FI92210C - Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI92210C FI92210C FI851842A FI851842A FI92210C FI 92210 C FI92210 C FI 92210C FI 851842 A FI851842 A FI 851842A FI 851842 A FI851842 A FI 851842A FI 92210 C FI92210 C FI 92210C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- arg
- leu
- ser
- ala
- ile
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth-hormone releasing factors (GH-RF) (Somatoliberin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Description
92210
Menetelma farmaseuttisesti kayttOkelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi
KeksinnOn kohteena on menetelma farmaseuttisesti . 5 kayttOkelpoisten kasvuhormonia vapauttavan tekijan syn-teettisten peptidianalogien valmistamiseksi. Peptidit vai-kuttavat ihmisen ja muiden eiainten aivolisSketoimintaan. Erityisesti tfimån keksinnOn kohteena on menetelma peptidin valmistamiseksi, joka edistaa aivolisakkeen kasvuhormonin 10 vapauttamista.
Fysiologit ovat pitkaan olleet perilia siita, etta alanakOkukkula saatelee aivolisakkeen etulohkon eritystoi-mintoja, jolloin alanakOkukkula tuottaa erikoisaineita, jotka kiihottavat tai estavat jokaisen aivolisakehormonin 15 erittymista. Hypotalaaminen estotekija luonnehdittiin 1972 somatostatiinin muodossa, joka estaa kasvuhormonin (GH) erittymisen. 1982 eristettiin ihmisen haima(kasvain)vapau-tustekijOita (hpGRF) ihmisen haimakasvainuutteista, ne puhdistettiin, luonnehdittiin, syntetisoitiin ja testat-20 tiin ja niiden havaittiin edistavan aivolisakkeen GH:n va pauttamista. Kumpaakin naista hypofysiotrooppisista teki-jOista on jåljennetty kokonaissynteesilia ja luonnon ra-kenteiden analogit on syntetisoitu. Uskotaan, etta ihmisen . hypotalaamisella GH-vapautustekijaiia on tasmaileen sama 25 rakenne; siten taman jaikeen kåytetåån kasitettå hGRF.
Vastaava rotan hypotalaaminen GH-vapautustekijå (rGRF), vastaava sian hypotalaaminen GH-vapautustekija (pGRF) ja vastaava naudan hypotalaaminen GH-vapautustekija (bGRF) on myOs luonnehdittu ja syntetisoitu.
30 Nyt on syntetisoitu ja testattu synteettisia poly- peptidejå, jotka vapauttavat GH:ia viljellyista aivolisa-kesoluista ja jotka kestavat ainakin osittain entsymaat-tista hajottamista kehossa ja joilla on hyvin olennaisesti lisaåntynyt teho. Nailia peptideillå on NaCH3-D-Ala(D-NMA) 35 2-asemassa ja/tai D-Leu 14-asemassa ja/tai D-Arg 29-ase- 92210 2 massa sekå edullisesti myos Nle 27-asemassa. D-Leu voi ol-la låsnå 17- ja/tai 23-asemissa ja joko D-Glu tai D-Asp vol olla låsnå 25-asemassa. Nåisså peptideisså voi olla myos joku seuraavista tåhteistå 1-asemassa: Tyr, D-Tyr, 5 Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His ja D-His, jossa tåh-teesså voi valinnaisesti olla metyylisubstituointi joko alfa-hiilellå tai alfa-aminoryhmåsså. Niisså voi valinnaisesti olla D-Asp 3-asemassa ja/tai joko D-Arg tai D-Ser 8-asemassa ja/tai D-Tyr 10-asemassa ja/tai D-Ala 15-asemas-10 sa. Niisså voi myos olla D-Met tai Nva joko Nle:n tai Met:n asemasta 27-asemassa.
Tåsså esitetyt farmaseuttiset yhdistelmåt sisåltå-våt analogeja, jotka ovat pituudeltaan n. 27 - 29 tåhdettå tai jonkin nåistå ei-myrkyllisen suolan, dispergoituna 15 farmaseuttisesti tai elåinlååketieteellisesti hyvåksyttå-våån nesteeseen tai kiinteåån kantimeen. Tållaisia farma-seuttisia yhdistelmiå voidaan kåyttåå kliinisesså lååke-tieteesså sekå ihmis- ettå elåinlååketieteesså, antamista vårten hoitotarkoituksissa ja myos diagnostisesti. Lisåksi 20 niitå voidaan kåyttåå ediståmåån låmminveristen elåinten, siipikarja mukaan lukien ja vesiviljelysså kylmåveristen elåinten, esimerkiksi kalojen, ankeriaiden yms., kasvua.
Peptidien måårittelemiseen kåytetty nimistd on Schroder'in & Lubke'n "The Peptides", Academic Press 25 (1965), måårittelemå, jossa tavanomaisen esitystavan mu- kaisesti aminoryhmå N-pååtteellå nåkyy vasemmalla ja kar-boksyyliryhmå C-pååtteellå oikealla. Luonnon aminohapoilla tarkoitetaan tavallisia, luonnossa esiintyviå aminohappo-ja, joita esiintyy proteiineissa ja joita ovat Gly, Ala, 30 Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Nle:llå tarkoitetaan norleusiinia ja Nva:11a tarkoitetaan norvaliinia. Kun amino-happotåhteellå on isomeerisiå muotoja, esitetåån aminohapon L-muoto, ellei toisin selvåsti ole osoitettu. 35 D-NMA tarkoittaa alaniinin D-isomeeriå, jossa alfa-amino- 3 92210 ryhma on substituoitu metyylilla.
Tåmå keksinto kohdistuu menetelmåån farmaseuttises-ti kåyttokelpoisten kasvuhormonia vapauttavan tekijån syn-teettisten peptidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on 5 sekvenssi: R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Re-Ser-R10-Arg-R12-R13-R14-Gly-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R2B-R29 -NHR, jos-sa Rx on Tyr tai His; Rj on Ala tai D-NMA; R8 on Ser tai Asn; R10 on Tyr tai D-Tyr; R12 on Arg tai Lys; R13 on lie tai 10 Val; R14 on Leu tai D-Leu; R18 on Tyr tai Ser; R^ on His tai Gin; R25 on Glu tai Asp; R28 on Asn tai Ser; R29 on Arg tai D-Arg; ja R on H tai CH2CH3; edellyttaen kuitenkin, ettå R29 tai R28 - R29 voidaan jattåå pois, ja edellyttaen myoskin, etta R2 on D-NMA ja/tai R14 on D-Leu ja/tai R29 on D-Arg.
15 Peptidit syntetisoidaan jollakin sopivalla menetel- mållå, kuten yksinomaisesti kiintofaasimenetelmilla, osit-tain kiintofaasimenetelmilla, osaskondensaatiolla tai klassisilla liuoskytkemisilla. Viime aikoina kehitettyja yhdistelmå-DNA-menetelmiå voidaan kayttåå osan analogista 20 valmistamiseksi, joka sisaltåa ainoastaan luonnon amino-happotahteitå, joka osa sitten voitaisiin kytkeå lyhyeen N-pååtepeptidiin. Esimerkiksi menetelmia yksinomaisesti kiintofaasisynteesiå vårten on esitetty oppikirjassa "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Yound, Freeman 25 & Co., San Francisco, 1969 ja esimerkkeja niistå on esitetty US-patentissa nro 4 105 603, myonnetty 8.8.1978
Vale et al:lle. Klassista liuossynteesia on selostettu yk-sityiskohtaisesti julkaisussa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch 30 (toimittaja) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Lånsi-Saksa. Fragmenttikondensaatiosynteesimenetelmasta on esitetty esimerkkeja US-patentissa nro 3 972 859 (3.8.1976). Muista kåytettavisså olevista synteeseistå on esitetty esimerkkeja US-patentissa nro 3 842 067 (15.10.1974) ja 35 US-patentissa nro 3 862 925 (28.1.1975).
« 92210 4
Yhteistå tållaisille synteeseille on eri aminohap-po-osien epåvakaisten sivuketjuryhmien suojaaminen sopi-villa suojaryhmillå, jotka eståvåt kemiallisen reaktion tapahtumisen siinå kohdassa, kunnes ryhmå on lopullisesti 5 poistettu. Yhteistå on tavallisesti myiis alfa-aminoryhmån suojaaminen aminohapolla tai osasella, samalla kun tåmå kokonaisuus reagoi karboksyyliryhmållå, mitå seuraa alfa-aminosuojaryhmån selektiivinen poistaminen sallimaan myii-hemmån reaktion tapahtuminen tåsså paikassa. Siten on ta-10 vallista, ettå yhtenå vaiheena synteesisså valmistetaan vålituoteyhdiste, joka sisåltåå jokaisen aminohappotåh-teistå sijoitettuna sen haluttuun sekvenssiin peptidiket-jussa sivuketjusuojaryhmåt kytkettyinå sopiviin tåhtei-siin.
15 KeksinnOn mukaiselle menetelmålle on tunnusomaista, ettå (a) muodostetaan vålituotepeptidi, jossa on ainakin yksi suojaryhmå ja jolla on kaava (II) tai sen tarkoituk-senmukaisesti lyhennetty muunnos: X1-^(X tai X2) -R2-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -R8( X4 tai X5)-20 Ser(X4)-R10(X2)-Arg(X6)-R12(X6 tai X7 )-R13-R14-Gly-Gln(X5)-Leu- R18(X2 tai X4) -Ala-Arg( X6) -Lys( X7) -Leu-Leu-R24( X tai X5)-R25-(X3)- Ile-Nle-R28( X4 tai X5)-R29(X6)-X9, jossa: X, X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin joko vety tai suojaryhmå ja X9 on joko suojaryhmå tai kiinnittåvå sidos hartsikantimeen 25 tai on des-X9, jossa tapauksessa C-pååte on NHR, (b) pilko-taan suojaryhmå tai -ryhmåt tai kiinnittåvå sidos kaavan (II) mukaisesta peptidistå; ja puhdistetaan saatu peptidi.
X1 on joko vety tai α-aminosuojaryhmå, X3:n tarkoit-tamat α-aminosuojaryhmåt ovat niitå, joiden hyvin tiede-30 tåån olevan kåyttfikelpoisia polypeptidien vaiheittaisen synteesin alalla. α-aminosuojaryhmien luokkia, joita voi-daan kåyttåå X3:nå, ovat (1) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmåt, kuten fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (FMOC), bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu Z, ku-35 ten p-klooribentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyyli- oksikarbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli ja p-metok- 5 9221 0 sibentsyylioksikarbonyyli; (2) alifaattiset uretaanisuoja-ryhmåt, kuten t-butyylioksikarbonyyli (BOC), di-isopropyy-limetyylioksikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etok-sikarbonyyli, allyylioksikarbonyyli; sekå (3) sykloalkyy-5 li-uretaani-tyyppiset suojaryhmåt, kuten syklopentyyliok-sikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja sykloheksyyli-oksikarbonyyli. Edullinen α-aminosuojaryhmå on BOC, sil-loinkin kun N“Me-substituoitua tåhdettå kåytetåån 1-asemas-sa.
10 X on vety tai suojaryhmå His:n imidatsolitypelle, kuten Tos.
X2 on sopiva suojaryhmå Tyr:n fenoli-hydroksyyliryh-målle, kuten tetrahydropyranyyli, tert-butyyli, trityyli, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ ja 2,6-diklooribentsyyli (DCB). Edulli-15 nen suojaryhmå on 2,6-diklooribentsyyli. X2 voi olla vety, mikå tarkoittaa, ettå aminohappotåhteellå tåsså asemassa ei ole sivuketjusuojaryhmåå.
X3 on vety tai sopiva esterin muodostava suojaryhmå Aspsn tai Glu:n karboksyyliryhmålle, kuten bentsyyli 20 (OBzl), 2,6-diklooribentsyyli, metyyli ja etyyli.
X4 voi olla sopiva suojaryhmå Thr:n tai Ser:n hyd-roksyyliryhmålle kuten asetyyli, bentsoyyli, tert-butyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-diklooribentsyyli ja CBZ. Edullinen suojaryhmå on Bzl. X4 voi olla vety, mikå 25 tarkoittaa, ettå hydroksyyliryhmållå ei ole suojaryhmåå.
X5 on vety tai sopiva suojaryhmå Asn:n tai Gln:n sivuket ju-amidoryhmål le. Se on edullisesti ksantyyli (Xan).
X6 on sopiva suojaryhmå Arg:n guanidiiniryhmålle, kuten nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli ja BOC 30 tai vety.
X7 on vety tai sopiva suojaryhmå Lys:n sivuketju-aminoryhmålle. Kuvaavia sopivia sivuketju-aminosuojaryhmiå ovat 2-klooribentsyylioksikarbonyyli-(2-Cl-Z), Tos, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.
35 X8 on vety tai sopiva sivuketjusuojaryhmå, kuten 92210 6 edellå on yleisesti måaritelty.
Met voi valinnaisesti olla suojattu hapella, mutta jåtetaån edullisesti suojaamatta.
Sivuketju-aminosuojaryhmån valinta ei ole ratkaise-5 va, paitsi ettå yleenså valitaan sellainen, joka ei poistu α-aminoryhmien suojausta purettaessa synteesin aikana. Toisille aminohapoille, esim. His:Ile, suojaaminen ei kui-tenkaan ole yleenså tarpeen sen jålkeen kun kytkeminen on loppuunsuoritettu ja suojaryhmåt voivat olla samoja.
10 X9 on sopiva suojaryhmå C-pååte-karboksyyliryhmålle, kuten esterin muodostava ryhmå X3 tai se on kiinnittåvå sidos, jota kåytetåån kiintofaasisynteesisså kiinnittåmistå vårten kiinteåån hartsikantimeen tai on des-X9, jossa ta-pauksessa C-pååte on NHR. Kun kåytetåån kiinteåå hartsi-15 kanninta, se voi olla joku tekniikan tasolla tunnetuista kuten kannin, jolla on kaava: -0-CH2-hartsikannin, -NH-bentshydryyliamiini(BHA)hartsikannin tai -NH-parametyyli-bentshydryyliamiini(MBHA)hartsikannin. Kun halutaan subs-tituoimaton amidi, on BHA- tai MBHA-hartsin kåytto edul-20 lista, koska pilkonta antaa suoraan amidin. Tapauksessa, jossa halutaan N-metyyliamidi, se voidaan kehittåå N-metyyli-BHA-hartsista. Jos halutaan muita substituoituja amideja tai jos halutaan muita substituoituja amideja tai jos halutaan muita ryhmiå kuin vapaa happo C-pååtteelle, 25 saattaa olla edullista syntetisoida peptidi kåyttåen klas-sisia menetelmiå, kuten Houben-Weyl -julkaisussa esite-tåån.
Vålituotteen kaavassa ainakin yksi X-ryhmistå on suojaryhmå tai X9 sisåltåå hartsikantimen. Siten keksinto 30 koskee menetelmåå kiinnostavan peptidin valmistamiseksi (a) muodostamalla peptidi, jossa on ainakin yksi suojaryhmå ja jolla on kaava (II), jossa: X, X1, X2, X3, X4, Xs, X6, X7 ja X8 ovat jokainen joko vety tai suojaryhmå ja X9 on joko suojaryhmå tai hartsikantimeen kiinnittåvå sidos tai 35 des-X9, jossa tapauksessa tåhteesså C-pååte on NHR; (b) 92210 7 pilkkomalla suojaryhmå tai -ryhmåt tai kiinnittavå sidos pois kaavan (II) peptidistå; ja (c) jos halutaan, muutta-malla saatu sekvenssin (i) peptidi ei-myrkylliseksi suo-lakseen.
5 Valittaessa nimenomaista sivuket jusuojaryhmåå, jota kåytetåån peptidien synteesisså, seurataan seuraavia ylei-siå sååntojå: (a) suojaryhma såilyttåå edullisesti suojaa-vat ominaisuutensa eikå pilkkoudu pois kytkentaolosuhteis-sa, (b) suojaryhmån tulisi olla keståvå reagenssille ja se 10 on, Xan:ia lukuunottamatta, edullisesti pysyvå reaktio- olosuhteissa, jotka valitaan a-aminosuojaryhmån poistami-seksi synteesin jokaisessa vaiheessa, ja (c) sivuketjusuo-jaryhmån taytyy olla poistettavissa kun synteesi, joka si-saltåa halutun aminohapposekvenssin, on suoritettu loppuun 15 reaktio-olosuhteissa, jotka eivåt muuta peptidiketjua ei-toivotulla tavalla.
Kun peptidejå ei valmisteta yhdistelmå-DNA-teknolo-giaa kåyttåen, ne valmistetaan edullisesti kåyttåen kiin-tofaasisynteesia kuten Merrifield'in, J. Am. Chem. Soc. 20 85, s. 2149 (1963) yleisesti selostamaa kiintofaasisyntee- sia, joskin myos muita samanarvoisia kemiallisia alalla tunnettuja synteesejå voidaan kåyttåå kuten edellå mainit-tiin. Kiintofaasisynteesi aloitetaan peptidin C-pååtteen påasta kytkemalla suojattu α-aminohappo sopivaan hartsiin. 25 Tållainen lahtoaine voidaan valmistaa kiinnittåmållå a-aminosuojattu aminohappo esterisidoksella kloorimetyloi-tuun hartsiin tai hydroksimetyylihartsiin tai amidisidok-sella BHA-hartsiin tai MBHA-hartsiin. Hydroksimetyylihart-sin valmistuksen ovat selostaneet Bodansky et al., Chem. 30 Ind. (Lontoo) 38, 1597-98 (1966). Kloorimetyloituja hart-seja on kaupallisesti saatavissa firmasta Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia ja firmasta Lab. Systems, Inc. Tållaisen hartsin valmistusta ovat selostaneet Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & 35 Co., San Francisco (1969), luku 1, sivut 1 - 6). BHA- ja 92210 8 MBHA-hartsikantimia on kaupallisesti saatavissa ja niita kåytetaån yleisesti ainoastaan kun halutussa syntetisoita-vassa polypeptidisså on substituoimaton amidi C-pååtteel-lå.
5 C-pååteaminohappo, esim. Asn, joka on suojattu BOC: llå tai Xanrllå, voidaan ensin kytkeå kloorimetyloituun hartsiin menetelmån mukaisesti, joka on esitetty julkai-sussa Chemistry Letters, K. Horiki et al. 165 - 168 (1978), kåyttaen KF DMFissa n. 60°C:ssa 24 tuntia sekoit-10 tåen, kun on syntetisoitava 43-tahteen peptidi. BOC-suojatun aminohapon kytkemisen jålkeen hartsikantimeIle a-ami-nosuojaryhmå poistetaan esim. kayttåen trifluorietikkahap-poa (TFA) metyleenikloridissa tai TFA yksinaån. Suojauksen purkaminen suoritetaan låmpotilassa 0°C:sta huoneen låmpo-15 tilaan. Muita standardipilkontareagensseja, kuten HC1 dioksaanissa ja olosuhteita spesifisten a-aminosuojaryh-mien poistamiseksi voidaan kåyttåå, kuten Schroder & Lubke, "The Peptides" 1, sivut 72 - 75 (Academic Press 1965), ovat selostaneet.
20 α-aminosuojaryhmån poistamisen jålkeen jåljelle jååvåt α-amino- ja sivuketjusuojatut aminohapot kytketåån vaiheittain halutussa jårjestyksesså edellå mååritellyn vålituoteyhdisteen saamiseksi tai vaihtoehtona siile, ettå jokainen aminohappo yhdistetåån erikseen tåsså synteesis-25 så, jotkut niistå voidaan kytkeå toisiinsa ennen lisååmis-tå kiintofaasireaktoriin. Sopivan kytkentåreagenssin va-linta kuuluu alaan perehtyneen tietåmykseen. Erityisen so-piva kytkentåreagenssiksi on N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCCI).
30 Aktivoimisreagenssit, joita kåytetåån peptidien kiintofaasisynteesisså, ovat hyvin tunnettuja peptidien alalla. Esimerkkejå sopivista aktivoimisreagensseista ovat karbodi-imidit, kuten N,N'-di-isopropyy1ikarbodi-imidi ja N-etyyli-N' - (3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita 35 aktivoimisreagensseja ja niiden kåyttoå peptidien kytken- 9221 0 9 nåsså, ovat selostaneet Schroder & Lubke, supra, luvussa III ja Kapoor, J. Phar. Sci., 59, sivut 1-27, (1970).
Jokainen suojattu aminohappo tai aminohapposekvens-si viedåån kiintofaasireaktoriin n. 4-kertaisessa tai suu-5 remmassa ylimååråsså ja kytkeminen suoritetaan dimetyyli-formeimidi(DMF) :CH2C12 (1 s 1 )-våliaineessa tai DMFissa tai CH2Cl2:ssa yksinåån. Tapauksissa, joissa esiintyy epåtåy-dellistå kytkeytymistå, kytkentåprosessi toistetaan ennen α-aminosuojaryhmån poistamista ennen seuraavan aminohapon 10 kytkemistå. Kytkentåreaktion tulosta synteesin jokaisessa vaiheessa, jos se suoritetaan kåsin, tarkkaillaan edulli-sesti ninhydriinireaktiolla, kuten ovat selostaneet E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Kytkentå-reaktiot voidaan toteuttaa automaattisesti, esim. Beckman 15 990 automaattisella syntetisoimislaitteella kåyttåen oh- jelmaa, jollaisen ovat esittaneet Rivier et al., Biopolymers, 1978, 17, sivut 1927 - 1938.
Sen jålkeen kun haluttu aminohapposekvenssi on saa-tu tåydelliseksi, vålituotepeptidi voidaan poistaa hartsi-20 kantimesta kåsittelemållå reagenssilla, kuten nestemåisel-lå fluorivedyllå, joka ei ainoastaan lohkaise peptidiå hartsista, vaan pilkkoo myos kaikki jåljellå olevat sivu-ketjusuojaryhmåt X, X2, X3, X4, X5, X6, X7 ja X8 ja kiinnit-tåvåt sidokset X9 sekå myos α-aminosuo jaryhmån X1, jos sel-25 laista kåytetåån, peptidin saamiseksi vapaan hapon muodos-sa. Jos Met on låsnå sekvenssisså, BOC-suojaryhmå poiste-taan edullisesti ensin kåyttåen trifluorietikkahappo (TFA)/etaaniditiolia ennen peptidin lohkaisua hartsista HF:llå mahdollisen S-alkyloinnin poistamiseksi. Kun pil-30 kontaan kåytetåån fluorivetyå, sisållytetåån reaktioas- tiaan anisolia ja metyylietyylisulfidia happoa poistaviksi aineiksi.
Seuraavassa esimerkisså esitetåån edullinen mene-telmå peptidien syntetisoimiseksi kiintofaasimenetelmållå. 35 On tietenkin selvåå, ettå vastaavasti lyhyemmån peptidi- 92210 10 osasen synteesi suoritetaan samalla tavalla pelkåståån poistamalla tarvittava måårå aminohappoja ketjun jommasta-kummasta pååstå; nykyaan tuntuu kuitenkin silta, ettå biologisesti aktiivisten osasten tulisi sisåltåå osoitettu 5 sekvenssi N-pååtteellå.
Esimerkki I (Vert ai lue s inter kki)
Peptidin [ N“MeTyr1, D-NMA2, D-Leu23 ] -rGRF (1-43) -OH, jolla on kaava: N MeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-10 His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-
Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH synteesi suoritetaan vaiheit-tain kayttåen Beckman 990 -peptidisyntetisoijaa kloorime-tyloidulla hartsilla, jonka korvausalue on n. 0,1 - 0,5 mmoolia/g hartsia. BOC-Asn(Xan):n kytkeminen hartsiin suo-15 ritetaan yleisellå menetelmållå, joka on esitetty julkai- sussa Chemistry Letters, supra, kayttåen KF:ia DMFsssa n. 60°C:ssa 24 tuntia sekoittaen, jonka seurauksena korvautuu n. 0,35 mmoolia Asn grammaa kohti hartsia.
Suojauksen poistamisen ja neutraloinnin jålkeen 20 peptidiketju rakennetaan vaihe vaiheelta hartsille. Jokai- sen aminohapon suojauksen poistaminen, neutralointi ja lisååminen suoritetaan yleisesti yhdenmukaisesti menetel-mån kanssa, jonka on yksityiskohtaisesti esittånyt Rivier, J., J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986 - 2992 (1974). Kaikista 25 liuottimista, joita kåytetåån, poistetaan kaasut huolelli- sesti suihkuttamalla inertillå kaasulla, esim. heliumilla tai typellå hapen, joka saattaisi ei-toivotulla tavalla hapettaa Met-tåhteen rikin, poissaolon takaamiseksi.
Suojauksen poistaminen suoritetaan edullisesti seu-30 raavan ohjelman A mukaisesti:
Ohielma A
Reagenssi Sekoittamisaika (min) 1. 60 % TFA/2 % etaaniditiolia 10 2. 60 % TFA/2 % etaaniditiolia 15 35 3. IPA/1 % etaaniditiolia 0,5 11
9221 O
4. EtjN (10 %) CH2Cl2:ssa 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10 %) CH2Cl2:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 5 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5
Kytkemiset suoritetaan edullisesti kuten seuraavas-sa ohjelmassa B esitetåån:
Ohielma B
Reagenssi Sekoittamisaika (min)
10 9. DCCI
10. Boc-aminohappo 50-90 11. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3M) CH2Cl2:ssa 15,0 15 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 (kahdesti) 0,5
Lyhyesti esitettynå kåytetåån yhdestå kahteen mmoo-lia BOC-suojattua aminohappoa metyleenikloridissa grammaa 20 kohti hartsia, plus yksi ekvivalentti 1,0 moolista DCCI metyleenikloridissa kahden tunnin aikana. Kun BOC-Arg(TOS) kytketaån, kåytetåån seosta, jossa on 50 % DMF ja metylee-nikloridia. Bzl-eetteriå kåytetåan hydroksyyli-sivuketju-suojaryhmånå Ser:Ile ja Thrslle. Asn:n tai Gln:n amidoryh-25 må suojataan Xan:lla, kun kåytetåån DCC-kytkentåå, mikå on edullista. P-nitrofenyyliesteriå (ONp) voidaan myos kåyt-tåå aktivoimaan Asn:n tai Gln:n karboksyylipåå ja esimer-kiksi BOC-Asn(ONp) voidaan kytkeå yli yon kåyttåen yhtå ekvivalenttia HOBt DMFsn ja metyleenikloridin 50 %:sessa 30 seoksessa, jossa tapauksessa DCC:tå ei lisåtå. 2-kloori-bentsyylioksikarbonyyli(2Cl-Z):tå kåytetåån suojaryhmånå Lys-sivuketjulle. Tos:ia kåytetåån suojaamaan Arg:n guani-diiniryhmå ja His:n imidatsolityppi ja Glu- tai Asp-sivu-ketju-karboksyyliryhmå suojataan OBzlslla. Tyr:n fenoli-35 hydroksyyliryhmå suojataan 2,6-diklooribentsyylillå (DCB).
• 92210 12
Synteesin lopussa saadaan seuraava yhdistelmå: BOC-NaMeTyr (X2) -D-NMA-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Ser (X4) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg (X6) -Arg (X6) -Ile-Leu-Gly-Gln (X5) -Leu-Tyr (X2) -Ala-Arg (X6) -Lys (X7) -Leu-D-Leu-His (X) -Glu (X3) -Ile-5 Met-Asn (Xs) -Arg (Xs) -Gin (X5) -Gly-Glu (X3) -Arg (X4) -Arg (Xs) -Phe-
Asn(X5)-X9, jossa X2 on DCB, X3 on OBzl, X4 on Bzl, Xs on Xan, X6 on Tos, X7 on 2Cl-z ja X9 on -0-CH2-hartsikannin. Xan on voitu osittain tai kokonaan poistaa TFA-kåsittelyl-lå, jota kaytettiin α-aminosuojaryhman poistamiseen.
10 Suojatun peptidihartsin pilkkomiseksi ja suojauksen poistamiseksi sltå kasitellåån 1,5 ml:11a anisolia, 0,5 ml:11a metyylietyylisulfidia ja 15 ml:11a fluorivetyå (HF) grammaa kohti peptidihartsia, -20°C:ssa puoli tuntia ja 0°C:ssa puoli tuntia. HF:n poistamisen jålkeen suurtyhjosså 15 hartsipeptidijåånnos peståan vuorotellen kuivalla dietyy- lieetterillå ja kloroformilla ja peptidi uutetaan sitten 2N vesipitoisella etikkahapolla, josta kaasut on poistettu ja erotetaan hartsista suodattamalla. Pilkottu peptidi, josta suojaus on poistettu, liuotetaan sitten 0,5 %:seen 20 etikkahappoon ja puhdistetaan, mikå voi tapahtua Sephadex G-50 hienogeelisuodatuksella.
Peptidiå puhdistetaan sitten edelleen valmistavalla tai puolivalmistavalla HPLC:lla, kuten Rivier et al., Peptides: Structure and Biological Function (1979), sivut 25 125-8 ja Marki et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981) ovat selostaneet. Hylsyja, jotka sopivat Waters Associates prep LC-500:n, kaytetaån 15 - 20 u C18 Silicalla Vydacista (300 A). CH3CN:n gradientti TEAP:ssa kehitetåån pienpaine Eldex-gradientin tekijallå, kuten on selostanut Rivier J., 30 J. Lig. Cromatography 1, 343 - 367 (1978). Kromatografija-keita tarkkaillaan huolellisesti HPLC:lla ja ainoastaan ne jakeet, jotka ovat olennaisen puhtaita, yhdistetåan. Suo-lan poisto puhdistetuista jakeista, jotka on itsenåisesti tarkistettu puhtauden suhteen, suoritetaan CH3CN:n gradien-35 tilla 0,1 %:sessa TFA:ssa. Keskijae lyofiloidaan sitten 92210 13 antamaan haluttu peptidi, jonka puhtaus voi olla yli 98 %.
Synteesi toistetaan kåyttåen MBHA-hartsia antamaan sama peptidi, jolla on amidoitu C-pååte, kåyttåen alkume-netelmåå, jonka ovat yleisesti selostaneet Vale et al. US-5 patentissa nro 4 292 313, Asn:n liittåmiseksi MBHA-hart-siin.
Esimerkki II
hGRF-analogiosasen [D-NMA2, Nle27]-hGRF( 1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-10 Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-
Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheit-tain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hart-silla, kuten ovat yleisesti selostaneet Vale et al. US-patentissa nro 4 292 313. Peptidin arvostellaan olevan 15 pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLC:aa.
Synteesi toistetaan [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-27)-NH2:n valmistamiseksi.
Esimerkki III
[D-NMA2, Nle27]-rGRF(l-29)-NH2:n, jolla on kaava: 20 H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-
Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla kuten esimerkisså II. Peptidin arvostellaan olevan pååasialli-25 sesti puhdas kåyttåen TLCsaa ja HPLCsaa.
Esimerkki IV
[D-NMA2, Nle27]-pGRF( 1-29)-NH2sn, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-30 Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen
Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten ovat yleisesti selostaneet Vale et al. US-patentissa nro 4 292 313. Peptidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLC:aa.
35 Esimerkki V
14 9221 0 [D-NMA2, Nle27]-bGRF(l-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen Beckman 5 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten yleisesti ovat selostaneet Vale et al. US-patentissa 4 292 313. Pep-tidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLCsaa.
Synteesi toistetaan [D-NMA2, Val13, Ser18]-rGRF(Ι-ΙΟ 29)-NH2:n valmistamiseksi.
Esimerkki VI
[D-NMA2, Nle27, D-Arg29]-pGRF( 1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-15 Ile-Nle-Ser-D-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain
kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten ovat yleisesti selostaneet Vale et al. US-patentissa 4 292 313. Peptidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLC:aa. Asetaattisuola valmis-20 tetaan sitten liuottamalla peptidi veteen ja lisååmållå IN
etikkahappoa. Saatu liuos lyofiloidaan antamaan etikkahap-posuola.
Esimerkki VII
hGRF-analogin [D-NMA2, Nle27, D-Arg29 ]-hGRF( 1-29)-25 NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-
Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-D-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkisså II. Tåmån analogin ar-30 vostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLCsaa ja HPLC:aa.
Esimerkki VIII
[D-Leu14, Nle27 ]-rGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-35 Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-
II
92210 15
Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkisså II. Peptidin arvostellaan olevan pååasialli-sesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLCraa.
5 Synteesi toistetaan [D-NMA2, D-Leu14, Nle27]- rGRF(1-29 )-NH2:n valmistamiseksi.
Esimerkki IX
hGRF-analogin [D-NMA2, Nle27, Asn28]-hGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-10 Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-
Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttaen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkisså II. Peptidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttaen TLC:aa ja HPLC:aa. 15 Esimerkki X
[Nle27, D-Arg29]-rGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-D-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen Beckman 20 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkis- så II. Peptidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLC:aa.
Esimerkki XI
hGRF-analogiosasen [D-NMA2, D-Tyr10, Nle27]-hGRF-25 (1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-
Thr-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkisså II. Peptidin arvos-:* 30 tellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLC:aa.
Esimerkki XII
hGRF-analogiosasen, D-NMA2, Nle27-hGRF( 1-29 )-NHEt:n, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser- 35 Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu- • « « 16 92210
Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NHCH2CH3, synteesi suoritetaan vai-heittain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria kloo-rimetyloidulla hartsilla, kuten esimerkisså I. Peptidi pilkotaan hartsista ammonalyysillå kåsittelemållå etyyli-5 amiinilla. Peptidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLC:aa.
Esimerkki XIII
[D-Leu14, Nle27]-rGRF( 1-29 )-NH2:n, jolla on kaava: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-10 Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-
Asn-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vaiheittain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkisså II.
Peptidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas 15 kåyttåen TLC:aa ja HPLCiaa.
Esimerkki XIV
hGRF-analogiosasen [His1, D-NMA2, Nle27]-hGRF( 1-29)-NH2:n, jolla on kaava: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-20 Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, synteesi suoritetaan vai heittain kåyttåen Beckman 990 Peptide Synthesizeria MBHA-hartsilla, kuten esimerkissS II. Peptidin arvostellaan olevan pååasiallisesti puhdas kåyttåen TLC:aa ja HPLC:aa.
·· Synteesi toistetaan kahdesti [His1, Nle27, D-Arg29]- 25 hGRF(1-27 )-NH2: n valmistamiseksi.
Esimerkeisså valmistettuja synteettisiå peptidejå verrataan synteettiseen hpGRF(l-40)-0H:hon in vitro-ana-lyyseisså ja niillå havaitaan yleenså olevan suuremmat tehot GH:n eritystå vårten ja samanlaiset luontaiset ak-30 tiivisuudet.
Kaikkien nåiden synteettisten peptidien katsotaan olevan biologisesti aktiivisia ja tehokkaasti kåyttdkel-poisia aivolisåkkeen GH-vapauttamisen stimulointiin.
Tiettyjen edustavien synteettisten peptidien suh-35 teellisen tehokkuuden måårittåmiseksi kasvuhormonin va- * 92210 17 pauttamisen ediståmiseksi suoritetaan in vitro-måarityksiå kayttåen synteettistå hpGRF(l-40)-OH:ta standardina rin-nakkaisessa vertailussa vastaavien analogien, jotka on syntetisoitu, ekvimolaaristen pitoisuuksien kanssa. Kåyte-5 tåån viljelyjå, jotka sisåltåvåt soluja rotan aivolisåk-keistå, jotka on poistettu n. 3 - 5 påivåå aikaisemmin. Tållaisia viljelyjå pidetåån optimaalisina kasvuhormonin erittåmistå vårten ja niitå kåytetåån vertailevaan testaa-miseen yleisellå tavalla, jonka ovat selostaneet Vale et 10 al., Endocrinology, 91, 562 - 572 (1972) ja yksityiskoh-taisemmin selostaneet Vale et al., Endocrinology, 112, 1553 - 1555 (1983). Inkubointi testattavan aineen kanssa suoritetaan 3-4 tunnissa ja viljelyvåliaineen tasaosia poistetaan ja kåsitellåån niiden immunoreaktiivisen GH:n 15 (irGH) mittaamiseksi hyvin luonnehditulla radioimmunoana-lyysilla.
Tulokset tåstå vertailevasta testauksesta ekvimo-laarisille pitoisuuksille on esitetty taulukossa I, jossa myos on esitetty yhdisteiden optinen kierto.
20
Taulukko I
Peptidi In vitro-koe Optinen _ Vertailu-% kierto 25 _ [a]” c=l 1 % etikka-happoa
hGRF(1-40)-OH
30 (standard! tåtå koetta vårten) 100 % [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-29)-NH2 1330 % - 57,9° [D-NMA2, Nle27]-hGRF(1-27)-NH2 150 % - 56,8° [D-NHA2, Nle27]-hGRF(1-29)-NHEt 1130 % - 57,0° [D-NMA2, Nle27, Asn2']-hGRF(1-29)-NH2 520 % - 57,6° 35 [D-Leu1*, Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 120 % - 52,6° [Nle27, D-Arg2*]-rGRF(1-29)-NH2 386 % - 52,7° [D-NMA2, Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 900 % - 51,9° [D-NMA2, D-Tyr10, Nle27]-hGRF-(1-29)-NH2 270% -56,7° [D-NMA2, Nle27, D-Arg”]-hGRF-(1-29)-NH2 580% -57,8° 40 [His1, D-NMA2, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2 260 % - 57,3° 92210 18 Nåiden synteettisten peptidien in vitro-testaus osoittaa, ettå niillå on yllattåen suurempi biologinen te-hokkuus kuin hpGRF(l-40)-OH:lla, esimerkiksi pienin teho-kas pitoisuus [D-NMA2, Nle27]-hGRF( l-29)-NH2; lie on η. 1 pi-5 komoolinen.
In vitro-testien kasvuhormonin erittåmisen suhteen lisåksi in vivo-kokeissa ruiskutetaan nåitå synteettisiå peptidejå laskimonsisåisesti uretaani-nukutettuihin uros-puolisiin rottiin ja mååritetåån, ettå ne tukahduttavat 10 spontaanin GH-erityksen poistamatta vastetta oksegeenisel- le GRFtlle. Verinåytteitå otetaan vålittomåsti ennen ruis-keita ja 10, 30 ja 90 minuuttia ruiskeiden jålkeen. GH-tasot veresså, mitattuina radioimmunoanalyysillå osoittavat, ettå synteettinen [ D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-29)-NH2 on 15 noin kuusi kertaa tehokkaampi kuin hGRF(1-40)-OH aivo-lisåke-GH:n veritasojen suhteen mitattuina sekå 10 ettå 30 minuutin kuluttua IV:n ruiskeesta. Muita tunnettuja GRF in vivo-testejå, joiden tiedetåån olevan tehokkaita havaitse-maan GH-eritys, kåytetåån nåiden tulosten vahvistamiseksi. 20 Annoksia våliltå n. 50 nanogrammaa - n. 5 mikrogrammaa nåitå peptidejå/kg kehon painoa pidetåån tehokkaina ai-kaansaamaan GH-eritys. Jotkut peptidit, jotka osoittavat in vitro biologis ta tehoa, joka on yhtå suuri tai jopa pienempi kuin standardilla, osoittavat in vivo tehokkuut-25 ta, joka on paljon suurempi.
Tållaisten synteettisten hGRF-analogien ja mahdol-lisesti rGRF-, bGRF- ja pGRF-analogien tulisi olla hyodyl-lisiå ihmiskåyttoon, kun lååkåri haluaa lisåtå GH-tuotan-toa. GH-erityksen kiihottaminen tållaisilla analogeilla on 30 kiinnostavaa potilailla, joilla on tåydellinen tai suh-teellinen GH-puutos, joka aiheutuu endogeenisen GRF:n ali-tuotannosta. Lisåksi on todennåkoistå, ettå lisååntynyt GH-eritys ja siihen liittyvå lisåys kasvussa voitaisiin saavuttaa ihmisillå tai elåimillå, joilla on normaalit GH-35 tasot. Lisåksi antaminen muuttaisi kehon rasvasisåltoå ja 19 9221 0 muuntelisi muita GH:sta riippuvia aineenvaihdunnallisia, immunologisia ja kehityksellisiå prosesseja. Esimerkiksi, nåmå analogit voivat olla hyodyllisia vålineena stimuloida anabolisia prosesseja ihmisissa olosuhteissa, jotka seu-.5 raavat palohaavojen saamista. Toisena esimerkkinå nåitå analogeja voidaan antaa lamminverisille kotitalouselåimil-le kuten kananpojille, kalkkunoille, porsaille, vuohille, karjalle ja lampaille ja niitå voidaan kåyttaå vesivilje-lyksesså kalojen ja muiden kylmaveristen merielåinten, 10 esim. merikilpikonnien ja ankeriaiden seka sammakkoelain-ten kasvattamiseen, kiihdyttåmåån kasvua ja nostamaan pro-teiini/rasva-suhdetta, mihin paastaan syottåmållå tehok-kaita måariå peptideja.
Ihmisille antamista vårten nåiden synteettisten 15 peptidien puhtauden tulisi olla våhintåån n. 93 % ja edul-lisesti våhintåån 98 %. Puhtaus tarkoittaa tåmån hakemuk-sen tarkoituksia vårten aiottua peptidiå, joka muodostaa todetun paino-%:n kaikista låsnå olevista peptideistå ja peptidiosasista. Tållaisten synteettisten peptidien anta-20 mista vårten kotitalous- ja muille elåimille niiden kasvun ediståmiseksi ja rasvapitoisuuden pienentåmiseksi voi niinkin pieni puhtaus kuin n. 5 % tai jopa niinkin pieni kuin 0,01 % olla hyvåksyttåvå.
Nåitå synteettisiå peptidejå tai niiden ei-myrkyl-25 lisiå suoloja, yhdistettyinå farmaseuttisesti tai elåin- lååketieteellisesti hyvåksyttåvån kantimen kanssa farma-seuttisen yhdistelmån muodostamiseksi, voidaan antaa elåimille, ihmiset mukaan lukien, joko laskimonsisåisesti, ihonalaisesti, lihaksensisåisesti, ihon kautta, esimerkik-30 si nenånsisåisesti tai myos suun kautta. Lååkåri voi kåyt-tåå tåtå antamista kiihdyttåmåån GH:n vapautumista, kun kåsiteltåvå isåntå on tållaisen terapeuttisen kåsittelyn tarpeessa. Tarvittava annos vaihtelee nimenomaisen kåsi-teltåvån tilan, tilan vakavuuden ja halutun kåsittelyn 35 kestoajan mukaan.
20 Tållaisia peptidejå annetaan usein ei-myrkyllisten suolojen kuten happoadditiosuolojen tai metallikompleksien muodossa, esim. sinkin, raudan yms. kanssa (joita pidetåån suoloina tamån hakemuksen tarkoituksia vårten). Kuvaavia 5 , tållaisia happoadditiosuoloja ovat hydrokloridi, hydrobro- midi, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, sitraat-ti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaatti, tart-raatti jne. Jos vaikuttava aineosa on annettava suun kaut-ta tabletin muodossa, tabletti voi sisåltåå sideainetta, 10 kuten traganttia, maissitårkkelystå tai gelatiinia; hajo-tusainetta, kuten algiinihappoa; ja liukuainetta, kuten magnesiumstearaattia. Jos halutaan antamista nestemåisesså muodossa, voidaan kåyttåå makeuttamista ja/tai maustamista ja laskimonsisåinen antaminen tapahtuu isotonisessa suola-15 liuoksessa, fosfaattipuskuriliuoksissa tms.
Nåitå peptidejå tulisi antaa ihmisille lååkårin oh-jauksen alaisena ja farmaseuttiset yhdistelmåt sisåltåvåt tavallisesti peptidiå yhdesså jonkin tavanomaisen, kiin-teån tai nestemåisen, farmaseuttisesti hyvåksyttåvån kan-20 timen kanssa. Tavallinen ruoansulatuskanavan ulkopuolinen annos on n. 0,01:stå η. 1 mikrogrammaan peptidiå/kg isån-nån kehon painoa.
Vaikka keksintoå on selostettu sen edullisten suo-ritusmuotojen suhteen, jotka muodostavat keksijoiden tållå 25 hetkellå tunteman parhaan tavan, on selvåå, ettå erilaisia muutoksia ja muunnoksia, jotka olisivat ilmeisiå alaan pe-rehtyneelle, voidaan tehdå poikkeamatta keksinnon piiris-tå, joka esitetåån oheisissa patenttivaatimuksissa. Esi-merkiksi muutoksia peptidiketjuun, erityisesti poisjåttojå 30 alkaen peptidin karboksyylipååtteestå ja ulottuen noin asemaan -27, voidaan tehdå nykyisin tunnetun kokeellisen kåytånnon mukaisesti peptidien tai peptidiosasten muodos-tamiseksi, jotka såilyttåvåt kaikki tai hyvin olennaiset osat peptidin biologisesta vaikutuksesta ja tållaisten 35 peptidien katsotaan kuuluvan keksinnon piiriin. Lisåksi
II
21
^ j O
jompaankumpaan pååtteeseen tai kumpaankin pååtteeseen voi-daan tehdå lisåyksiå ja/tai yleisesti samanarvoiset tåh-teet voidaan korvata luonnossa esiintyvillå tåhteillå, kuten peptidikemiassa yleisesti on hyvin tunnettua, muiden 5 analogien tuottamiseksi, joilla on ainakin olennainen osa vaaditun polypeptidin tehosta. Lisåksi muunnoksia voidaan tehdå edulliseen -NH2-ryhmåån C-pååtteellå nykytekniikan tason mukaisesti esimerkiksi aminohappotåhteen C-pååtteellå karboksyyliosa voi olla radikaali -COOR, -CRO, 10 -CONHNHR, -CON(R) (R') tai -CH2OR, jolloin R ja R' ovat alempi alkyyli, fluori-alempi alkyyli tai vety, sillå tål-laisista muunnoksista on tuloksena samanarvoisia synteet-tisiå peptidejå.
Claims (6)
1. Menetelmå farmaseuttisesti kåyttokelpoisten kas-vuhormonia vapauttavan tekijån synteettisten peptidianalo- 5 gien valmistamiseksi, joilla on sekvenssi: R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-R10-Arg-R12-R13-R14-Gly-Gln-Leu-R18-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-Ile-Nle-R28-R29 -NHR, jossa R3 on Tyr tax His; R2 on Ala tax D-NMA; R8 on Ser tai Asn; R10 on Tyr tax D-Tyr; R12 on Arg tai Lys; R13 on Ile tai 10 Val; R14 on Leu tai D-Leu; R18 on Tyr tai Ser; R24 on His tai Gin; R25 on Glu tax Asp; R2B on Asn tai Ser; R29 on Arg tai D-Arg; ja R on H tai CH2CH3; edellyttåen kuitenkin, ettå R29 tai R28 - R29 voidaan jåttåå pois, ja edellyttåen myOskin, ettå R2 on D-NMA ja/tai R14 on D-Leu ja/tai R29 on D-Arg, 15 tunnettu siitå, ettå (a) muodostetaan vålituote-peptidi, jossa on ainakin yksi suojaryhmå ja jolla on kaa-va (II) tai sen tarkoituksenmukaisesti lyhennetty muunnos: X1-R1 (X tax X2 )-R2-Asp( X3 ) -Ala-Ile-Phe-Thr( X4 )-R8( X4 tax X5)-Ser (X4 )-R10( X2 )-Arg( X6) -R12( X6 tax X7 )-R13-R14-Gly-Gln( X5 )-Leu-20 R18(X2 tax X4) -Ala-Arg( X6 )-Lys( X7 )-Leu-Leu-R24( X tai X5)-R25- (X3)-Ile-Nle-R28(X4 tai X5)-R29(X6)-X9 jossa: X, X1, X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 ovat kukin joko vety tai suojaryhmå ja X9 on joko suojaryhmå tai kiinnittåvå sidos hartsikantimeen tai on des-X9, jossa tapauksessa C-pååte on NHR, (b) pilkotaan 25 suojaryhmå tai -ryhmåt tai kiinnittåvå sidos kaavan (II) mukaisesta peptidistå; ja puhdistetaan saatu peptidi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå R2 on D-NMA.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmå, 30 tunnettu siitå, ettå R29 on D-Arg.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå R14 on D-Leu.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå R2 on D-NMA ja R28 on Asn. 92210 23
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, t u n-n e t t u siitå, ettå valmistetaan synteettinen peptidi, jolla on kaava: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-5 Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2. 92°1 O 24
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61184484 | 1984-05-18 | ||
| US06/611,844 US4528190A (en) | 1983-10-25 | 1984-05-18 | GRF Analogs IV |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI851842A0 FI851842A0 (fi) | 1985-05-09 |
| FI851842L FI851842L (fi) | 1985-11-19 |
| FI92210B FI92210B (fi) | 1994-06-30 |
| FI92210C true FI92210C (fi) | 1994-10-10 |
Family
ID=24450622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI851842A FI92210C (fi) | 1984-05-18 | 1985-05-09 | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4528190A (fi) |
| EP (1) | EP0161852B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0689036B2 (fi) |
| KR (1) | KR910000379B1 (fi) |
| AT (1) | ATE73823T1 (fi) |
| AU (1) | AU578467B2 (fi) |
| CA (1) | CA1271299A (fi) |
| DD (1) | DD236536A5 (fi) |
| DE (1) | DE3585634D1 (fi) |
| DK (1) | DK162103C (fi) |
| EG (1) | EG17394A (fi) |
| ES (1) | ES8606412A1 (fi) |
| FI (1) | FI92210C (fi) |
| GR (1) | GR851207B (fi) |
| HU (1) | HU197759B (fi) |
| IE (1) | IE57813B1 (fi) |
| IL (1) | IL75088A (fi) |
| MX (1) | MX157381A (fi) |
| NO (1) | NO168043C (fi) |
| NZ (1) | NZ212113A (fi) |
| PH (1) | PH20976A (fi) |
| PT (1) | PT80450B (fi) |
| SU (1) | SU1530097A3 (fi) |
| YU (1) | YU46153B (fi) |
| ZA (1) | ZA852919B (fi) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4728726A (en) * | 1982-10-04 | 1988-03-01 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs IIIb |
| US4732972A (en) * | 1983-03-07 | 1988-03-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polypeptides having growth hormone releasing activity |
| US4649131A (en) * | 1984-09-24 | 1987-03-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
| EP0193910A3 (en) * | 1985-03-06 | 1988-11-23 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Synthesis of a derivative of grf and intermediate peptides |
| US4734399A (en) * | 1985-08-06 | 1988-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| US4880778A (en) * | 1986-05-12 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof |
| FR2599038B1 (fr) * | 1986-05-26 | 1990-06-29 | Sanofi Sa | Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires |
| DE3742633A1 (de) * | 1987-12-16 | 1989-06-29 | Hoechst Ag | Peptide mit beeinflussender wirkung auf die hypophyse von saeugern |
| US5565606A (en) * | 1986-10-21 | 1996-10-15 | Hoechst Aktiengesellschaft | Synthesis of peptide aminoalkylamides and peptide hydrazides by the solid-phase method |
| US4843064A (en) * | 1987-01-13 | 1989-06-27 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs V |
| IL84758A (en) * | 1987-01-13 | 1992-03-29 | Salk Inst For Biological Studi | Peptides stimulating the release of pituitary growth hormone in fish and amphibians,and pharmaceutical compositions containing them |
| US4914189A (en) * | 1987-02-05 | 1990-04-03 | The Adminstrators Of The Tulane Educational Fund | Synthetic GHRH analogs |
| EP0289186A3 (en) * | 1987-04-23 | 1990-04-04 | International Minerals And Chemical Corporation | Process for increasing the growth rate and enhancing the feed efficiency of meat producing livestock |
| IL86102A (en) * | 1987-05-11 | 1994-04-12 | Univ Tulane | Alkylated peptides that release growth hormone and their use |
| US5112808A (en) * | 1987-05-11 | 1992-05-12 | American Cyanamid Company | Alkylated hormone-releasing peptides and method of treatig mammals therewith |
| US5002931A (en) * | 1987-05-22 | 1991-03-26 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs VII |
| US4839344A (en) * | 1987-06-12 | 1989-06-13 | Eastman Kodak Company | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US4801456A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| USRE33699E (en) * | 1987-07-09 | 1991-09-24 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| US4880777A (en) * | 1987-09-01 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Synthetic peptides having growth hormone releasing activity |
| ES2054754T3 (es) * | 1987-09-18 | 1994-08-16 | Hoffmann La Roche | Analogos ciclicos del grf. |
| WO1989007110A1 (en) * | 1988-01-28 | 1989-08-10 | Eastman Kodak Company | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US5043322A (en) * | 1988-07-22 | 1991-08-27 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic GRF analogs |
| US5023322A (en) * | 1988-08-31 | 1991-06-11 | Mta Kutatas-Es Szervezetelemzo Intezete | Analogs of growth hormone releasing factor (GRF) and a method for the preparation thereof |
| US5756458A (en) * | 1989-06-16 | 1998-05-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Stabilized potent GRF analogs |
| US5716937A (en) * | 1989-12-13 | 1998-02-10 | The General Hospital Corporation | Method for treating cardiac malfunction |
| JPH06500311A (ja) * | 1990-06-29 | 1994-01-13 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | ヒスチジン置換されたヒト成長ホルモン放出因子類縁体 |
| ATE119916T1 (de) * | 1990-12-10 | 1995-04-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur enzymatischen herstellung von grf(1-44)nh2. |
| JPH05507939A (ja) * | 1991-04-09 | 1993-11-11 | エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー | 成長ホルモン放出因子の類似体 |
| ZA922746B (en) * | 1991-04-26 | 1992-12-30 | Lilly Co Eli | Superactive grf analogs |
| US5246920A (en) * | 1992-06-15 | 1993-09-21 | University Of South Florida | Treatment of hyperprolactinemia |
| US5811074A (en) * | 1992-06-29 | 1998-09-22 | University Of South Florida | Method of diagnosing pituitary dependent growth hormone deficiency |
| GB9324691D0 (en) * | 1993-12-01 | 1994-01-19 | Hafslund Nycomed As | Peptide compounds |
| US5550212A (en) * | 1993-12-17 | 1996-08-27 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Analogues of hGH-RH(1-29)NH2 having antagonistic activity |
| IT1285405B1 (it) * | 1995-06-06 | 1998-06-03 | Alza Corp | Modificazione di farmaci polipeptidici per accrescere il flusso per elettrotrasporto. |
| AU2002233082B2 (en) * | 2001-02-02 | 2005-11-10 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Long lasting growth hormone releasing factor derivatives |
| NZ539218A (en) * | 2002-09-18 | 2008-03-28 | Univ Montreal Ct Hospitalier Chum | Synthetic GHRH analogues of 29 amino acids or more |
| WO2009009727A2 (en) * | 2007-07-12 | 2009-01-15 | Akela Pharma Srl | Ghrh analogs and therapeutic uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| US4518586A (en) * | 1983-01-13 | 1985-05-21 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs III |
| IL70530A (en) * | 1983-01-13 | 1986-09-30 | Salk Inst For Biological Studi | Synthetic peptides having growth hormone releasing factor activity and compositions containing them |
| AU575843B2 (en) * | 1983-08-10 | 1988-08-11 | The Administrators Of The Tulane Eductional Fund | Growth hormone releasing peptides |
-
1984
- 1984-05-18 US US06/611,844 patent/US4528190A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-18 ZA ZA852919A patent/ZA852919B/xx unknown
- 1985-04-26 DE DE8585302975T patent/DE3585634D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-26 AT AT85302975T patent/ATE73823T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-26 EP EP85302975A patent/EP0161852B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-29 IE IE1087/85A patent/IE57813B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-02 CA CA000480584A patent/CA1271299A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-03 IL IL75088A patent/IL75088A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-05-08 PH PH32242A patent/PH20976A/en unknown
- 1985-05-09 FI FI851842A patent/FI92210C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 YU YU77185A patent/YU46153B/sh unknown
- 1985-05-13 PT PT80450A patent/PT80450B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 AU AU42488/85A patent/AU578467B2/en not_active Ceased
- 1985-05-15 NO NO851947A patent/NO168043C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-05-16 EG EG306/85A patent/EG17394A/xx active
- 1985-05-17 DD DD85276457A patent/DD236536A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 MX MX105337A patent/MX157381A/es unknown
- 1985-05-17 NZ NZ212113A patent/NZ212113A/en unknown
- 1985-05-17 HU HU851870A patent/HU197759B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 GR GR851207A patent/GR851207B/el unknown
- 1985-05-17 SU SU853898058A patent/SU1530097A3/ru active
- 1985-05-17 DK DK220685A patent/DK162103C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 ES ES543235A patent/ES8606412A1/es not_active Expired
- 1985-05-17 JP JP60105746A patent/JPH0689036B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-17 KR KR1019850003400A patent/KR910000379B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92210C (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| CA1243016A (en) | Human grf peptide analogs | |
| US4529595A (en) | GRF Analogs | |
| US4626523A (en) | GRF analogs II | |
| FI87080B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av grf -analoger. | |
| KR0138907B1 (ko) | 합성 펩티드 | |
| US5262519A (en) | GRF analogs XI | |
| US4595676A (en) | Rat hypothalamic GRF | |
| US4728726A (en) | GRF analogs IIIb | |
| FI89499C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar peptid | |
| FI94356B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän synteettisen peptidianalogin tai sen ei-myrkyllisen suolan valmistamiseksi | |
| EP0274916A2 (en) | GRF analogs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THE SALK INSTITUTE FOR BIOLOGICAL |