ile, homoisoleucina, S-metilcisteína, metionina, etionina ou butionina pode ser um grupo alquilo modificado mostrado na fórmula (2), como descrito acima.

Além disso, a presente invenção abrange, como formas de realização preferidas, um agente para aumentar a concentração intracelular de iões de cálcio ou um agente para induzir a secreção da GH, compreendendo um péptido parcial consistindo em aminoácidos do terminal amina até ao 13°, 14° ou 15° aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 ou 3 como definido nas reivindicações. Neste caso, não é sempre necessário que as respectivas unidades de aminoácido que constituem o péptido parcial sejam quimicamente modificadas.

Além disso, uma forma de realização preferida da presente invenção consiste no seguinte composto do tipo peptidico.

Um derivado da grelina, refere-se a um composto do tipo peptidico em que a estrutura quimica da grelina natural é parcialmente modificada e, grelina de cadeia curta, refere-se a um péptido consistindo em menos de 27 ou 28 aminoácidos, o qual é derivado da grelina natural com 27 a 28 aminoácidos, pela eliminação de alguns aminoácidos. Além disso, um residuo de aminoácido na posição n, refere-se a um residuo de aminoácido na posição n em relação ao terminal amina. 0 aminoácido do terminal amina da grelina ou do seu derivado grelina de cadeia curta pode ser qualquer aminoácido (o aminoácido do terminal amina da grelina natural é a glicina) 58 desde que o grupo α-amina do referido aminoácido não esteja protegido ou possa ser um D- ou L-aminoácido, mas é, de um modo preferido, alanina, valina, ácido aminoisobutanóico ou ácido butanóico. 0 2o resíduo pode ser qualquer aminoácido (e. g. serina na grelina natural), de um modo preferido, um aminoácido tendo uma cadeia lateral pequena, tais como alanina, serina, histidina, norvalina ou um composto não-aminoácido. 0 Io e 2o resíduos podem ser um δ-aminoácido correspondendo a dois aminoácidos, por exemplo, ácido 5-aminopentanóico, ácido 5-amino-5-dimetilpentanóico, ácido 2,5-diaminopentanóico, etc., exemplificados nos Exemplos.

Os resíduos de aminoácido seleccionados na 3a e 4a posições podem ser D- ou L-aminoácidos, D- ou L-N-metilaminoácidos ou uma combinação destes aminoácidos. Em particular, é preferido que o aminoácido na 3a posição seja um L-aminoácido ou os aminoácidos, tanto na 3a, como na 4a posições, sejam L-aminoácidos. A configuração estérica dos resíduos de aminoácido seleccionados na 3a e 4a posições pode ser apropriadamente seleccionada, dependendo da sequência de aminoácidos na Ia e 2a posições. Ou seja, ambos os resíduos da 3a e 4a posições são, de um modo preferido, L-aminoácidos, no caso da sequência de aminoácidos Gly-Ser na Ia e 2a posições da grelina natural, enquanto que ambos os resíduos da 3a e 4a posições podem ser D-aminoácidos, no caso de outra sequência de aminoácidos, tal como Aib-His. Além disso, se os resíduos na Ia e 2a posições são um δ-aminoácido (e. g., ácido aminopentanóico) tendo um 59 comprimento de 2 aminoácidos, os resíduos na 3a e 4a posições podem ser L- ou D-aminoácidos.

Os resíduos de aminoácido seleccionados na 3a e 4a posições são, de um modo preferido, D- ou L-aminoácidos, tais como leucina, valina, norleucina, homoleucina, homoisoleucina, naftilalanina e seus homólogos, triptofano, fenilalanina e ciclo-hexilalanina ou seus D- ou L-N-metilaminoácidos .

Os resíduos de aminoácido seleccionados na 3a e 4a posições são, de um modo mais preferido, aminoácidos hidrofóbicos aromáticos, tais como naftilalanina e seus homólogos, triptofano, fenilalanina e ciclo-hexil alanina, de entre os aminoácidos hidrofóbicos descritos acima.

Além disso, os resíduos de aminoácido seleccionados na 3a e 4a posições são, de um modo preferido, aminoácidos básicos, tais como lisina, arginina e histidina. É, especialmente, preferida lisina. A molécula grelina deve ser básica devido a estes aminoácidos básicos melhorando, deste modo, adicionalmente, a actividade de libertação de Ca.

Os resíduos de aminoácido seleccionados na 3a e 4a posições são, de um modo preferido, os que têm grupos funcionais nas suas cadeias laterais, os quais podem ser modificados com um grupo acilo (grupo alcanilo, grupo alcenonilo ou grupo arilalcanilo), um grupo alquilo ou um grupo aralquilo e os exemplos preferidos desses resíduos de aminoácidos incluem serina, homoserina, treonina, cisteína, homocisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido adípico, lisina, ornitina, etc. 60

Os aminoácidos tendo estas cadeias laterais reactivas podem ser D- ou L-aminoácidos ou os seus D- ou L-N-metilaminoácidos correspondentes, mas é, particularmente, preferido que o resíduo da 3a posição seja um L-aminoácido ou que ambos os resíduos da 3a e 4a posições sejam L-aminoácidos.

Além disso, a cadeias laterais destes aminoácidos podem estar ligadas a um grupo acilo, tais como grupo alcanilo (o seu número de átomos de carbono é de 2 a 35, de um modo preferido, 6 a 18, de um modo mais preferido, 8 a 12), um grupo alcenonilo (o seu número de átomos de carbono é de 2 a 35, de um modo preferido, 6 a 18, de um modo mais preferido, 8 a 12) , um grupo arilalcanilo (grupo benzoílo, fenacetilo, fenilbutirilo, naftoílo, naftilacetilo ou naftilpropionilo, etc.), um grupo alquilo (o seu número de átomos de carbono é de 2 a 35, de um modo preferido, 6 a 18, de um modo mais preferido, 8 a 12) ou um grupo aralquilo (grupo benzilo, fenetilo, fenilpropilo, fenilbutilo, fenilpentilo, naftilmetilo, etc.), através de uma ligação carbamato, tiocarbamato, éster, amida, persulfureto, éter, tioéter ou tioéster. Além disso, o alquilo e os grupos aralquilo anteriormente referidos podem ser ligados, sem ser através da ligação aos átomos de carbono α dos aminoácidos na 3a e 4a posições. A combinação dos resíduos de aminoácido seleccionados na 3a e 4a posições é, de um modo preferido, uma combinação de um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, como o resíduo de aminoácido da 3a posição e um aminoácido hidrofóbico, como o resíduo de aminoácido da 4a posição. 61 0 resíduo de aminoácido da 3a posição, tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, é, de um modo preferido, um aminoácido modificado no carbono a, no qual (a) foi introduzida uma cadeia alquilo saturada ou não saturada, contendo um ou mais átomos de carbono, através ou não de um grupo alquileno, contendo um ou mais átomos de carbono e através de uma ligação éster, éter, tioéter, amida ou persulfureto ou (b) foi introduzida uma cadeia alquilo saturada ou não saturada, contendo um ou mais átomos de carbono. Em particular, é mais preferido um aminoácido modificado, em cujo carbono a foi introduzida uma cadeia alquilo saturada, contendo um ou mais átomos de carbono. 0 grupo carboxilo do aminoácido na 4a posição pode ser uma amida, uma alquilamida (e. g. metilamida ou etilamida) ou uma aralquilamida (e. g. benzilamida, adamantanamida ou adamantanalquilamida) .

Além disso, pode ser ligado um grupo básico, tal como um grupo amina ou um grupo guanidida, à alquil ou aralquilamida. 0 grupo básico inclui e. g., -CONH-CH2CH2-NH2, -CONH-CH2NHCH3, -CONH-CH2CH2CH2-NH-C (NH2)=NH, e -CONHCH2Ph-NH2.

Pode ser adicionado um aminoácido básico, tais como arginina, lisina e histidina, ao grupo carboxilo do aminoácido na 4 a posição e este aminoácido básico pode ser um D- ou L-aminoácido, um racemato ou D- ou L-N-metilaminoácido. 0 grupo carboxilo do aminoácido pode ser uma alquil ou aralquilamida, como descrito acima. Além disso, pode ser adicionado um grupo básico, tais como um grupo amina ou um grupo guanidida à alquil ou aralquilamida. 0 grupo básico inclui os exemplificados acima. 62

Como uma sequência de aminoácidos do aminoácido na 5a posição e aminoácidos subsequentes, pode ser adicionada, ao aminoácido na 4a posição, uma sequência de qualquer comprimento, consistindo em leucina na 5a posição e aminoácidos subsequentes, até o aminoácido na 28a posição da grelina humana ou de rato.

Essas sequências de aminoácidos são, de um modo preferido, grelina (1-5), grelina (1-6), grelina (1-7), grelina (1-8), grelina (1-9), grelina (1-10) e grelina (1-11), em que grelina (m-n) se refere a um péptido tendo uma sequência de aminoácidos nas posições mana partir do terminal amina da grelina. Em particular, é preferida a grelina (1-5) . 0 seu terminal carboxilo é, de um modo preferido, uma alquil ou aralquilamida, como descrito acima.

Além disso, pode ser ligado um grupo básico, tal como um grupo amina ou um grupo guanidida à alquil ou aralquilamida. O grupo básico inclui os exemplificados acima.

Além disso, pode ser adicionado um aminoácido básico, tais como arginina, lisina e histidina, ao aminoácido do terminal carboxilo de um derivado de grelina eliminado no terminal carboxilo, em que foi adicionada uma sequência de aminoácidos de qualquer comprimento, consistindo nos aminoácidos do aminoácido na 5a posição até ao aminoácido na 28a posição, ao terminal carboxilo da grelina (1-4).

Este aminoácido básico pode ser um D- ou L-aminoácido, um racemato ou D- ou L-N-metilaminoácido. 63 0 grupo carboxilo do aminoácido básico pode ser uma alquil ou aralquilamida, como descrito acima. Além disso, pode ser ligado um grupo básico, tais como grupo amina ou grupo guanidida, à alquil ou aralquilamida. 0 grupo básico inclui os exemplificados acima.

Numa forma de realização, particularmente, preferida, o aminoácido do terminal carboxilo da grelina (1-5), grelina (1-6) e grelina (1-7) é um D- ou L-aminoácido ou o seu D- ou L-N-metilaminoácido correspondente.

Além disso, podem ser adicionados aminoácidos, básicos, tais como arginina, lisina e histidina, a residuos na 5a, 6a e 7a posição e estes aminoácidos básicos podem ser D- ou L-aminoácidos, racematos ou D- ou L-N-metilaminoácidos. 0 grupo carboxilo desse aminoácido básico pode ser uma alquil ou aralquilamida, como descrito acima. Além disso, pode ser ligado um grupo básico, tais como grupo amina ou grupo guanidida, à alquil ou aralquilamida. 0 grupo básico inclui os exemplificados acima.

Numa forma de realização preferida na presente invenção, no caso em que o terminal carboxilo é uma alquil ou aralquilamida, como descrito acima, o composto peptídico da presente invenção pode ser um derivado amida em que é, adicionalmente, ligado um grupo amina ao grupo alquilo ou aralquilo. Especificamente, pode ser referido um composto peptidico em que o terminal carboxilo é, e. g., aminoetilamida. 0 composto do tipo peptidico da presente invenção em que o terminal carboxilo é uma amida ou um derivado de amida, como 64 descrito acima, é um composto útil, devido à sua resistência à decomposição por enzimas, tais como carboxipeptidases, in vivo.

De um modo semelhante o composto do tipo peptídico da presente invenção, incluindo o N-metilaminoácido é, também, um composto útil, devido à sua resistência a enzimas. 0 composto do tipo peptídico da presente invenção pode ser obtido sob uma forma normal. Por exemplo, este pode ser isolado a partir de uma fonte natural, como acima ou produzido por tecnologia de ADN recombinante e/ou síntese química. Além disso, quando é necessária uma modificação (e. g., acilação) dos resíduos de aminoácido, o composto peptídico pode ser submetido a uma reacção de modificação, por métodos bem conhecidos na técnica.

Especificamente, o composto do tipo peptídico da presente invenção pode ser obtido por cultura de células hospedeiras, transformadas com um vector de expressão contendo um ADN codificando o péptido da presente invenção e, seguidamente, recuperando o péptido pretendido a partir da cultura.

Pode ser obtido um composto, tendo o péptido pretendido modificado por, e. g., acilação nas células, por selecção das células hospedeiras. Quando o referido péptido não é modificado, pode ser realizada uma reacção de modificação, tal como, acilação, de acordo com o necessário, através de métodos bem conhecidos na técnica. Na reacção de acilação, podem ser, também, utilizadas enzimas, tais como lipase. 0 vector no qual o gene deverá ser integrado inclui, e. g., vectores de E. coli (pBR322, pUC18, pUC19, etc.), vectores de 65

Bacillus subtilis (pUBUO, pTP5, pC194, etc.), vectores de levedura (tipo YEp, tipo YRp, tipo YIp) ou vectores de células animais (retrovirus, virus vaccinia, etc.), mas podem ser, também, utilizados quaisquer outros vectores com capacidade de manter o gene pretendido de forma estável, em células hospedeiras. 0 vector é introduzido em células hospedeiras adequadas. Para integrar o gene pretendido num plasmideo e introduzir o plasmideo em células hospedeiras, podem ser utilizados métodos descritos em Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989) .

Para expressar o gene do péptido pretendido no plasmideo acima, é ligado operativamente um promotor, a montante do referido gene. 0 promotor utilizado na presente invenção pode ser qualquer promotor adequado, compatível com células hospedeiras utilizadas para a expressão do gene pretendido. Por exemplo, pode ser utilizado o promotor lac, promotor trp, promotor lpp, promotor ÀPL, promotor recA, etc., no género Escherichia, como células hospedeiras a serem transformadas; pode ser utilizado o promotor SP01, promotor SP02, etc., no género Bacillus; pode ser utilizado o promotor GAP, promotor PH05, promotor ADH, etc., em leveduras; e pode ser utilizado o promotor derivado de SV40, promotor derivado de retrovirus, etc., em células animais. 0 vector contendo o gene pretendido, obtido nesta forma, é utilizado para transformar células hospedeiras. As células hospedeiras incluem microrganismos (por exemplo, o género Escherichia, o género Bacillus, etc.), leveduras (o género

Saccharomyces, o género Pichia, o género Candida, etc.), células animais (células CHO, células COS, etc.), etc. 0 meio de cultura 66 é, de um modo preferido, um meio liquido e, de um modo particularmente preferido, o meio contém uma fonte de carbono, uma fonte de azoto, etc. necessárias para o crescimento das células transformadas a serem cultivadas. Se pretendido, podem ser adicionados vitaminas, promotores de crescimento, soro, etc.

Para produção directa do péptido modificado com um ácido gordo, as células são, de um modo preferido, as que têm a actividade de uma protease de processamento, com capacidade para cortar um local adequado num polipéptido precursor do referido péptido e a actividade de acilação do resíduo de serina no referido péptido. As células hospedeiras tendo essa actividade de processamento de protease e actividade de acilação da serina podem ser obtidas, pela transformação de células hospedeiras com um vector de expressão contendo um ADNc codificando o referido polipéptido precursor e, seguidamente, pela selecção das células transformadas, pela confirmação de se estas produzem o péptido modificado com um ácido gordo, tendo uma actividade de libertação de Ca ou uma actividade de indução da secreção da GH.

Após a cultura, o péptido da presente invenção é separado e purificado a partir da cultura, de uma forma normal. Para a extração do produto pretendido a partir dos microrganismos ou células cultivados, por exemplo, os microrganismos ou células após a cultura são recolhidos e suspensos num tampão contendo uma desnaturante de proteínas (e. g. cloridrato de guanidina) e os microrganismos ou as células são rebentados por sonicação, etc. e, seguidamente, são centrifugadas. Para purificar o produto pretendido a partir do sobrenadante, podem ser apropriadamente combinados métodos de separação e purificação, tais como filtração em gel, ultrafiltração, diálise, SDS-PAGE, várias técnicas cromatográficas, tendo em consideração o peso 67 molecular, solubilidade, carga (ponto isoeléctrico), afinidade, etc., do produto pretendido. 0 composto peptídico da presente invenção pode ser sintetizado quimicamente de uma forma habitual. Por exemplo, aminoácidos tendo grupos protectores são condensados por um método em fase liquida e/ou um método em fase sólida, de forma a estender uma cadeia peptidica, seguidamente, todos os grupos protectores são dai removidos, utilizando um ácido e o produto bruto, resultante, é purificado pelas técnicas de purificação acima, para originar o composto peptídico pretendido. Um resíduo de aminoácido pode ser selectivamente acilado, no local pretendido, por uma acilase ou aciltransferase.

Encontram-se bem estabelecidos vários métodos para a produção de péptidos e o composto do tipo peptídico da presente invenção pode ser, também, facilmente produzido por esses métodos conhecidos. Por exemplo, o composto do tipo peptídico pode ser sintetizado pelo método clássico de síntese peptidica ou pelo método em fase sólida.

Seguidamente, é descrito um processo de produção do composto peptídico da presente invenção, através de uma combinação de tecnologia de ADN recombinante e síntese química, por referência a exemplos.

Os ésteres activos de péptidos do terminal amina, por exemplo, (1) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(RIO)-Osu, (2) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(RIO)-Phe-Osu e (3) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(RIO)-Phe-Leu-Osu, são sintetizados quimicamente e são, seguidamente, ligados a péptidos do terminal carboxilo, produzidos por tecnologia de ADN recombinante ou 68 (4) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR, (5) seja, respectivamente, LSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR e (6) SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR; ou seja, (1) é ligado a (4), (2) a (5) e (3) a (6), pelo que, são obtidos compostos peptidicos, consistindo, cada um, respectivamente, em 28 aminoácidos. Especificamente, XXXXZSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR é expresso em E. coli seguido pela protecção dos seus grupos amina com Boc2(0) para originar

Boc-XXXXZSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc) LQPR. Seguidamente, o péptido, resultante, é convertido em NH2-SPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR, por quebra com uma enzima selectiva para o terminal carboxilo do aminoácido Z. Este composto é misturado com

Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(RIO)-Phe-Leu-Osu numa solução aquosa entre neutra e alcalina débil e o

BocGlySer(Bu)Ser(RIO)FLSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(B oc)LQ PR, resultante, é tratado com ácido trifluoroacético, pelo que, o produto pretendido pode ser obtido. A notação acima de aminoácidos de uma letra está de acordo com uma descrição em Cellular Molecular Biology, 3a edição publicada a 10 de Dezembro de 1997 por Newton Press Co, Ltd.

Além disso, Boc representa t-butiloxicarbonilo, Osu representa um residuo derivado de N-hidroxissuccinimida, pela eliminação de hidrogénio do seu grupo hidroxilo, Bu representa um grupo butilo e RIO representa o grupo substituinte do aminoácido, modificado de acordo com a presente invenção.

Os sais do composto do tipo peptidico da presente invenção são, de um modo preferido, sais farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, sais com bases inorgânicas, sais com 69 bases orgânicas, sais com ácidos inorgânicos, sais com ácidos orgânicos e sais com aminoácidos básicos ou acidicos.

Os exemplos preferidos dos sais com bases inorgânicas incluem sais de metais alcalinos, tais como sais de sódio, sais de potássio, etc.; sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de cálcio, sais de magnésio, etc.; e sais de aluminio, sais de amónio, etc.

Os exemplos preferidos dos sais com bases orgânicas incluem sais com trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclo-hexilamina, N,N'-dibenziletilenodiamina, etc.

Os exemplos preferidos dos sais com ácidos inorgânicos incluem sais com ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc.

Os exemplos preferidos dos sais com ácidos orgânicos incluem sais com ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, etc.

Os exemplos preferidos dos sais com aminoácidos básicos incluem sais com arginina, lisina, ornitina, etc., e os exemplos adequados dos sais com aminoácidos acidicos incluem sais com o ácido aspártico, ácido glutâmico, etc.

Entre estes sais, os sais de sódio e os sais de potássio são os mais preferidos. 70 0 composto do tipo peptídico da presente invenção ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, tem baixa toxicidade e tem uma acção indutora da secreção da GH e estes podem ser administrados como tal ou após misturados com transportadores, excipientes, veiculos intensificadoress, etc., conhecidos, farmaceuticamente aceitáveis, a um mamifero (por exemplo, ser humano, murganho, rato, coelho, cão, gato, bovino, cavalo, porcino, macaco, etc.). No caso da injecção intravenosa num adulto, a dose diária é de 0,01 a 5 mg/kg, de um modo preferido, 0,04 a 1,5 mg/kg. Esta dose é, desejavelmente, administrada uma vez a três vezes cada dia. O composto do tipo peptídico da presente invenção é combinado com veículos farmaceuticamente aceitáveis e pode ser oral ou parentérico, sob a forma de preparações farmacêuticas sólidas, tais como comprimidos, cápsulas, grânulos, pós, etc. ou como preparações farmacêuticas líquidas, tais como xaropes, injecções, etc.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem uma ampla variedade de veículos orgânicos ou inorgânicos que são, normalmente, utilizados como materiais farmacêuticos e estes são combinados como veículos, lubrificantes, ligantes, desintegrantes, em preparações farmacêuticas sólidas ou como solventes, adjuvantes, agentes suspensores, agentes que conferem isotonicidade, tampões e agentes suavizantes, em preparações farmacêuticas líquidas.

De acordo com a necessidade, podem ser, também, utilizados aditivos farmacêuticos, tais como conservantes, antioxidantes, agentes corantes, adoçantes, etc. 71

Os exemplos preferidos dos veículos incluem, e. g., lactose, açúcar branco, D-manitol, amido, celulose cristalina, ácido silícico leve anidro, etc. Os exemplos preferidos dos lubrificantes incluem estearato de magnésio, estearato de cálcio, talco, sílica coloidal, etc. ligantes incluem celulose D-manitol, dextrina, hidroxipropilmetilcelulose,

Os exemplos preferidos dos cristalina, açúcar branco, hidroxipropilcelulose, polivinilpirrolidona, etc.

Os exemplos preferidos dos disintegrantes incluem amido, carboximetilcelulose, carboximetilcelulose de cálcio, croscalomelose de sódio, carboximetilamido de sódio, etc.

Os exemplos preferidos dos solventes incluem água para injecção, álcool, propilenoglicol, macrogol, óleo de sésamo, óleo de milho, etc.

Os exemplos preferidos dos solubilizantes incluem polietilenoglicol, propilenoglicol, D-manitol, benzoato de benzilo, etanol, trisaminometano, colesterol, trietanolamina, carbonato de sódio, citrato de sódio, etc.

Os exemplos preferidos dos agentes de suspensão incluem tensioactivos, tais como estearil trietanolamina, laurilsulfato de sódio, ácido laurilaminopropiónico, lecitina, cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio e monoestearato de glicerina e polímero hidrofílicos, tais como polivinilálcool, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxietilcelulose e hidroxipropilcelulose. 72

Os exemplos preferidos dos agentes que conferem isotonicidade incluem cloreto de sódio, glicerina, D-manitol, etc.

Os exemplos preferidos dos tampões incluem soluções tampão, tais como fosfatos, acetatos, carbonatos, citratos, etc.

Os exemplos preferidos dos agentes suavizantes incluem álcool benzilico, etc.

Os exemplos preferidos dos conservantes incluem p-oxiesterbenzoatos, clorobutanol, álcool benzilico, álcool fenetilico, ácido desidroacético, ácido sórbico, etc.

Os exemplos preferidos dos antioxidantes incluem sulfitos, ácido ascórbico, etc. A composição farmacêutica acima proporciona um efeito igual ou mais elevado do que o efeito da GH, após administração e pode reduzir vários efeitos secundários causados pela administração da GH.

Como doenças atribuíveis à deficiência ou diminuição da GH, doenças às quais pode ser aplicada a composição farmacêutica ou os efeitos da composição farmacêutica, incluem, mas não estão limitadas a, activação dos osteoblastos e reconstituição óssea em pessoas com nanismo e seres humanos normais, aumento de força muscular e da quantidade muscular em adultos deficientes em GH, melhoria de motilidade em adultos deficientes em GH, tratamento queimaduras graves em crianças, sua utilização combinada com gonadotropinas na indução da ovulação, prevenção de anomalias no 73 metabolismo das proteínas pela administração de prednisona, promoção da "educação" das células T em distúrbios imunitários graves, o efeito de inibição da redução do peso corporal dos idosos e o efeito de aumento de tecidos gordos adiposos e prevenção da atrofia dérmica

Além disso, as doenças ou efeitos não directamente correlacionados com deficiência ou diminuição da GH incluem, e. g., o efeito de aumento do fluxo pulsátil, como mostrado no Exemplo 7 e, deste modo, este é eficaz no tratamento de doenças cardíacas, tais como insuficiência cardíaca, etc. 0 efeito da composição farmacêutica não está restringido a seres humanos. Ou seja, este tem um efeito na promoção do crescimento em animais, na redução de gordura na carne, etc., que é igual ou superior à da GH administrada.

Por exemplo, como mostrado no Exemplo 13, a composição farmacêutica da presente invenção apresenta uma acção promotora do apetite após administração ventricular ou administração intravenosa, consequentemente, esta pode ser utilizada como um promotor do apetite, no tratamento da anorexia ou sitofobia.

Além disso, como mostrado no Exemplo 14, a composição farmacêutica da presente invenção tem uma acção promotora da motilidade e da secreção de ácidos gástricos do estômago e, consequentemente, pode ser, também, utilizada como um agente no tratamento doenças funcionais do estômago, tais como dispepsia não-diabrótica, atonia gástrica leve súbita, dispepsia funcional e refluxo esofágico. 74

Além disso, como mostrado por exemplo no Exemplo 15, a composição farmacêutica da presente invenção apresenta uma acção de promoção do crescimento celular na medula óssea, duodeno e jejuno, por administração intravenosa e, deste modo, pode ser utilizada como um agente de protecção da túnica mucosa do intestino delgado, um agente para a prevenção de lesões da túnica mucosa no intestino delgado, durante a nutrição intravenosa e um agente para o tratamento da osteoporose.

Além disso, a composição farmacêutica descrita acima tem um efeito no tratamento das doenças ou para melhorar as patologias físicas descritas abaixo.

Por exemplo, pode ser utilizada no tratamento estimulante, para a libertação de hormonas do crescimento em idosos, na prevenção de efeitos secundários catabólico de corticóides açúcares, prevenção e tratamento da osteoporose, estímulo do sistema imunitário, promoção do tratamento de danos, promoção da reparação de ossos partidos, tratamento do atraso no crescimento, tratamento da insuficiência renal ou insuficiência funcional atribuível ao atraso do crescimento, tratamento de patologias de insuficiência correlacionadas com patologias de insuficiência fisiológica, incluindo crianças deficientes na hormona do crescimento e doenças crónicas, tratamento da obesidade e atraso do crescimento correlacionado com a obesidade, tratamento do atraso do crescimento correlacionado com a síndrome de Plauda-Villi e síndrome de Taner, promoção da recuperação de doentes queimados e redução da hospitalização, tratamento do atraso do crescimento intrauterino, má-formação esquelética, doença hipercorticóide e síndrome de Cusshing, indução da libertação da hormona do crescimento pulsátil, substituição da hormona do crescimento em doentes com stress, 75 má-formação da cartilagem, síndrome de Noonan, esquizofrenia, depressão, doença de Alzheimer, tratamento do atraso na reparação de danos e privação fisico-social, tratamento da insuficiência pulmonar e dependência de orgão respiratório, diminuição da reacção catabólica das proteínas após operação significativa, diminuição da perda de proteína e cachexia causada por doenças crónicas, tais como cancro e SIDA, tratamento do hiperinsulinismo, incluindo nesidioblastose do pâncreas, terapia com adjuvante para a indução da ovulação e tratamento de doentes com repressão imunitária, melhoria da força muscular e motilidade, manutenção da espessura da pele em idosos, homeostase metabólica e homeostase renal, estímulo dos osteoblastos, a reformação óssea e estímulo do crescimento da cartilagem, de forma a estimular o crescimento do timo e prevenir a deterioração da função tímica que acompanha o envelhecimento.

Além disso, são, também, esperados os efeitos seguintes em animais. Por exemplo, é feita referência a um aumento na taxa de crescimento dos animais, um aumento na produção de leite e da pelagem em animais, estímulo do sistema imunitário em animais de estimação, tratamento de doenças causadas pela idade avançada em animais de estimação, promoção do crescimento de animais domésticos e um aumento da pelagem em ovelhas.

Um anticorpo cujo antigénio é um péptido modificado com um ácido gordo da presente invenção, tendo uma actividade de libertação de Ca ou uma actividade de indução da secreção da GH, pode ser obtido através de um método conhecido na técnica. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal e pode ser obtido através de um método conhecido na técnica. Além disso, um método de medição do péptido modificado com um ácido 76 gordo, utilizando o referido anticorpo e um kit de medição, utilizando o referido método de medição pode utilizar, também, um método conhecido na técnica.

Como descrito no Exemplo 17, são, respectivamente, preparados anticorpos contra os péptidos do terminal amina e carboxilo da grelina e, dado que este último reconhece serina na 3a posição, modificada com um ácido gordo, ambos os anticorpos podem ser utilizados para separar e quantificar grelina modificada com um ácido gordo e grelina a partir da qual o ácido gordo foi eliminado.

Os anticorpos contra péptidos do terminal amina e carboxilo da grelina podem ser obtidos através de um método conhecido e estes podem ser anticorpos monoclonais ou policlonais.

Pode ser, também, produzido, da mesma forma, um anticorpo que reconhece, especificamente, uma cadeia lateral do 3o resíduo de aminoácido (de um modo preferido, um ácido gordo) e que se liga a um péptido parcial do terminal amina do composto do tipo peptídico, para o presente composto do tipo peptídico, tendo um aminoácido modificado na 3a posição do terminal amina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Além disso, pode ser, também, produzido, da mesma forma, um anticorpo que se liga, especificamente, ao péptido tendo um aminoácido modificado, contra o composto do tipo peptídico da presente invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. A presente invenção abrange, também, um kit de teste compreendendo uma combinação de um anticorpo que reconhece, especificamente, uma cadeia lateral do aminoácido modificado e um anticorpo que reconhece aminoácidos (ou um péptido) excluindo 77 o aminoácido modificado e/ou um composto não-aminoácido, de um modo preferido, um anticorpo contra um péptido parcial do terminal carboxilo do composto do tipo peptídico da presente invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, como descrito acima.

Além disso, a presente invenção abrange um método de ensaio em que o composto do tipo peptídico da presente invenção, tendo um aminoácido modificado, de um modo preferido, um aminoácido acilado ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e o composto do tipo peptídico da presente invenção não contendo um aminoácido modificado ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, são separados e detectados pela utilização do referido kit de teste.

Seguidamente, o método de ensaio e o kit de teste descritos acima são descritos por referência às suas formas de realização, que, no entanto, não pretendem limitar a presente invenção.

Ou seja, o método de ensaio inclui, por exemplo, (i) um método de quantificação do composto do tipo peptídico, etc., da presente invenção, numa solução de teste, o qual compreende permitir a reacção competitiva de um material de teste numa solução de teste e o composto do tipo peptídico marcado, etc., da presente invenção, com um anticorpo contra o composto do tipo peptídico, etc., da presente invenção, e, seguidamente, a determinação da proporção do composto do tipo peptídico marcado, etc., da presente invenção, ligado ao referido anticorpo e (ii) um método de quantificação das proteínas, etc., da presente invenção, numa solução de teste, compreendendo permitir a reacção de uma solução de teste com o anticorpo da presente invenção, insolubilizado num veículo e outro anticorpo marcado 78 da presente invenção, simultaneamente ou sucessivamente e, seguidamente, a medição da actividade do agente de marcação no veiculo insolubilizante e/ou a actividade do agente de marcação não capturado no veiculo insolubilizante. Nos métodos de quantificação (i) e (ii), é preferido que um anticorpo seja um anticorpo que reconheça uma região do terminal amina da proteina, etc., da presente invenção, enquanto que outro anticorpo seja um anticorpo que reaja com uma região do terminal carboxilo da proteina, etc. da presente invenção.

No método de ensaio, o composto do tipo peptídico, etc., da presente invenção, pode ser utilizado o anticorpo monoclonal contra o referido composto (também designado, seguidamente, como anticorpo anti-proteina), não, apenas, para quantificar a proteina, etc., da presente invenção, mas, também, para a sua detecção por coloração de tecidos, etc.

Para estes objectivos, pode ser utilizada, tanto a própria molécula de anticorpo, como uma fracção F(ab')2, Fab' ou Fab da molécula de anticorpo. 0 método de quantificação do composto do tipo peptidico, etc., da presente invenção, pela utilização do referido anticorpo, não é particularmente limitado, desde que o método compreenda a detecção da quantidade de anticorpo correspondente à quantidade de antigénio (e. g., a quantidade de proteina), o antigénio ou um conjugado antigénio-anticorpo numa solução de teste, através meios químicos ou físicos e o cálculo deste com base numa curva padrão preparada utilizando soluções padrão, contendo quantidades conhecidas do antigénio. Por exemplo, de um modo preferido, são utilizados a nefelometria, o método competitivo, o método imunométrico e o método de sanduíche, mas 79 o método de sanduíche seguidamente descrito é, de um modo preferido, particularmente, utilizado devido à sensibilidade e especificidade.

Para um método de medição utilizando uma marcação no método de ensaio da presente invenção, a marcação inclui, e. g., um isótopo radioactivo, uma enzima, um material fluorescente e um material luminescente. 0 isótopo radioactivo inclui, por exemplo, 125I, 131I, 3H, 14C, etc. A enzima é, de um modo preferido, uma enzima estável com actividade específica elevada, que inclui, por exemplo, β-galactosidase, β-glucosidase, fosfatase alcalina, peroxidase e desidrogenase do malato. 0 material fluorescente inclui, por exemplo, fluorescamina e isocianato de fluoresceína. 0 material luminescente inclui, por exemplo, luminol, derivados do luminol, luciferina e lucigenina.

Além disso, pode ser, também, utilizado um sistema biotina-avidina para a ligação da marcação ao anticorpo ou antigénio.

Seguidamente, a presente invenção é descrita mais detalhadamente por referência aos Exemplos. A menos que especificado de outra forma, os meios de manipulação genética estiveram de acordo com Molecular Cloning (Sambrook et ai., 1989). 80

Exemplo 1. Criação de um estirpe celular expressando GHS-R e medição de actividade de libertação de Ca.

Para o ensaio de um aumento na concentração intracelular de iões de cálcio (actividade de libertação de Ca) ocorrendo após a ligação de um secretagogo da GH (GHS) ao receptor da GHS (GHS-R), foi criada uma estirpe celular expressando GHS-R de rato, da seguinte forma. Foi obtido um ADNc completo da GHS-R de rato por RT-PCR (reacção em cadeia da polimerase - transcritase reversa) em que foi utilizado ADNc derivado de cérebro de rato como molde. Foram sintetizados iniciadores sentido e antisentido consistindo nas sequências nucleotidicas seguintes, a partir da sequência nucleotidica conhecida de GHS-R de rato [K. K. Mckee et ai., Molecular Endocrinology 11, 415-423 (1997)].

Iniciador sentido: 5'-ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3'

Iniciador antisentido: 5'-ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3' 0 ADNc amplificado foi ligado ao vector pcDNAIII (Invitrogen) para construir o vector de expressão GHSR-pcDNAIII. As células CHO foram transformadas através do vector de expressão e as células transformadas, expressando GHS-R de forma estável, foram seleccionadas num meio contendo G418 1 pg/mL. A estirpe celular CHO-GHSR62 seleccionada respondeu a GHRP-6 IO-10 a 10-9 M (hexapéptido de Libertação da Hormona do Crescimento). Foi medida a modificação na concentração intracelular de iões de cálcio (actividade de libertação de Ca) através de um sistema FLIPR (Molecular Device). Antes desta medição, foram colocadas 4 X 104 células CHO-GHSR62 numa microplaca de 96 poços com 81 paredes negras (Corning, Ltd) e foram cultivadas durante 12 a 15 horas. Seguidamente, as células foram incubadas com Fluo4 fluorescente 4 μΜ (Molecular Probe Co., Ltd), durante 1 hora e foram lavadas quatro vezes com BSS de Hank (Solução Salina Equilibrada de Hank), contendo Hepes 20 mM ([Ν-2-hidroxietil]-piperazina-N- [ácido 2-etanossulfónico]) e probenecida 2,5 mM e a actividade de libertação de Ca foi ensaiada por adição a uma amostra e medição da modificação da fluorescência.

Exemplo 2. Purificação de um péptido indutor da secreção da GH endógena

Utilizando as células CHO-GHSR62 descritas no Exemplo 1, foi examinada uma ampla variedade de tecidos e órgãos derivados de rato em termos da sua actividade de libertação de Ca e, consequentemente, foi verificado que um extracto peptidico derivado do estômago de rato tem uma actividade significativa de libertação de Ca, mesmo numa pequena quantidade de 0,5 mg. Consequentemente, foi purificado um péptido tendo a actividade de libertação de Ca, a partir de um extracto de estômago de rato, por vários tipos de cromatografia.

Foram levados à ebulição 40 g de estômago de rato, fresco, durante 5 minutos, em 5 vezes água fervente, para inactivar as proteases ai presentes. Após o arrefecimento, a amostra fervida foi colocada em AcOH 1 M-HC1 20 mM, seguida da extracção do péptido com um misturador Polytron. 0 extracto foi centrifugado a 11000 rpm durante 30 min. e o sobrenadante foi concentrado em cerca de 40 mL num evaporador. O concentrado foi precipitado com acetona, pela adição de acetona a este, numa concentração de 66% 82 e, após a remoção dos precipitados formados, a acetona no sobrenadante foi evaporada. 0 sobrenadante foi aplicado numa coluna pré-empacotada Sep-Pak C18 de 10 g (Waters Co, Ltd), anteriormente equilibrada com TFA (ácido trifluoroacético) a 0,1%, foi lavado com CH3CN a 10%/TFA a 0,1% e, seguidamente, foi eluido com CH3CN a 10%/TFA a 0,1%. A amostra foi liofilizada, após o solvente no eluido ter sido evaporado. A amostra liofilizada foi dissolvida em AcOH 1 M e absorvida em SP-Sephadex C-25 (tipo H+) , previamente equilibrada com AcOH 1 M. A amostra foi eluida gradualmente com AcOH 1 M, seguidamente, com piridina 2 M e, finalmente, com piridina-AcOH 2 M (pH 5,0), pelo que, foram obtidas 3 fracções ou seja, respectivamente, SP-I, SP-II e SP-III. A fracção SP-III foi aplicada a uma coluna de filtração em gel Sephadex G-50 e foi ensaiada uma aliquota de cada fracção, para a actividade de libertação de Ca, pela utilização das células CHO-GHSR62. Na Fig. la é mostrado um perfil de cromatografia em coluna Sephadex G-50 e as fracções activas (fracções 43 a 48 na Fig. la), tendo pesos moleculares de cerca de 3000, foram fraccionadas por cromatografia liquida de elevado desempenho (HPLC) por permuta iónica CM numa coluna TSK CM-2SW (4,6 x 250 mm, Tosoh Corp.) a pH 6,4. As fracções activas por CM-HPLC foram fraccionadas secundariamente por CM-HPLC, na mesma coluna, a pH 4,8 (Fig. lb) . As fracções activas (tempo de eluição de 55 a 56 minutos, na Fig. lb) foram purificadas até à homogeneidade por HPLC de fase reversa numa coluna pBondasphere C-18 (3,9 x 150 mm, Waters Co., Ltd). Foram purificadas 16 pg de um péptido tendo uma actividade de libertação de Ca e designado como grelina, a partir de 40 g de estômago de rato.

Exemplo 3. Análise estrutural da grelina 83 A sequência de aminoácidos da grelina purificada derivada de rato foi determinada por um sequenciador de péptidos (ABI 494, Applied Biosysytems Co, Ltd). A grelina consistiu um péptido composto por 28 resíduos de aminoácido, consistindo na sequência seguinte: Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg em que Xaa é um aminoácido não identificado. Com base na sequência nucleotídica do ADNc de rato, foi estimado que Xaa fosse Ser, indicando uma determinada modificação da Ser no péptido.

Consequentemente, a grelina não modificada com serina na 3a posição do terminal amina, foi sintetizada quimicamente por um sintetizador de péptidos (ABI 433A, Applied Biosystems Co, Ltd) . Dado que o tempo eluição da grelina sintética não modificada em HPLC de fase reversa foi, significativamente, diferente do da grelina natural (Fig. 2a), foi verificado que a grelina sintética não modificada era mais, significativamente, hidrofílica do que a grelina natural. A partir do resultado acima, foi verificado que na grelina natural, a serina na 3a posição do terminal amina (3a serina) foi modificada com um resíduo hidrofóbico.

Para revelar o grupo modificante da 3a serina, a grelina purificada foi analisada por espectrometria de massa de ionização por electrovaporização (ESI-MS). 0 peso molecular determinado (3314,9 ± 0,7) da grelina natural foi superior em cerca de 126 ao peso molecular (3188,5) do péptido da grelina não modificada, que foi estimado a partir da sequência nucleotídica do ADNc. A partir do resultado acima, foi 84 verificado que o grupo hidroxilo da 3a serina da grelina natural foi modificada com o ácido gordo n-octanoilo (C8:0).

Para confirmar isto, o péptido n-octanoil (C8:0)grelina foi sintetizado quimicamente e examinado para o seu tempo eluição em HPLC de fase reversa. Na síntese química do péptido n-octanoílico (C8:0), foi sintetizado um péptido em que todos os grupos funcionais excepto o grupo hidroxilo da 3a serina foram protegidos pelo método Fmoc em fase sólida, utilizando um sintetizador de péptidos (ABI 433A, Applied Biosystems Co, Ltd) e, seguidamente, o péptido pretendido foi obtido por acilação do grupo hidroxilo da 3a serina com ácido n-octanóico e etil-3-carbodi-imida (3-dimetilaminopropilo), na presença de 4-(dimetilamino)piridina. 0 péptido n-octanoílico sintético apresentou o mesmo tempo eluição que a grelina natural purificada (Fig. 2a). Além disso, o péptido n-octanoílico sintético e um fragmento de péptido na Ia à 4a posições a partir do terminal amina (Glyl-Phe4), que foi obtido por tratamento da grelina natural com quimiotripsina, apresentaram o mesmo tempo de retenção em HPLC de fase reversa . A partir do resultado acima, foi concluído que a grelina natural derivada de rato tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2, em que o grupo hidroxilo da 3a serina foi acilado com ácido n-octanóico (ácido caprílico) (Fig. 2c).

Além disso, grelina humana foi purificada a partir de um extracto de estômago humano e foi verificado que a sua estrutura tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 3, em que o grupo hidroxilo da cadeia lateral da 3a serina foi acilado com ácido n-octanóico (ácido caprílico) (Fig. 4a) . 85

As estruturas das grelinas derivadas de rato e de humano foram determinadas, utilizando os purificados das fracções activas na Fig. lb, como fracções do primeiro pico (tempo de eluição de 55 a 56 minutos) e, após purificação, foi, também, analisada a estrutura de outras fracções activas na Fig. lb, da mesma forma, indicando a presença de, não, apenas, ácido caprilico (C8:0) mas, também, seu ácido monoeno (C8:l), ácido cáprico (CIO:0) e o seu ácido monoeno (CIO:1) e ácido láurico (C12:0) e o seu ácido monoeno (C12:1) como o ácido gordo modificante da 3a serina.

Além disso, foram purificadas grelinas de galinha, enguia e rã, a partir de extractos de estômago, da mesma forma que no Exemplo 2 e foram analisados em termos da sua estrutura, da mesma forma que no Exemplo 3. Foi verificado que a grelina de galinha tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ IDN°: 25, a grelina de enguia tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 26 e a grelina de rã tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 27 e, em todas as grelinas, o grupo hidroxilo da cadeia lateral da 3a serina foi acilado com ácido n-octanóico (ácido caprilico) . Além disso, foram purificadas grelinas de rã (Xenopus laevis) , peixe (truta arco-iris) e caninas, a partir de extractos de estômago, da mesma forma que no Exemplo 2 e forma analisadas para a sua estrutura, da mesma forma que no Exemplo 3.

Foi verificado que a grelina de rã tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 28, a truta arco-íris grelina tem a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ IDN°: 29 e 30 e a grelina canina tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 31 e, em todas as 86 grelinas, o grupo hidroxilo da cadeia lateral da 3a serina ou treonina foi acilado com ácido n-octanóico (ácido caprilico) .

Foram obtidas a grelina-23, consistindo em 23 resíduos de aminoácido, mostrada na SEQ ID N°: 29 e a grelina-20 de consistindo em 20 resíduos de aminoácido, mostrada na SEQ: ID N°: 30, a partir da truta arco-íris. Exemplo 4. Actividade de libertação de Ca da grelina. A grelina natural e a grelina sintética modificada com n-octanoílo apresentaram uma actividade de libertação de Ca, mas a grelina sintética não modificada não apresentou uma actividade significativa de libertação de Ca (Fig. 2b). Além disso, uma vez que o ácido n-octanóico ou uma mistura de ácido n-octanóico e grelina sintética não modificada não apresentaram uma actividade significativa de libertação de Ca, foi verificado que o resíduo ácido n-octanóico na grelina natural constitui uma estrutura importante da actividade de libertação de Ca. Seguidamente, a grelina refere-se a [O-n-octanoil-serina 3]-grelina (Fig. 2c).

Em células CHO-GHSR62, a grelina apresenta uma actividade mais elevada de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio (actividade de libertação de Ca) do que a GHRP-6, enquanto que a GHRH (hormona de libertação da GH, expressa como GRF na Fig. 3a) não apresenta actividade de libertação de Ca (Fig. 3b) . A actividade de libertação de Ca da grelina foi identificada numa concentração de 10-11 M ou superior e a sua EC50 foi de 2,5 nM. A actividade de libertação de Ca da grelina foi inibida na presença de antagonista específico ([D-Lys 3]-GHRP-6) 10-4 M para GHS-R [R. G. Smith, et al., Science 260, 1640-1643 (1993) ] e a actividade de libertação de Ca foi restabelecida numa concentração elevada de grelina, na ausência do antagonista 87 (Fig. 3b). 0 resultado acima indica que a actividade de libertação de Ca da grelina é inibida de um modo antagonistico, pelo antagonista especifico para GHS-R.

Exemplo 5. ADNc para um precursor da grelina e sua expressão em vários órgãos A sequência de aminoácidos da grelina não apresentava qualquer homologia com as sequências de aminoácidos de qualquer péptido conhecido, mas em resultado de uma pesquisa de homologia na base de dados GenBank, foi encontrada a mesma sequência numa sequência EST de rato (Marcação de Sequência Expressa) (N° de aceitação do GenBank AI549172) . Foram sintetizados seguintes os iniciadores PCR, com base nesta sequência EST:

Iniciador sentido: 5'-TTGAGCCCAGAGCACCAGAAA-3'

Iniciador antisentido: 5'-AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3'

Estes 2 iniciadores foram utilizados em RT-PCR, em que foi utilizado um ADNc derivado de estômago de rato como molde. As condições de PCR utilizaram 35 ciclos, consistindo, cada um, em 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 1 min. O fragmento de ADN amplificado foi utilizado como uma sonda, para rastrear uma biblioteca de ADNc de estômago de rato. Foi obtido um ADNc completo, codificando o derivado da grelina de rato, por rastreio de cerca de 2 x 105 fagos recombinantes • 0 ADNc da grelina de rato era composto por 501 bases mostradas na SEQ ID N° : 6, codificando um precursor da grelina 88 (pré-pró-grelina) composto por 117 aminoácidos (Fig. 4a). Os 23 resíduos de aminoácido do terminal amina do precursor da grelina apresentaram propriedades de péptido sinal. A grelina inicia na glicina 24 e os 2 últimos aminoácidos (Pro-Arg) na grelina madura consistiram numa sequência que sofre quebra com uma protease.

Foi sujeita a rastreio, uma biblioteca de ADNc de estômago humano, utilizando ADNc de grelina de rato, sob condições de severidade baixa, de forma a obter um ADNc completo da grelina humana. A biblioteca de ADNc de estômago humano foi preparada a partir de poly(A)+ARN gástrico humano (Clontech, Ltd) pela utilização de um kit de síntese de ADNc (Pharmacia, Ltd) . 0 ADNc completo da grelina humana, deste modo, obtido era composto por 511 bases mostradas na SEQ ID N°: 7, codificando um precursor da grelina humana (pré-pró-grelina) consistindo em 117 aminoácidos (Fig. 4a) . A homologia ao nível da sequência de aminoácidos, entre os precursores da grelina, derivados de rato e de humano, foi de 82,9%, revelando que as grelinas são altamente conservadas entre espécies. 0 poly(A)+ARN isolado a partir de vários tecidos de rato foi analisado, de forma a conhecer a distribuição da grelina nos tecidos (Fig. 4b) . Pela análise de transferência de Northern dos tecidos de rato, foi identificado um ARNm precursor da grelina com 0,62 kb, no estômago. Foram, também, identificadas duas bandas ténues no ventrículo e estas correspondiam a ARNm com 6,2 kb e 1,2 kb, os quais eram maiores do que o ARNm no estômago, sugerindo, deste modo, a existência de um processamento de ARNm diferente do do estômago. A partir do resultado acima, foi verificado que o estômago é um local principal de expressão da grelina. 89

Exemplo 6. Efeito da grelina sobre a secreção das hormonas pituitárias

Foi examinado, in vitro e in vivo, se grelina tem ou não actividade de indução da secreção da GH. Em primeiro lugar, foi examinado o efeito da grelina sobre as células cultivadas primárias da pituitária anterior num ensaio in vitro. Foram recolhidas pituitárias anteriores, a partir de ratos SD do sexo masculino com 4 semanas e foram dispersadas por tratamento com colagenase e as células foram recolhidas, lavadas duas vezes com meio DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) contendo FCS (soro bovino fetal) a 10% e um antibiótico e foram suspensas em meio DMEM, para preparar células cultivadas primárias da pituitária anterior. Foram inoculadas 5 x 104 células numa placa de cultura celular de 96 poços, revestida com poli-D-lisina e foram cultivadas durante 3 a 4 dias. O meio de cultura foi substituído por meio DMEM, contendo 0,1 mL de amostra e foi mantido a 37 °C, durante 15 minutos. Foi recolhida uma alíquota do meio de cultura, que foi medida por radioimunoensaio para as concentrações de várias hormonas pituitárias no meio de cultura. De entre as hormonas pituitárias, foram medidas GH, FSH, LH, PRL e TSH, utilizando um kit produzido por Biotrak/Amersham, Ltd e a ACTH foi medida, utilizando um kit EIA, de elevada sensibilidade, produzido por Península Laboratories.

Quando foi adicionada grelina a células cultivadas primárias da pituitária anterior, foi verificado um aumento da concentração intracelular de iões de cálcio, enquanto que a grelina não modificada sintética apresentou, também, uma actividade ligeiramente aumentada de libertação de Ca (Fig. 5a) . 90

Este resultado indica que, tanto a grelina, como a grelina não modificada, actuam directamente sobre as células da pituitária. Seguidamente, a actividade de indução da secreção da GH da grelina foi examinada, utilizando as células cultivadas primárias da pituitária anterior e pela adição de grelina 10-6 M, a concentração de GH na cultura estava aumentada, dependendo da concentração, mas não foi observado qualquer aumento nas concentrações de outras hormonas pituitárias (FSH, LH, PRL, TSH) (Fig. 5b). A actividade de indução da secreção da GH pela grelina foi examinada ín vivo. Após terem sido injectados intravenosamente 10 pg de grelina sintética num rato do sexo masculino (250 g) , foi recolhido sangue, periodicamente, durante até 60 minutos, para medição da concentração das hormonas pituitárias no plasma, por radioimunoensaio. De entre as hormonas pituitárias, apenas a GH foi libertada no sangue e atingiu o nivel máximo em 5 a 10 minutos após a injecção intravenosa da grelina. A partir deste resultado, foi verificado que grelina libertada a partir do estômago para o sangue, actua sobre as células da pituitária anterior e liberta GH no sangue e foi confirmado que a grelina é uma substância indutora da secreção da GH endógena especifica, não identificada.

Exemplo 7. Aumento do débito cardíaco no rato

Foi examinado o efeito da administração aguda da grelina no sistema cardiovascular de um rato sob anestesia. Foram divididos ratos Wistar do sexo masculino (Carerie), pesando, cada um, 220 a 250 g, aleatoriamente, em 4 grupos (grupos aos quais foram administradas, respectivamente, 10, 1, 0,5 e 0,2 pg de grelina), 91 para examinar o efeito da administração aguda da grelina sobre o sistema cardiovascular. A grelina foi diluida com soro fisiológico e, seguidamente, foi preparada uma dose de 10, 1, 0,5 ou 0,2 pg/rato e foram administrados, rapidamente, 120 pL, através de um tubo de injecção (PE50) o qual tinha sido inserido na veia jugular comum direita, para a medição do débito cardíaco. A pressão sanguínea sistémica e o débito cardíaco foram medidas e a resistência vascular periférica foi calculada como um indicador dinâmico. Os ratos foram anestesiados com pentobarbital e fixados na posição dorsal. Para a medição da pressão sanguínea média, foi inserida uma cânula de polietileno (PE50), cheia com heparina, na artéria femural direita. O débito cardíaco foi medido utilizando um medidor do débito cardíaco (CARDIOTHER M500R) do tipo de diluição térmico. Foi inserido um tubo de injecção (PE50), cheio com soro fisiológico, na veia jugular comum direita do rato e foi conservado no ventrículo direito. Foi inserido um micro-cateter na veia de veia jugular comum direita do rato e foi conservado na parte inicial da aorta. A infusão utilizou 100 pL de soro fisiológico à temperatura ambiente (25 °C) . A medição do débito cardíaco foi iniciada, pressionando o botão MEDIDA do medidor do débito cardíaco do tipo de diluição, térmico e, simultaneamente, pela injecção da infusão (100 pL de soro fisiológico) . 0 débito cardíaco foi medido 5 vezes, para a determinação do débito cardíaco médio. A pressão sanguínea média e o débito cardíaco foram determinados aos 1, 5, 15 e 30 minutos, antes e após a administração da grelina. A resistência vascular periférica foi determinada pela divisão da pressão sanguínea média pelo débito cardíaco. 92 TABELA 2

Peso corporal (g) Débito cardíaco (mL/min/kg) após administração de 1 pg de grelina 0 min. 1 min. 5 min. 15 min. 30 min. Média 230 347 382 367 341 338 SEM 3,7 14,3 10,2 11,5 7,9 8,8

Na tabela, SEM é a média do erro padrão.

Peso corporal (g) Débito cardíaco (mL/min/kg) após administração de 1 pg de grelina 0 min. 1 min. 5 min. 15 min. 30 min. Média 237 350 390 392 370 344 SEM 1,0 8,5 7,4 15,8 14,7 13,8

Na Tabela, SEM é a média do erro padrão.

Foi detectado um aumento do débito cardíaco, no grupo ao qual foi administrado 1 pg de grelina (Tabela 1) e no grupo ao qual foram administrados 10 pg de grelina (Tabela 2), 1 a 5 minutos após a administração.

Exemplo 8. Isolamento da grelina e grelina-27, a partir de várias origens

Foi purificada grelina, a partir do extracto de estômago de rato, utilizando a actividade de libertação de Ca como um 93 indicador, no método descrito no Exemplo 2. A fracção activa (tempo de eluição de 59 minutos na Fig. lb) em CM-HPLC secundário foi purificada até à homogeneidade, por HPLC de fase reversa, numa coluna pBondasphere C-18 (3,9 x 150 mm, produzida por Waters Co, Ltd). Esta fracção foi analisada por espectrometria de massa de ionização por electrovaporização (ESI-MS), revelando um pico de peso molecular (3187,2 ± 0,9) que era menor, em cerca de 126, do que o da grelina natural modificada com ácido octanóico (C8) consistindo em 28 aminoácidos. A determinação da sequência de aminoácidos deste péptido por um sequenciador de péptidos (ABI 494, produzido por Applied Biosysytems Co, LTd) revelou que este é um péptido composto pelos seguintes 27 resíduos de aminoácido: Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg (Xaa é um aminoácido não identificado). Ou seja, este péptido era composto por uma sequência de aminoácidos em que foi eliminada a 13a ou 14a glutamina da grelina consistindo em 28 aminoácidos. Dado que a actividade de libertação de Ca deste péptido era semelhante à da grelina com 28 aminoácidos, como mostrado no Exemplo 9, este péptido foi designado como grelina-27. A grelina-27 humana foi isolada a a partir do extracto de estômago humano, da mesma forma que a grelina de rato e foi confirmado que consistia na sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 11. As fracções dos picos com tempos de retenção de 64 a 65 minutos em CM-HPLC secundário foram purificadas e analisadas por espectrometria de massa de ionização por electrovaporização (ESI-MS), revelando um pico do peso molecular (3341,4 ± 0,9). Dado que este péptido modificado com um ácido gordo era composto por 28 aminoácidos, este revelou ser um péptido em que em a 3a serina da grelina (28 aminoácidos) foi modificada com ácido decanóico (CIO) . 94

Foi clonada um ADNc codificando um precursor da grelina-27, obtido da biblioteca ADNc de estômago de rato preparada no Exemplo 5, por hibridação em placa, em que o fragmento de ADN amplificado por PCR, preparado no Exemplo 5, foi utilizado como uma sonda. A sequência nucleotidica do ADNc foi determinada e foi confirmado que codificava o precursor da grelina-27. 0 ADNc do precursor da grelina-27 de rato, resultante, era composto pela sequência nucleotidica estabelecida na SEQ ID N°: 14, codificando o precursor da grelina-27, tendo a sequência de aminoácidos (116 aminoácidos) estabelecida na SEQ ID N°: 12. Foi, também, clonado um ADNc para o precursor da grelina-27 humana, da mesma forma, como descrito acima e revelou consistir na sequência nucleotidica estabelecida na SEQ ID N°: 15, codificando o precursor da grelina-27 humana, tendo a sequência de aminoácidos (116 aminoácidos) estabelecida na SEQ ID N°: 13.

Foi clonado um ADNc codificando um precursor da grelina ou da grelina-27 derivada de porco, a partir de uma biblioteca de ADNc de porco, de acordo com o método descrito no Exemplo 5, por hibridação em placa, em que o fragmento de ADN amplificado por PCR, descrito no Exemplo 5, foi utilizado como uma sonda. Foi determinada a sequência nucleotidica do clone de ADNc, resultante, e foi confirmado que codificava um precursor da grelina porcina ou um precursor da grelina-27 porcina. 0 ADNc, resultante, para o precursor da grelina porcina, era composto pela sequência nucleotidica estabelecida na SEQ ID N°: 20, codificando um precursor da grelina, tendo a sequência de aminoácidos (118 aminoácidos) estabelecida na SEQ ID N°: 18. O ADNc para o precursor da grelina-27 porcina era composto pela sequência nucleotidica estabelecida na SEQ ID N°: 21, codificando o precursor da grelina-27, tendo a sequência de 95 aminoácidos (117 aminoácidos) estabelecida na SEQ ID N°: 19. Consequentemente, a grelina porcina (28 aminoácidos) e a grelina-27 porcina (27 aminoácidos) são compostas pelas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID N°: 16 e 17, respectivamente.

Foi clonado um ADNc, codificando um precursor da grelina derivado de enguia, Xenopus laevis ou truta arco-íris, a partir de várias bibliotecas de ADNc, de acordo com o método descrito no Exemplo 5, por hibridaçâo em placa, em que o fragmento de ADN amplificado por PCR, descrito no Exemplo 5, foi utilizado como uma sonda. Foi determinada a sequência nucleotídica do clone de ADNc resultante e foi confirmado que codificava o precursor da grelina. 0 ADNc resultante do precursor da grelina de enguia era composto pelos jogo de nucleótidos estabelecidos na SEQ ID N°: 36, o ADNc para o precursor da grelina de rã era composto pelos nucleótidos estabelecidos na SEQ ID N°: 37 e o ADNc para o precursor da grelina da truta arco-íris era composto pelos nucleótidos estabelecidos na SEQ ID N°: 38 ou 39.

Foram obtidos o ADNc codificando o precursor da grelina-23 da truta arco-íris, estabelecido na SEQ ID N°: 38 e a o ADNc codificando o precursor da grelina-20, estabelecido na SEQ ID N°: 39.

Foi verificado, a partir das sequências nucleotídicas do ADNc acima, que o precursor da grelina de enguia tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 32, o precursor da grelina de rã tem a sequência de aminoácidos estabelecida na 96 SEQ ID N°: 33 e o precursor da grelina da truta arco-íris tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 34 ou 35.

Foram obtidas a sequência de aminoácidos do precursor da grelina-23, estabelecida na SEQ ID N°: 34 e a sequência de aminoácidos do precursor da grelina-20, na SEQ ID N°: 35, a partir da truta arco-íris,.

Foi clonado um ADNc para um precursor da grelina bovina pelo método de PCR. Ou seja, foi realizada PCR, em que foi utilizado ADN sintético, tendo sequências nucleotídicas concebidas com base em sequências de aminoácidos conservadas entre as grelinas e as grelinas-27 derivadas de rato, humano e porco, como iniciador e foi utilizada uma biblioteca de ADNc de estômago de bovino como molde. 0 fragmento de ADN, deste modo, amplificado tem a sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID N°: 24, codificando uma parte do precursor da grelina-27 bovino estabelecida na SEQ ID N°: 23. Consequentemente, a grelina-27 de bovino tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N° : 22. No fragmento de ADN amplificado pela PCR acima, utilizando uma biblioteca de ADNc de estômago de bovino como molde, não estava presente ADN codificando um precursor da grelina (28 aminoácidos).

Os aminoácidos das grelinas derivadas de rato, humano e porco e das grelinas-27 derivadas de rato, humano, porco e bovino eram muito semelhantes e, em particular, as sequências de aminoácidos do Io ao 10° aminoácidos das 7 grelinas descritas acima, eram completamente idênticas entre si. 97

Exemplo 9. Comparação da actividade entre vários derivados da grelina

Foram examinados fragmentos peptídicos, obtidos por digestão parcial de grelinas derivadas de rato e de humano, com várias proteases ou péptidos sintetizados quimicamente, para a sua actividade de libertação de Ca, para determinar uma sequência de aminoácidos nuclear e o comprimento de cadeia óptimo de um ácido gordo modificante, necessário para a actividade de libertação de Ca. A actividade de libertação de Ca da grelina foi expressa em termos da concentração da grelina (EC só, nM) na qual e atingida 50% da actividade máxima.

Consequentemente, valores baixos de EC50 são indicadores de actividade mais elevada. 98

Tabela 3

Comparação da actividade entre vários derivados da grelina

Origem SEQ ID N°: Aminoácidos ácido gordo modificante actividade de libertação de Ca Observação (ECS0, nM) humano 3 1-28 Acilo (C: 8) 2,6 grelina natural humano 3 1-15 Acilo (C: 8) 7,0 humano 3 1-11 Acilo (C: 8) 15 rato 2 1-28 Acilo (C: 8) 2,9 grelina natural rato 2 1-15 Acilo (C: 8) 8,6 rato 2 1-11 Acilo (C: 8) 15 rato 2 1-10 Acilo (C: 8) 19 rato 2 1-9 Acilo (C: 8) 38 rato 2 1-8 Acilo (C: 8) 100 rato 2 1-4 Acilo (C: 8) 480 rato 2 16-28 Acilo (C: 8) >10000 rato 2 (1-28)+ Acilo (C: 8) 2,8 grelina-27 (14-28) rato 2 1-28 Acilo (C:16) 3,1 rato 2 1-28 Acilo (C:10) 2,6 rato 2 1-28 Acilo (C: 6) 16 rato 2 1-28 Acilo (C: 4) 280 rato 2 1-28 Acilo (C: 2) 780 A actividade de libertação de Ca da grelina está presente do lado do terminal amina. Um péptido proveniente do terminal amina até ao 4 o aminoácido tem uma actividade de libertação de Ca suficiente e um péptido proveniente do terminal amina até ao 10° aminoácido mostra uma actividade significativa de libertação de Ca próximo do da grelina natural. Quando o comprimento de cadeia de ácido gordo modificante é C: 2 (grupo acetilo), é produzida uma actividade suficiente e quando o comprimento de 99 cadeia é C:8 (grupo octanoílo), é alcançada a actividade máxima de libertação de Ca e, ainda, se o número de átomos de carbono do ácido gordo for, adicionalmente, aumentado para C:10 (grupo decanoilo) ou C:16, a actividade significativa de libertação de Ca não se altera. Ou seja, a actividade de libertação de Ca mais significativa é produzida, quando o ácido gordo modificante da 3a serina do terminal amina contém 8 ou mais átomos de carbono.

Exemplo 10. Síntese de vários derivados da grelina (1) Síntese de derivados petídicos

Os derivados de aminoácido para além de Fmoc-DSer (C8Hi7) e Fmoc-Ser (C8Hi7) e reagentes de síntese, foram adquiridos à Perkin Elmer, Novabiochem ou Watanabe Kagaku Co, Ltd. A extensão da cadeia peptidica foi realizada, principalmente, pela utilização do sintetizador Applied Biosystem 433A produzido por Perkin Elmer e foi construído um derivado de péptido protegido, em resina, pelo método Boc ou Fmoc. O péptido protegido, em resina, obtido pelo método Boc foi desprotegido com fluoreto de hidrogénio anidro (HF), na presença de p-cresol que, deste modo, liberta o péptido que foi, então, purificado. O péptido protegido, em resina, obtido pelo método Fmoc foi desprotegido com ácido trifluoroacético (TFA) ou TFA diluído, contendo vários purificadores e o péptido libertado foi purificado. A purificação foi realizada por HPLC de fase reversa numa coluna de C4 ou C18. A pureza do produto purificado foi confirmada por HPLC de fase reversa e a sua estrutura foi confirmada por análise da composição em aminoácidos e espectrometria de massa. 100 0 péptido da presente invenção é produzido por um método de síntese peptídica convencional. Por exemplo, pode ser produzido por um método descrito, nos capítulos 2 e 3 de "Biochemical Experimental Course 1, Protein Chemistry IV" (Tóquio Kagaku

Dojin) ou em "Development of Medicines, a second series, volume 14, Peptide Synthesis (Hirokawa Shoten Co, Ltd) . Consequentemente, os exemplos típicos do péptido da presente invenção são mostrados abaixo. Especificamente, a síntese de péptidos acilados ou alquilados é exemplificada abaixo. Além disso, foi feito reagir um derivado de grelina humana (que pode ser abreviado, seguidamente, como hGrelina) ou um derivado de grelina de rato (que pode ser abreviado, seguidamente, como rGrelina) com tripsina ou quimiotripsina ou com ambas as enzimas, sucessivamente, para originar os seguintes fragmentos da grelina: 19. Grelina (16-28), 20. hGrelina (1-15), 21. rGrelina (1-15), 23. hGrelina (1-11), 24. rGrelina (1-11), 25. Grelina (1-10), 26. Grelina (1-9), 27. Grelina (1-8) e 30. Grelina (1-4). Seguidamente, estes fragmentos foram isolados por HPLC analítico e medidos para a sua actividade. 41. [N-Acetil]-Grelina (1-10) foi preparada de uma forma normal por tratamento da Grelina (1-10) com N-acetilsuccinimida. O composto N° 2 (grelina de rato) utiliza um material natural e 10. [Ser3 (Butiril)]-rGrelina, 11. [Ser3 (Hexanoil) ]-rGrelina, 12. [Ser3(Decanoil)]-rGrelina, 13. [Ser3(Lauroil)]-rGrelina e 14. [Ser3 (Palmitoil)]-rGrelina foram sintetizadas, da mesma forma que na síntese do Composto 1 (hGrelina) e, seguidamente, foram medidas para a sua actividade. 101 [Abreviaturas Principais]

Resina HMP; resina de 4-hidroximetil-fenoximetilo resina Fmoc amida; resina de 4-(2', 4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxiacetamidoetilo

Resina PAM; resina de fenilacetoamidometilo HBTU; hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazole-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio TBTU; tetrafluoroborato de 2-(ΙΗ-benzotriazole-l-il)-1,1,3,3- tetrametilurónio HOBt; 1-hidroxibenzotriazole DCC; diciclo-hexilcarbodi-imida DIPCI; di-isopropilcarbodi-imida TFA; ácido trifluoroacético DIPEA; di-isopropiletilamina TIPS; triisopropilsilano

Fmoc; fluorenilmetoxicarbonilo

Boc; t-butiloxicarbonilo

Trt; tritilo 102

But; t-butilo

Pmc; 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo

Prl; propionilo

PhPrl; fenilpropionilo

Bzl; benzilo

Bom; benziloximetilo

Tos; toluenosulfonilo

Cl-Z; 2-cloro-benziloxicarbonilo

Pis; 2-fenilisopropilo

Mtt; 4-metiltritilo DMF; N,N-dimetilformamida NMP; Af-metilpirrolidona DMAP; 4-dimetilaminopiridina HOSu; W-hidroxissucciniimida

Adod; ácido 2-aminododecanóico

Aib; ácido 2-aminoisobutílico 103

Ape; ácido 5-aminopentanóico

Cha; ciclo-hexilalanina

Dap; 2, ácido 3-diaminopropiónico

Nal; naftilalanina

Nle; norleucina [Aminoácidos protectores utilizados em sintese] Método Fmoc:

Boc-Gly, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser (But) , Fmoc-Ser (Trt), Fmoc-Glu (OBut) , Fmoc-His (Boc), Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Leu, Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-Phe, Fmoc-DPhe, Fmoc-Ser (n-C8Hi7), Fmoc-DSer (n-C8Hi7) , Fmoc-Cys (n-C8Hi7), Fmoc-Asp (OPis), Fmoc-Ser (Bzl), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Dap (Octanoílo), Fmoc-2-LNal, Fmoc-2-DNal, Fmoc-Nle,

Fmoc-Lys (Mtt), Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Asp (O-C7H15) Método Boc:

Boc-Gly, Boc-Ser (Bzl), Boc-Ser (Ac), Boc-Ser (Prl),

Boc-Glu (OBzl), Boc-His (Bom), Boc-Gln, Boc-Arg (Tos), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Ala, Boc-Val, Boc-Phe, Boc-Cys (u-C8Hi7) , Boc-Ape Boc-Ser (n-C8Hi7) 104 [Equipamento utilizado] (a) Sistema de HPLC analítico Equipamento: Shimadzu LC-10A System Coluna: YMC PROTEIN-RP (4,6 mmí)) x 150 mm)

Temperatura da coluna: 40 °C

Eluente: um gradiente linear de acetonitrilo 0 a 50 durante 20 minutos, em ácido trifluoroacético a 0,1%

Velocidade do fluxo: 1 mL/min.

Detecção: UV (210 nm)

Volume de injecção: 10 a 100 pL (b) Sistema de HPLC preparativa

Equipamento: Waters 600 Multisolvent Delivery System Colunas: YMC-Pack-ODS-A (5 pm, 20 mm x 250 mm) YMC-Pack-PROTEIN-RP (5 pM, C4, 10 mm x 250 mm) YMC-Pack-PROTEIN-RP (5 pM, C4, 20 mm x 250 mm) 105 YMC-PROTEIN-RP (4,6 ιτιτηφ x 150 mm)

Eluente: Um gradiente linear adequado de concentração de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%

Caudal: 10 mL/min. (para a coluna com um diâmetro interior de 20 mm), 3 mL/min. (para a coluna com um diâmetro interior de 10 mm), 1 mL/min. (para a coluna com um diâmetro interior de 4,6 mm) Detecção: 210 nm, 260 nm

Injecção: 10 a 2000 pL (foram injectados 2000 ou mais pL através de uma bomba) (c) Espectrómetro de massa

Equipamento: Finigan MAT TSQ700 Fonte de iões: ESI Modo de detecção de iões: Positivo Voltagem de vaporização: 4,5 kV Temperatura do capilar: 250 °C

Fase móvel: Uma mistura de ácido acético e metanol a 0,2% (1:1)

Velocidade do fluxo: 0,2 mL/min.

Gama de varrimento: m/z 300 a 1500 106 (d) Análise da sequência de aminoácidos

Equipamento: Applied Biosystem 477A, sequenciador do modelo 492, produzido por Perkin Elmer (e) Análise da composição em aminoácido

Equipamento: Analisador de aminoácidos do modelo L-8500, produzido por Hitachi, Co, Ltd.

Amostra: A menos que especificado de outra forma, a amostra foi hidrolizada com HC1 6 M, a 110 °C, durante 24 horas, num tubo selado. (2) Exemplo da síntese de um derivado tendo acil serina ou acil treonina (método Fmoc, derivados amida do terminal carboxilo)

Composto 1 hGrelina: GSS(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Foi tratada Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetida, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir

Fmoc-Ser(But) -Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu (OBufc) -His(B oc) -G ln(Trt) -Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gin(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(B oc)-Glu(OBu 107 t)-Ser (Bu1) -Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-P ro-Arg(Pmc)-resina. Após Boc-Gly ter sido, finalmente, introduzido por DCC/HOBt, o péptido protegido, em resina, resultante, (1,3 g) foi tratado com uma solução de TFA 1%-TIPS 5%-cloreto de metileno (15 mL), durante 30 minutos. O péptido em resina foi filtrado, foi lavado várias vezes com cloreto de metileno (30 mL), foi lavado com DIEA a 5% (10 mL) e, seguidamente, com cloreto de metileno (30 mL) . 0 péptido de-Trt em resina, resultante, (cerca de 1,3 g) foi dilatado com NMP (10 mL) , foram ai adicionados ácido octanóico (144,2 mg, 1,0 mmol) e DIPCI (126,2 mg, 1,0 mmol), na presença de DMAP (61,1 mg, 0,5 mmol) e foi permitida a reacção durante 8 horas. A resina foi recuperada por filtração e foi lavada com NMP e, seguidamente, com cloreto de metileno, seguido de secagem sob vácuo, para originar cerca de 1,2 g de péptido protegido em resina, em que a cadeia lateral da 3a serina foi adicionada de octanoilo. Foi adicionado um reagente desprotector (10 mL) a este produto, consistindo em TFA a 88%-fenol a 5%-TlPS a 2%-H20 a 5% e a mistura foi agitada à temperatura ambiente, durante 2 horas. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos resíduos resultantes, para formar precipitados. Os precipitados foram recuperados por filtração e secos, para originar cerca de 550 mg de péptido bruto. Foram dissolvidos 200 mg deste produto em 10 mL de água e foram aplicados à YMC-Pack-PROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) e foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar cerca de 120 mg do produto pretendido. 108 (3) Exemplo da síntese de um derivado tendo acil serina ou acil treonina (método Fmoc, compostos i amida do terminal carboxilo)

Composto 3 Grelina (1-9)-NH2; GSS (CO-C7H15) FLSPEH-NH2

Foi tratada Fmoc-amida-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetida, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir Fmoc-Ser (But) -Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser (But)-Pro-Glu(OBut) -His(Bo c)-resina. Após Boc-Gly ter sido, finalmente, introduzido por DCC/HOBt, o péptido protegido, em resina, resultante, (cerca de 550 mg) foi tratado com uma solução de TFA 1%-TIPS 5%-cloreto de metileno (10 mL) , durante 30 minutos. O péptido em resina foi recuperado por filtração, foi lavado várias vezes com cloreto de metileno (30 mL) , foi lavado com DIEA a 5% (10 mL) e, seguidamente, com cloreto de metileno (30 mL). O péptido de-Trt em resina, resultante, (cerca de 750 mg) foi dilatado com NMP (10 mL), foram ai adicionados ácido octanóico (144,2 mg, 1,0 mmol) e DIPCI (126,2 mg, 1 mmol), na presença de DMAP (61,1 mg, 0,5 mmol) e foi permitida a reacção durante 4 horas. A resina foi recuperada por filtração e foi lavada com NMP e, seguidamente, com cloreto de metileno, seguido de secagem sob vácuo, para originar cerca de 800 mg de péptido protegido em resina, em que a cadeia lateral da 3a serina foi adicionada de octanoilo. Foi adicionado TFA (10 mL) a este produto e foi misturado à temperatura ambiente, durante 30 minutos. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos resíduos resultantes, para formar 109 precipitados. Os precipitados foram recuperados por filtração e secos, para originar cerca de 250 mg de péptido bruto. Foram dissolvidos cerca de 200 mg deste produto em 10 mL de ácido acético aquoso a 30%, foram aplicados à YMC-Pack-PROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) e foram eluidos com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar cerca de 150 mg do produto pretendido. (4) Exemplo da síntese de um derivado tendo acil serina ou acil treonina (método Boc)

Composto 9 [Ser3(Propionil)]-rGrelina (1-28);

GSS (CO-CH2CH3) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR

Foi construída grelina de rato protegida em resina (4-28), a partir de Boc-Arg (Tos)-Pam resina (0,75 g, 0,5 mmol) através de química Boc e Boc-Ser (CO-CH2CH3)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH e

Boc-Gly-OH foram condensados com metade da resina (1,4 g). A resina resultante, 1,5 g, foi tratada com uma mistura de HF e p-cresol (8,5 mL: 1,5 mL) , a 0 °C, durante 1 hora e o HF foi evaporado. Foi adicionado éter aos resíduos, pelo que foram obtidos 671 mg de péptido bruto. Esta amostra foi dissolvida em ácido acético a 50% (AcOH), foi aplicada a uma coluna preparativa YMC-Pack-ODS-A (5 pm, 20 mm x 250 mm) e foi eluída com um gradiente de 0 a 95% de concentração de acetonitrilo numa solução de TFA a 0,1%, a uma velocidade de 10 mL/min., durante 75 minutos. As fracções contendo o produto pretendido foram liofilizadas, para originar 135,8 mg do péptido bruto. Uma parte (0,5 mg) deste produto foi aplicada na coluna de YMC-A-302 (C18, 110 4,6 mm mm x 150) e foi eluída com um gradiente de 15 a 19% de concentração de acetonitrilo, a num caudal de 1 mL/min. Este processo de purificação foi repetido e as fracções pretendidas foram combinadas para originar 0,41 mg do produto pretendido.

Foram produzidos os seguintes derivados petidicos, tendo acil serina ou acil treonina, da mesma forma que na produção do Composto 3 ou 9 descrita acima.

Os resultados da espectrometria de massa e da análise da composição em aminoácidos dos derivados petidicos tendo acil serina ou acil treonina, são resumidos abaixo.

Composto 1. hGrelina ESI-MS 3371,0 (teórico: 3370,9), composição em aminoácidos: Ser; 3,53 (4), Glx; 5,91 (6), Gly; 1,02 (1), Ala; 1,00 (1), Vai; 0. 96 (1), Leu; 2, Phe; 1,06 (1), Lys; 3,90 (4), His; 0,97 (1), Arg; 2,87 (3), Pro; 3,87 (4)

Composto 3. Grelina (l-9)-amida ESI-MS [M+H]; 1085,7 (teórico: 1085,2), composição em aminoácidos: Ser; 2,45 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1), His; 1,08 (1), Pro; 0,97 (1) 111

Composto 4. [Ser2 (Octanoil), Ser3]-Grelina (l-9)-amida ESI-MS [M+H]; 1085,8 (teórico: 1085,2), composição em aminoácidos: Ser; 2,46 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), His; 1,09 (1), Pro; 0,97 (1)

Composto 5. [Ser2 (Octanoil)]-Grelina (l-9)-amida ESI-MS [M+H]; 1211,7 (teórico: 1211,4), composição em aminoácidos: Ser; 2,48 (3), Glx; 1,00 (1), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), His; 1,11 (1), Pro; 0,98 (1)

Composto 8. [Ser3 (Acetil)]-rGrelina ESI-MS 3231,0 (teórico: 3230,7), composição em aminoácidos: Ser; 3,50 (4), Glx; 5,90 (6), Gly; 0,98 (1), Ala; 2,00 (2), Leu; 2, Phe; 1,01 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,99 (2), Pro; 3,99 (4)

Composto 9. [Ser3(Propionil)]-rGrelina ESI-MS 3245,0 (teórico: 3242,8), composição em aminoácidos: Ser; 3,42 (4), Glx; 5,93 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 2,00 (2), Leu; 2, Phe; 1,10 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,99 (2), Pro; 3,83 (4) 112

Composto 15. [Ser3(3-Fenilpropionil)]-hGrelina ESI-MS 3377,0 (teórico: 3376,9), composição em aminoácidos:

Ser; 3,06 (4), Glx; : 5,92 (6) , Gly; i—1 oo Oh o Ala; 0,98 (1), Vai; 0, 99 (D, Leu; 2, Phe; 1 ,13 (D, Lys; 4,03 (4), His; 1,08 (D, Arg; 3, 00 (3), Pro; 3,76 (4)

Composto 16. [Ser3(3-Octenoil)]-hGrelina ESI-MS 3369,0 (teórico: 3368,9), composição em aminoácidos:

Ser; 3,59 (4), Glx, : 5,91 (6) , Gly; i—1 O o \—1 Ala; 1,02 (1), Vai; 0, 99 (D, Leu; 2, Phe; 1 ,15 (D, Lys; 3,97 (4), His; 0,98 (D, Arg; 2, 93 (3), Pro; 3,88 (4)

Composto 28. Grelina (l-8)-amida ESI-MS [M+H] 948,5 (teórico: 948,1), composição em aminoácidos: Ser; 2,45 (3), Glx; 0,97 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 0,97 (1)

Composto 29. Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H] 819,6 (teórico: 819,0), composição em aminoácidos: Ser; 2,52 (3), Gly; 1,01 (1), Leu; 1_, Phe; 1,02 (1), Pro; 1,09 (1) 113

Composto 30. Grelina (l-6)-amida ESI-MS [M+H]; 722,4 (teórico: 721,8), composição em aminoácidos: Ser; 2,47 (3), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1)

Composto 31. Grelina (1-5) ESI-MS [M+H] 636,5 (teórico: 635,8), composição em aminoácidos: Ser; 1,78 (2), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1)

Composto 32. Grelina (l-5)-amida ESI-MS [M+H] 635,4 (teórico: 634,8), composição em aminoácidos: Ser; 1,67 (2), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1)

Composto 33-2. Grelina (l-4)-amida ESI-MS [M+H] 522,2 (teórico: 521,6), composição em aminoácidos: Ser; 1,65 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; 1

Composto 34. Grelina (l-3)-amida ESI-MS [M+H] 375,2 (teórico: 374,4), composição em aminoácidos: Ser; 1,66 (2), Gly; 1 114

Composto 35. [Lys8]-Grelina (l-8)-amida ESI-MS [M+H] 947,9 (teórico: 947,1), composição em aminoácidos: Ser; 2,70 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 0,99 (1), Pro; 1,00 (1)

Composto 36. [Arg8]-Grelina (l-8)-amida ESI-MS [M+H] 975,8 (teórico: 975,2), composição em aminoácidos: Ser; 2,70 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1_, Phe; 1,01 (1), Arg; 0,99 (1), Pro; 1,00 (1)

Composto 37. [Lys6]-Grelina (l-6)-amida ESI-MS [M+H] 763,6 (teórico: 762,9), composição em aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Lys; 1,00 (1)

Composto 38. [Lys5]-Grelina (l-5)-amida ESI-MS [M+H] 650,5 (teórico: 649,8), composição em aminoácidos: Ser; 1,79 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; _1, Lys; 0,99 (1)

Composto 39. [DPhe4, Lys5]-Grelina (l-5)-amida ESI-MS [M+H] 650,5 (teórico: 649,8), composição em aminoácidos: Ser; 1,79 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; 1, Lys; 0,99 (1) 115

Composto 40. [N-Aminopentanoil]-Grelina (3-7)-amida ESI-MS [M+H] 774,7 (teórico: 774,0), composição em aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Pro; 1,00 (1)

Composto 43. [IV-Glicil] -Grelina (3-7)-amida ESI-MS [M+H]; 732,7 (teórico: 731,9), composição em aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Pro; 1,00 (1)

Composto 44. [Leu2]-Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H]; 845,7 (teórico: 845,1), composição em aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,01 (1), Leu; 2_, Phe; 1,02 (1), Pro; 0,99 (1)

Composto 45. [His2]-Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H]; 869,7 (teórico: 869,0), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido cloridrico (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 1,02 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), His; 0,95 (1), Pro; 0,99 (1)

Composto 46. [Lys2] -Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H]; 860,7 (teórico: 860,1), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido cloridrico 116 (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 1,04 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Composto 47. [Gly2]-Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H]; 789,5 (teórico: 788,9), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido clorídrico (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 1,14 (2), Gly; 2,01 (2), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Composto 59. [Thr3(Octanoil)]-hGrelina composição em 5,91 (6), Gly; (4), Phe; 1,00 Vai; 0,96 (1) ESI-MS M; 3384,0 (teórico: 3384,9), aminoácidos: Ala; 1,02 (1) Arg; 2,99 (3), Glx; 1,02 (1), His; 1,00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4,05 (1), Pro; 4,06 (4), Ser; 2,66 (3), Thr; 0,94 (1),

Composto 60. [Leu2, Thr3 (Octanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3410,0 (teórico: 3411, 0), composição em aminoácidos: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,01 (1), His; 1,01 (1), Leu; 3 (3), Lys; 4,02 (4), Phe; 1, 01 (D, Pro; 4,00 (4), Ser; 1,81 (2), Thr; 0,96 (D, Vai; 0,97 (D

Composto 69. [Ser3(4-Metilpentanoil)]-hGrelina ESI-MS M; 3343,0 (teórico: 3342,9), composição em aminoácidos: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,97 (3), Glx; 5,86 (6), Gly; 117 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2, Lys; 4,00 (4), Phe; 1,01 (1) ,

Pro; 3,99 (4), Ser; 3,54 (4), Vai; 0,98 (1)

Composto 75. [Lys7]-Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H]; 850,5 (teórico: 850,0), composição em aminoácidos: Ser; 2,67 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1_, Phe; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1) (5) Exemplo da síntese de um terminal amina acilado derivado Composto 6. [N-octanoil, Ser3]-Grelina (l-9)-amida; C7H15CO-GSSFLSPEH-NH2

Foi tratada Fmoc-amida resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetida, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir

Fmoc-Gly-Ser (But) -Ser (But) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-Glu (OBut) -His (Boc )-resina. Após 0 tratamento com piperazina, o péptido em resina, resultante, (550 mg) foi lavado com NMP, foram aí adicionados DIPCI (126,2 mg, 1 mmol) e ácido octanóico (144,2 mg, 1,0 mmol), na presença de HOBt (135,1 mg, 1 mmol) e foi permitida a reacção durante 4 horas. A resina foi recuperada por filtração, lavada com NMP e, seguidamente, com cloreto de metileno e seca sob vácuo, para originar cerca de 600 mg de péptido protegido em resina, em que 0 grupo amina da Gly do terminal amina foi adicionada de octanoílo. Este produto foi dseprotegido com TFA (10 mL) (tratamento durante 30 minutos), para originar 200 mg de péptido bruto. A totalidade da amostra foi aplicada na YMC-Pack 118 PROTEIN-RP (5 μιη, C4, 20 mm x 250 mm) e foi eluída com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (fluxo: 10 mL/min), durante 60 minutos. Foram obtidos cerca de 180 mg do produto pretendido.

Valores medidos: ESI-MS [M+H]; 1085,6 (teórico: 1085,2), composição em aminoácidos: Ser; 2,47 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1), His; 1,09 (1), Pro; 0,96 (1) (6) Exemplo da síntese de um derivado contendo serina, tendo uma cadeia lateral alquilo

Composto 50. [Ser3 (Octil)]-Grelina (l-7)-amida; GSS (C8Hi7) FLSP-NH2

Fmoc-Ser (CsH^)

Foi adicionado hidreto de sódio, sob arrefecimento em gelo, (3,19 g, 133 mmol) a uma solução de Boc-Ser (12,3 g, 53,9 mmol) em DMF (300 mL) e foi misturado à temperatura ambiente, durante 1,5 horas. Foi aí adicionado iodeto de octano (11,0 mL, 60,9 mmol) e foi misturado à temperatura ambiente, durante 16 horas. Após ter sido adicionada água (40 mL) , gota a gota, à solução de reacção, sob arrefecimento em gelo, o solvente foi evaporado sob vácuo. Os resíduos resultantes foram purificados por aplicação a uma coluna de cromatografia em sílica gel (gel; Art9385, Merck, Ltd, eluente; diclorometano:metanol:ácido acético = 120:10:1), para originar 6,88 g de Boc-Ser (C8Hi7) (rendimento, 36,2%), sob a forma de uma matéria oleosa amarela pálida. Foi adicionado ácido trifluoroacético (120 mL) a este produto, Boc-Ser (C8Hi7) (6,88 g, 21,7 mmol), sob arrefecimento em gelo e foi misturado durante 0,5 horas à temperatura 119 ambiente. Após o ácido trifluoroacético ter sido evaporado, os resíduos resultantes foram dissolvidos em éter dietílico (120 mL) e foi aí adicionado HC1 4N-dioxano (22 mL) que foi misturado, durante 1 hora sob arrefecimento em gelo. Os cristais precipitados foram recuperados por filtração, para originar 5,23 g de Η-Ser (C8Hi7) .HC1 (rendimento, 96,3%), sob a forma de cristais incolores. Após ter sido adicionada trietilamina (1,40 mL, 10 mmol) a uma suspensão (50 mL) deste produto Η-Ser (C eHi7) .HC1 (2,54 g, 10,0 mmol) em carbonato de hidrogénio de sódio a 10%, foi aí adicionada uma solução de Fmoc-Osu (5,00 g, 14,8 mmol) em 1,2-dimetoxietano (20 mL), gota a gota, ao longo de um período de 10 minutos e foi misturado à temperatura ambiente, durante 16 horas. Os insolúveis foram filtrados, seguidamente foi adicionado diclorometano ao filtrado e a fase orgânica foi separada e lavada com uma solução de NaCl a 13%. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e o solvente foi evaporado. Os resíduos resultantes foram purificados por aplicação coluna de cromatografia de sílica gel (gel; BW-300, Fuji Silicia Co, Ltd, eluente; diclorometano:metanol = 93:7), para originar 2,75 g de Fmoc-Ser (C 8Hi7) (rendimento: 62,6%), sob a forma de cristais incolores.

Rf = 0,45 (CHC13: MeOH = 9:1, sílica gel 60F254 , MERCK, Ltd). Fmoc-DSer (CeHi7) : Rf = 0,45 (CHCI3: MeOH = 9:1, sílica gel 6OF254, MERCK Co., Ltd) .

Foi tratada Fmoc-amida resina (400 mg, 0,25 mmol, ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetida, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir Fmoc-Ser (But) -Ser (C8Hi7) -Phe-Leu-Ser (But) -pro-resina . Após Boc-Gly ter sido, finalmente, introduzido por DCC/HOBt, uma parte (250 mg) do péptido protegido em resina, resultante, foi 120 tratado com TFA (10 mL), durante 30 minutos. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos resíduos resultantes, para originar cerca de 120 mg de péptido bruto, sob a forma de precipitados. Este produto foi dissolvido em AcOH a 5% (10 mL), foi aplicado à YMC-Pack-ODS-A (5 pm, 20 mm x 250 mm) e foi eluído com um gradiente linear de 0 a 60% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: lOmL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar cerca de 40 mg do produto pretendido.

Composto 84. [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil)]-Grelina (3-5)-benzilamida; H-Ape-Ser (CsHi7) -Phe-Leu-NH-Cíb-Ph

Foi colocada oxima resina (230 mg/0,25 mmol, Novabiochem, Ltd) num recipiente de reacção equipado com um filtro de vidro e Boc-Leu-OH . H20 (190 mg, 0,75 mmol), previamente dissolvido em cloreto de metileno (DCM) e seco sobre MgCp, DCC (160 mg, 0,75 mmol), foram aí adicionados 5 mL de DCM e foi agitado durante a noite. O produto de reacção foi lavado várias vezes com uma quantidade adequada de DCM, DCM/EtOH (1:1) e DCM, por esta ordem. Após a introdução de Leu, <1> foram aí adicionados 10 mL de TFA/DCM a 25%, foi agitado durante 30 minutos e a resina foi lavada, várias vezes, com DCM, álcool isopropílico (iPrOH) , DCM e DMF, por esta ordem e <2> foi introduzida no recipiente de reacção uma solução preparada pela dissolução de 0,75 mmol (3 equivalentes) de Boc-aminoácido, 0,75 mmol (3 equivalentes) de TBTU e 0,75 mmol (3 equivalentes) de HOBt e,

seguidamente, pela adição de 1,25 mmol (5 equivalentes) de DIPEA 121 em 5 mL DMF num frasco Erlenmeyer e foi agitado durante 1 hora; esta operação foi realizada, repetidamente, para condensar os aminoácidos sequencialmente. Finalmente, foram obtidos 370 mg de resina Boc-NH-(CH2) 4-CO-Ser(C8Hi7)-Phe-Leu-Oxima. A resina foi suspensa em cerca de 5 mL de DMF, foram ai adicionados cloridrato de benzilamina (180 mg, 1,25 mmol), trietilamina (173 pL, 1,25 mmol) e ácido acético (72 pL, 1,25 mmol) e a mistura foi agitada. Após 24 horas, a resina foi filtrada, o filtrado foi evaporado e o péptido protegido com Boc, resultante, foi precipitado em 10 mL de HC1 1 N. Este produto foi lavado com água e seco, foram ai adicionados 5 mL de TFA e foi deixado reagir durante 30 minutos, eliminando, deste modo, Boc. O TFA foi evaporado e o produto foi precipitado com éter (Et20) , pelo que, foi obtido o produto pretendido [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil) ]-Grelina (3-5)-benzilamida, 110 mg. Os compostos 82, 83 e 85 foram sintetizados da mesma forma.

Os seguintes derivados peptídicos tendo alquilserina, excepto os Compostos 82 a 85, foram produzidos da mesma forma que na produção do Composto 50, descrita acima.

Os resultados da espectrometria de massa e da análise da composição em aminoácidos dos derivados petidicos tendo alquilserina, são resumidos abaixo.

Composto 17. [Ser3(Octil)]-hGrelina ESI-MS; 3357,0 (teórico: 3356,9), composição em aminoácidos: Ser; 2,92 (3+1), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 0,98 (1), Vai; 0,99 (1), Leu; 2, Phe; 1,13 (1), Lys; 4,04 (4), His; 1,09 (1), Arg; 3,01 (3), Pro; 3,89 (4) 122

Composto 50. [Ser3(Octil) ] -Grelina (1-7)-amida ESI-MS [M+H]; 805,5 (teórico: 805,0), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido clorídrico (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 0,86 (2 + 1), Gly; 1,01 (1) , Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,95 (1)

Composto 51. [Ser3(Octil) , DPhe4]-Grelina (1-7)-amida ESI-MS [M+H]; 805,4 (teórico: 805,0), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido clorídrico (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 0,97 (2+1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,05 (1), Pro; 1,16 (1)

Composto 52. [DSer3(Octil)]-Grelina (1-7)-amida ESI-MS [M+H]; 805,4 (teórico: 805,0), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido clorídrico (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 1,51 (2+1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Composto 53. [DSer3 (Octil), DPhe4] -Grelina (1-7)-amida ESI-MS [M+H]; 805,5 (teórico: 805,0), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido clorídrico (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 1,51 (2+1), Gly; 1,00 (1) , Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,01 (1) 123

Composto 67. [Ser3 (Bzl)]-hGrelina

3334, 8), composição em (3) , Glx; 5, 92 (6) , Gly; Lys; 4,00 (4) , Phe; 1, 02 0, 98 (D ESI-MS M; 3335,0 (teórico: aminoácidos: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,96 1,00 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), (1), Pro; 4,08 (4), Ser; 3,58 (4), Vai;

Composto 76. [N-Aminopentanoil, Ser3(Octil), Lys5]-Grelina (3-5)-amida ESI-MS [M+H]; 591,5 (teórico: 590,8), composição em aminoácidos: Ser; 0,45 (1), Phe; 1, Lys; 1,00 (1)

Composto 77. [V-Aminopentanoilo, DSer3(Octil) , DPhe4,

Lys5]-Grelina (3-5)-amida ESI-MS [M+H]; 591,5 (teórico: 590,8), composição em aminoácidos: Ser; 0,45 (1), Phe; _1, Lys; 1,01 (1)

Composto 78. [Aib1, His2, Ser3(Octil), Lys5]-Grelina (1-5)-amida ESI-MS [M+H]; 714,6 (teórico: 713,9), composição em aminoácidos: Ser; 0,45 (1), Phe; 1, His; 1,01 (1), Lys; 1,00 (1) 124

Composto 79. [Aib1, His2, DSer3 (Octil) , DPhe4, Lys5] -Grelina (1-5)-amida ESI-MS [M+H]; 714,5 (teórico: 713,9), composição em aminoácidos: Ser; 0,44 (1), Phe; 1, His; 1,00 (1), Lys; 1,01 (1)

Composto 81. [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil)]-Grelina (3-5)-amida ESI-MS [M+H]; 576,5 (teórico: 575,8), composição em aminoácidos: Ser; 0,49 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

Composto 82. [IV-Aminopentanoil, Ser3 (Octil)]-Grelina (3-5)-metilamida ESI-MS [M+H]; 590,6 (teórico: 589,8), composição em aminoácidos: Ser; 0,49 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

Composto 83. [IV-Aminopentanoil, Ser3 (Octil) ]-Grelina (3-5)-etilamida ESI-MS [M+H]; 604,3 (teórico: 603,8), composição em aminoácidos: Ser; 0,50 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1) 125

Composto 84.

[N-Aminopentanoil,

Ser3(Octil)]-Grelina (3-5)-benzilamida ESI-MS [M+H]; 666,5 (teórico: 665,9), composição em aminoácidos: Ser; 0,46 (1), Leu; 1, Phe; 0,98 (1)

Composto 85. [N-Aminopentanoil, Ser3(Octil)]-Grelina (3-5)-aminoetilamida ESI-MS [M+H]; 619,6 (teórico: 618,9), composição em aminoácidos: Ser; 0,47 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1) (7) Exemplo da sintese de um derivado contendo cisteina tendo uma cadeia lateral alquilo

Composto 48. [Cys3 (Octil) ] -Grelina (1-7) -NH2; GSC(C8Hi7) FLSP-NH2

Foi tratado Fmoc-amida-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetido, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir Fmoc-Ser (But)-Cys (C8Hi7)-Phe-Leu-Ser (But)-Pro resina. Após Boc-Gly ter sido, finalmente, introduzido por DCC/HOBt, o péptido protegido em resina, resultante, (550 mg) foi tratado com TFA (10 mL), durante 30 minutos. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos resíduos resultantes, para originar cerca de 120 mg de péptido bruto, sob a forma de precipitados. Este produto foi dissolvido em 10 mL de ácido acético a 5%, foi aplicado à 126 YMC-Pack-ODS-A (5 pm, 20 mm x 250 mm) e foi eluído com um gradiente linear de 0 a 60% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar cerca de 44 mg do produto pretendido.

Composto 68. [Cys3 (Trt)]-hGrelina;

GSC (C-Ph3) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Foi tratado Fmoc-Arg (Pmc)-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetido, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir Fmoc-Ser (But) -Cys(Trt) -Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBut) -His (B oc) -Gin(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gin(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(B o c) -Glu (OBut) -Ser (Bu1) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro-Pro-Ala-Lys (Boc) -Le u-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP resina. Após Boc-Gly ter sido, finalmente, introduzido por DCC/HOBt, foi recuperado o péptido protegido, em resina, resultante, (1,4 g) . Foi adicionado TFA (15 mL) a uma parte (400 mg) da resina, resultante e foi misturado, à temperatura ambiente, durante 1 hora. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos resíduos resultantes, para formar precipitados. Foram dissolvidos cerca de 90 mg de precipitados em 40 mL de água, seguidamente, foram aplicados à YMC-Pack-PROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) e foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e 127 liofilizadas, para originar cerca de 60 mg do produto pretendido.

Os seguintes derivados petidicos, tendo alquilcisteina, foram produzidos da mesma forma que na produção dos Compostos 48 ou 68, descrita acima.

Os resultados da espectrometria de massa e da análise da composição em aminoácidos dos derivados petidicos, tendo alquilcisteina, são resumidos abaixo.

Composto 18. [Cys3(Octil)]-rGrelina ESI-MS; 3317,0 (teórico: 3316,9), composição em aminoácidos: Ser; 2,69 (3), Glx; 5,90 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,99 (2), Leu; 2, Phe; 1,02 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1) , Arg; 1,98 (2), Pro; 3,87 (4)

Composto 48. [Cys3(Octil)]-Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H]; 821,7 (teórico: 821,1), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido clorídrico (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 0,60 (2), Gly; 1,08 (1) , Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,96 (1)

Composto 49. [Cys3(Octil), DPhe4]-Grelina (l-7)-amida ESI-MS [M+H]; 821,6 (teórico: 821,1), composição em aminoácidos após hidrólise com ácido propiónico-ácido clorídrico 128 (50/50), a 150 °C, durante 2 horas: Ser; 0,58 (2), Gly; 1,02 (1), Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,97 (1)

Composto 68. [Cys3(Trt)]-hGrelina ESI-MS 3503,0 (teórico: 3503,1), composição em aminoácidos: Ser; 2,42 (3), Glx; 5,77 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,01 (1), Vai; 0,94 (1), Leu; 2, Phe; 0,99 (1), Lys; 3,94 (4), His; 0,99 (1) ,

Arg; 2,92 (3), Pro; 3,81 (4) (8) Exemplo da sintese de um derivado peptidico contendo N-metilaminoácidos

Composto 86. [N-Aminopentanoil, Ser3(Octil), MePhe4,

MeLeu5] -Grelina (3-5)-amida; NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -MePhe-MeLeu-NH2

Foi colocado Fmoc-amida resina (0,40 g, 0,25 mmol) num recipiente de reacção equipado com um filtro de vidro, foram ai adicionados 15 mL de piperidina a 20% em NMP e foi agitado durante 20 minutos, removendo, deste modo, o grupo Fmoc.

Seguidamente, foram ai adicionados 15 mL de NMP, 1,0 mmol (4 equivalentes) de Fmoc-MeLeu-OH, 1,0 mmol (4 equivalentes) de TBTU, 1,0 mmol (4 equivalentes) de HOBt e 1,0 mmol (4 equivalentes) de DIPEA e foram agitados durante 1 hora, para condensar Fmoc-MeLeu. Seguidamente, a cadeia peptidica foi extendida por realização, repetida, da remoção do grupo Fmoc em piperidina a 20% e condensação do Fmoc-aminoácido (3 equivalentes) por hexafluorofosfato de 129 bromo-tris-pirrolidino-fosfónio (3 equivalentes) , na presença de 2,25 mmol (9 equivalentes) de DIPEA. A conclusão da reacção de condensação foi confirmada por desprotecção de uma pequena quantidade da resina com TFA e pelo seu exame por HPLC e espectrometria de massa (MS). Após ter sido obtido

Boc-NH-(CH2) 4-CO-Ser (0-C8Hi7)-MePhe-MeLeu-resina, esta resina foi tratada com TFA durante 30 minutos, pelo que a resina foi quebrada para desproteger o péptido. Após o TFA ter sido evaporado, o péptido foi lavado com éter (Et20) , para originar 120 mg de NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -MePhe-MeLeu-NH2. Este produto foi aplicado à YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm x 250 mm) e foi eluído com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar 70 mg do produto pretendido. Após este derivado ter sido hidrolizado com ácido propiónico.HC1 (50/50), a 150 °C durante 2 horas, a quantidade do péptido foi quantificada utilizando a proporção entre a área do pico do ácido aminopentanóico detectado no analisador de aminoácidos e a do padrão de ácido aminopentanóico 10 nmol. ESI-MS [M+H]; 604,5 (teórico: 603,8), aminoácidos detectados após hidrólise com ácido propiónico HC1 (50/50), a 150 °C durante 2 horas: Ser, Ape. 130 (9) Síntese de um derivado persulfureto misto

Composto 57. [Cys3(S-Heptil)]-hGrelina;

GSC (S-C7H15) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Foi adicionado um reagente desprotector (15 mL) consistindo em TFA a 88%-fenol a 5%-TIPS a 2%-H20 a 5%, a um péptido protegido em resina-HMP (1 g) , obtido por síntese, da mesma forma que na produção do Composto 68 e, seguidamente, foi misturado à temperatura ambiente, durante 2 horas. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos resíduos resultantes, pelo que, foram obtidas cerca de 550 mg de pó de [Cys3]-hGrelina bruta. Este produto foi aplicado à YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm x 250 mm) e foi eluído com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar 300 mg de [Cys3]-hGrelina (1-28). Foram dissolvidos 40 mg (11,4 pmol) deste produto em água (20 mL) , foi aí adicionado 1 mL de solução de 4,4'-ditiodipiridina (7,5 mg, 34,2 pmol) em acetonitrilo e foi deixado durante 1 hora. Após ter sido confirmada a conclusão da reacção, a solução de reacção foi lavada várias vezes com clorofórmio, para remover o excesso de 4,4'-ditiodipiridina e do derivado piridona. A camada aquosa (10 mL) contendo [tiopiridilCys3]-hGrelina (1-28) foi ajustada para pH 7,4 com NH3 aq. A 5 % e foi aí adicionada uma solução de 1-heptano[sic.]tiol (4,5 mg, 34,2 pmol) , em 2 mL acetonitrilo. Após 1 hora, a solução de reacção foi aplicada à YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm x 250 mm) e foi eluída com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 131 10 mL/min), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar 15 mg do produto pretendido.

Composto 57. [Cys3(S-Heptil)]-hGrelina ESI-MS 3391,0 (teórico: 3391,0), composição em aminoácidos:

Ser; 2,76 (3), Glx, ; 5,81 (6) , Gly; 0,99 (1), Ala; 1,01 (1), Vai; 0, 95 (D, Leu; 2, Phe; 0 ,99 (D, Lys; 3,95 (4), His; 0,99 (D, Arg; 2,93 (3), Pro; 3,84 (4) (10) Exemplos da síntese de um derivado tendo uma amida numa cadeia lateral na 3a posição e éster na direcção inversa

Composto 55. [Asp3 (NH-Heptil)]-hGrelina;

GSD (NH-C7H15) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Foi tratado Fmoc-Arg(Pmc)-HM-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetido, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir Fmoc-Ser(But)-Asp (OPis)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu (OBu^-His(Boc)-Gin(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gin(Trt)-Arg(Pm c) -Lys (B oc) -Glu (OBu1) -Ser (Bu1) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro-Pro-Ala-Lys (B oc)-Leu-Gln (Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP resina. Após Boc-Gly ter sido, finalmente, introduzido por DCC/HOBt, 0 péptido protegido, em resina, resultante, (1,3 g) foi tratado com uma solução de TFA-cloreto de metileno a 4% (15 mL), durante 15 minutos. O péptido em resina foi recuperado por filtração, foi lavado 132 várias vezes com cloreto de metileno (30 mL) , foi lavado com DIEA a 4% (10 mL) e, seguidamente, com cloreto de metileno (30 mL). O péptido de-Pis em resina, resultante, (cerca de 1,3 g) foi dilatado com NMP (10 mL), foram ai adicionados cloridrato de carbodi-imida solúvel em água (191,7 mg, 1,0 mmol), HOBt (135,2 mg, 1,0 mmol) e n-heptilamina (115,2 mg, 1,0 mmol) e foi permitida a reacção durante 8 horas. A resina foi recuperada por filtração, lavada com NMP e cloreto de metileno e seca sob vácuo, para originar cerca de 1,2 g de péptido protegido em resina, em que o residuo Asp 3 se encontrava heptilamidado. Foi ai adicionado um reagente de desprotecção (10 mL), consistindo em TFA a 88%-fenol a 5%-TIPS a 2%-H20 a 5% e foi misturado à temperatura ambiente, durante 2 horas. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos resíduos resultantes, para formar precipitados. Os precipitados foram recuperados por filtração e secos, para originar cerca de 550 mg de péptido bruto.

Foram dissolvidos 200 mg deste produto em 10 mL água e foram aplicados à YMC-PackPROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) e foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 54% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: lOmL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar cerca de 120 mg do produto pretendido. 133

Composto 61. [Lys3(Octanoil)]-hGrelina;

GSK (CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Foi tratado Fmoc-Arg(Pmc)-HM-resina (403 mg, 0,25 mmol, um produto de ABI, Ltd) com piperazina a 20%, durante 20 minutos e foi submetido, repetidamente, à introdução de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt e eliminação de Fmoc por piperazina, sequencialmente, para construir

Boc-Gly-Ser(tBu)-Lys(Mtt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu (OBu3) -Hi s (Boc )-Gin(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gin(Trt)-Arg(Pmc)-Lys (Boc) -Glu (OBu1) -Ser (Bu1) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro-Pro-Ala-Lys (Boc) -L eu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP resina. Foram tratados cerca de 300 mg do péptido protegido em resina, resultante, com solução de TFA 1%-TIPS 5%-cloreto de metileno (15 mL), durante 60 minutos. O péptido em resina foi recuperado por filtração e lavado várias vezes com cloreto de metileno (30 mL), lavado com DIEA a 10% (10 mL) e, seguidamente, com cloreto de metileno (30 mL) . O péptido de-Mtt em resina resultante (cerca de 300 mg) foi dilatado com NMP (2 mL), foi ai adicionado ácido octanóico (40 pL, 0,25 mmol) e DCC (52 mg, 0,25 mmol), na presença de HOBt (34 mg, 0,25 mmol) e foi permitida a reacção durante a noite. A resina foi recuperada por filtração, lavada com NMP e, seguidamente, com cloreto de metileno e seca sob vácuo, para originar cerca de 300 mg de péptido protegido em resina, em que o 3o residuo de lisina foi adicionado de octanoílo. Foi aí adicionado um reagente desprotecção (5 mL) consistindo em TFA a 88%-fenol a 5%-TIPS a 2%-H20 a 5% e foi misturado à temperatura ambiente, durante 2 horas. A resina foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado, seguido pela adição de éter aos 134 resíduos resultantes, para formar precipitados. Os precipitados foram separados por filtração e foi seco, para originar cerca de 234 mg de péptido bruto.

Este produto foi dissolvido em 6 mL de ácido acético, foi aplicado à YMC-Pack ODS-A (5 pm, 20 mm x 250 mm) e foi eluído com um gradiente linear de 0 a 60% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.), durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar cerca de 100 mg de pó. Este produto foi dissolvido em 2 mL de ácido acético a 50%, foi aplicado à YMC-PackPROTEIN-RP (5 pm, C4, 20 mm x 250 mm) e foi eluído com um gradiente linear de 0 a 60% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 10 mL/min.] ) , durante 60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar cerca de 52 mg de pó.

Os compostos seguintes foram produzidos, da mesma forma que na preparação dos Compostos 55 ou 61, descrita acima.

Os resultados da espectrometria de massa e da análise da composição em aminoácidos dos derivados petídicos sintetizados pelo método Fmoc convencional, são resumidos abaixo.

Composto 54. [Asp3 (O-Heptil)]-hGrelina (1-28) ESI-MS 3371,0 (teórico: 3370,9), composição em aminoácidos: Asx; 0,99 (1), Ser; 2,70 (3), Glx; 5,87 (6), Gly; 1,01 (1), Ala; 1,01 (1), Vai; 0,94 (1), Leu; 2, Phe; 1,00 (1), Lys; 4,02 (4), His; 1,00 (1), Arg; 2,98 (3), Pro; 3,84 (4) 135

Composto 55. [Asp3 (NH-Heptil)]-hGrelina (1-28) ESI-MS 3370,0 (teórico: 3369,9), composição em aminoácidos: Asx; 0,88 (1), Ser; 2,95 (3), Glx; 5,97 (6), Gly; 1,21 (1), Ala; 1,03 (1), Vai; 0,98 (1), Leu; 2, Phe; 1,00 (1), Lys; 3,94 (4), His; 0,92 (1), Arg; 2,91 (3), Pro; 3,99 (4)

Composto 56. [Dap3(Octanoil)]-hGrelina ESI-MS M; 3370,0 (teórico: 3369, 9), composição em aminoácidos: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,94 (3), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,00 (1), His; 0,91 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3, 93 (4), Phe; 0, 99 (D, Pro; 4,01 (4), Ser; 2,88 (3), Vai; 0,98 (D, Dap; N.D.

Composto 58. [Adod3]-hGrelina (1-28)

ESI-MS M; 3355,0 (teórico: 3355, 0), composição em aminoácidos: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,91 (3) , Glx; 5,95 (6), Gly; 1,01 (1), His; 0, 91 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3, 94 (4), Phe; 0, 99 (1), Pro; 4,02 (4) , Ser; 2,88 (3), Vai; 0, 96 (D

Composto 61. [Lys3(Octanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3412,0 (teórico: 3412, 0), composição em aminoácidos: Ala; 1,05 (1) , Arg; 3,05 (3), Glx; 6,02 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1, 00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 5,11 (5) , Phe; 0, 97 (D, Pro; 4,20 (4) , Ser; 2,68 (3), Vai; 1,00 (D 136

Composto 62. [Trp3]-hGrelina

ESI-MS M; 3343,0 (teórico: 3343,9), composição em aminoácidos: Ala; 1,00 (1 ) , Arg; 3,03 (3), Glx; 5, 94 (6) , Gly; 1,01 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4,00 (4) , Phe; 0, 99 (D , Pro; 3,96 (4), Ser; 2 ,60 (3), Trp; N.D., Vai; 0, 98 (D

Composto 63. [Phe3]-hGrelina ESI-MS M; 3305,0 (teórico: 3304, 8) , composição em aminoácidos: Ala; 0,99 (1), Arg; 2,96 (3) , Glx; VO co LO (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3, 98 (4) , Phe; 2,01 (2) , Pro; 3,99 (4), Ser; 2,67 (3), Vai; 0, 98 (D

Composto 64. [Cha3] -hGrelina ESI-MS M; 3411,0 (teórico: 3410,9), composição em aminoácidos: Ala; 1,02 (1) , Arg; 3,01 (3), Glx; 5, 92 (6) , Gly; 1—1 O 1—1 (1) , His+Cha ; 2,01 (1+1), Leu; 2 (2), Lys; 4,02 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 4,03 (4), Ser; 2,72 (3), Vai; 0,97 (D

Composto 65. [2-LNal3]-hGrelina ESI-MS M; 3354,0 (teórico: 3354, 9), composição em aminoácidos: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,95 (3) , Glx; 5, 87 (6) , Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3, 98 (4) , Phe; T—1 O T-1 (1), Pro; 3,94 (4), Ser; 2,73 (3), Vai; 0, 97 (D , Nal; N.D. (D 137

Composto 66. [2-°Nal3]-hGrelina ESI-MS M; 3355,0 (teórico: 3354, 9), composição em aminoácidos: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,95 (3) , Glx; 5,96 (6) , Gly; 1,00 (1), His; 0,92 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,94 (4), Phe; 0, 99 (D , Pro; 4,02 (4), Ser; 2,91 (3), Vai; 0, 98 (D, Nal; N. D. (2)

Composto 70. [Leu3]-hGrelina ESI-MS M; 3270,0 (teórico: 3270, 8) , composição em aminoácidos: Ala; 0,99 (1), Arg; 2,95 (3) , Glx; CO co LO (6) , Gly; 1,01 (1), His; 1,00 (1), Leu; 3 (3) , Lys; 3, 96 (4) , Phe; O 0 1 1 (D , Pro; 3,89 (4), Ser; 2,65 (3), Vai; 0, 97 (D

Composto 71. [Ile3]-hGrelina ESI-MS M; 3270,0 (teórico: 3270,8), composição em aminoácidos: Ala; 0,98 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5, 87 (6) , Gly; 0,99 (1), His; 1,01 (1), Ile; 0,98 (1), Leu; 2 (2) , Lys; 3, 97 (4), Phe; 1,00 (1), Pro; 3,97 (4), Ser; 2,65 (3), Vai; 0, 98 (D

Composto 72. [Lys3(Octanoil)]-hGrelina ESI-MS M; 3286,0 (teórico: 3285, 8), composição em aminoácidos: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,94 (3) , Glx; 5,95 (6), Gly; 0,99 (1), His; 0,92 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4, 92 (5) , Phe; 0, 99 (1), Pro; 4,02 (4), Ser; 2,91 (4), Vai; 0, 99 (D 138

Composto 73. [Nle3] -hGrelina ESI-MS M; 3270,0 (teórico: 3270, 8), composição em aminoácidos: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,98 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2(2), Lys; 4,01 (4) , Phe; 1,01 (D, Pro; 4,01 (4), Ser; 2,71 (3), Vai; 0, 98 (D, Nle; N.D. (1)

Compostos 74. [Vai3]-hGrelina ESI-MS M; 3256,0 (teórico: 3256, 8), composição em aminoácidos: Ala; 0,98 ( 1) , Arg; 2,96 (3) , Glx; 5,84 (6) , Gly; 1,00 (1), His; 1,01 (1) , , Leu; 2 (2), Lys; 3, 97 (4), Phe; 0, 99 (D, Pro; 3,94 (4), Ser; 2,64 (3), Vai; 1, 97 (2)

Composto 80. [Aib1, His2, °Nal3, DPhe4, Lys5]-Grelina (1-5)-amida; Ipamorelina ESI-MS [M+H]; 712,5 (teórico: 711,9), composição em aminoácidos: Phe; 1, His; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1)

Exemplo 11. Comparação da actividade entre compostos do tipo peptidico derivados da grelina

As actividades de libertação de Ca dos compostos do tipo peptidico derivados da grelina, sintetizados no Exemplo 10 e do péptido da Grelina natural foram medidas, da mesma forma que no Exemplo 1. 139 (1) Modificação de uma cadeia lateral da 3a serina A. Posição de um grupo octanoilo A caracteristica estrutural significativa da grelina reside no grupo octanoilo do grupo hidroxilo da 3a serina. Em primeiro lugar, foi examinado se é vantajoso para a actividade que a posição de serina a ser octnalizada seja a 3a posição. Neste exame, foi utilizada a actividade intracelular de libertação de Ca em células CHO expressando o receptor da GSH de rato, como indicador.

Com base na grelina (1-9) amida (um derivado de grelina de cadeia curta) cujo valor de EC50 se manteve a 5,4 nM, foram sintetizados [serina2 (octanoil), serina3]-grelina (1-9) amida, [serina2 (octanoil)]-grelina (1-9) amida e [N“-octanoil serina3]-grelina (1-9) amida e foi examinada a sua actividade intracelular de libertação de Ca.

Os resultados são resumidos na Tabela 4. 140

Tabela 4

Actividade do derivado da grelina 1 Estrutura do Composto EC5o da actividade de libertação de Ca (nM) 1. Grelina humana GSS(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1,3 2. Grelina de rato GSS(CO-C7H15)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 1,5 3. Grelina (l-9)-amida H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Gl u-His-Ntb 5,4 4. [Ser'* (Octanoil) , SerJ]-Grelina (1-9)-amida H-Gly-Ser(CO-C7H15)-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Gl u-His-NH2 1100 5. [Ser“* (Octanoil) ]-Grelina (1-9)-amida H-Gly-Ser (CO-C7H15) -Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-S er-Pro-Glu-His-NH2 1400 6. [N-octanoil, SerJ]-Grelina (1-9)-amida C7Hi5CO-Gly-Leu-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-Hi s-NH2 >10000 A actividade foi reduzida para cerca de 1/200, por transferência de um grupo octanoilo da 3a serina para 2a serina, na grelina humana (EC50 = 1100 nM). O derivado tendo grupos octanoilo em ambas as 2a e 3a posições apresentou, também, uma actividade reduzida (EC5q = 1400 nM) . 141

Além disso, a actividade foi relativamente enfraquecida pela adição de N-octanoilo, apenas, no grupo amina do terminal amina (EC50 > 10000 nM) . A partir destes resultados, foi verificado que a posição do aminoácido modificada com um grupo octanoilo é, particularmente, de um modo preferido, a 3a posição na molécula da grelina. B. Comprimento da cadeia de um ácido gordo A actividade intracelular de libertação de Ca do derivado sem octanoilo, derivado da grelina de rato por eliminação do grupo octanoilo da cadeia lateral da 3a serina foi de 3500 nM, em comparação com a actividade da grelina adicionada de octanoilo (2,6 nM) e, deste modo, é evidente que o grupo octanoilo da cadeia lateral da 3a serina desempenha um papel muito importante na expressão da actividade.

Consequentemente, foi examinada a relação entre a actividade e o número de átomos de carbono do grupo acilo da cadeia lateral da serina, na grelina de rato, utilizando vários ácidos gordos saturados. Ou seja, foram determinadas as actividades de libertação de Ca intracelular dos derivados da grelina, em que o grupo hidroxilo da 3a serina foi acilado com um grupo acetilo (CH3CO-) , grupo propionilo (CH3CH2CO-), grupo butirilo (CH3(CH2) 2CO-), grupo hexanoílo (CH3(CH2) 4CO-), grupo decanoilo (CH3 (CH2) sCO-) , grupo lauroilo (CH3 (CH2) 10CO-) e grupo palmitoilo (CH3 (CH2) 14CO-) .

Os resultados são resumidos na Tabela 5. 142

Tabela 5

Actividade do derivado da grelina 2 Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 7. [SerJ]-grelina de rato GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 3500 8. [SerJ (Acetil)]-rGrelina GSS (CO-CH3) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 780 9. [SerJ (Propionil) ] -rGrelina GSS (CO-C2H5) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR n.t. 10. [Sera (Butiril)]-rGrelina GSS (CO-C3H7) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 280 11. [SerJ (Hexanoil)]-rGrelina GSS(CO-C5H11)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 16 12. [SerJ (Decanoil)]-rGrelina GSS(CO-C9H19)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 1,7 13. [SerJ(Lauroil)]-rGrelina GSS (CO-C11H23) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 2,4 14. [Ser^(Palmitoil)]-rGrelina GSS (CO-C15H31) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 6, 5

Na tabela, "n.t". indica que a amostra não foi testada. A influência do comprimento da cadeia do ácido gordo sobre a actividade foi incrementalmente significativa, com um valor de EC50 de 780 nM para os derivados da grelina tendo um grupo acetilo (C2) e um valor de EC50 de 280 nM para os derivados da grelina tendo um grupo butanoilo (C4), os derivados da grelina tendo o grupo hexanoílo (C7) ocasionaram um aumento adicional na 143 actividade de libertação de Ca (valor de EO50, 16 nM) e o grupo octanoílo da grelina permitiu que actividade de libertação de Ca alcançasse um máximo (valor de EO50, 1,5 nM) . Mesmo os derivados da grelina tendo o grupo decanoílo (CIO) mantiveram uma actividade de libertação de Ca (valor de EO50, 1,7 nM) semelhante à da grelina e, além disso, o valor de EC50 foi de 2,4 nM para os derivados da grelina tendo um grupo lauroilo (C12) e 6,5 nM para os derivados da grelina tendo um grupo palmitoilo (Cl 6), indicando, deste modo, que a actividade de libertação de Ca foi mantida, mesmo quando foi aumentado o comprimento da cadeia de ácido gordo. C. Substituição de vários grupos acilo

Os derivados da grelina humana foram preparados pela ligação de ácido 3-fenilpropiónico (HO-CO-CH2CH2Ph) , como um exemplo tipico de um ácido gordo aromático, ácido 3-octenóico (CH3 (CH2) 3CH=CH-CH2COH) , como um exemplo tipico de um ácido gordo não saturado ou ácido 4-metilpentanóico ( (CH3) 2CH-CH2CH2C02H), como um exemplo tipico de um ácido gordo ramificado, em vez de ácido gordo saturado, através de uma ligação éster, ao grupo hidroxilo da 3a serina e a sua actividade foi examinada. D. Conversão em grupos alquilo

Podem ser formados derivados da grelina, quimicamente estáveis, pela conversão da ligação éster, quimicamente instável, numa ligação éter ou tioéter, quimicamente estável ou semelhante. No entanto, será óbvio que a manutenção da actividade é uma imposição para esta conversão. 144

Consequentemente, foram examinados para a sua actividade, um derivado de éter da grelina humana em que a 3a serina foi octilada (CeHi7) e um derivado tioéter da grelina de rato em que a 3a serina foi substituída por uma cisteína e foi octilada.

Além disso, foi preparado um derivado da grelina humana em que a 3a serina foi benzilada (-CH2Ph) e um derivado da grelina humana em que a 3a serina foi substituída por cisteína e foi tritilada (—C(Ph)3) .

Os resultados são resumidos na Tabela 6. São mostradas as actividades de libertação de Ca do derivado da grelina humana, em que a 3a serina foi benzilada(-CH2Ph) e do derivado da grelina humana, em que a 3a serina foi substituída por cisteína e tritilada (—C(Ph)3), assim como, respectivamente, a dos Compostos 67 e 68, na Tabela 13. É, também, mostrada a actividade de libertação de Ca do derivado da grelina humana, em que foi ligado ácido 4-metilpentanóico ( (CH3) 2CH-CH2CH2C02H) ao grupo hidroxilo da 3a serina, através de uma ligação éster, assim como, a do Composto 69, na Tabela 13. 145

Tabela 6

Actividade do derivado da grelina 3 Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 15. [SerJ (3-Fenilpropionil) ] -hGrelina GSS (CO-CH2CH2Ph) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1,4 16. [SerJ (3-0ctenoil) ] -hGrelina 1,7 GSS (CO-CH2CH=CH (CH2) 3CH3) ) FLSPEHQRVQQRKESKK PPAKLQPR 17. [SerJ (Octil)]-hGrelina GSS (C8Hi7) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1,2 18. [CysJ (Octil)]-rGrelina GSC (C8Hi7) flspehqkaqqrkeskkppaklqpr 5,4 A introdução do grupo 3-octenoilo, como um exemplo de ácido gordo não saturado, na cadeia lateral da 3a serina, ocasionou uma actividade de libertação de Ca semelhante à actividade dos derivados da grelina tendo um grupo octanoilo (EC50 = 1,7 nM) .

De um modo interessante, mesmo se foi introduzido um grupo fenilpropionilo, a actividade de libertação de Ca foi mantida elevada (EC50 = 1,4 nM) e, mesmo se foi introduzido um grupo 4-metilpentanoílo (C 6), como um exemplo de ácido gordo ramificado, o valor da EC50 foi de 4,4 nM, indicando que foi mantida a actividade de libertação de Ca (Composto 69 na Tabela 13) , revelando, deste modo, que é não sempre necessário que o grupo acilo da cadeia lateral da 3a serina seja um grupo alcanoilo de cadeia linear. 146

Além disso, os valores de EC50 dos derivados éter e tioéter, que era expectável serem quimicamente estáveis, em que a 3a serina ou 3a cisteina foram octiladas, foram mantidos, respectivamente, em 1,2 nM e 5,4 nM, revelando deste modo que nem sempre é necessário que a cadeia lateral do resíduo de aminoácido na 3a posição seja um grupo acilo.

Além disso, os valores de EC50 das grelinas em que o resíduo de aminoácido da 3a posição foi substituído por Ser (Bzl) [ou seja, 0 derivado da grelina humana em que a 3 a serina foi benzilada (-CH2Ph)] ou por Cys(Trt) [ou seja, 0 derivado da grelina humana em que a 3a serina foi substituída por cisteina e tritilada (—C (Ph) 3) ] foram, respectivamente, de 7,6 nM e 20 nM, indicando, deste modo, que foi mantida a actividade de libertação de Ca (Compostos 67 e 68 na Tabela 13). (2) Determinação da região activa A actividade de libertação de Ca intracelular da grelina (16-28) contendo a região do terminal carboxilo original era relativamente baixa (EC50 > 10000 nM), enquanto que os valores da EC50 da grelina humana (1-15) e da grelina de rato (1-15) , contendo, ambas, a região do terminal amina original, foram, respectivamente, 7,0 nM e 8,6 nM, indicando, deste modo, que a actividade intracelular de libertação de Ca foi mantida e foi, deste modo, revelado que o local activo da grelina está presente na região do terminal amina (Tabela 7) . 147

Tabela 7

Actividade do derivado da grelina 4 Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 19. Grelina (16-28) H-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-pro-Ala-lysLeu-Gln-Pro-Ar g-OH > 10000 20. hGrelina (1-15) H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-OH 7,0 21. rGrelina (1-15) H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Ala-Gln-Gln-Arg-OH 8,6 22. [des Glni4]-rGrelina GSS(CO-C7H15)FLSPEHQKAQ RKESKKPPAKLQPR 1,5

Além disso, dado que as actividades da grelina humana e de rato (1-15) eram, praticamente, iguais, os aminoácido presentes na 11a e 12a posições (arginil-valil- na humana e -lisil-aranil-na de rato) não estão limitados a estes aminoácidos.

Os resultados da correlação entre a estrutura e a actividade, obtidos utilizando grelina humana ou de rato, podem ser aplicados, respectivamente, às grelinas de rato e humanas.

Além disso, a [des-glutamina14]-grelina de rato, preparada pela remoção da 14a glutamina da grelina, apresenta uma actividade de libertação de Ca (EC50 = 1,5 nM) semelhante à da 148 grelina de rato, indicando que o aminoácido intermédio da molécula da grelina pode ser eliminado. (3) Comprimento da cadeia peptidica e introdução de um grupo básico no terminal carboxilo

Com base na verificação de que a grelina (1-15) têm uma actividade relativamente significativa, foi preparado um derivado por eliminação, de um modo adequado, de resíduos de aminoácido do terminal carboxilo da grelina (1-15) e a sua actividade foi avaliada.

Na Tabela 8 são mostradas as actividades dos derivados de cadeia curta, tendo ácido carboxílico no terminal carboxilo e os derivados de cadeia curta, amidados no terminal carboxilo.

Tabela 8

Actividade do derivado da grelina 5 Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 23. hGrelina (1-11) H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-OH 15 24. rGrelina (1-11) H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-OH 15 149

Tabela 8 (continuação)

Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 25. Grelina (1-10) H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-OH 19 26. Grelina (1-9) H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-OH 38 27. Grelina (1-8) H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-OH 100 28. Grelina (l-8)-amida H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-NH2 13 29. Grelina (l-7)-amida H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro- nh2 2, 6 30. Grelina (l-6)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-Ser-NH2 4,8 31. Grelina (1-5) H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-OH 68 32. Grelina (l-5)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-NH2 6,2 33-1. Grelina (1-4) H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-OH 480 33-2. Grelina (l-4)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15)-Phe -NH2 160 34. Grelina (l-3)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -NH2 > 10000 150 A actividade de libertação de Ca da grelina (1-3) amida foi relativamente baixa (EC5o> 10000 nM) . A EC50 da grelina (1-4), adicionando fenilalanina à grelina (1-3), foi de 480 nM e a EC50 do seu derivado amida do terminal carboxilo foi de 160 nM, revelando, deste modo, que estes têm uma actividade significativa de libertação de Ca.

Além disso, a actividade da grelina (1-5) amida, adicionando a leucina à grelina (1-4) amida foi de cerca de 26 vezes mais elevada (EC50 = 6,2 nM) do que a da grelina (1-4) amida, revelando, deste modo, uma actividade de libertação de Ca ao mesmo nível que a da grelina natural. A actividade mais elevada de libertação de Ca foi encontrada na grelina (1-7) amida e o seu valor de EC50 foi quase equivalente à da grelina natural. A partir do resultado acima, o factor estrutural, essencial para a expressão da actividada da grelina, pode ser atribuído à sequência do 4a resíduo do terminal amina, mas uma vez que a sua afinidade para o receptor ou transdução de sinal da grelina é drasticamente melhorada pela adição de um resíduo, tal como leucina na 5a posição, de um modo preferido, é adicionado um resíduo, tal como leucina, na 5a posição.

Como é evidente a partir do resultado acima, a actividade de libertação de Ca tendeu a ser aumentada pela amidação do ácido carboxílico do terminal carboxilo.

Por exemplo, a actividade de libertação de Ca da grelina (1-9) após a amidação (EC50 = 5,4 nM) foi cerca de 7 vezes mais elevada do que a actividade antes da amidação (EC50 = 38 nM) e a 151 actividade de libertação de Ca da grelina (1-4) após a amidação (EC50 = 160 nM) foi cerca de 3 vezes mais elevada do que a actividade antes da amidação (EC50 = 480 nM) . Além disso, a actividade de libertação de Ca da grelina (1-8) amida (EC50 = 13 nM), produzida a partir da grelina (1-9) amida, por remoção do resíduo 9 de histidina básica, foi inferior à actividade da grelina (1-9) amida (EC50 = 5,4 nM), enquanto que a actividade de libertação de Ca da grelina (1-7) amida (EC50 = 2,6 nM) , produzida pela remoção de ácido glutâmico 8, como aminoácido acídico, foi mais elevada do que a actividade antes da remoção (EC50 = 13 nM) .

Um efeito de amidação consiste na neutralização da carga negativa do ácido carboxílico e o resultado acima indica que a basicidade do aminoácido do terminal carboxilo no derivado de cadeia curta contribui, significativamente, para o aumento da actividade.

Com base neste resultado, foram preparados derivados dotados de basicidade no terminal carboxilo, os quais são semelhantes à grelina (1-7) amida, apresentando actividade elevada e a sua actividade foi examinada.

Os resultados são mostrados na Tabela 9. 152

Tabela 9

Actividade do derivado da grelina 6 Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 35. [LysB]-Grelina (1-8)-amida H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Lys-NH2 1,1 36. [Arga] -Grelina (1-8)-amida H-Gly-Ser-Ser(CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-Arg-NH2 1,1 37. [Lysb]-Grelina (1-6)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-Lys-NH2 12 38. [Lyss] -Grelina (1-5)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-Lys-NH2 10 39. [DPhe\ Lys5] -Grelina (1-5)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -DPhe-Lys-NH2 1700 A actividade de libertação de Ca da [lisina6]-grelina (1-6) amida, tendo lisina adicionada no terminal carboxilo da grelina (1-5) (EC50 = 12 nM) , foi ligeiramente inferior à actividade da grelina (1-5) (EC50 = 4,8 nM) , enquanto que a actividade de libertação de Ca da grelina (1-4), tendo lisina adicionada no terminal carboxilo (EC50 = 10 nM) , foi cerca de 50 vezes mais elevada do que a actividade antes da adição (EC50 = 480 nM). Além disso, a actividade de libertação de Ca do derivado amida, tendo, respectivamente, arginina ou lisina adicionadas no terminal carboxilo da grelina (1-7) (EC50 = 1,1 nM) , foi muito mais significativa do que a actividade da grelina (1-7) amida (EC50 = 2,6 nM) . 153

Foi divulgado que, em quase todos os casos, a actividade é aumentada por dissimulação da acidez no terminal carboxilo e introdução de um grupo básico. (4) Resíduo glicina e 2a serina do terminal amina

Com base em ter sido verificado que a grelina (1-7) amida (EC50 = 2,6 nM) [Composto 29 na Tabela 8] ou a grelina (1-9) amida (EC50 = 5,4 nM) [Composto 3 na Tabela 4] têm actividade, foi examinada a influência da glicina e da 2a serina do terminal amina sobre a actividade.

Os resultados são resumidos na Tabela 10.

Tabela 10

Actividade do derivado da grelina 7 Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 40. [N-Aminopentanoil]-Grelina (3-7)-amida NH2- (CH2) 4-CO-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-Ser-Pro- nh2 3,4 41. [W-Acetil]-Grelina (1-10) CH3CO-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gl n-OH > 10000 42. [N-Tyr]-rGrelina YGSS(CO-C7H15)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 120 154

Tabela 10 (continuação)

Estrutura do Composto EC50 da actividade de libertação de Ca (nM) 43. [N-Glicil]-Grelina (3-7)-amida H-Gly-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 380 44. [Leu^]-Grelina (1-7)-amida H-Gly-Leu-Ser (CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 42 45. [His^] -Grelina (1-7)-amida H-Gly-His-Ser (CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 35 46. [Lys^]-Grelina (1-7)-amida H-Gly-Lys-Ser (CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 24 47. [Gly^]-Grelina (1-7)-amida H-Gly-Gly-Ser (CO-C7H15)-Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 78 A actividade da Na-acetil-grelina (1-10) , em que o grupo amina do terminal amina na grelina (1-10) foi bloqueado, foi relativamente baixa (EC50 > 10000 nM) . Como descrito acima, a actividade da [fP-ocatanoil, Serina3] -grelina (1-9) amida (Composto 6 na Tabela 1) foi, também, relativamente baixa (EC 50 A 10000 nM) e, deste modo, o grupo amina do terminal amina não é, de um modo preferido, bloqueado, de forma a expressar a actividade de libertação de Ca.

Por outro lado, a actividade de libertação de Ca da N^-aminopentanoil-grelina (3-7) amida, em que a glicina e a 2a serina do terminal amina foram substituídas por ácido 5-amino-n-pentanóico (NH2-(CH2) 4-CO-) tendo um comprimento dos 20S resíduos, foi, praticamente, mantida (EC50 = 3,4 nM) , a actividade de libertação de Ca da [N^-glicil]-grelina (3-7) amida, da qual tinha sido eliminada a 2a serina foi inferior (EC50 = 380 nM) e a actividade de libertação de Ca da 155 [N-tirosil]-grelina de rato, tendo um resíduo de tirosina adicionado no terminal amina da grelina de rato foi mais baixa (EC50 = 120 nM), pelo que é preferido, para obter uma actividade mais significativa, que o grupo amina do terminal amina esteja presente numa posição de um comprimento de 2 resíduos, a partir do octanoílo do 3o resíduo de serina até ao terminal amina.

Além disso, os valores de EC50 dos derivados da grelina (1-7) amida em que a 2a serina tinha sido substituída por leucina, glicina, histidina e lisina foram, respectivamente, de 42 nM, 78 nM, 24 nM e 35 nM, indicando uma actividade de libertação de Ca ligeiramente inferior à da grelina (1-7) amida.

Uma vez que este resultado indica que o 2 o resíduo de serina (-NH-CH (CH2OH)-CO-) pode ser substituído pela estrutura parcial -CH2-CH2-CO- no ácido aminopentanóico, o 2o resíduo de serina actua, pelo menos, como um espaçador para separar o grupo amina do terminal amina da grelina, através de uma distância pré-determinada do 3o grupo octanoílo. A razão pela qual foi mantida a actividade com a substituição do 2o resíduo de serina pelo ácido 5-aminopentanóico consiste na basicidade do terminal amina ter sido aumentada, pela introdução de alquilamina na sua estrutura.

Em resumo, é considerado que o grupo amina do resíduo de glicina do terminal amina confira basicidade ao terminal amina da molécula grelina, expressando, deste modo, a actividade da grelina e por isso o grupo amina no terminal amina não é, de um modo preferido, bloqueado.

Além disso, é considerado que o 2o resíduo de serina actua como um espaçador para separar o grupo amina do terminal amina 156 do 3o grupo octanoílo, através uma distância pré-determinada, e, consequentemente, o 2o resíduo de serina pode ser substituído por um aminoácido ou composto não-aminoácido tendo uma cadeia lateral relativamente menos volumosa. Ou seja, a posição do grupo octanoílo na molécula grelina é definida em relação ao grupo amina do terminal amina e esta relação posicionai constitui uma parte da estrutura activa da grelina.

Ou seja, a cadeia lateral do 2° aminoácido é, de um modo preferido, relativamente menos volumosa, tais como na serina, alanina e norvalina e não um aminoácido tendo uma estrutura volumosa e é preferido um resíduo de aminoácido que não restrinja a flexibilidade dos resíduos vizinhos, como o 2o aminoácido. Além disso, dado que a actividade de libertação de Ca da Na-aminopentanoil-grelina (3-7) amida é, praticamente, mantida (EC50 = 3,4 nM) , a 2a serina pode ser substituída por um composto não-aminoácido. (5) Actividade óptica do 3o e 4o resíduos de aminoácido

Com base na estrutura da grelina (1-7) amida, foram preparados os seus derivados, em que a 3a L-serina e a 4 a L-fenilalanina tinham sido substituídas pelos L-aminoácidos correspondentes e foi examinada a influência que a configuração do 3o e 4o aminoácidos tem sobre a actividade de libertação de Ca. Especificamente, com base na [serina3 (octil) ]-grelina (1-7) amida (EC50 = 5,8 nM) [Composto 50 na Tabela 11] e na [cisteína3(octil)]-grelina (1-7) amida (EC50 =7,4 nM) [Composto 48 na Tabela 11], que mantiveram uma boa actividade, foram preparados os seus derivados, em que a 3a serina e a 4a 157 fenilalanina tinham sido substituídas pelos correspondentes L- ou D-aminoácidos.

Os resultados são resumidos na Tabela 11. A partir destes resultados, tanto o 3o como o 4 o aminoácidos são, de um modo preferido, L-aminoácidos.

Tabela 11

Actividade do derivado da grelina 8 Estrutura do Composto CE 50 da actividade de libertação de Ca (nM) 48. [CysJ (Octil)]-Grelina (1-7)-amida H-Gly-Ser-Cys (C8Hi7) -Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 7,4 ~49~. [CysJ(Octil) , uPhe4] -Grelina (1-7)-amida H-Gly-Ser-Cys (C8Hi7) -DPhe-Leu-Ser-Pro-NH2 3000 50. [SerJ (Octil) ] -Grelina (1-7) -amida H-Gly-Ser-Ser (C8Hi7) -Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 5,8 51. [SerJ (Octil) , uPhe4] -Grelina (1-7)-amida H-Gly-Ser-Ser (C8H17) -DPhe-Leu-Ser-Pro-NH2 2200 52. [uSerJ (Octil) ] -Grelina (1-7)-amida H-Gly-Ser-DSer (C8Hi7) -Phe-Leu-Ser-Pro-NH2 > 10000 53. [°SerJ (Octil) , uPhe4]-Grelina (1-7)-amida H-Gly-Ser-°Ser (C8Hi7) -DPhe-Leu-Ser-Pro-NH2 > 10000 158 (6) Modo de ligação de uma cadeia lateral na 3a posição

Foram preparados derivados da grelina em que a ligação éster original foi substituída por éster na direcção inversa (Composto N° 54), uma amida (Compostos N° 55 e 56), um persulfureto (Composto N° 57) e metileno (Composto N°58), de forma a que a cadeia lateral na 3a posição tivesse o mesmo comprimento que a da cadeia da grelina (-CH2-O-CO-C7H15) . Além disso, foram preparados derivados éster tendo um impedimento estérico no átomo de carbono β do aminoácido da 3a posição (Compostos N° 59 e 60) e um derivado amida em que foram extendidas 3 unidades de metileno (Composto N° 61). Os resultados são resumidos na Tabela 12.

Tabela 12

Actividade do derivado da grelina 9 Estrutura do composto EC50 da Actividade (nM) 54 . [AspJ (O-Heptil)]-hGrelina GSD(O-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 5,1 55. [AspJ (NH-Heptil) ] -hGrelina GSD (NH-C7H15) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 11 56. [DapJ (Octanoil) ] -hGrelina GS-NH-lCH (CH2NHCO-C7H15) -co-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 2, 6 57. [CysJ(S-Heptil)]-hGrelina GSC(S-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1,4 159

Tabela 12 (continuação)

Estrutura do composto EC50 da Actividade (nM) 58. [AdodJ] -hGrelina GS-NH-CH(n-C10H21)-CO-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 0, 91 59. [ThrJ (Octanoil) ] -hGrelina GST(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 10 60. [Leu^, ThrJ (Octanoil) ] -hGrelina GLT(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 46 61. [LysJ (Octanoil) ] -hGrelina GSK(CO-C7H15)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 32 A actividade do Composto 58, em que a cadeia lateral na 3a posição tinha sido substituída, exclusivamente, por unidades de metileno, apresentou a actividade mais significativa (valor de ECso = 1 nM ou inferior). A actividade dos outros derivados foi variada, dependendo do tipo de ligação, mas foi confirmado que o modo de ligação de uma cadeia lateral do aminoácido 3 não exerce uma influência significativa sobre a actividade. (7) Hidrofobicidade de uma cadeia lateral na 3a posição

Foram preparados derivados em que 0 grupo Ser (octanoílo) 3 tinha sido substituído por um aminoácido hidrofóbico, a maioria dos quais são aminoácidos naturais e a sua actividade foi examinada. Os resultados são resumidos na Tabela 13. 160

Tabela 13 10. Actividade de derivados da Grelina Estrutura do Composto EC50 da Actividade (nM) 62. [TrpJ] -hGrelina GSWFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 31 63. [PheJ]-hGrelina GSFFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 2000 64. [ChaJ]-hGrelina GS-Cha-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 19 65. [2-LNalJ]-hGrelina GS-LNal-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 8,2 66. [2-uNalJ]-hGrelina GS-DNal-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR > 10000 67. [SerJ (Bzl)]-hGrelina GSS(CH2-C6H5)flspehqrvqqrkeskkppaklqpr 7,6 68. [CySJ(Tritil)]-hGrelina GSC (C-Ph3) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 20 69. [SerJ(4-Metilpentanoil)]-hGrelina GSS (CO-CH2CH2CH (CH3) 2) FLSPEHQRVQQRKESKKPP AKLQPR 4,4 70. [LeuJ] -hGrelina GSLFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 4400 71. [IleJ]-hGrelina GSIFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR > 10000 72. [LysJ]-hGrelina GSKFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 120 73. [NleJ]-hGrelina GS-Nle-FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 2800 74. [ValJ]-hGrelina GSVFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 1600 161

Os valores de EC50 dos derivados tendo um aminoácido hidrofóbico aromático, tais como triptofano, ciclo-hexilalanina ou naftilalanina na 3a posição foram, respectivamente, 31 nM, 19 nM e 8,2 nM, indicando que a actividade de libertação de Ca foi mantida. Inesperadamente, quando foi introduzida fenilalanina na 3a posição, a actividade de libertação de Ca foi ligeiramente baixa, mas mesmo se tiverem sido introduzidos Ser(Bzl) ou Cys(Tritil), mais hidrofóbicos, na 3a posição, a actividade de libertação de Ca foi mantida, de um modo semelhante e, deste modo, foi confirmado que é mais preferida a hidrofobicidade da cadeia lateral na 3a posição para a expressão da actividade.

Por um lado, quando um aminoácido hidrofóbico alifático, tal como, a leucina, isoleucina, norleucina ou valina foi

introduzido na 3a posição, a actividade de libertação de Ca dos derivados foi, geralmente, mantida, mas, ligeiramente, abaixo dos derivados que introduzem o aminoácido aromático. A actividade do Composto 73, tendo norleucina na 3a posição apresentou uma EC50 = 2800 nM, enquanto que a actividade da 6-amina-norleucina (lisina; Composto 72), tendo um grupo amina adicionado a uma cadeia lateral da norleucina, foi aumentada para 120 nM, em termos de valores de EC50, de forma que foi confirmado que, à semelhança da basicidade do terminal carboxilo, descrito acima é, também, preferida a basicidade de uma cadeia lateral na 3a posição. 162 (8) Derivados grelina de cadeia curta

Como descrito acima, foi verificado que um fragmento da grelina dos aminoácidos 1 a 4 do terminal amina apresenta actividade significativa e que esta actividade é, adicionalmente, aumentada pela adição de leucina na 5a posição do fragmento referido; o 3o residuo de aminoácido é, de um modo preferido, o que tem uma cadeia lateral hidrofóbica; a actividade é aumentada pela introdução de um residuo básico; e os resíduos de aminoácido 1 e 2 podem ser substituídos por um composto não-aminoácido, tendo um comprimento de 2 resíduos, tal como, um δ-aminoácido. Com base nestes resultados, foram preparados vários derivados de grelina de cadeia curta, baseados na região do terminal amina (1-5), como mostrado nos Compostos N° 76 a 87, nas Tabelas 14 e 15 e as suas actividades foram examinadas. Os resultados são resumidos nas Tabelas 14 e 15. 0 composto 80 é conhecido (Ipamorerin; K. Raum et al., Eur. J. of Endocrinol., 139: 552-561, 1998). 163

Tabela 14

Actividade do derivado da grelina 11 Estrutura do composto EC50 da Actividade (nM) 75. [Lys']-Grelina (l-7)-amida H-Gly-Ser-Ser (CO-C7H15) -Phe-Leu-Ser-Lys-NH2 11 76. [N-Aminopentanoil, SerJ(Octil), Lys5]-Grelina (3-5)-amida NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -Phe-Lys-NH2 12 77. [N-Aminopentanoilo, uSerJ (Octil) , DPhe4, Lys5]-Grelina (3-5)-amida NH2- (CH2) 4CO- DSer (C8Hi7) -DPhe-Lys-NH2 1600 78. [Aib1, His*, SerJ(Octil), Lys5]-Grelina (1-5)-amida H-Aib-His-Ser (C8Hi7) -Phe-Lys-NH2 34 "79^ [Aib1, His% “Ser5 (Octil) , uPhe4, Lys5]-Grelina (1-5)-amida H-Aib-His-DSer (C8Hi7) -DPhe-Lys-NH2 38 80. [Aib1, HisS uNalJ, uPhe4, Lys5]-Grelina (1-5)-amida H-Aib-His-DNal-DPhe-Lys-NH2 2,5

Dado que a actividade de libertação de Ca do Composto 80 conhecido foi elevada (2,5 nM), foi, também, examinada a actividade do Composto 79 derivado de Composto 80, pela substituição da 2-D-naftilalanina na 3a posição por D-octil serina e, em resultado, o seu valor de EC50 foi de 38 nM, indicando que a actividade foi mantida. O Composto 77, tendo D-octil serina e D-fenilalanina na 3a e 4a posições, tendo a mesma estrutura de aminoácidos que o Composto 79, excepto os 164 aminoácidos 1 e 2, apresentou uma actividade mais baixa (1600 nM) e estes resultados indicam que a sequência ou a estrutura dos aminoácidos 1 e 2 afectam, também, a configuração estérica das cadeias laterais do 3o e 4o aminoácidos, importantes para a manifestação da actividade.

Ou seja, no caso em que os aminoácidos 1 e 2 foram substituídos pelo ácido aminopentanóico, a actividade foi mantida em 34 nM, mesmo se 2-D-naftilalanina na 3a posição e a D-fenilalanina na 4a posição foram substituídas pelos seus L-aminoácidos correspondentes (Composto 78) e, deste modo, a sequência de aminoácidos (Gly-Ser) na Ia ao 2a posições da grelina requer a configuração L para os aminoácidos 3 e 4, mas, mesmo se os aminoácidos 3 e 4 tiverem a configuração D, a actividade é tornada significativa, pela introdução de outra sequência de aminoácidos, tal como, Aib-His. Foi também confirmado que, independentemente, da configuração L- ou D- na 3a e 4a posições, a actividade é expressa pela introdução de ácido aminopentanóico na Ia e 2a posições. 165

Tabela 15

Actividade do derivado da grelina 12 Estrutura do Composto EC5o da Actividade (nM) 81. [W-Aminopentanoil, Ser3 (Octil) ] -Grelina (3-5)-amida NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -Phe-Leu-NH2 11 82. [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil) ] -Grelina (3-5)-metilamida NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -Phe-Leu-NH-CH3 12 83. [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil)]-Grelina(3-5)-etilamida NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -Phe-Leu-NH-C2H3 22 84. [W-Aminopentanoil, Ser3 (Octil)]-Grelina(3-5)-benzilamida NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -Phe-Leu-NH-CH2-C6H5 98 85. [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil)]-Grelina (3-5), aminoetilamida NH2- (CH2) 4-CO-Ser (C8Hi7) -Phe-Leu-NH- (CH2) 2-NH2 3, 5 86. [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil), MePhe4, MeLeu5] -Grelina (3-5) -amida NH2- (CH2)4-CO-Ser(CSH17)-MePhe-MeLeu-NH2 82 87. [uLeua]-hGrelina GSS (CO-C7H15) f-dl-spehqrvqqrkeskkppaklqpr 220

Foi examinada a correlação entre a actividade e a estrutura da região do terminal carboxilo, utilizando [N-Aminopentanoil, Ser3 (Octil)]-Grelina (3-5) baseada na região do terminal amina (1-5) da grelina. A actividade dos seus derivados, em que a leucina do terminal carboxilo na 5a posição tinha sido 166 modificada com amida, metilamida, etilamida ou benzilamida foi mantida, mas tendeu a ser reduzida, como mostrado, respectivamente, por valores de EC50 de 11 nM, 12 nM, 22 nM e 98 nM. Por outro lado, a actividade foi aumentada pela substituição da etilamida por aminoetilamida, como mostrado por um valor de EC50 de 3,5 nM, revelando, deste modo, que é preferida a comunicação de basicidade ao terminal carboxilo da molécula da grelina.

Estes vários derivados amida do terminal carboxilo são compostos úteis, devido à sua resistência à decomposição in vivo com carboxipeptidases. 0 Composto 86 (EC50 = 86 nM) contendo ácido N-metilamino é, também, um composto útil devido à sua resistência às enzimas.

Exemplo 12. Actividade de libertação de GH dos derivados da grelina em ratos (1) Actividade de libertação de GH de vários derivados da grelina de cadeia longa em ratos

Foram administrados 18 nmol do Composto 17 ( [Ser3 (Octil)]-hGrelina)/kg, 30 nmol do Composto 18 ( [Cys3 (Octil)]-rGrelina)/kg, 100 nmol do Composto 65 ([2-LNal3]-hGrelina)/kg ou 18 nmol do Composto 15 ([Ser3(3-Fenilpropinil)]-hGrelina)/kg, rapidamente e intravenosamente, em ratos da variedade IGS-SD (com cerca de 7 semanas), sob anestesia com Nembutal, para cada amostra (n = 3) . Quinze minutos após a administração, foi recolhido plasma e a concentração da GH no plasma foi medida por radioimunoensaio (Biotrak/Amersham). Separadamente, foram administrados, 167 respectivamente, albumina do soro bovino (BSA) a 0,2%-soro fisiológico, 6 nmol de rGrelina e hGrelina/kg ou 80 nmol de Ipamorelin/kg (Composto 80) a outros ratos, como controlo e as concentrações de GH no plasma foram comparadas, 15 minutos após a administração (para cada amostra, n = 3).

Os resultados são mostrados na Tabela 13. O Composto 17 ([Ser3 (Octil)]-hGrelina), o Composto 18 ([Cys3(Octil)]-rGrelina) e o Composto 15 ([Ser3(3-PhPrl) ]-hGrelina) apresentam uma actividade significativa de libertação de GH e a actividade de libertação de GH da [2-LNal3] -hGrelina apresentou uma boa correlação com a actividade intracelular de libertação de Ca.

Tabela 16

Actividade de libertação de GH de vários derivados de grelina de cadeia longa Composto administrado Valor da dose nível de GH no plasma, 15 min. ECso (nM) (nmol/kg) após a administração (ng/mL) Rato Rato Rato M ± S.D. 1 2 3 Soro fisiológico - - 32 52 59 49 ± 12 hGrelina 1,3 6 1802 1613 2203 1873 ± 301 rGrelina 1,5 6 2056 1082 1205 1448 ± 530 Ipamorelina (Composto 80) 2,5 80 377 260 1184 607 ± 503 [Ser3 (Octil)]-hGrelina 1,2 18 1626 1602 1743 1657 ± 75 [Cys3 (Octil)]-rGrelina 5,4 30 2786 2342 2354 2494 ± 253 [Ser3(Fenilpropionil)] -hGrelina 1,4 18 2119 2078 1581 1926 ± 299 [2-LNal3] -hGrelina 8,2 100 1637 1576 1357 1524 ± 147 168 (2) Modificação de GH no plasma por administração de [Cys3(Octil)]-grelina de rato

Após o Composto 18 ([Cys(Octil)]-grelina de rato) ter sido administrado intravenosamente numa dose de 5 pg/cabeça, em ratos do sexo masculino da variedade Wistar (cerca de 260 a 280 g) , sob anestesia com Nembutal, foi medida a GH libertada para o sangue. Foram, também, administrados soro fisiológico e grelina de rato (5 pg /cabeça), como controlo e foram comparados com o Composto 18.

Como mostrado nas Tabelas 17 a 19, a actividade da [Cys3 (Octil) ]-grelina de rato promotora da secreção da GH foi equivalente à da grelina natural de rato (ou seja, Cmax da GH segregada foi cerca de 1100 ng/mL para ambas as grelinas) e, além disso, o tempo de secreção tendeu a prolongar-se. A actividade intracelular de libertação de Ca do Composto 18 foi 5,4 nM, em termos de ECso.

Tabela 17

Modificação do nível de GH no plasma por administração de [Cys3(Octil) ]-grelina de rato [Cys(C18)~ de rato 5 ]-grelina pg/cabeça Tempo (min) 0 5 10 15 20 30 60 Nível de Rato 1 377 338 687 927 900 469 98 GH no Rato 2 101 294 258 300 358 245 86 plasma Rato 3 59 476 949 1229 1417 704 133 (ng/mL) Rato 4 33 530 959 1451 1299 800 220 Rato 5 32 613 1060 1561 1359 726 122 Média 120 450 783 1093 1067 589 132 ±S.D. ±146 ±133 ±324 ±506 ±445 ±229 ±53 169

Tabela 18

Modificação do nível de GH no plasma, por administração de soro fisiológico

Soro fisiológico Tempo (min) 0 5 10 15 20 30 60 Nível de Rato 1 0 88 129 133 116 107 430 GH no Rato 2 204 122 118 134 128 69 36 plasma Rato 3 77 0 0 0 0 0 11 (ng/mL) Rato 4 0 0 0 0 48 27 110 Rato 5 0 0 0 0 0 0 210 Média 56 42 49 53 58 41 159 +S.D. ±89 ±58 ±67 ±73 ±61 ±47 ±170

Tabela 19

Modificação do nível de GH no plasma por administração de grelina de rato Grelina de rato 5 pg/cabeça Tempo (min) 0 5 10 15 20 30 60 Nível de Rato 1 143 186 425 405 215 56 3 GH no Rato 2 10 1396 2028 1566 876 242 27 plasma Rato 3 838 163 443 681 419 120 36 (ng/mL) Rato 4 348 556 1387 1469 1293 663 100 Rato 5 0 875 1380 1009 1414 452 20 Média 268 635 1133 1026 843 306 37 ±S.D. ±348 ±517 ±690 ±498 ±525 ±250 ±37 170

Exemplo 13. Acção de aumento do apetite da grelina (1) Acção de aumento do apetite por administração no ventrículo

Foi administrado soro fisiológico contendo grelina de rato, em várias concentrações, às 8:45 da manhã, nos ventrículos cerebrais de ratos do sexo masculino da variedade Wistar (16 a 20 animais por grupo), pesando, cada um, 300 a 325 g. Foi administrado soro fisiológico isento de grelina aos ventrículos, como controlo. Após a administração, foi permitida a alimentação ad libitum dos ratos e foi medida a quantidade de alimento tomado ao longo de 2 horas após a administração. Como mostrado na Fig. 6, foi observado um aumento da quantidade de alimento tomado, nos ratos aos quais foram administradas 50 pmol de grelina, intracerebroventricularmente e foi observado um aumento da quantidade de alimentos tomados, dependente da dose, em ratos aos quais foram administrados 200 pmol e 500 pmol de grelina, mas a quantidade de alimentos tomados foi reduzida nos ratos aos quais foram administrados 2 nmol de grelina. Normalmente, os ratos tomam o alimento à noite, de forma que de manhã, os ratos estão com o estômago cheio e raramente tomam alimentos (ver o rato ao qual foi administrado soro fisiológico como controlo, na Fig. 6) e, deste modo, o aumento da quantidade de alimentos tomados através da administração de grelina no ventrículo cerebral, indica que grelina tem uma acção de aumento do apetite. 171 (2) Acção de aumento do apetite por administração intravenosa

Foram administrados 50 pg de grelina de rato/kg, intravenosamente, nas veias da cauda de ratos SD (Sprague-Dawley) (5 animais) e de ratos Wister (4 animais) do sexo masculino, com 9 meses e foi medida a quantidade de alimentos tomados durante 2 horas após a administração (avaliada das 16:00 às 19:00 da tarde). Como mostrado na Tabela 20, a quantidade de alimentos tomados foi aumentada, de um modo evidente, pela administração intravenosa da grelina, em comparação com a quantidade de alimentos tomados sem administração de grelina de rato, a qual foi determinada utilizando o mesmo animal na mesma hora num outro dia. Ou seja, foi demonstrado que a grelina tem uma acção de aumento do apetite, mesmo por administração intravenosa.

Tabela 20

Quantidade de alimentos tomado (g) estirpe N° do Rato Administração de Sem administração de grelina grelina S-D 1 3,2 2,2 2 3,7 1,0 3 3,2 0,1 4 2,7 1,3 5 2,6 0,8 Média 3,1 1,1 S.D. 0,4 0,8 172 (continuação)

Quantidade de alimentos tomado (g) estirpe N° do Rato Administração de Sem administração de grelina grelina Wister 6 2,3 0,2 7 1,9 1,4 8 1,6 0,1 9 2,1 0,3 Média 2,0 0,5 S.D. 0,3 0,6

Exemplo 14. Aumento da funções gástrica pela grelina

Foi realizada seguinte experiência, para avaliar o efeito da grelina sobre a função gástrica. Foram submetidos a jejum ratos da estirpe SD do sexo masculino (7 a 8 semanas, pesando 200 a 280 g) , durante 20 ou mais horas e foram, seguidamente, utilizados na experiência. Os ratos foram anestesiados pela administração intraperitoneal de uretano (1,25 g/kg) e foram mantidos quentes, utilizando uma almofada de aquecimento e uma luz de aquecimento. Foi inserida uma cânula traqueal, o esófago foi ligado com fio de seda e cada rato foi submetido à seguinte operação de medição da secreção do ácido gástrico ou da motilidade gástrica. Na experiência utilizando o animal consciente, o rato foi submetido à operação da medição da secreção de ácido gástrico ou da mobilidade gástrica, sob anestesia leve, por inalação de éter.

Na experiência da secreção de ácido gástrico sob anestesia com uretano, a operação foi realizada de acordo com o método proposto por Ohno et al. [Ohno, T., et al., Jpn. J. Pharmacol. 173 43, 429-439 (1987)]. Resumidamente, o abdómen foi sujeito a incisão, na posição supina e o estômago e o duodeno foram expostos. Foi inserido um tubo de polietileno na parte dianteira do estômago, para preparar uma fistula gástrica aguda. Foi inserido outro tubo de polietileno no estômago, após divisão do duodeno e a parte circundante do piloro foi ligada e fixada. 0 conteúdo do estômago foi infundido com soro fisiológico, o qual foi ajustado para pH 7,0, num reservatório e foi aquecido a 37 °C. Caudal foi de 1,0 mL/min. O fluido de infusão foi ajustado para pH 7,0 por titulação com NaOH 100 mM, utilizando uma unidade fixadora de pH (Hiranuma, Comitite-8) . Após ter sido confirmado que uma quantidade básica da secreção de ácido gástrico estava estável, o produto químico do teste foi administrado intravenosamente e foi medida a taxa de secreção de ácido gástrico, em intervalos de 5 minutos. Foram utilizadas quatro ratos em cada grupo.

Na experiência durante a vigília, o rato foi submetido à mesma operação sob anestesia leve, por inalação de éter e, seguidamente, foi realizado um pequeno corte no flanco e foi extraído um tubo de infusão a partir do corpo. O estômago e o duodeno expostos foram recolocados no abdómen, o local de excisão foi suturado e o animal foi fixado, deitado de costas, numa jaula de fixação de ratos do tipo Ballman e, após ter sido confirmado que o rato recuperou da anestesia, o rato foi submetido à experiência. 0 esófago foi ligado, mas não foi inserida uma cânula na traqueia.

Na experiência para a medição da motilidade gástrica sob anestesia com uretano, foi utilizado um método com um balão miniaturizado, de acordo com o método proposto por Takeuchi e

Nobuhara [Takeuchi, K. e Nobuhara, Y., Digestive Diseases and 174

Sciences 30, 1181-1188 (1985)]. Ou seja, foi inserido um balão cheio de água e um cateter de suporte no estômago, após divisão da parte dianteira do estômago. Este foi fixado de forma a situar-se numa glândula da linha gástrica e uma extremidade do cateter foi ligado a um transdutor de pressão (LPU-0.1-350-0-II, de Nihon Kohoden Corporation) . Após ter sido confirmado que a motilidada gástrico estava estável, o produto químico de teste foi administrado intravenosamente, cumulativamente, em intervalos de 60 minutos. Para a motilidade gástrica, foram medidos a amplitude da pressão interna no estômago e o número de reacções de encolhimento na motilidade por encolhimento, tendo uma amplitude de H20 de 20 ou mais cm, em intervalos de 10 minutos. Foram utilizados quatro animais em cada grupo. Na experiência que utilizou animais conscientes, o rato foi submetido à mesma operação sob anestesia leve, por inalação de éter e, após o local de excisão ter sido foi suturado, o animal foi fixado na posição de pronação numa jaula de fixação de ratos do tipo Ballman. Após ter sido confirmado que o rato estava recuperado da anestesia, o animal foi submetido à experiência.

Foram dissolvidas grelina de rato e dicloridrato de histamina em soro fisiológico e foram administrados na veia da cauda, numa dose de 1 mL/kg. Foi administrado, subcutaneamente, sulfato de atropina, 30 minutos antes da administração da grelina, para verificar se a acção do nervo vago estava envolvida na acção da grelina ou se os feixes de nervo vago cervicais tinham sido cortados bilateralmente. Foi administrada, subcutaneamente, famotidina (Gaster®, produzida por Yamanouchi Pharmaceutical Co, Ltd.), 30 minutos antes da administração da grelina, para verificar o envolvimento do receptor H2 da histamina na acção da grelina. Os resultados são mostrados como médio ± erro padrão. A análise estatística foi realizada, 175 utilizando testes múltiplos de comparação de Dunnett. 0 valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Como mostrado na Fig. 7A e na Tabela 21, a secreção de ácido gástrico foi promovida, de uma forma dependente da dose, após a administração intravenosa de grelina de rato, numa dose de 0,8 a 20 pg/kg, num rato sob anestesia de uretano.

No rato sob anestesia, a motilidade espontânea do estômago não foi, praticamente, observada antes da administração da grelina. Quando foi administrada grelina de rato intravenosamente, numa dose de 0,8 a 20 pg/kg, num rato com esta patologia, tanto a amplitude como a frequência da motilidade gástrica foram promovidas, como mostrado nas Fig. 8A e B e na Tabela 21. Estas reacções foram observadas, imediatamente, após a administração da grelina de rato. A secreção de ácido gástrico foi aumentada pela administração de 20 pg/kg, atingiu o nivel máximo ao fim de 20 minutos e diminuiu, gradualmente, durante 90 minutos após a administração. Como mostrado nas Fig. 7 A e B, a reacção máxima na acção promotora da secreção de ácido gástrico pela administração de 20 pg de grelina de rato/kg foi quase comparável à reacção induzida pela administração intravenosa de 3 mg de histamina/kg. A acção de promoção da amplitude da motilidade gástrica atingiu a reacção máxima ao fim de 10 minutos, em qualquer dose e a acção foi gradualmente reduzida pela administração de 20 pg de grelina/kg, até 50 minutos após a administração.

Além disso, como mostrado na Tabela 21, a acção de promoção da secreção gástrica induzida pela administração de 20 pg de grelina de rato/kg foi inibida, quase completamente, pelo pré-tratamento com atropina ou vasotomia cervical bilateral, mas 176 esta acção não foi afectada pelo pré-tratamento da administração subcutânea de 1 mg de famotidina/kg, i. e., um antagonista do receptor de H2 da histamina. Além disso, a acção de promoção da motilidade gástrica induzida pela administração de grelina de rato foi completamente inibida pelo pré-tratamento com atropina ou vagotomia cervical bilateral. A partir destes resultados, foi confirmado que a acção de promoção da grelina sobre as funções gástricas não ocorre através do mecanismo histaminérgico, mas sim, através da activação do sistema do nervo vago. A secreção de ácido gástrico foi promovida, em ratos conscientes, da mesma forma que nos ratos sob anestesia com uretano, pela administração intravenosa de grelina de rato (4 e 20 pg/kg) . Em comparação com um rato sob anestesia, um rato consciente apresentou motilidade gástrica espontânea antes da administração do produto químico de teste e mesmo neste estado, a motilidade gástrica foi promovida juntamente com a sua amplitude e frequência, pela administração de 0,8 a 20 pg de grelina de rato/kg, ao rato. A partir do resultado acima, foi confirmado que, pela administração intravenosa da grelina, a promoção da secreção de ácido gástrico e promoção da motilidade gástrica ocorre não, apenas, num rato anestesiado mas, também, num rato consciente. 177

Tabela 21

Tratamento Secreção de ácido Motilidade gástrica gástrico (p equivalente/60 min.) Frequência (tempos/60 min) Amplitude (cm H2O/60 min.) Soro fisiológico 17,611,2 1,311,0 1,711,0 Grelina de rato Injecção i.v. de 0,8 pg/kg 24,512,2 35,5118,1 6,714,4 Injecção i.v. de 4 pg/kg g/kg 23,512,6 60,8125,6 11,115,3 Injecção i.v. de 20 pg/kg 43,314,6 (*1) 100, 5120, 4 ( *1) 21,812,5 (* 1) InjecçSo intravenosa de 20 pg de 1 administração subcutânea de 1 mg de atropina/kg 26,113,9(*2) 0 (*3) 0 (*3) grelina de rato/kg + remoção do nervo vago 18,413,7(*3) 0 (*3) 0 (* 3) Injecção intravenosa de 20 pg de grelina de rato/kg + administração subcutânea de 1 mg de famotidina/kg 43,014,2 NT NT

Os símbolos na tabela indicam: *1, p <0,01; *2, p <0,05; e *3, p <0,01 NT: NSo testado.

Exemplo 15. Acção promotora do crescimento celular da grelina e dos derivados da grelina

Foi realizada a seguinte experiência, para examinar a acção promotora do crescimento celular da grelina administrada. Foram administrados, respectivamente, vinte pg de grelina de rato ou de grelina de rato do tipo tioéter (Composto 18 [Cys3(octil)]-hGrelina)/kg nas veias da cauda de ratos Wister do sexo masculino (7,5 semanas). Dezassete horas após a 178 administração, foi administrada 3H-timidina nas veias da cauda e, após 1 hora, foram excisados o duodeno, o jejuno e a medula óssea. Foi medida a incorporação 3H-timidina nas fracções de ADN destes tecidos, para examinar a acção de promoção do crescimento celular da grelina e dos derivados da grelina. Os tecidos foram cortados finamente e foram homogeneizados, utilizando um homogenizador Polytron e, após a centrifugação, o sobrenadante foi precipitado com ácido tricloroacético, para originar uma fracção de ADN. A radioactividade da fracção de ADN foi medida por um contador de cintilação liquida.

Como mostrado na Tabela 22, a incorporação de 3H-timidina nestes tecidos ou órgãos foi aumentada pela administração intravenosa de grelina de rato ou de grelina de rato do tipo tioéter e foi, deste modo, confirmado que grelina apresenta uma acção de promoção do crescimento celular, no duodeno, no jejuno e na medula óssea. A duração do tempo de acção de promoção do crescimento celular, após a administração intravenosa de grelina foi semelhante à da após a administração de GHRH (hormona de libertação da hormona do crescimento), foi, portanto considerado que a acção de promoção do crescimento celular da grelina ocorre através da GH (hormona do crescimento), segregada, principalmente, a partir da pituitária. Foi considerado que a regulação da secreção da GH pela grelina, como um factor fisiológico, é razoável para a regulação do organismo e verificam-se menos efeitos adversos, os quais podem ocorrer por administração da GH. 179

Tabela 22

Exemplo Grelina de Grelina do tipo Comparativo rato tioéter Medula óssea 100,0 141,7 144,5 (nos tecidos) ±17,8% ±30,1% ±16,5% Duodeno 100,0 136,0 114,0 (na fracção do ADN) ±14,2% ±17,8% ±11,7% Jejuno 100,0 159,0 151,0 (na fracção do ADN) ±6,8% ±7,5% ±23,6%

Os valores numéricos mostram a proporção (%) da incorporação do isótopo radioactivo, em relação à média (em triplicado) do exemplo comparativo (i. e., o grupo ao qual foi administrado soro fisiológico).

Exemplo 16. Quantificação da grelina por anticorpos anti-grelina

Foi quantificada a grelina em vários tecidos vivos, por radioimunoensaio (RIA), utilizando anticorpos produzidos contra péptidos dos terminais amina e carboxilo da grelina de rato, como antigénios.

Foram imunizados coelhos com [C-Cys]-grelina de rato [1-11] (péptido com os aminoácidos 1 a 11 do terminal amina da grelina de rato, tendo cisteina ligada ao seu terminal carboxilo) e [C-Cys]-grelina de rato [13-28] (péptido com os aminoácidos 13 a 28 do terminal amina da grelina de rato, tendo cisteina ligada ao seu terminal carboxilo), como antigénios, para formar, respectivamente, o anticorpo contra o terminal amina 180 (anti-antigénio [C-Cys]-grelina de rato [1-11]) e anticorpo contra o terminal carboxilo (anti-antigénio [C-Cys]-grelina de rato [13-28]).

Como mostrado na Fig. 9a, a IC50 (concentração inibitória a 50%) da grelina de rato foi de 3,1 fmol, para a ligação entre a grelina de rato marcada com um isótopo radioactivo e o anticorpo contra o terminal amina. Este anticorpo contra o terminal amina, embora apresentando reactividade cruzada a 100% com a grelina humana sintetizada guimicamente e a grelina de rato, apresentou, apenas, uma reactividade cruzada a 0,3% com a n-hexanoil grelina de rato, em gue a 3a serina tinha sido modificada com grupo n-hexanoilo e reactividade cruzada a 20% com a n-decanoil grelina de rato, em gue a 3a serina tinha sido modificada com o grupo n-decanoilo. Além disso, o anticorpo terminal do amina não reagiu com a grelina a partir da qual o ácido gordo tinha sido libertado. 0 anticorpo do terminal amina apresentou uma afinidade semelhante para grelina de rato (28 aminoácidos) , grelina humana (28 aminoácidos) e grelina-27 (grelina, consistindo em 27 aminoácidos), encontradas em humanos e ratos. Consequentemente, foi confirmado que o anticorpo contra o terminal amina reconhece, especificamente, a grelina natural em que a 3a serina foi modificada com um grupo n-octanoílo.

Como mostrado na Fig. 9b, a grelina de rato natural, modificada com o grupo n-octanoilo e a grelina de rato, modificada por remoção de n-octanoilo da grelina de rato natural, apresentaram um valor de IC5o semelhante, de 44 fmol, para a ligação entre a grelina de rato marcada com um isótopo radioactivo e o anticorpo contra o terminal carboxilo. Ou seja, 181 foi confirmado que o anticorpo contra o terminal carboxilo tem a mesma afinidade para a grelina modificada com um ácido gordo e para a grelina da qual foi libertado um ácido gordo.

Estes resultados revelaram que, no que respeita às grelinas que ocorrem em vários tecidos num organismo vivo, a grelina em que a 3a serina foi modificada com um grupo n-octanoílo pode ser quantificada através de um anticorpo contra o terminal amina, enquanto que, tanto a grelina modificada com um ácido gordo, como a grelina da qual foi libertado um ácido gordo, podem ser quantificadas através de um anticorpo contra o terminal carboxilo. A Tabela 23 mostra o resultado do exame dos conteúdos da grelina modificada com um ácido gordo e os conteúdos, tanto da grelina modificada com um ácido gordo, como da grelina da qual foi libertado um ácido gordo, em vários tecidos de um organismo vivo.

Tabela 23

Tecidos Quantidade de grelina de rato que reage com anticorpo (fmol/mg tecidos) C-RIA N-RIA Hipotálamo 1,8+0,3 <0,05 Pituitária 8,5+3,1 <0,05 Tiróide 3,5+2,0 <0,05 Glândula da mandíbula 8,8+1,3 <0,05 Timo 3,5+0,4 <0,05 Glândula adrenal 3,1+0,4 <0,05 182 (continuação)

Tecidos Quantidade de grelina de rato que reage com anticorpo (fmol/mg tecidos) C-RIA N-RIA Átrio 2,310,2 0,0710,01 Ventrículo 2,110,1 <0,05 Aorta 2,410,7 0,1410,03 Pulmão 3,110,4 <0,05 Fígado 2,810,5 <0,05 Pâncreas 2,610,6 0,1510,05 Estômago 1779,81533,9 377,31155,83 Duodeno 106,717,3 20,5710,69 Jejuno 60,2117,2 10,7315,44 íleo 20,515,1 0,1610,08 Ceco 15,112,5 1,7015,44 Cólon 10,410,7 <0,05 Rim 5,410,3 <0,05 Espermário 2,810,2 <0,05 Plasma (1 mL) 219,6171,8 4,0211,91

Na tabela, C-RIA indica o resultado da quantificação por radioimunoensaio, utilizando o anticorpo contra o terminal carboxilo, enquanto que N-RIA indica o resultado da quantificação com anticorpo contra o terminal amina.

Os valores numéricos na tabela indicam "média ± desvio padrão".

Exemplo 17. Produção de grelina de rato (1-28) por um método de semi-sintese 183

Esquema da síntese

Neste exemplo, foi produzida rGrelina a partir dos fragmentos rGrelina (6-28) e Grelina (1-7), anteriormente preparados, respectivamente, por métodos de engenharia genética e de síntese química, como se segue.

Especificamente, foi expressa β-galactosidase 97-(QFE-SRHRR)-rGrelina (6-28) ou seja, uma proteína de fusão entre a β-galactosidase 97 e a rGrelina (6-28), no interior da qual está presente uma sequência de aminoácidos (-QFE-SRHRR-), tendo um local de quebra pela protease V8 e pela protease KexII, em E. coli. Esta proteína de fusão foi tratada com a protease V8, para excisar SRHRR rGrelina (6-28). Seguidamente, todos os grupos amina da SRHRR rGrelina (6-28) foram protegidos com grupos Boc e o péptido resultante foi tratado com a protease KexII, para originar [Lys (Boc) 11,16'19'2°'24]-rGrelina (6-28) da qual o grupo amina do terminal amina da Ser 6 tinha sido isolado. Este fragmento protegido foi condensado [com N^-Boc]-rGrelina (1-5)-Osu, obtida por síntese química e a [Lys (Boc)11'16'19'20'24]-rGrelina resultante, foi tratada com um ácido, pelo que, foi produzida rGrelina.

Neste exemplo, foi descrita a semi-síntese da rGrelina, mas pode ser, também, sintetizada hGrelina, através deste método.

Além disso, neste exemplo, o fragmento (1-5) foi condensado com o fragmento (6-28), mas os fragmentos (1-2), (1-3) e (1-7) do terminal amina, sintetizados quimicamente, podem ser, respectivamente, condensados com os fragmentos (3-28), (4-28) e (8-28) do terminal carboxilo, com um comprimento arbitrário, consistindo em aminoácidos da 28a posição até à 3a posição, 184 construídos através de engenharia genética, para produção de grelina como uma proteína de fusão. Para a redução do número de passos na síntese química, é vantajosa a condensação entre (1-2) e (3-28) ou entre (1-3) e (4-28). Do ponto de vista da prevenção completa da racemização causada pela condensação, é, particularmente preferida a condensação entre (1-7) e (8-28), utilizando Pro 7.

Construção de vector de expressão pG97s rGR e expressão da grelina (6-28) como uma proteina de fusão

Foi obtido um fragmento de ADN da rGrelina (6-28) tendo uma sequência de aminoácidos QFE-SRHRR na região pré-pró, com base na sequência nucleotidica do ADNc da grelina de rato, por emparelhamento, utilizando um oligómero totalmente sintético.

Para inserir este fragmento de ADN em pG97SnPPH34 (JP-A 9-296000), o pG97SnPPH34 foi tratado com Sall e Smal, eliminando, deste modo, o seu gene precursor da hormona paratiróide humana. O produto foi tratado com fosfatase alcalina e foi ligado com ligase de T4, ao fragmento do gene derivado da rGrelina, anteriormente tratado com Sall e cinase. O plasmídeo ligado foi transformado na estirpe DH5 de E. coli, para originar o plasmídeo pG97s rGR. O plasmídeo pG97s rGR foi transformado em E. coli M25 (ompT) e o transformante resultante foi cultivado em 3 placas, contendo, cada uma, 200 mL de meio de liquido Terrific Broth (triptona a 1,2%, extracto de levedura a 2,4%, glicose a 0,4%) e foi cultivado sob agitação, a 37 °C. Quando a concentração (OD660) das célula bacterianas atingiu 0,8, foi aí adicionado 185 isopropil-l-tio-p-D-galactopiranósido (IPTG), numa concentração final de 2 mM, para a expressão da proteína de fusão rGrelina (6-28) . Além disso, as células bacterianas foram cultivadas durante 4 horas e, seguidamente, foram recolhidas por centrifugação. A estrutura da proteína de fusão rGrelina (6-28) é como se segue:

Proteína de fusão rGrelina 6-28: (p-Galactosidase-97S)-QFE-SRHRR rGrelina (6-28)

Processamento da proteína de fusão rGrelina 6-28 e purificação de [SRHRR]-rGrelina (6-28)

Foram suspensos 20 mL das células bacterianas resultantes, em tampão TE e as células bacterianas foram rebentadas com uma prensa francesa. Seguidamente, os corpos de inclusão foram recolhidos por centrifugação a 3000 rpm, durante 15 minutos, foram suspensos, novamente, em 10 mL de tampão TE e água desionizada e foram centrifugados, pelo que, o corpo de inclusão foi lavado. O corpo de inclusão foi diluído com água desionizada de forma a que a sua ODeeo fosse reduzida para 50,0 e foi aí adicionado Tris-HCl (pH 8,2), numa concentração final de 50 mM e o corpo de inclusão foi dissolvido em ureia (concentração final: 3,5 M). Foi adicionado derivado V8D5 da protease rV8 (abreviado, seguidamente, como V8D5) (JP-A9-47291), numa concentração final de 10 g/mL, a esta solução mantida a 30 °C e a solução foi tratada com a enzima a 30 °C, durante 20 minutos. A reacção foi terminada pela adição de ácido acético a 3% (AcOH).

Foi adicionado um excesso de 1,5 vezes de água desionizada à solução da reacção terminada da enzima V8D5, contendo 186 [SRHRR]-rGrelina (6-28), seguidamente, esta solução foi ajustada para pH 5,0 com NaOH 5N, para precipitar o fragmento derivado da β-galactosidase que foi, então, removido por centrifugação a 5000 rpm, durante 10 minutos. O sobrenadante contendo [SRHRR]-rGrelina (6-28) foi aplicado a uma coluna TSK-ODS 80Ts (diâmetro das partículas de resina de 20 pm, 50 mm I.D. x 100 mm, TOSOH Co., Ltd.), previamente equilibrada com TFA a 0,1%. O péptido pretendido foi eluído com um gradiente linear, de tampão A a 100% [0,8 mL/min., acetonitrilo 1%, TFA a 0,1%] até tampão B a 100% [acetonitrilo a 50%, TFA a 0,095%], a qual foi programada para terminar num volume de 5 colunas. Foram recolhidas as fracções contendo o péptido pretendido [SRHRR]-rGrelina (6-28) (cerca de 50 mg).

Purificação da [Boc-SRHRR] - [Lys (Boc) n'16'19'20'24]-rGrelina (6-28)

Foram adicionadas 6 moles equivalentes (19,2 mg, 6 x 15 pmol) de bicarbonato de di-t-butilo, à solução aquosa de acetonitrilo a 50%, contendo cerca de 50 mg (15 pmol) de [SRHRR]-rGrelina (6-28), seguidamente, foi ajustada para pH 9 com trietilamina e deixada à temperatura ambiente, durante 15 minutos. Foi adicionado ácido acético à solução de reacção, numa concentração final de 0,5% e, após o acetonitrilo ter sido evaporado, a solução foi adicionada à coluna pré-empacotada EMPORE-Octil (C 8) HD 4 mm/1 mL, previamente equilibrada com acetonitrilo a 10%, contendo de TFA a 0,1% e, após a coluna ter sido lavada com solução de equilibração, a [Boc-SRHRR] - [Lys (Boc) n'16'19'20'24]-rGrelina (6-28) foi eluída com acetonitrilo a 90%, contendo TFA a 0,095%. O acetonitrilo foi 187 evaporado e foram obtidos 6 mL de solução contendo cerca de 30 mg do péptido pretendido. A espectrometria de massa indicou, principalmente, dois péptidos, cujo peso molecular após a modificação Boc foi aumentado em 500 (peso molecular determinado, 3895) ou em 600 (peso molecular determinado, 3995) em relação ao peso molecular (peso molecular determinado = 3396, peso molecular teórico = 3398) antes da modificação Boc.

Quebra de [Lys (Boc)n'16'19'20'24]-rGrelina (6-28) pela protease Kex2 e sua purificação.

Foram adicionados uma solução de cloreto de cálcio e Tris-HCl, pH 8,2, em concentrações finais de, respectivamente, 0,3 mM e 20 mM, à solução aquosa resultante da [Boc-SRHRR] - [Lys (Boc)11,1β'19'20'24]-rGrelina (6-28) (30 mg, 6 mL) .

Após ter sido ai adicionada uma solução da protease Kex2 (JP-A 10-229884), numa concentração de 1 x 105 unidades/mL, a amostra foi tratada com a protease a 30 °C, durante 60 minutos.

Em HPLC, desapareceu um pico da [Boc-SRHRR]-[Lys (Boc) n,i6,i9,2o,24] _rQre]_j_na (6—28), foi deslocado um pico da [Lys (Boc) ιι,ΐβ,ΐ9,2ο,24] _rQre]_j_na (6—28) em direcção à região da hidrofobicidade e foi observado um pico de um fragmento hidrofilico correspondente a Boc-SRHRR.

Após o desaparecimento do material de partida ter sido confirmado, a solução de reacção foi ajustada para pH 3,5 com ácido acético aquoso e foi aplicada na coluna ODS-80Ts de cromatografia de fase reversa (volume da coluna de 1,66 cc, 188 diâmetro das partículas da resina 20 pm, TOSOH Co., Ltd.), previamente equilibrada com acetonitrilo a 1,0%, contendo ácido acético a 1%. Após a coluna ter sido lavada com um volume de 5 colunas de solução de equilibração, a [Lys (Boc) n'16'19'20'24]-rGrelina (6-28) foi eluída com um gradiente linear de acetonitrilo a 1,0% até acetonitrilo a 90,0%, contendo, ambas, ácido acético a 1%, a qual foi programada para terminar num volume de 5 colunas. As fracções principais foram liofilizadas, para originar 6,2 mg do péptido protegido pretendido.

Condensação do fragmento e desprotecção

Foram adicionados trietilamina (51,0 pL, 0,366 mmol) e uma solução de bicarbonato de di-t-butilo (78,0 mg, 0,0356 mmol), em TFE (4,00 mL) , respectivamente, a uma solução de Grelina (1-5) (190 mg, 0,0301 mmol, Composto 31), em trifluoroetanol (TFE) (6,00 mL) e foram misturados, à temperatura ambiente, durante 13 horas. 0 solvente foi evaporado e foi adicionado éter (20,0 mL) aos resíduos resultantes, pelo que, foram obtidos 180,5 mg de [if-Boc]-rGrelina (1-5).

Seguidamente, foi adicionado HOSu (5,20 mg, 0,0452 mmol) a uma solução de [if-Boc]-rGrelina (1-5) (22,0 mg, 0,0301 mmol), em DMF (1,00 mL) e foi aí adicionado DIPCI (7,30 pL, 0,0466 mmol), num banho a -30 °C. Após a mistura ter sido agitada no banho a -30 °C, durante 1 hora e, seguidamente, à temperatura ambiente, durante 18 horas, o solvente foi evaporado e os resíduos resultantes foram convertidos em pó, com éter, para originar 14,1 mg de [Na-Boc] -rGrelina (1-5)-Osu, sob a forma de um éster de succinimida da [Na-Boc]-rGrelina (1-5). 189

Seguidamente, foram adicionados [N^-Boc]-rGrelina (1-5)-OSu (3,3 mg, 3,96 μπιοί) e trietilamina (2,5 pL, 17,9 μπιοί) a uma solução de [Lys (Boc) 11,16'19'2()'24]-rGrelina (6-28) (6,10 mg, 2,18 μπιοί), em DMF (0,6 mL), preparada pelo método recombinante e foram misturados à temperatura ambiente, durante 24 horas. O solvente foi evaporado, foi adicionado TFA (2,00 mL), sob arrefecimento em gelo, directamente aos resíduos resultantes e foi misturado à temperatura ambiente, durante 1,5 horas. O TFA foi evaporado e foi adicionado éter aos resíduos, pelo que, foram obtidos 6,2 mg de péptido bruto, contendo Grelina (1-28).

Este produto foi dissolvido em 2 mL de ácido acético a 5% (AcOH) , foi aplicado à YMC-Pack-ODS-A (5 pm, 20 mm x 250 mm) e foi eluído com um gradiente linear de 0 a 95% de acetonitrilo em ácido trif luoroacético a 0,1% (caudal: lOmL/min.), durante

60 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas, foram liofilizadas, foram aplicadas à YMC-PackPROTEIN-RP (C4, 10 mm x 250 mm) e foram eluídas com um gradiente linear de 7.5 a 21,3% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 4,7 mL/min.), durante 30 minutos.

As fracções pretendidas foram recolhidas, foram

liofilizadas, foram aplicadas à YMC-PackPROTEIN-RP (C4, 10 mm x 250 mm) e foram eluídas com um gradiente linear de 7.5 a 21,3% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% (caudal: 4,7 mL/min.), durante 30 minutos. As fracções pretendidas foram recolhidas e liofilizadas, para originar 2,1 mg de rGrelina (1-28). Este produto apresentou um tempo de retenção em HPLC analítico concordante com o do padrão de rGrelina (1-28) e apresentou uma actividade intracelular de libertação de Ca de EC50=1,5 nM, a qual foi equivalente à da grelina natural. 190 ESI-MS 3315,0 (teórico: 3314,8), composição em aminoácidos: Ser; 3,74 (4), Glx; 5,69 (6), Gly; 1,18 (1), Ala; 2,05 (2), Leu; 2_, Phe; 0,98 (1), Lys; 4,98 (5), His; 1,03 (1), Arg; 1,96 (2),

Pro; 4,01 (4)

Composto 87 [Dleu5] -rGrelina (1-28)

Foram obtidas 0,8 mg de [Dleu5]-rGrelina (1-28), como sub-produto na esterificação da [Ι'/'-Βοο] -rGrelina (1-5) com succinimida ou na condensação dos fragmentos. A sua actividade intracelular de libertação de Ca foi EC50 = 220 nM. ESI-MS 3315,0 (teórico: 3314,8), composição em aminoácidos: Ser; 3,80 (4), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,23 (1), Ala; 2,07 (2), Leu; 2_, Phe; 0,97 (1), Lys; 4,92 (5), His; 1,02 (1), Arg; 1,97 (2),

Pro; 4,11 (4)

Análise de GC-MS da leucina, após hidrólise em D2O/DCI: L-Leu; 1,17 (1), D-Leu; 0,83 (1) 191

Aplicabilidade Industrial

Pela administração do novo composto do tipo peptidico da presente invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, em seres humanos ou animais, este demonstra um efeito de actividade excelente como uma preparação farmacêutica para a promoção do crescimento de crianças e melhoria do defeito de funções metabólicas causadas pela deficiência em GH, pela indução da secreção da GH, sem causar efeitos secundários substanciais e o seu anticorpo demonstra um efeito de actividade excelente como um agente de diagnóstico de doenças atribuíveis à deficiência em GH e como um instrumento de investigação no campo da ciência. 192 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> KANGAWA, Kenji <120> Novos Péptidos <130> DS03F216 (EP) <150> Jp 1999/210002 <151> 1999-7-23 <150> Jp 1999/338841 <151> 1999-11-29 <150> Jp 2000/126623 <151> 2000-4-26 <160> 39

<210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Sequência de aminoácidos para uma região nuclear de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento < 4 0 0 > 1

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro 1 5 <210> 2 <211> 28 193 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de rato <400> 2

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys 15 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 20 25

<210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do do secretagogo da hormona do crescimento humana < 4 0 0 > 3

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Arg Vai Gin Gin Arg Lys 15 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 20 25

<210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <2 2 3> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de rato 194 < 4 Ο Ο > 4

Met Vai Ser Ser Ala Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu 1 5 10 15 Trp Met Asp Met Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His 20 25 30 Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu 35 40 45 Gin Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Hls Pro Glu Asp Arg Gly Gin 50 55 60 Ala Glu Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe 65 70 75 80 Asp Vai Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gin Tyr Gin Gin His Gly Arg 85 90 95 Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Vai Lys Glu 100 105 110

Ala Pro Ala Asn Lys 115

<210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento humana 195 <4 Ο0> 5

Met Pro Ser Pro Gly Thr Vai Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu 1 5 10 15 Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu Hls 20 25 30 Gin Arg Vai Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu 35 40 45 Gin Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gin 50 55 60 Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Vai Arg Phe Asn Ala Pro Phe 65 70 75 80 Asp Vai Gly Ile Lys Leu Ser Gly Vai Gin Tyr Gin Gin Hls Ser Gin 85 90 95 Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu 100 105 110 Ala Pro Ala Asp Lys 115 <210> 6 <211> 501 <212> ADNc <213> Rattus norvegicus <2 2 0>

<221> CDS <222> (31) . . . (381) <2 2 3> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de rato 196 <400> 6 tccagatcat ctgtcctcac caccaaggcc atg gtg tct tca gcg act 48

Met Vai Ser Ser Ala Thr 1 5 ate tgc agt ttg cta ctc ctc age atg ctc tgg atg gac atg gee atg 96 Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu Trp Met Asp Met Ala Met 10 15 20 gea ggt tcc age ttc ttg age cca gag cac cag aaa gee cag cag aga 144 Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg 25 30 35 aag gaa tcc aag aag cca cca gct aaa ctg cag cca cga gct ctg gaa 192 Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg Ala Leu Glu 40 45 50 ggc tgg ctc cac cca gag gac aga gga caa gea gaa gag gea gag gag 240 Gly Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gin Ala Glu Glu Ala Glu Glu 55 60 65 70 gag ctg gaa ate agg ttc aat gct ccc ttc gat gtt ggc ate aag ctg 288 Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Vai Gly Ile Lys Leu 75 80 85 tca gga gct cag tac cag cag cat ggc cgg gee ctg gga aag ttt ctt 336 Ser Gly Ala Gin Tyr Gin Gin His Gly Arg Ala Leu Gly Lys Phe Leu 90 95 100 cag gat ate ctc tgg gaa gag gtc aaa gag gcg cca gct aac aag 381 Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Vai Lys GlU Ala Pro Ala Asn Lys 105 110 115 taaccactga caggactggt ccctgtactt tcctcctaag caagaactca catccagctt 441 ctgcctcctc tgcaactccc agcactctcc tgctgactta caaataaatg ttcaagctgt 501 <210> 7 <211> 511 <212> ADN <220> A \—1 Cs] CM V CDS <222> (34) . . ..(384) 197 <213> Homo sapiens <223> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento humana < 4 0 0 >7 gcaggcccac ctgtctgcaa cccagctgag gcc atg ccc tcc cca 45

Met Pro Ser Pro ggg acc gtc tgc age ctc ctg ctc ctc 1 ggc atg ctc tgg ctg gac ttg 93 Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu Trp Leu Asp Leu 5 10 15 20 gcc atg gca ggc tcc age ttc ctg age cct gaa cac cag aga gtc cag 141 Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Arg val Gin 25 30 35 cag aga aag gag teg aag aag cca cca gcc aag ctg cag ccc cga gct 189 Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg Ala 40 45 50 cta gca ggc tgg ctc ege ccg gaa gat gga ggt caa gca gaa ggg gca 237 Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gin Ala Glu Gly Ala 55 60 65 gag gat gaa ctg gaa gtc cgg ttc aac gcc ccc ttt gat gtt gga ate 285 Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Val Gly Ile 70 75 80 aag ctg tca ggg gtt cag tac cag cag cac age cag gcc ctg ggg aag 333 Lys Leu Ser Gly Val Gin Tyr Gin Gin HiS Ser Gin Ala Leu Gly Lys 85 90 95 100 ttt ctt cag gac ate ctc tgg gaa gag gcc aaa gag gcc cca gcc gac 381 Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala Pro Ala Asp 105 110 115 aag tgatcgccca caagccttac tcacctctct ctaagtttag aagcgctcat 434

Lys ctggcttttc gcttgcttct gcagcaactc ccacgactgt tgtacaagct caggaggcga 494 ataaatgttc aaactgt 511 198 <210> 8 <211> 4

<212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Sequência de aminoácidos para uma região nuclear de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento <4 00> 8

Gly Ser Ser Phe 1

<210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Sequência de aminoácidos para uma região nuclear de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento <400> 9

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin 15 10

<210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de rato 199 <400> 10 GXy Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Arg Lys Glu 15 10 15

Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 20 25

<210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 3> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento humana < 4 0 0 > 11

Leu Ser Pro Glu His Gin Arg Vai Gin Arg Lys Glu 5 10 15 Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 25

Gly Ser Ser Phe 1

Ser Lys Lys Pro 20 <210> 12 <211> 116 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <223> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de rato <400> 12

Met Vai Ser Ser Ala Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu 15 10 15

Trp Met Asp Met Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His 20 25 30

Gin Lys Ala Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin 35 40 45 200

Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Hls Pro Glu Asp Arg Gly Gin Ala 50 55 60 Glu Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp 65 70 75 80 Vai Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gin Tyr Gin Gin Hls Gly Arg Ala 85 90 95 Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Vai Lys Glu Ala 100 105 110

Pro Ala Asn Lys 115

<210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento humana <4 00> 13

Met Pro Ser Pro Gly Thr Vai Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu 1 5 10 15 Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His 20 25 30 Gin Arg Vai Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin 35 40 45 Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gin Ala 50 55 60 Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Vai Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp 65 70 75 80 Vai Gly Ile Lys Leu Ser Gly Vai Gin Tyr Gin Gin His Ser Gin Ala 85 90 95 Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala 100 105 110

Pro Ala Asp Lys 115 201 <210> 14 <211> 498 <212> ADNc <213> Rattus norvegicus <2 2 Ο >

<221> CDS <222> (31)...(378) <223> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de rato <400> 14 tccagatcat ctgtcctcac caccaaggcc atg gtg tct tca gcg act 48

Met Vai Ser Ser Ala Thr 1 5 ate tgc agt ttg cta ctc ctc age atg ctc tgg atg gac atg gee atg 96 Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Met Leu Trp Met Asp Met Ala Met 10 15 20 gea ggt tcc age ttc ttg age cca gag cac cag aaa gee cag aga aag 144 Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu Hls Gin Lys Ala Gin Arg Lys 25 30 35 gaa tcc aag aag cca cca gct aaa ctg cag cca cga gct ctg gaa ggc 192 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg Ala Leu Glu Gly 40 45 50 tgg etc cac cca gag gac aga gga caa gea gaa gag gea gag gag gag 240 Trp Leu His Pro Glu Asp Arg Gly Gin Ala Glu Glu Ala Glu Glu Glu 55 60 65 70 ctg gaa ate agg ttc aat gct ccc ttc gat gtt ggc ate aag ctg tca 288 Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Vai Gly Ile Lys Leu Ser 75 80 85 gga gct cag tac cag cag cat ggc cgg gee ctg gga aag ttt ctt cag 336 Gly Ala Gin Tyr Gin Gin HlS Gly Arg Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gin 90 95 100 202 378 gat ate etc tgg gaa gag gtc aaa gag gcg cca gct aac aag Asp Ile Leu Trp Glu Glu Vai Lys Glu Ala Pro Ala Asn Lys 105 110 115 taaccactga caggactggt ccctgtactt tcctcctaag caagaactca catccagctt 438 ctgcctcctc tgcaactccc agcactctcc tgctgactta caaataaatg ttcaagctgt 498 <210 > 15 <211> 508 <212> ADN <220>

<221> CDS <222> (34)...(381) <213> Homo sapiens <2 2 3> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró para péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento humana <4 00> 15 gcaggcccac ctgtctgcaa cccagctgag gee atg ccc tcc cca 45

Met Pro Ser Pro 1 ggg acc gtc tgc age etc ctg etc etc ggc atg etc tgg ctg gac ttg 93 Gly Thr Vai Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu Trp Leu Asp Leu 5 10 15 20 gee atg gea ggc tcc age ttc ctg age cct gaa cac cag aga gtc cag 141 Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu Hls Gin Arg Vai Gin 25 30 35 aga aag gag teg aag aag cca cca gee aag ctg cag ccc cga gct cta 189 Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg Ala Leu 40 45 50 gea ggc tgg etc ege ccg gaa gat gga ggt caa gea gaa ggg gea gag 237 Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gin Ala Glu Gly Ala Glu 55 60 65 203 gat gaa ctg gaa gtc cgg ttc aac gcc ccc ttt gat gtt gga ate aag 285

Asp Glu Leu Glu Vai Arg Phe Asn Ala Pro Phe Asp Vai Gly Ile Lys 70 75 80 ctg tea ggg gtt cag tac cag cag cac age cag gcc ctg ggg aag ttt 333

Leu Ser Gly Vai Gin Tyr Gin Gin His Ser Gin Ala Leu Gly Lys Phe 85 90 95 100 ctt cag gac ate etc tgg gaa gag gcc aaa gag gcc cca gcc gac aag 381

Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu Ala Pro Ala Asp Lys 105 110 115 tgatcgccca caagccttac tcacctctct ctaagtttag aagcgctcat 431 ctggcttttc gcttgcttct gcagcaactc ccacgactgt tgtacaagct caggaggcga 491 ataaatgttc aaactgt 508

<210> 16 <211> 28 <212> PRT <213> Sus scrofa (porco) <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento porcina < 4 0 0 > 16

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Vai Gin Gin Arg Lys 15 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg 20 25

<210> 17 <211> 27 <212> PRT <213> Sus scrofa (porco) <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento porcina 204 < 4 Ο Ο > 17

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Vai Gin Arg Lys Glu 15 10 15

Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg 20 25

<210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Sus scrofa (porco) <223> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento porcina < 4 0 0 > 18

Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Vai Leu 1 5 10 15 Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Hls Gin Lys Vai Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys 35 40 45 Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Vai Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro 65 70 75 80 Cys Asp Vai Gly lie Lys Leu Ser Gly Ala Gin Ser Asp Gin His Gly 85 90 95 Gin Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Vai Thr 100 105 110 Glu Ala Pro Ala Asp Lys

<210 > 19 <211> 117 <212> PRT 205 115 <213> Sus scrofa (porco) <223> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento porcina <4 OCO 19

Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser val Leu 1 5 10 15 Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu 20 25 30 Hls Gin Lys Vai Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu 35 40 45 Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp Ser Gly Glu 50 55 60 Vai Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Pro Cys 65 70 75 80 Asp Vai Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gin Ser Asp Gin His Gly Gin 85 90 95 Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu Vai Thr Glu 100 105 110 Ala Pro Ala Asp Lys 115 <210> 20 <211> 494 <212> ADN <2 2 0 > <221> CDS <222> (9)...(362) <213> Sus scrofa (porco) <2 2 3> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento porcina 206 < 4 Ο Ο > 20 ctgaggcc atg ccc tcc acg ggg acc att tgc age ctg ctg etc etc 47

Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu 1 5 10 age gtg ctc ctc atg gea gac ttg gee atg gcg ggc tcc age ttc ttg 95 Ser Vai Leu Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu 15 20 25 age ccc gaa cac cag aaa gtg cag cag aga aag gag tcc aag aag cca 143 Ser Pro Glu Hls Gin Lys Vai Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro 30 35 40 45 gea gee aaa ctg aag ccc cgg gee ctg gaa ggc tgg ctc ggc cca gaa 191 Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu 50 55 60 gac agt ggt gag gtg gaa gg<= acg gag gac aag ctg gaa ate cgg ttc 239 Asp Ser Gly Glu Vai Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe 65 70 75 aac gee ccc tgt gat gtt ggg ate aag ttg tea ggg gct cag tcc gac 287 Asn Ala Pro Cys Asp Vai Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gin Ser Asp 80 85 90 cag cac ggc cag ccc ctg ggg aaa ttt ctc cag gac ate ctc tgg gaa 335 Gin His Gly Gin Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu 95 100 105 gag gtc act gag gee ceg gee gac aag tgattgtccc tgagaccagc 382 Glu Vai Thr Glu Ala Pro Ala Asp Lys 110 115 cacctctgtt ctcccagcct cctaagggct cacctggctt ccaggacgot tccactatca 442 cacccagctc tgagggatgc tagcctggga ggtgaataaa cattcagact gg 494 <210> 21 <211> 491 <212> ADN <220> <221> CDS <222> (9)...(359) 207 <213> Sus scrofa (porco) <223> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento porcina <400> 21 ctgaggcc atg ccc tcc acg ggg acc att tgc age ctg ctg etc etc 47

Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu 15 10 age gtg ctc ctc atg gea gac ttg gee atg gcg ggc tcc age ttc ttg 95 Ser Val Leu Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu 15 20 25 age ccc gaa cac cag aaa gtg cag aga aag gag tcc aag aag cca gea 143 Ser Pro Glu His Gin Lys Val Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala 30 35 40 45 gee aaa ctg aag ccc cgg gee ctg gaa ggc tgg ctc ggc cca gaa gac 191 Ala Lys Leu Lys Pro Arg Ala Leu Glu Gly Trp Leu Gly Pro Glu Asp 50 55 60 agt ggt gag gtg gaa ggc acg gag gac aag ctg gaa ate cgg ttc aac 239 Ser Gly Glu Val Glu Gly Thr Glu Asp Lys Leu Glu Ile Arg Phe Asn 65 70 75 gee ccc tgt gat gtt ggg ate aag ttg tea ggg gct cag tcc gac cag 287 Ala Pro Cys Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gin Ser Asp Gin 80 85 90 cac ggc cag ccc ctg ggg aaa ttt ctc cag gac ate ctc tgg gaa gag 335 Hls Gly Gin Pro Leu Gly Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu Glu 95 100 105 gtc act gag gee ccg gee gac aag tgattgtccc 1 tgagaccagc 379 Vai Thr Glu Ala Pro Ala Asp Lys 110 115 cacctctgtt ctcccagcct cctaagggct cacctggctt ccaggacgct tccactatca 439 cacccagctc tgagggatgc tagcctggga ggtgaataaa cattcagact gg 491 <210> 22 <211> 27 208 <212> PRT <213> Bos taurus <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento bovina <400> 22

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Glu Leu Gin Arg Lys Glu

Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 23 <211> 89 <212> PRT <213> Bos taurus <223> Sequência aminoácidos parcial para a forma pré-pró de péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento bovina <400> 23

Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Glu 1 5 10 15 Leu Gin Arg Lys Glu Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg 20 25 30 Thr Leu Glu Gly Gin Phe Asp Phe Glu Vai Gly Ser Gin Ala Glu Gly 35 40 45 Ala Glu Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Phe Phe Asn Ile Gly 50 55 60 Ile Lys Leu Ala Gly Ala Gin Ser Leu Gin His Gly Gin Thr Leu Gly 65 70 75 80 Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu <210> 24 209 85 <211> 267 <212> ADN <2 2 0> <221> CDS <222> (1)...(267) <213> Bos taurus <223> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos (27 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento bovina <400> 24 gac ttg gcc atg gcg ggc tcc age ttt ctg age ccc gaa cat cag gaa 48 Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Glu 1 5 10 15 ctg cag aga aag gaa gct aag aag cca tea ggc aga ctg aag ccc cgg 96 Leu Gin Arg Lys Glu Ala Lys Lys Pro ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg 20 25 30 acc ctg gaa ggc cag ttt gac ccg gag gtg gga agt cag gcg gaa ggt 144 Thr Leu Glu Gly Gin Phe Asp Phe Glu Val Gly Ser Gin Ala Glu Gly 35 40 45 gea gag gac gag ctg gaa ate cgg ttc aac gcc CCC ttt aac att ggg 192 Ala Glu Asp Glu Leu Glu Ile Arg Phe Asn Ala Phe Phe Asn Ile Gly 50 55 60 ate aag cta gea ggg gct cag tcc ctc cag cat ggc cag acg ttg ggg 240 Ile Lys Leu Ala Gly Ala Gin Ser Leu Gin His Gly Gin Thr Leu Gly 65 70 75 80 aag ttt ctt cag gac ate ctc tgg gaa 267 Lys Phe Leu Gin Asp Ile Leu Trp Glu 85

<210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Gallus domesticus 210 <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de galinha <400> 25

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gin Gin Gin Lys 15 10 15

Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg 20

(210) 26 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Anguilla japonica <220> <221> AMIDAÇÃO <222> 21 <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de enguia <400> 26

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Arg Pro Gin Gly Lys Asp Lys 15 10 15

Lys Pro Pro Arg Vai 20

<210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Rana cafesbeiana <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de rã 211 < 4 Ο Ο > 27

Gly Leu Ser Phe Leu Ser Pro Ala Glu Met Gin Lys Ile Ala Glu Arg 15 10 15

Gin Ser Gin Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Arg 20 25

<210> 28 <211> 27 <212> PRT <213> Xenopus laevis <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de rã (Xenopus laevis) <400> 28

Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gin Lys Ile Ala Glu Arg 1 5 10 15

Gin Ser Gin Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met 20 25

<210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <2 2 0 > <221>AMIDAÇÂO <222> 23 <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos (23 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento da truta arco-íris <400> 29

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Lys Pro Gin Vai Arg Gin Gly 1 5 10 15

Lys Gly Lys Pro Pro Arg Vai 20 212 <210> 30

<211> 20 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> AMIDAÇÂO <222> 20 <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos (20 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de truta arco-iris <400> 30

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Lys Pro Gin Gly Lys Gly Lys 15 10 15

Pro Pro Arg Vai 20

<210> 31 <211> 28 <212> PRT <213> Canis familiaris <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de cão < 4 0 0 > 31

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Leu Gin Gin Arg Lys 15 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg 20 25 <210> 32 <211> 108 213

<212> PRT <213> Anguilla japonica <223> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de enguia <400> 32

Met Lys Arg Thr Ala Tyr Ile Ile Leu Leu Vai Cys Vai Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Met Asp Ser Vai Gin Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin 20 25 30 Arg Pro Gin Gly Lys Asp Lys Lys Pro Pro Arg Vai Gly Arg Arg Asp 35 40 45 Ser Asp Gly Ile Leu Asp Leu Phe Met Arg Pro Pro Leu Gin Asp Glu 50 55 60 Asp Ile Arg Hls Ile Thr Phe Asn Thr Pro Phe Glu Ile Gly Ile Thr 65 70 75 80 Met Thr Glu Glu Leu Phe Gin Gin Tyr Gly Glu Vai Met Gin Lys Ile 85 90 95 Met Gin Asp Leu Leu Met Asp Thr Pro Ala Lys Glu 100 105

<210> 33 <211> 114 <212> PRT <213> Xenopus laevis <223> Sequência de aminoácidos para péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de rã (Xenopus laevis) <4 0 0>3 3

Met Asn Phe Gly Lys Ala Ala Γΐβ Phe Gly Vai Vai Leu Phe Cys Leu 15 10 15 214

Leu Trp Thr Glu Gly Ala Gin Ala Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala 20 25 30 Asp Met Gin Lys Ile Ala Glu Arg Gin Ser Gin Asn Lys Leu Arg His 35 40 45 Gly Asn Met Asn Arg Arg Gly Vai Glu Asp Asp Leu Ala Gly Glu Glu 50 55 60 Ile Gly Vai Thr Phe Pro Leu Asp Met Lys Met Thr Gin Glu Gin Phe 65 70 75 80 Gin Lys Gin Arg Ala Ala Vai Gin Asp Phe Leu Tyr Ser Ser Leu Leu 85 90 95 Ser Leu Gly Ser Vai Gin Asp Thr Glu Asp Lys Asn Glu Asn Pro Gin 100 105 110

Ser Gin

<210> 34 <211> 82 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <223> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos (23 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de truta arco-iris < 4 0 0 > 3 4

Met Ile Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala Lys Ser Vai Ser 1 5 10 15 Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Lys Pro Gin Vai Arg Gin 20 25 30 Gly Lys Gly Lys Pro Pro Arg Vai Gly Arg Arg Asp Ile Glu Ser Phe 35 40 45 Ala Glu Leu Phe Glu Gly Pro Leu His Gin Glu Asp Lys His Asn Thr 50 55 60 Ile Lys Ala Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser Glu Glu Glu Phe 65 70 75 80

Gin Glu 215

<210> 35 <211> 99 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <2 2 3> Sequência de aminoácidos para a forma pré-pró de péptidos endógenos (20 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de truta arco-iris <4 00>35

Met Ile Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala Lys Ser Vai Ser 15 10 15

Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Lys Pro Gin Gly Lys Gly 20 25 30

Lys Pro Pro Arg Vai Gly Arg Arg Asp Ile Glu Ser Phe Ala Glu Leu 35 40 45

Phe Glu Gly Pro Leu His Gin Glu Asp Lys His Asn Thr Ile Lys Ala 50 55 60

Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser Glu Glu Glu Phe Gin Glu Tyr 65 70 75 80

Gly Ala Vai Leu Gin Lys Ile Leu Gin Asp Vai Leu Gly Asp Thr Ala 85 90 95

Thr Ala Glu <210> 36 <211> 503 <212> ADN <2 2 0 >

<221> CDS <222> (66) ... (389) <213> Anguilla japonica <2 2 3> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de enguia 216 <400> 36 tccaagaggc actgggtttc ctcttaaagt gcaaaactcc actgtgagct tcagacatga 60 ggcag atg aaa cgc acc gca tac ate ate ctg ctg gtc tgc gtc ctg 107 Met Lys Arg Thr Ala Tyr Ile lie Leu Leu Vai Cys Vai Leu 1 5 10 gcg ctg tgg atg gac tet gtc cag gct ggc tcc age ttc etc age ccc 155 Ala Leu Trp Met Asp Ser Vai Gin Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro 15 20 25 30 tea cag aga ceg cag ggg aag gat aag aag cct ccc agg gtt ggc aga 203 Ser Gin Arg Pro Gin Gly Lys Asp Lys Lys Pro Pro Arg Val Gly Arg 35 40 45 cga gac tea gat ggg ate ctg gac ctg ttt atg agg ccc cca ttg cag 251 Arg Asp Ser Asp Gly Ile Leu Asp Leu Phe Met Arg Pro Pro Leu Gin 50 55 60 gat gaa gac ate aga cac att acg ttt aac act cct ttt gag ate ggg 299 Asp Glu Asp Ile Arg Hls Ile Thr Phe Asn Thr Pro Phe Glu Ile Gly 65 70 75 ate acc atg act gag gag ctg ttc cag caa tat gga gaa gtg atg cag 347 Ile Thr Met Thr Glu Glu Leu Phe Gin Gin Tyr Gly Glu vai Met Gin 80 85 90 aag ate atg cag gat ttg ctg atg gac aca cct gee aaa gag 389 Lys Ile Met Gin Asp Leu Leu Met Asp Thr Pro Ala Lys Glu 95 100 105 tgacaagagt ggatatgatc tggacttoat aaaaccctgc gtcccatata ttcctgcatt 449 attgcatgoa taattcaacc aattgttaaa catttaataa aattttgcaa aege 503 <210> 37 <211> 484 <212> ADN <220> <221> CDS <222> (47) ... (388) <213> Xenopus laevis 217 <2 2 3> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos do secretagogo da hormona do crescimento de rã (Xenopus laevis) <400> 37 tttcactttt atctcgcagg cggcaccggt gaccaggacc ttcagg 46 atg aat ttt ggt aaa gcc gcc ato ttt ggg gtt gtc ttg tto tgo otg 94

Met Asn Phe Gly Lys Ala Ala Ile Phe Gly Vai Vai Leu Phe Cys Leu 15 10 15 ctg tgg acg gag ggg gcc cag gct ggc ttg acc ttc ctg agt cca gcc 142

Leu Trp Thr Glu Gly Ala Gin Ala Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala 20 25 30 gac atg cag aag att gcg gag agg caa tea cag aat aag ctg aga cac 190 Asp Mét Gin Lys Ile Ala Glu Arg Gin Ser Gin Asn Lys Leu Arg His 35 40 45 ggc aat atg aat ege agg ggt gtg gag gat gac ctg gcc ggg gag gag 238 Gly Asn Met Asn Arg Arg Gly Vai Glu Asp Asp Leu Ala Gly Glu Glu 50 55 60 ate ggg gtg acc ttc cct ctg gat atg aag atg acg cag gag cag ttc 286 Ile Gly Vai Thr Phe Pro Leu Asp Met Lys Met Thr Gin Glu Gin Phe 65 70 75 80 cag aag cag agg gct gcg gtg cag gac ttc ctg tac tcc tcc ctc ctc 334 Gin Lys Gin Arg Ala Ala Vai Gin Asp Phe Leu Tyr Ser Ser Leu -Leu 85 90 95 tet etc ggg tea gtg cag gat aca gaa gac aag aat gaa aat cct cag 382 Ser Leu Gly Ser Vai Gin Asp Thr Glu Asp Lys Asn Glu Asn Pro Gin 100 105 110 age caa tgagaatgàtgaaaatccgc-tcgtctctga tgcccctccc cgatctgtgt 438 Ser Gin gtctttatta tctctgtgta acccagaaat aaatcttatt tatggc 484 <210> 38 <211> 462 218 <212> ADN <220>

<221> CDS <222> (12) . . . (257) <213> Oncorhynchus mykiss <223> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos (23 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de truta arco-iris <400> 38 tcacaggtot c atg ata otg atg ctg tgt act ctg got ctg tgg gcc 47

Met II© Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala 15 10 aag tca gtc agt gct ggc tcc age ttc ctc age CCC tcc cag aaa cca 95 Lys Ser Vai Ser Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Lys Pro 15 20 25 cag gta aga cag ggt aaa ggg aag CCC cct cga gtt ggt cgg i cga gac 143 Gin Vai Arg Gin Gly Lys Gly Lys Pro Pro Arg Vai Gly Arg Arg Asp 30 35 40 att gag age ttt gct gag ctg ttt gag ggt CCC ctt cac cag gaa gac 191 Ile Glu Ser Phe Ala Glu Leu Phe Glu Gly Pro Leu His Gin Glu Asp 45 50 55 60 aaa cac aat acg ate aag gct cct ttt gag atg ggc ate acc atg agt 239 Lys His Asn Thr Ile Lys Ala Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser 65 70 75 gag gag gag ttc cag gag tatggtgccg tgctgcagaa gatcctgcag 287 Glu Glu Glu Phe Gin Glu 80 gacgtcctgg gagacactgc cactgcagaa tgatcacaac ttggcataga cacggaatac 347 aaagaacctc cattccctgt tctccaactt tcctttctca acttgtctta tacccaatgt 407 actgtgtgaa catcgtttga attgtaaaag atgaataaaa taaccgcggc cgcta 462

<210> 39 <211> 453 <212> ADN 219 <2 2 Ο > <221> CDS <222> (12) . . . (308) <213> Oncorhynchus mykiss <223> Sequência de bases de ADNc codificando a forma pré-pró de péptidos endógenos (20 aminoácidos) do secretagogo da hormona do crescimento de truta arco-íris <400> 39 tcacaggtct c atg ata ctg atg ctg tgt act ctg gct ctg tgg gcc 47

Met Ile Leu Met Leu Cys Thr Leu Ala Leu Trp Ala 15 10 aag tca gtc agt gct ggc tcc age ttc ctc age ccc tcc cag aaa cca 95

Lys Ser Vai Ser Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gin Lys Pro 15 20 25 cag ggt aaa ggg aag cce cct cga gtt ggt cgg cga gac att gag age 143

Gin Gly Lys Gly Lys Pro Pro Arg Vai Gly Arg Arg Asp Ile Glu Ser 30 35 40 ttt gct gag ctg ttt gag ggt ccc ctt cac cag gaa gac aaa cac aat 191 Phe Ala Glu Leu Phe Glu Gly Pro Leu His Gin Glu Asp Lys His Asn 45 50 55 60 acg ate aag gct cct ttt gag atg ggc ate acc atg agt gag gag gag 239 Thr Ile Lys Ala Pro Phe Glu Met Gly Ile Thr Met Ser Glu Glu Glu 65 70 75 ttc cag gag tat ggt gcc gtg ctg cag aag ate ctg cag gac gtc ctg 287 Phe Gin Glu Tyr Gly Ala Vai Leu Gin Lys Ile Leu Gin Asp Vai Leu 80 85 90 gga gac act gcc act gea gaa tgatcacaac i ttggcataga cacggaatac 338 Gly Asp Thr Ala Thr Ala Glu 95 aaagaacctc cattccctgt tctccaactt tcctttctca acttgtctta tacccaatgt 398 actgtgtgaa catcgtttga attgtaaaag atgaataaaa taacactgct tcctt 453

Lisboa, 17 de Agosto de 2007 220

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto do tipo peptídico, (a) no qual o segundo ou o terceiro resíduo de aminoácido do terminal amina é um aminoácido modificado, no qual é introduzida uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 35 átomos de carbono, no átomo de carbono α do aminoácido, através de um éster, éter, tioéter, tioéster, amida, carbamida, tiocarbamida ou ligação persulfureto e através ou não de um grupo alquileno contendo 1 a 10 átomos de carbono ou no qual uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 20 átomos de carbono é introduzida no átomo de carbono α do aminoácido, em que H é ligado ao átomo de carbono α do referido aminoácido modificado, (b) o qual compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID N°: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 ou uma sequência de aminoácidos em que, pelo menos, um aminoácido pode ser eliminado, substituído e/ou adicionado, no qual o segundo ou terceiro aminoácido do terminal amina é substituído pelo referido aminoácido modificado, em que o referido, pelo menos, um aminoácido não é eliminado, substituído e/ou adicionado, do primeiro ao quarto aminoácido do terminal amina na referida sequência de aminoácidos, excepto por o aminoácido 2 ou 3 do terminal amina ser substituído pelo referido aminoácido modificado e 1 (c) o qual que tem uma actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio em consequência da ligação ao receptor do secretagogo da hormona do crescimento, ou a um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Composto do tipo peptidico, (a) no qual o segundo ou terceiro resíduo de aminoácido do terminal amina é um aminoácido modificado, seleccionado de (i) serina, treonina, tirosina ou oxiprolina, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral é convertido num grupo representado por -OCO-Zlf -OCS-Zi ou -O-Z3 ou (ii) cisteína, na qual o grupo mercapto da cadeia lateral é convertido em -SCO-Zi, -SCS-Zi, -S-Z3 ou -S-S-Ζβ ou (iii) lisina ou arginina, nas quais o grupo amina da cadeia lateral é convertido em -NH-CO-Z2, -NH-CS-Z2, -N (Z5) (Z6) , -NH-CO-NH-Z- ou -NH-CS-NH-Z7 ou (iv) histidina ou triptofano, nas quais o grupo imina da cadeia lateral é convertida num grupo representado pela fórmula:

O II

4 ou

4 2 em que Zi, é hidrogénio ou uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 50 átomos de carbono, Z2, Z4 Z6, Z7 e Z8 são iguais ou diferentes e representam H ou uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 10 átomos de carbono, Z3 representa uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 10 átomos de carbono, Z5 representa uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 10 átomos de carbono, (b) o qual compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID N°: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 ou uma sequência de aminoácidos em que, pelo menos, um aminoácido pode ser eliminado, substituído e/ou adicionado, no qual o segundo ou terceiro aminoácido do terminal amina é substituído pelo referido aminoácido modificado, em que 0 referido, pelo menos, um aminoácido não é eliminado, substituído e/ou adicionado entre 0 primeiro ao quarto aminoácido do terminal amina, na referida sequência de aminoácidos , excepto por 0 aminoácido 2 ou 3 do terminal amina ser substituído pelo referido aminoácido modificado, e (c) o qual tem uma actividade de aumento da concentração intracelular de iões de cálcio, em consequência da ligação ao receptor do secretagogo da hormona do crescimento, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 3
3. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o aminoácido modificado é (i) serina, cujo grupo hidroxilo da cadeia lateral é convertido num grupo representado por -OCO-Zi, -OCS-Zi ou -0-Z3 ou (ii) cisteina cujo grupo mercapto da cadeia lateral é convertido em -SCO-Zi, -SCS-Zi, -S-Z3 ou -S-S-Z8, em que Zlf Z3 e Z8 têm o mesmo significado que o definido na reivindicação 2.
4. Composto do tipo peptidico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o aminoácido modificado é serina, treonina, tirosina ou oxiprolina, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral é convertido num grupo representado por -OCO-Zi-, em que Zi, é H ou uma cadeia alquilo, saturada ou não saturada, contendo 1 a 50 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
5. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o aminoácido modificado é um resíduo de aminoácido no qual é ligado um ácido gordo ao grupo hidroxilo da cadeia lateral, através de uma ligação éster ou ao grupo mercapto da cadeia lateral, através de uma ligação tioéster ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
6. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 5, em que o ácido gordo contém 2 a 35 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido gordo é seleccionado de ácidos gordos contendo 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 4
8. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 7, em que o ácido gordo é seleccionado de ácido octanóico, um seu ácido gordo monoeno e um seu ácido gordo polieno ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
9. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 7, em gue o ácido gordo é seleccionado de ácido decanóico, um seu ácido gordo monoeno e um seu ácido gordo polieno ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
10. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID N°: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 e 30, nas quais o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina ou da treonina na terceira posição a partir do terminal amina na referida sequência de aminoácidos se encontra acilado com um grupo acilo contendo 2 a 35 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
11. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID N°: 1, 8 ou 9 ou uma sequência de aminoácidos, na qual a serina na terceira posição do terminal amina na referida sequência de aminoácidos é convertida em treonina, na qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina ou da treonina na terceira posição do terminal amina é acilada com um grupo acilo contendo 2 a 35 átomos de carbono ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 5
12. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID N°: 3 ou 11, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina na terceira posição do terminal amina é acilada com octanoilo ou com um seu sal farmaceuticamente aceitável.
13. Composto do tipo peptídico de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 3, no qual o grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina na terceira posição do terminal amina é acilada com n-octanoílo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
14. Composto do tipo peptídico como reivindicado na reivindicação 1, em que o composto tem adicionalmente uma actividade de indução da secreção da hormona do crescimento.
15. Composto do tipo peptídico de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, o qual compreende um aminoácido básico ligado ao terminal carboxilo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
16. Composto do tipo peptídico de acordo com qualquer da reivindicações 1 a 15, em que o terminal amina é modificado com um grupo alquilo ou acilo, saturado ou não saturado, contendo um ou mais átomos de carbono e/ou o grupo hidroxilo do grupo carboxilo do terminal carboxilo é OZ ou é substituído por NR2R3, em que Z é um catião farmaceuticamente aceitável ou um grupo alquilo inferior, linear ou ramificado e R2 e R3 são iguais ou diferentes e 6 representam H ou um grupo alquilo inferior, linear ou ramificado ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
17. Anticorpo contra um composto do tipo peptidico descrito nas reivindicações 1 a 16, o qual reconhece especificamente o péptido parcial do terminal amina que tem o aminoácido modificado, como definido em qualquer das reivindicações 1 a 16, em que o referido péptido parcial do terminal amina é um péptido parcial do terminal amina do composto do tipo peptidico descrito nas reivindicações 1 a 16.
18. Método in vitro para o ensaio de um composto do tipo peptidico descrito nas reivindicações 1 a 16, o qual compreende a utilização do anticorpo descrito na reivindicação 17, para a detecção do composto do tipo peptidico descrito nas reivindicações 1 a 16.
19. Kit para a detecção de um composto do tipo peptidico descrito nas reivindicações 1 a 16, o qual compreende a utilização do anticorpo descrito na reivindicação 17.
20. Agente ou uma composição farmacêutica, a qual compreende um composto do tipo peptidico descrito nas reivindicações 1 a 16 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável como um ingrediente activo.
21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20 para o tratamento de doenças atribuíveis a um defeito ou uma diminuição na hormona do crescimento.
22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, para tratamento de doenças cardíacas. 7
23. Agente de acordo com a reivindicação 20, o qual é um agente promotor do apetite.
24. Agente de acordo com a reivindicação 20, o qual é um agente terapêutico para o tratamento de doenças funcionais do estômago.
25. Agente de acordo com a reivindicação 20 para proteger a túnica mucosa do intestino, para a prevenção de lesões da mucosa do intestino delgado, durante a nutrição intravenosa.
26. Agente de acordo com a reivindicação 20, o qual é um agente terapêutico para o tratamento da osteoporose.
27. Agente de acordo com a reivindicação 20, para a redução da cachexia causada por doenças crónicas.
28. Agente de acordo com a reivindicação 20, o qual é um agente terapêutico para o tratamento da insuficiência pulmonar.
29. Composição farmacêutica, agente ou agente terapêutico, de acordo com qualquer das reivindicações 20 a 28, os quais se destinam à aplicação a animais para além dos humanos.
30. Um método para produção de um composto do tipo peptidico descrito nas reivindicações 1 a 16, o qual compreende a ligação de um éster activado do péptido do terminal amina, o qual é obtido por sintese quimica, a um péptido do terminal carboxilo, o qual é obtido pela tecnologia de recombinação genética. 8
31. Um método para produção de um composto do tipo peptídico descrito nas reivindicações 5-14 pela tecnologia de recombinação genética, o qual compreende utilização de células tendo actividade de acilação da serina, por ligação de ácido octanóico a um grupo hidroxilo da cadeia lateral da serina da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 8, através de uma ligação éster. Lisboa, 17 de Agosto de 2007 9