DK162103B - Syntetiske grf-analoge peptider og farmaceutisk acceptable salte heraf samt farmaceutisk middel indeholdende peptidet eller et ikke-toksisk salt deraf - Google Patents
Syntetiske grf-analoge peptider og farmaceutisk acceptable salte heraf samt farmaceutisk middel indeholdende peptidet eller et ikke-toksisk salt deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK162103B DK162103B DK220685A DK220685A DK162103B DK 162103 B DK162103 B DK 162103B DK 220685 A DK220685 A DK 220685A DK 220685 A DK220685 A DK 220685A DK 162103 B DK162103 B DK 162103B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- arg
- leu
- ser
- ala
- gln
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth-hormone releasing factors (GH-RF) (Somatoliberin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Description
i
DK 162103 B
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte GRF-analoge peptider, der fremmer frigørelsen af væksthormon fra hypofysekirtelen, farmaceutisk acceptable salte heraf samt farmaceutisk middel indeholdende disse.
S
Fysiologer har længe erkendt, at hypothalamus styrer adenohy-pofysens sekretionsfunktioner, idet hypothalamus producerer særlige stoffer, der stimulerer eller inhiberer sekretionen af hvert hypofysehormon. En hypothalamisk inhiberingsfaktor blev 10 i 1972 karakteriseret i form af somastatin, der inhiberer sekretionen af væksthormon (GH). I 1982 isoleredes humane pan-creas-(svulst) frigørelsesfaktorer (hpGRF) fra ekstrakter af humane pancreassvulster, hvilke faktorer blev renset, karakteriseret, syntetiseret og afprøvet og viste sig at fremme af-15 gøreisen af GH fra hypofysen. Begge disse hypofysiotrope faktorer er blevet genfremstillet ved hjælp af total syntese, og med de naturlige stoffer analoge forbindelser er blevet syntetiseret. Det antages, at human hypothalam GH-frigørelsesfaktor har nøjagtig den samme opbygning. Derfor anvendes udtrykket 20 hGRF i det følgende . En tilsvarende rotte-hypothalam GH-fri-gørelsesfaktor (rGRF), en tilsvarende svin-hypothalam GH-fri-gørelsesfaktor (pGRF) og en tilsvarende kvæg-hypothalam GH-frigørelsesfaktor (bGRF) er også blevet karakteriseret og syntetiseret.
25
Syntetiske polypeptider er nu blevet syntetiseret og afprøvet, hvilke polypeptider frigør GH fra dyrkede hypofyseceller og i det mindste delvis kan modstå enzymatisk nedbrydning i legemet samt udviser meget betydelig forøget virkningsstyrke. Disse 30 peptider har NaCH3-D-Ala(D-NMA) i 2-stillingen og/eller D-Leu i 14-sti 11 ingen og/eller D-Arg i 29-sti 11 i ngen og har Nle i 27-stillingen. Peptiderne kan også have en af følgende rester i 1-sti 11 i ngen: Tyr, D-Tyr eller His, hvilken rest eventuelt kan have en methylsubstitution i α-aminogruppen. De kan even-35 tuelt have D-Tyr i 10-sti 11 i ngen.
i j
DK 162103 B
2
Farmaceutiske midler ifølge opfindelsen er kendetegnet ved at indeholde et peptid ifølge krav 1 eller et ikke-toksisk salt af ethvert af disse, dispergeret. i en farmaceutisk eller veterinært acceptabelt flydende eller fast bærer. Sådanne farma-5 ceutiske midler kan anvendes inden for klinisk medicin, såvel human som veterinær, til administration med henblik på terapeutiske formål og også diagnostisk. Endvidere kan de anvendes til fremme af væksten af varmblodede dyr inklusive fjerkræ og inden for hydroponik til koldblodede dyr, f.eks. fisk, ål, 10 etc.
Den til definering af peptiderne benyttede nomenklatur er den af Schroder & Lubke anførte i "The Peptides", Academic Press (1965), hvori aminogruppen ved N-terminalen i overensstemmelse 15 med konventionel angivelse forekommer til venstre, og car- boxylgruppen ved C-terminalen forekommer til højre. Hed naturlig aminosyre menes en af de almindelige naturligt forekommende aminosyrer, der findes i proteiner og omfatter Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, 20 Met, Phe, Tyr, Pro, Trp og His. Med Nle menes norleucin. Når aminosyreresten har isomere former, er det L-formen af aminosyren, der angives, medmindre andet er udtrykkeligt anført. D-NMA betyder D-isomeren af alanin, hvori α-aminogruppen er substitueret med methyl.
25
De syntetiske peptider ifølge opfindelsen er kendetegnet ved følgende sekvens (I):
Rj-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R8-Ser-Rio“Arg-R2-Ri3-Ri4-Gly-Gln-30 Leu-R-ji8“Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25"Ile"Mle“R28'“R29“ein-Gln-
Gly-NHR, hvori R er H eller lavere alkyl, Ri· er Tyr, D-Tyr eller His med NaMe-substitution eller i usubstitueret form, R2 er Ala eller D-NMA, Re er Ser eller Asn, Rio er Tyr eller D-Tyr, R12 er Arg eller Lys, R13 er Ile eller Val, R14 er Leu 35 eller D-Leu, Rie er Tyr eller Ser, R24 er His eller Gin, R25 er Glu eller Asp, R28 er Asn eller Ser, og R29 er Arg eller D-Arg, forudsat imidlertid, at enhver sekvens af rester begyn- [ 3
DK 162103 B
tiende ved C-terminalen og strækkende sig til og med R2g kan være udeladt, og forudsat endvidere, at R2 er D-NMA og/eller Rj4 er D-Leu og/eller R29 er D-Arg.
5 Peptiderne syntetiseres ved hjælp af en egnet metode, såsom udelukkende ved hjælp af fastfaseteknik, ved hjælp af delvis fastfaseteknik, ved fragmentkondensation eller ved hjælp af klassiske opløsningskoblinger. Anvendelse af for nylig udviklet rekombinant DNA-teknik kan benyttes til fremstilling af en 10 del af en analog indeholdende kun naturlige aminosyrerester, som derpå kunne knyttes til et kort N-terminal peptid. Metoder til udelukkende fastfasesyntese er eksempelvis angivet i lærebogen "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, og er eksemplificeret i US-pa-15 tentskrift nr. 4.105.603. Klassisk opløsningssyntese er be skrevet detaljeret i afhandlingen "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (udgiver) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Vesttyskland. Fragment-kondensation-syntesemetoden er eksemplificeret i US-20 patentskrift nr. 3.972.859. Andre til rådighed stående synteser er eksemplificeret i US-patentskrifterne nr. 3.842.067 og nr. 3.862.925.
Fælles for sådanne synteser er beskyttelsen af de forskellige 25 aminosyremolekyldeles labile sidekædegrupper med passende beskyttelsesgrupper, der vil forhindre en kemisk reaktion i at finde sted på det pågældende sted, indtil gruppen til sidst fjernes. Fælles er sædvanligvis også beskyttelsen af en a-aminogruppe på en aminosyre eller et fragment, medens denne 30 del eller enhed reagerer ved carboxylgruppen, efterfulgt af selektiv fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen for at gøre efterfølgende reaktion mulig på dette sted. Følgelig er det fælles, som et trin i syntesen, at en intermediær forbindelse dannes, hvilken forbindelse indeholder hver af aminosyreres-35 terne placeret i dens ønskede rækkefølge i peptidkæden med si-dekædebeskyttelsesgruppe knyttet til de pågældende rester.
4
DK 162103 B
Mellemprodukter ved syntesen kan have formlen (II): χΙ-R^X eller X2)-R2-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-R8(X4 eller X5)-Ser(X4)-R10(X2)-Arg(X6)-Ri2(X6 eller X7)-R13-R14-Gly-Gln-5 (X5)-Leu-R18(X2)-Ala-Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-LeU"R24(X eller X5)- R25(X3)“Ile-N1e-R28(X4 eller X5)-R29(X6)-Gln(X5)-G1n(x5)61y-X9, hvori X1 er enten hydrogen eller en α-aminobeskyttelses-gruppe. α-aminobeskyttelsesgrupperne, der kommer i betragtning som χΐ, er de som vides at være anvendelige inden for trinvis 10 syntese af polypeptider. Til klasserne af α-aminobeskyttelsesgrupper, der kan anvendes som X*, hører (l) aromatiske beskyttelsesgrupper af urethantype, såsom fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), benzyloxycarbonyl (Z) og substitueret Z, såsom p-chlorbenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromben-15 zyloxycarbonyl og p-methoxybenzyloxycarbonyl, (2) alifatiske urethan-beskyttelsesgrupper, såsom t-butyloxycarbonyl (BOC), di isopropylmethyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, ethoxycar- bonyl og allyloxycarbonyl, og (3) cykloalkylbeskyttelsesgrup-per af urethantype, såsom cyklopentyloxycarbony1, adamantyl-20 oxycarbonyl og cyklohexyloxycarbonyl. Den foretrukne a-amino-beskyttelsesgruppe er BOC, endog når en Na-Me-substitueret rest benyttes i 1-sti11 ingen.
X er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for imidazolnitro-25 genatomet i His, såsom Tos.
X2 kan være en egnet beskyttelsesgruppe for den phenoliske hy-droxylgruppe i Tyr, såsom tetrahydropyranyl, tert.-butyl, tri-tyl, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ og 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Den fore-30 trukne beskyttelsesgruppe er 2,6-dichlorbenzyl. X2 kan være hydrogen, hvilket betyder, at der ikke findes nogen sidekæde-beskyttelsesgruppe på aminosyreresten i denne stilling.
35
DK 162103 B
5 3 X er hydrogen eller en egnet esterdannende beskyttelsesgruppe for carboxylgruppen i Asp eller Glu, såsom benzyl(OBzl), 2,6-dichlorbenzyl, methyl og ethyl.
4 X kan være en egnet beskyttelsesgruppe for hydroxylgruppen 5 i Thr eller Ser, såsom acetyl, benzoyl, tert.-butyl, trityl, tetrahydropyranyl, Bzl, 2,6-dichlorbenzyl og CBZ. Den fore- 4 trukne beskyttelsesgruppe er Bzl. X kan være hydrogen, hvilket betyder, at der ikke findes nogen beskyttelsesgruppe på hydroxylgruppen.
10 X^ er hydrogen eller en egnet beskyttelsesgruppe for sidekæde- 5 amidogruppen i Asn eller Gin. X er fortrinsvis xanthyl(Xan).
g X er en egnet beskyttelsesgruppe for quanidinogruppen i Arg, såsom nitro, Tos, CBZ, adamantyloxycarbonyl og BOC, eller g også er X hydrogen.
7 15 X er hydrogen eller en passende beskyttelsesgruppe for side-kædeaminogruppen i Lys. Eksempler på egnede sidekædeamino-beskyttelsesgrupper er 2-chlorbenzyloxycarbonyl(2-Cl-Z), Tos, t-amyloxycarbonyl og BOC.
Met kan eventuelt være beskyttet ved hjælp af oxygen, men 20 lades fortrinsvis være ubeskyttet.
Valget af en sidekædeaminobeskyttelsesgruppe er ikke afgørende, bortset fra at man generelt vælger en, der ikke fjernes under afbeskyttelse af α-aminogrupperne under syntesen. For nogle aminosyrer, f.eks. His, er beskyttelse imidlertid generelt 25 ikke nødvendig efter at kobling er gennemført, og beskyttelsesgrupperne kan være de samme.
g X er en egnet beskyttelsesgruppe for C-terminal-carboxylgrup- 3 . 9 pen, såsom den esterdannende gruppe X , eller også er X er forankringsbinding, der inden for fastfasesyntese anvendes 30 til at binde til en fast harpiksbærer, eller også er den des- 9 . . : X , i hvilket tilfælde resten ved C-terminalen har en carboxyl- del, som er Y, således som ovenfor anført. Når en fast har-
DK 162103 B
6 piksbærer anvendes, kan den være enhver af de hidtil kendte, såsom en med formlernei-O-CE^-harpiksbærer, -NH-benzhydryl-amin (BHA)-harpiksbærer eller -NH-paramethylbenzhydrylamin (MBHA)-harpiksbærer. Når det usubstituerede amid ønskes, fore-5 trækkes anvendelse af BHA- eller MBHA-harpiks, fordi spaltning direkte fører til amidet. I tilfælde af at N-methylamidet ønskes, kan det dannes fra en N-methyl-BHA-harpiks. Hvis andre substituerede amider ønskes, eller hvis andre grupper end den frie syre ønskes ved C-terminalen, kan det være at fore-10 trække at syntetisere peptidet under anvendelse af klassiske metoder som anført i Houben-Weyl-afhandlingen.
I formlen for mellemproduktet er mindst én af X-grupperne en beskyttelsesgruppe, eller også omfatter X^ en harpiksbærer.
Et peptid ifølge opfindelsen kan fremstilles ved (a) dannelse 15 af et peptid med mindst en beskyttelsesgruppe samt formlen (II), hvori X, X1, X2, X3, X4, X5, X6 og X7 er enten hy- q drogen eller en beskyttelsesgruppe, og X er enten en beskyttelsesgruppe eller en forankringsbinding til harpiksbærer g eller des-X , i hvilket tilfælde resten ved C-terminalen har 20 en carboxymolekylde1, der er Y, (b) fraspaltning af beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrupperne eller forankringsbindingen fra peptidet med formlen (II), og (c) om ønsket omdannelse af det resulterende peptid med sekvensen (I) til et 'ikke-toksisk salt deraf. 1 2 3 4 5 6
Ved valg af en bestemt sidekædebeskyttelsesgruppe, der skal 2 anvendes ved syntesen af peptiderne, følges følgende generel 3 le regler: (a) beskyttelsesgruppen bevarer fortrinsvis sine 4 beskyttende egenskaber og fraspaltes ikke under koblingsbe 5 tingelser, (b) beskyttelsesgruppen bør være stabil over for 6 reagenset og er med undtagelse af Xan fortrinsvis stabil under de reaktionsbetingelser, der vælges til fjernelse af a-amino-beskyttelsesgruppen på hvert trin i syntesen, og (c) sidekædebeskyttel sesgruppen skal kunne fjernes efter afslutning af syntesen indeholdende den ønskede aminosyresekvens under
DK 162103 B
7
O
reaktionsbetingelser, der ikke på uønsket måde vil ændre peptidkæden.
Når peptider ikke fremstilles under anvendelse af rekombi-5 nant DNA-teknik, fremstilles de fortrinsvis under anvendelse af fastfasesyntese, såsom den der generelt er beskrevet af Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, side 2149 (1963), selv om andre dermed ækvivalente i og for sig kendte kemiske synteser også kan anvendes som nævnt i det foregående. Fastfase-10 syntese påbegyndes fra peptidets C-terminale ende ved kobling af en beskyttet α-aminosyre til en passende harpiks. Et sådant udgangsmateriale kan fremstilles ved at knytte en cc-amino-beskyttet aminosyre til en chlormethyleret ester eller en hydroxymethylharpiks ved hjælp af en esterbinding eller til 15 en BHA-harpiks eller MBHA-harpiks ved hjælp af en amidbinding. Fremstilling af hydroxymethylharpiksen er beskrevet af Bodan-sky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-1598 (1966). Chlor-methylerede harpikser fås kommercielt fra Bio Rad Laboratories, Richmond, California og fra Lab. Systems, Inc. Fremstilling 20 af en sådan harpiks er beskrevet af Stewart et al., "Solid
Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), kapitel 1, side 1-6. BHA- og MBHA-harpiksbærere fås kommercielt og anvendes generelt kun, når det ønskede polypeptid, som syntetiseres, har et usubstitueret amid ved C-terminalen.
25
Den C-terminale aminosyre kan til at begynde med kobles til den chlormethylerede harpiks i overensstemmelse med proceduren angivet i Chemistry Letters, K. Horiki et al., 165-168 (1978), under anvendelse af KF i DMF ved ca. 60°C 30 i 24 timer under omrøring, når peptider med 29-32 aminosyre-rester skal syntetiseres. Efter kobling af den BOC-beskytten-de aminosyre til harpiksbæreren, fjernes a-aminobeskyttelsesgruppen, såsom ved anvendelse af trifluoreddikesyre (TFA) i methylenchlorid eller TFA alene. Afbeskyttelsen udføres ved 35 o en temperatur mellem ca. 0 C og stuetemperatur. Andre stan- dardspaltningreagenser, såsom HCl i dioxan, og betingelser til fjernelse af specifikke α-aminobeskyttelsesgrupper kan
DK 162103 B
8
O
anvendes som beskrevet i Schroder & Lubke, "The Peptides", 1 side 72 - 75 (Academic Press 1965).
Efter fjernelse af a-aminobeskyttelsesgruppen kobles de tilbage-5 værende α-amino- og sidekædebeskyttede aminosyrer trinvis i den ønskede orden til opnåelse af den ovenfor definerede mellemproduktforbindelse, eller også kan som alternativ til tilføjelse af hver aminosyre separat i syntesen nogle af dem være koblet til hinanden forud for tilsætning til fastfase-10 reaktoren. Udvælgelsen af et passende koblingsmiddel ligger inden for fagmandens viden. Særlig egnet som koblingsreagens er N,N'-dicyklohexylcarbodiimid (DCCI).
De aktiverende reagenser, der anvendes ved fastfasesyntesen 15 af peptiderne, er velkendte på peptidområdet. Eksempler på egnede aktiverende reagenser er carbodiimider, såsom N,N'-diisopropylcarbodiimid og N-ethyl-N1-(3-dimethylaminopropyl)= carbodiimid. Andre aktiverende reagenser og deres anvendelse til peptidkobling er beskrevet af Schroder & Lubke supra, 20 ·.'··' i kapitel III og af Kapoor, J. Phar. Sci., 59, side 1-27 (1970).
Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens indføres i fastfasereaktoren i ca. et firdobbelt eller større overskud, 25 og koblingen kan udføres i et medium af dimethylformamid(DMP): CH2CI2 (1:1) eller i DMF eller alene. I et tilfælde, hvor ufuldstændig kobling finder sted, gentages koblingsproceduren før fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen forud for koblingen af den næste aminosyre. Vellykketheden af koblings-30 reaktionen på hvert trin i syntesen, hvis den udføres manuelt, måles fortrinsvis ved hjælp af ninhydrinreaktionen, således som beskrevet af E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). Koblingsreaktionerne kan udføres automatisk, såsom på en Beckman 990 automatisk syntetisator, under anvendelse 35 af et program, såsom det af Rivier et al. omtalte i Biopolymers, 1978, 17, side 1927-1938.
Efter at den ønskede aminosyresekvens er blevet afsluttet, ί* DK 162103 Β 9 kan mellemproduktpeptidet fjernes fra harpiksbæreren ved behandling med et reagens, såsom flydende hydrogenfluorid, der ikke alene spalter peptidet fra harpiksen, men også fraspalter 2 3 alle tilbageværende sidekædebeskyttelsesgrupper X, X , X , 5 X^, X3, X^ og X7 og forankringsbindingen X^ og også oc-aminobeskyttelsesgruppen X^, hvis der anvendes en, til opnåelse af peptidet i form af den frie syre. Hvis Met findes i sekvensen, fjernes BOC-beskyttelsesgruppen fortrinsvis først under anvendelse af trifluoreddikesyre (TFA)/ethandithiol lo forud for fraspaltning af peptidet fra harpiksen med HF til fjernelse af potentiel S-alkylering. Ved anvendelse af hydrogenfluorid til spaltning medtages anisol og methylethylsulfid i reaktionsbeholderen som skylle- eller rensemidler.
Det efterfølgende eksempel angiver en foretrukken metode til |5 syntetisering af peptider ved hjælp af fastfaseteknikken.
Eksempel 1.
Syntesen af peptidet [N^eTyr1, D-NMA2, D-Leu23]-rGRF(1-43)-OH med formlen:
NQMeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-20 Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH
udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en chlormethyleret harpiks med et sub-*2.5 stitutionsområde på ca. 0,1 til 0,5 mmol/g harpiks. Kobling af BOC-Asn(Xan) til harpiksen gennemføres ved hjælp af den generelle procedure, der er angivet i Chemistry Letters, supra, under anvendelse af KF i DMF ved ca. 60°C i 24 timer under omrøring, og den resulterer i substitution af ca. 0,35 'bO mmol Asn pr. gram harpiks.
Efter afblokering og neutralisering opbygges peptidkæden trin for trin på harpiksen. Afblokering, neutralisering og til- i føjelse af hver aminosyre foretages generelt i overensstemmelse !
DK 162103 B
10 med proceduren angivet detaljeret af J. Rivier i J. Amer.
Chem. Soc., 96, 2986-2992 (1974). Alle benyttede opløsningsmidler afgasses ved gennembobling med en inert gas, f.eks. helium eller nitrogen, til sikring af fravær af oxygen, som 5 på uønsket måde kunne oxidere svovlet i Met-resten.
Afblokering udføres fortrinsvis i overensstemmelse med skema A som følger:
Skema A.
Reagens Blandetid (min.) 10 1. 60% TFA/2% ethandithiol 10 2. 60% TFA/2% ethandithiol 15 3. IPA/1% ethandithiol 0,5 4. Et3N (10%) i CH2C12 0,5 5. · MeOH 0,5 15 6. Et3N (10%) i CH2C12 0,5 7. MeOH (2 gange) 0,5 8. CH2C12 (2 gange) 0,5
Koblingerne udføres fortrinsvis som angivet i følgende skema B: 20 Skema B.
Reagens Blandetid (min.)
9. DCCI
10. Boc-aminosyre 50-90 11. MeOH (2 gange) 0,5 25 12. CH2C12 (2 9an9e> 0,5 13. Ac20 (3M) i CH2C12 15,0 14. ch2c12 0,5 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 (2 gange) 0,5.
DK 162103B
11
Kort fortalt anvendes ét eller to mmol BOC-beskyttet aminosyrer i methylenchlorid pr. gram harpiks plus ét ækvivalent 1,0 molær DCCI i methylenchlorid i 2 timer. Når BOC-Arg(TOS) kobles, anvendes en blanding af 50% DMF og methylenchlorid.
5 Bzl-ether anvendes som hydroxyl-sidekædebeskyttelsesgruppe for Ser og Thr. Amidogruppen i Asn eller Gin beskyttes eller med Xan, når DCC-kobling anvendes, som det foretrækkes. P-nitrophenylester(ONp) kan også anvendes til aktivering af carboxylenden af Asn eller Gin, og BOC-Asn(ONp) kan f.eks.
10 kobles natten over under anvendelse af ét ækvivalent HOBt i en 50% blanding af DMF og methylenchlorid, i hvilket tilfælde intet DCC tilsættes. 2-chlor-benzyloxycarbonyl(2C1-Z) anvendes som beskyttelsesgruppe for Lys-sidekæden. Tos anvendes til beskyttelse af Arg's guanidinogruppe og His's imida-15 zolnitrogen, og Glu- eller Asp-sidekædecarboxylgruppen be skyttes med OBzl. Tyr's phenoliske hydroxylgruppe beskyttes med 2,6-dichlorbenzyl(DCB). Ved syntesens afslutning opnås følgende sammensætning: BOC-NaMeTyr(X2)-D-NMA-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Ser (X4)- 20 ser(X4)-Tyr (X2)-Arg(X6)-Arg(X6)-Ile-Leu-Gly-Gln(X5)-Leu-Tyr= (X2)-Ala-Arg(X6)-Lys (X7)-Leu-D-Leu-His(X)-Glu(X3)-Ile-Met-
Asn(X5)-Arg(X6)-Gin(X5)-Gin(X5)-Giy-Glu(X3)-Arg(X6)-Asn(X5)-
Gin (X5)-Glu(X3)-Gin(X5)-Arg(X6)-Ser (X4)-Arg (X6)-Phe-Asn(X5)- X^, hvor X2 er DCB, X3 er OBzl, X4 er Bzl, X^ er Xan, X® er 7 9 25 Tos, X er 2C1-Z, og X er -O-OE^-harpiksbærer. Xan kan helt eller delvis være fjernet ved hjælp af TFA-behandling, der anvendes til afblokering af a-aminobeskyttelsesgruppen.
For at spalte og afbeskytte den beskyttede peptid-harpiks, behandles denne med 1,5 ml anisol, 0,5 ml methylethylsulfid 30 og 15 ml hydrogenfluorid(HF) pr. gram peptid-harpiks ved -20°C
i 1/2 time og ved 0°C i 1/2 time. Efter fjernelse af HF under højvakuum, vaskes det tilbageværende harpiks-peptid skiftevis med tør diethylether og chloroform, og peptidet ekstra-heres derpå med afgasset 2N vandig eddikesyre og skilles fra 35 harpiksen ved filtrering.
DK 162103B
12
Det fraspaltede og afbeskyttede peptid opløses derpå i 0 -5% eddikesyre og underkastes rensning, som kan omfatte filtrering med fin gel af "Sephadex" G-50.
Peptidet renses derpå yderligere ved hjælp af præparativ el-5 ler halvpræparativ HPLC som beskrevet af Rivier et al., Pep tides: Structure and Biological Function, (1979), side 125 -128, og Marki et al. J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981). Patroner, der passer til Waters Associates prep LC-500, pakkes med 15 - 20 l-^g-silica fra Vydac (300A). En gradient af CH^CN 10 i TEAP dannes ved hjælp af en Eldex lavtryksgradientdanner, således som beskrevet af J. Rivier i J. Liq. Chromatography 1, 343-367 (1978). De kromatografiske fraktioner måles omhyggeligt ved hjælp af HPLC, og kun de fraktioner, der udviser væsentlig renhed,samles. Afsaltning af de rensede fraktioner, 15 der er kontrolleret uafhængigt for renhed, opnås ved anvendelse af en gradient af CH^CN i 0,1% TFA. Midterfraktionen lyofiliseres derpå til opnåelse af det ønskede peptid, hvis renhed kan være' større end 98%.
Syntesen gentages under anvendelse af en MBHA-harpiks til 20 fremstilling af det samme peptid med en amideret C-terminal under anvendelse af en begyndelsesprocedure som generelt beskrevet af Vale et al. i US patentskrift nr. 4.292.313 til at knytte Asn til MBHA-harpiksen.
Eksempel 2.
25 Syntesen af et amideret 40-rest-peptid [CaMeHis·*·, D-NMA^, 2 3 D-Leu ]-hGRF(1-40)-NH2 med formlen: H-CaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-D-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-
Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-N^
DK 162103 B
13 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som generelt beskrevet af Vale et al. i US patentskrift nr. 4.292.313. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af 5 TLC og HPLC.
Eksempel 3.
Syntesen af det analoge hGRF-fragment [D-NMA^, Nle^J-hGRF(1- 32)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-10 Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-
Gln-Gln-Gly-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Denne analog bedømmes som værende i det væsentlige ren ved an-15 vendelse af TLC og HPLC.
Eksempel 4.
2 27
Syntesen af det analoge hGRF-fragment [D-NMA , Nle ]-hGRF(l-29)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-20 Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-
nh2 I
udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep- ! tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendel-25 se af TLC og HPLC. | 2 27 i
Syntesen gentages til fremstilling af [D-NMA , Nle ]-hGRF(l-27)-NH2.
14
DK 162103 B
Eksempel 5.
Syntesen af [D-NMA2, Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-5 NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TCL og HPLC.
10 Eksempel 6.
Syntesen af [D-NMA2, D-Glu25, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-Glu-Ile-Nle-Ser-15 Arg-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
20 Eksempel 7.
Syntesen af [D-NMA2, D-Asp3'25]-hGRF(l-32)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-Asp-Ile-Met- . Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2
DK 162103 B
15 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som beskrevet i eksempel 2. Denne analog bedømmes som værende i det væsentlige xen ved anvendelse af TLC og HPLC.
5 Eksempel -8.
Syntesen af [D-NMA2, Nle27]-pGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-
Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-N^ udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 10 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som generelt beskrevet af Vale et al. i US patentskrift nr. 4.292.313.. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel 9.
15 Syntesen af [D-NMA2, Nle27]-bGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-
Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som generelt beskrevet 20 af Vale et al. i US patentskrift nr. 4.292.313. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel 10.
Syntesen af [N^eHis1, D-NMA2, Nle27]-pGRF(1-29)-NH2 med form-25 len: 16
DK 162103 B
H-NaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-
Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-
Arg-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 5 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som generelt beskrevet af Vale et al. i US patentskrift nr. 4.292.313. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel 11.
10 Syntesen af [D-NMA^, Lys1^, Nle^7]-rGRF(l-29)-NH2 med form len: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-
Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg- nh2 15 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
2 13 18
Syntesen gentages til fremstilling af [D-NMA , Val , Ser ]-20 rGR'F(l-29)-NH2.
Eksempel 12.
? 27 9Q
Syntesen af [D-NMA , Nle , D-Arg ]-pGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- 25 Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-D-
Arg-NH2
DK 162103 B
17 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som generelt beskrevet af Vale et al. i US patentskrift nr. 4.292.313. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af 5 TLC og HPLC. Acetatsaltet fremstilles derpå ved opløsning af peptidet i vand og tilsætning af IN eddikesyre. Den resulterende opløsning lyofiliseres til opnåelse af eddikesyre-saltet..
Eksempel 13.
2 27 7Q
10 Syntesen af hGRF-analogen ID-NMA , Nle , D-Arg ]-hGRF(l- 29)-NH2 -med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-
Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-D-
Arg-NH2 15 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Denne analog bedømmes som værende i det væsentlige ren ved anvendelse af TLC og HPLC.
2 14 27
Syntesen gentages til fremstilling af [D-NMA , D-Leu , Nle , 29 20 D-Arg ]-hGRF(1-32)-NH2.
Eksempel 14.
Syntesen af [D-Leu*4, Nle^]-rGRF(l-29)-NH2 med formlen: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-25 NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-
DK 162103 B
18 tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Syntesen gentages til fremstilling af [D-NMA2, D-Leu14, Nle2^]-rGR'F (1-29) ~NH2.
5 Eksempel 15.
9 9 7 9 q
Syntesen af hGRF-analogen [D-NMA , Nle , Asn J-hGRF(l-29)-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-
Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg- 10 nh2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
15 Eksempel .16.
27 79
Syntesen af [Nle , D-Arg ]-rGRF(l-29)-NH2 med formlen: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-
Gly'-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-D-
Arg-NH2 20 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
19
Eksempel 17.
2 10 27
Syntesen af det hGRF-analoge fragment [D-NMA , D-Tyr , Nle ]-hGR'F( 1-29 )-NH2 med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-Tyr-Arg-Lys-Val-5 Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-
Arg-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvend-10 else af TLC og HPLC.
2 17 27
Syntese gentages til fremstilling af [D-NMA , D-Leu , Nle ]-hGRF(l-27)-NH2.
Eksempel 18« 2 27
Syntesen af det hGRF-analoge fragment [D-NMA , Nle ]-hGRF(l-15 29)-NHEt med formlen: H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-
Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg- nhch2ch3 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 20 peptidsyntetisator til en chlormethyleret harpiks som i eksem pel 1. Peptidet spaltes fra harpiksen ved hjælp af ammonolyse ved behandling med ethylamin. Peptidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel 19.
25 Syntesen af Syntesen af [D-Leu14, Nle27]-rGRF(l-29)-NH2 med formlen:
DK 162103 B
20 H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-D-Leu-
Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-5 tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
Eksempel 20.
1 2 27
Syntesen af det hGRF-analoge fragment [D-Tyr , D-NMA , Nle , oq D-Arg ]-hGRF(1-29)-NH2 10 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidét bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvendelse af TLC og HPLC.
1 2
Syntesen gentages to gange til fremstilling af [Met , D-NMA , 15 Nle27]-hGRF(1-27)-NH2.
Eksempel 21.
rri 2
Syntesen af det hGRF-analoge fragment [D-N MeTyr, D-NMA ,
Nle^7]-hGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-D-NaMeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-20 Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Nle-
Ser-Arg-NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvend-25 else af TLC og HPLC.
DK 162103 B
21
Eksempel 22.
Syntesen af det hGRF-analoge fragment [His^-, D-NMA^, Nle^]-hGRF(1-29)-NH2 med formlen: H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-5 Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg- NH2 udføres på trinvis måde under anvendelse af en Beckman 990 peptidsyntetisator til en MBHA-harpiks som i eksempel 2. Pep-tidet bedømmes som værende i det væsentlige rent ved anvend-10 else af TLC og HPLC.
1 27
Syntesen gentages to gange til fremstilling af [His , Nle , 29 D-Arg ]-hGRF(l-27)-NH2.
De syntetiske peptider, som er fremstillet ifølge eksemplerne, sammenlignes med syntetisk hpGRF(1-40)-0H ved in vitro forsøg 15 og viser sig at udvise generelt større virkningsstyrker med hensyn til sekretion af GH og lignende egenvirkninger. Alle disse syntetiske peptider anses for biologisk aktive og potentielt anvendelige til stimulation af frigørelsen af GH fra hypofysen.
20 Til bestemmelse af den relative effektivitet af visse repræsentative syntetiske peptider med hensyn til fremme af frigørelsen af væksthormon udføres in vitro forsøg ved anvendelse af syntetisk hpGRF(1-40)-0H som standard ved sammenligning side om side med ækvimolære koncentrationer af de repræ-25 sentative analoge, som er blevet syntetiseret. Anvendte kulturer indbefatter celler af rottehypofysekirteler, der er fjernet ca. 3-5 dage forinden. Sådanne kulturer betragtes som optimale til sekretion af væksthormon og anvendes til den sammenlignende afprøvning på den generelle måde, der er 30 beskrevet af Vale et al. i Endocrinology, 91, 562-572 (1972) og som nærmere beskrevet af Vale et al. i Endocrinology, 112,
DK 162103 B
22 1553-155 (1983). Inkubation sammen med det stof, der skal undersøges, udføres i 3 - 4 timer, og aliquot mængder af kulturmediet fjernes og behandles til måling af deres indhold af im-munoreaktivt GH(ir GH) ved en godt karakteriseret radioimmuno-5 prøve.
Resultaterne af denne sammenlignende afprøvning ved ækvimolære koncentrationer er vist i tabel 1.
10 Tabel 1.
Optisk
Sammen- drejning, ligning, [a]*2 f c=l,
Peptid % i% hAc
hGRF(1-40)-OH
(standard til dette forsøg) 100% 15 [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-29)-NH2 1330% 57,9° [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-27)-NH2 150% 56,8° [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-29)-NHEt 1130% 57,0° [D-NMA2, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NH2 520% 57,6° [D-Leu14, Nle27]-rGRF(l-29)-NH2 120% 52,6° 20 [Nle27, D-Arg29]-rGRF(l-29)-NH2 386% 52,7° [D-NMA2, Nle27]-rGRH(129)-NH2 900% 51,9° [D-NMA2, D-Tyr10, N1e27]-hGRF(1-29)-NH2 270% 56,7° [D-NMA2, Nle27, D-Arg29]-hGRF(1-29)-NH2 580% 57,8° [D-Tyrl, D-NMA2, Nle27, D-Arg29]-25 hGRF(129)-NH2 60% 57,5° [D-NaMeTyr1, D-NMA2, Nle27]- hGRF(l-29)-NH2 30% 57,2° [Hisi, D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-29)-NH2 260% 57,3° [Ac-Tyrl, D-NMA2, NIe27]-hGRF(1-29)-NH2 90% 56,8° 30 [D-NMA2, Serl®, Nle27]-rGRF(1-29)-NH2 260% 52,3° [D-NMA2, Nle27, Asn28]-hGRF(1-29)-NHEt 1510% 56,9° [D-NMA2, Nle27]-hGRF(l-28)-NHEt 140% 56,5° [D-NMA2, Nle27, Asn28]-hGRF(1-32)-NH 82% 57,9° 35
In vitro afprøvning af disse syntetiske peptider viser, at mange af dem har overraskende større biologisk virkningsstyrke end den, den udvises af hpGRF(1-40)-OH, og f.eks. er den
DK 162103 B
23
O
mindste effektive koncentration af [D-NMA2, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2 ca. 1 picomolær.
Foruden in vitro forsøgene vedrørende sekretion af væksthor-5 mon blev de syntetiske peptider ved in vivo eksperimenter intravenøst injiceret i urethanbedøvede hanrotter, og det blev fastslået, at de undertrykker spontan GH-sekretion uden ophævelse af reaktionen på eksogent GRF. Blodprøver udtages umiddelbart før og 10, 30 og 90 minutter efter injektioner-10 ne. GH-mængder i blod, målt ved radioimmunprøve, viser, at syntetisk [D-NMA2, Nle27]-hGRF(1-29)-NH2 er ca. 6 gange mere virksomt end hGRF(1-40)-OH med hensyn til blodmængder af hy-pofysært GH ved måling både 10 og 30 minutter efter fjerde injektion. Andre kendte in vivo GRF-forsøg, som vides at 15 være effektive til påvisning af sekretion af GH, anvendes til bekræftelse af disse resultater. Doser mellem ca. 50 nano-gram og ca. 5 mikrogram af disse peptider pr. kg legemesvægt anses for effektive til at forårsage GH-sekretion. Nogle peptider, der in vitro udviser en biologisk virkningsstyrke, 20 som er ca. lig med eller endog en smule mindre end standarden, udviser meget større in vivo virkningsstyrke.
Sådanne syntetiske hGRF-analoge og eventuelt rGRF-, bGRF- og pGRF-analoge skulle være anvendelige til humane anvendelser, 25 ved hvilke en læge ønsker at forøge GH-produktionen. Stimulation af GH-sekretion ved hjælp af sådanne analoge har interesse for patienter med fuldstændig eller relativ GH-mangel forårsaget af underproduktion af endogent GRF. Det er endvidere sandsynligt, at forøget GH-sekretion og dennes led-30 sagende vækstforøgelse kunne opnas hos mennesker og dyr med normale GH-mængder. Administration skulle endvidere kunne ændre legemets fedtindhold og modificere andre GH-afhængige metaboliske, immunologe og udviklingsmæssige processer. For eksempel kan disse analoge være anvendelige som et middel 35 til stimulation af anabole processer i mennesker under sådanne omstændigheder, som følger efter pådragelse af forbrændinger. Som et andet eksempel kan disse analoge administreres til kommercielle varmblodede dyr, såsom høns, kalkuner, svin,
DK 162103 B
24
O
geder, kvæg og får, og de kan anvendes inden for hydroponik til opdræt af fisk og andre koldblodede havdyr, f.eks. hav-skilpadder og ål samt amfibier, til accelerering af vækst og forøgelse af forhold mellem protein og fedt, som opnås 5 ved fodring med effektive mængder af peptiderne.
Til administration til mennesker bør disse syntetiske peptider hnve en renhed på mindst ca. 93% og fortrinsvis mindst 98%. Renhed vil i denne forbindelse referere til det tilsigtede 10 peptid, der udgør den anførte vægt% af alle tilstedeværende peptider og peptidfragmenter. Til administration af sådanne syntetiske peptider til kommercielle og andre dyr med henblik på fremme af vækst og reduktion af fedtindhold kan en renhed så lav som ca. 5% eller endog så lav som 0,01% være accep-15 tabel.
Disse syntetiske peptider eller de ikke-toksiske salte deraf i kombination med en farmaceutisk eller veterinært acceptabel bærer til dannelse af et farmaceutisk middel kan admini-20 streres til dyr inklusive mennesker enten intravenøst, subkutant, intramuskulært eller perkutant, f.eks. intranasalt eller endog oral. Administrationen kan foretages af en læge med henblik på stimulation af frigørelsen af GH, når den behandlede vært kræver en sådan terapeutisk behandling. Den 25 krævede dosis vil variere med den pågældende tilstand, der behandles, med alvorligheden af tilstanden og med varigheden af den ønskede behandling.
Sådanne peptider adminstreres ofte i form af ikke-toksiske 30 salte, såsom syreadditionssalte eller metalkomplekser, f.eks. med zink, jern eller lignende (der betragtes som salte til det foreliggende formål). Eksempler på sådanne syreadditionssalte er hydrochloridet, hydrobromidet, sulfatet, phosphatet, maleatet, acetatet, citratet, benzoatet, succinatet, malatet, 35 ascorbatet, tartratet og lignende. Hvis den aktive bestanddel skal administreres oralt i tabletform, kan tabletten indeholde et bindemiddel, såsom tragacanth, majsstivelse eller
Claims (6)
1. Syntetisk GRF-analogt peptid eller et ikke-toksisk salt deraf, kendetegnet ved, at det har sekvensen: Rj-R2“Asp-Ala-ne-Phe-Thr-Rg-Ser-Rio-Ar9"^12"R13"R14“G1y_G1n"1-eu"
20 Rig-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-R24-R25-ne_Nle-R28-R29-Gln_Gln“G1y“ NHR, hvor R er H eller lavere alkyl/ Ri er Tyr, D-Tyr eller His med NaMe-substi tut i on eller usubstitueret, R2 er Ala eller D-NMA, Rg er Ser eller Asn, Riq er Tyr eller D-Tyr, R12 er Arg eller Lys, Rj3 er Ile eller Val, Rj4 er Leu eller D-Leu, R^g 25 er Tyr eller Ser, R24 er His eller Gin, R25 er Glu eller Asp, R2g er Asn eller Ser, og R2g er Arg eller D-Arg, forudsat imidlertid, at enhver sekvens af rester begyndende ved C-terminalen og strækkende sig til og med R28 kan være udeladt, og forudsat også, at R2 er D-NMA og/eller R^4 er D-Leu og/el-30 ler r29 er D-Arg.
2. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R3 er D-NMA.
3. Peptid ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R2g er D-Arg. DK 162103B
4. Peptid ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at Rj4 er D-Leu.
5. Peptid ifølge ethvert af kravene 1-4, kendeteg-5 net ved, at R er H.
6. Farmaceutisk middel til stimulation af frigørelsen af GH i et dyr, kendetegnet ved, at det omfatter peptidet ifølge krav 1 eller et ikke-toksisk salt deraf samt en farma- 10 ceutisk eller veterinært acceptabel flydende eller fast bærer derfor. 15 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/611,844 US4528190A (en) | 1983-10-25 | 1984-05-18 | GRF Analogs IV |
| US61184484 | 1984-05-18 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK220685D0 DK220685D0 (da) | 1985-05-17 |
| DK220685A DK220685A (da) | 1985-11-19 |
| DK162103B true DK162103B (da) | 1991-09-16 |
| DK162103C DK162103C (da) | 1992-02-17 |
Family
ID=24450622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK220685A DK162103C (da) | 1984-05-18 | 1985-05-17 | Syntetiske grf-analoge peptider og farmaceutisk acceptable salte heraf samt farmaceutisk middel indeholdende peptidet eller et ikke-toksisk salt deraf |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4528190A (da) |
| EP (1) | EP0161852B1 (da) |
| JP (1) | JPH0689036B2 (da) |
| KR (1) | KR910000379B1 (da) |
| AT (1) | ATE73823T1 (da) |
| AU (1) | AU578467B2 (da) |
| CA (1) | CA1271299A (da) |
| DD (1) | DD236536A5 (da) |
| DE (1) | DE3585634D1 (da) |
| DK (1) | DK162103C (da) |
| EG (1) | EG17394A (da) |
| ES (1) | ES8606412A1 (da) |
| FI (1) | FI92210C (da) |
| GR (1) | GR851207B (da) |
| HU (1) | HU197759B (da) |
| IE (1) | IE57813B1 (da) |
| IL (1) | IL75088A (da) |
| MX (1) | MX157381A (da) |
| NO (1) | NO168043C (da) |
| NZ (1) | NZ212113A (da) |
| PH (1) | PH20976A (da) |
| PT (1) | PT80450B (da) |
| SU (1) | SU1530097A3 (da) |
| YU (1) | YU46153B (da) |
| ZA (1) | ZA852919B (da) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4728726A (en) * | 1982-10-04 | 1988-03-01 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs IIIb |
| US4732972A (en) * | 1983-03-07 | 1988-03-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polypeptides having growth hormone releasing activity |
| US4649131A (en) * | 1984-09-24 | 1987-03-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
| EP0193910A3 (en) * | 1985-03-06 | 1988-11-23 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Synthesis of a derivative of grf and intermediate peptides |
| US4734399A (en) * | 1985-08-06 | 1988-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| US4880778A (en) * | 1986-05-12 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof |
| FR2599038B1 (fr) * | 1986-05-26 | 1990-06-29 | Sanofi Sa | Procede de preparation de nonacosapeptides et peptides intermediaires |
| DE3742633A1 (de) * | 1987-12-16 | 1989-06-29 | Hoechst Ag | Peptide mit beeinflussender wirkung auf die hypophyse von saeugern |
| US5565606A (en) * | 1986-10-21 | 1996-10-15 | Hoechst Aktiengesellschaft | Synthesis of peptide aminoalkylamides and peptide hydrazides by the solid-phase method |
| IL84758A (en) * | 1987-01-13 | 1992-03-29 | Salk Inst For Biological Studi | Peptides stimulating the release of pituitary growth hormone in fish and amphibians,and pharmaceutical compositions containing them |
| US4843064A (en) * | 1987-01-13 | 1989-06-27 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs V |
| US4914189A (en) * | 1987-02-05 | 1990-04-03 | The Adminstrators Of The Tulane Educational Fund | Synthetic GHRH analogs |
| EP0289186A3 (en) * | 1987-04-23 | 1990-04-04 | International Minerals And Chemical Corporation | Process for increasing the growth rate and enhancing the feed efficiency of meat producing livestock |
| IL86102A (en) * | 1987-05-11 | 1994-04-12 | Univ Tulane | Alkylated peptides that release growth hormone and their use |
| US5112808A (en) * | 1987-05-11 | 1992-05-12 | American Cyanamid Company | Alkylated hormone-releasing peptides and method of treatig mammals therewith |
| US5002931A (en) * | 1987-05-22 | 1991-03-26 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs VII |
| US4839344A (en) * | 1987-06-12 | 1989-06-13 | Eastman Kodak Company | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US4801456A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| USRE33699E (en) * | 1987-07-09 | 1991-09-24 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| US4880777A (en) * | 1987-09-01 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Synthetic peptides having growth hormone releasing activity |
| ATE106895T1 (de) * | 1987-09-18 | 1994-06-15 | Hoffmann La Roche | Zyklische grf-analoga. |
| EP0400051B1 (en) * | 1988-01-28 | 1995-05-10 | Polygen Holding Corporation | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US5043322A (en) * | 1988-07-22 | 1991-08-27 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic GRF analogs |
| US5023322A (en) * | 1988-08-31 | 1991-06-11 | Mta Kutatas-Es Szervezetelemzo Intezete | Analogs of growth hormone releasing factor (GRF) and a method for the preparation thereof |
| US5756458A (en) * | 1989-06-16 | 1998-05-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Stabilized potent GRF analogs |
| US5716937A (en) * | 1989-12-13 | 1998-02-10 | The General Hospital Corporation | Method for treating cardiac malfunction |
| JPH06500311A (ja) * | 1990-06-29 | 1994-01-13 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | ヒスチジン置換されたヒト成長ホルモン放出因子類縁体 |
| DK0490249T3 (da) * | 1990-12-10 | 1995-05-29 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til enzymatisk fremstilling af GRF(1-44)-NH2 |
| CA2084061A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-10 | Arthur M. Felix | Growth hormone releasing factor analogs |
| ZA922746B (en) * | 1991-04-26 | 1992-12-30 | Lilly Co Eli | Superactive grf analogs |
| US5246920A (en) * | 1992-06-15 | 1993-09-21 | University Of South Florida | Treatment of hyperprolactinemia |
| US5811074A (en) * | 1992-06-29 | 1998-09-22 | University Of South Florida | Method of diagnosing pituitary dependent growth hormone deficiency |
| GB9324691D0 (en) * | 1993-12-01 | 1994-01-19 | Hafslund Nycomed As | Peptide compounds |
| US5550212A (en) * | 1993-12-17 | 1996-08-27 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Analogues of hGH-RH(1-29)NH2 having antagonistic activity |
| IT1285405B1 (it) * | 1995-06-06 | 1998-06-03 | Alza Corp | Modificazione di farmaci polipeptidici per accrescere il flusso per elettrotrasporto. |
| AU2002233082B2 (en) * | 2001-02-02 | 2005-11-10 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Long lasting growth hormone releasing factor derivatives |
| NZ539218A (en) * | 2002-09-18 | 2008-03-28 | Univ Montreal Ct Hospitalier Chum | Synthetic GHRH analogues of 29 amino acids or more |
| US20090088380A1 (en) * | 2007-07-12 | 2009-04-02 | Pierrette Gaudreau | Ghrh analogs and therapeutic uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| US4518586A (en) * | 1983-01-13 | 1985-05-21 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs III |
| IL70530A (en) * | 1983-01-13 | 1986-09-30 | Salk Inst For Biological Studi | Synthetic peptides having growth hormone releasing factor activity and compositions containing them |
| AU575843B2 (en) * | 1983-08-10 | 1988-08-11 | The Administrators Of The Tulane Eductional Fund | Growth hormone releasing peptides |
-
1984
- 1984-05-18 US US06/611,844 patent/US4528190A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-18 ZA ZA852919A patent/ZA852919B/xx unknown
- 1985-04-26 DE DE8585302975T patent/DE3585634D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-26 EP EP85302975A patent/EP0161852B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-26 AT AT85302975T patent/ATE73823T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-29 IE IE1087/85A patent/IE57813B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-02 CA CA000480584A patent/CA1271299A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-03 IL IL75088A patent/IL75088A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-05-08 PH PH32242A patent/PH20976A/en unknown
- 1985-05-09 FI FI851842A patent/FI92210C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 YU YU77185A patent/YU46153B/sh unknown
- 1985-05-13 PT PT80450A patent/PT80450B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 AU AU42488/85A patent/AU578467B2/en not_active Ceased
- 1985-05-15 NO NO851947A patent/NO168043C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-05-16 EG EG306/85A patent/EG17394A/xx active
- 1985-05-17 ES ES543235A patent/ES8606412A1/es not_active Expired
- 1985-05-17 JP JP60105746A patent/JPH0689036B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-17 KR KR1019850003400A patent/KR910000379B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 HU HU851870A patent/HU197759B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 GR GR851207A patent/GR851207B/el unknown
- 1985-05-17 DD DD85276457A patent/DD236536A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 NZ NZ212113A patent/NZ212113A/en unknown
- 1985-05-17 DK DK220685A patent/DK162103C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 MX MX105337A patent/MX157381A/es unknown
- 1985-05-17 SU SU853898058A patent/SU1530097A3/ru active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| FI88402C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara grf-analoger | |
| US4626523A (en) | GRF analogs II | |
| HU191263B (en) | Process for producing factor for promoting letting out growth hormone of human pancreatic origine | |
| FI87080C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av grf-analoger | |
| JP2739910B2 (ja) | 環状ｇｒｆ類似体 | |
| US5262519A (en) | GRF analogs XI | |
| CA1247601A (en) | Rat grf and analogs | |
| US4728726A (en) | GRF analogs IIIb | |
| US4784987A (en) | GRF analogs VI | |
| US5002931A (en) | GRF analogs VII | |
| KR0163033B1 (ko) | Grf 유사체 viia | |
| US4843064A (en) | GRF analogs V | |
| EP0274916A2 (en) | GRF analogs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |