JPS59501951A

JPS59501951A - ヒト膵臓ｇｒｆ

Info

Publication number: JPS59501951A
Application number: JP83503459A
Authority: JP
Inventors: リビエル・ジヤン・ウ−・エフ; シユピ−ス・ヨアヒム; ベ−ル・ワイリ−・ダブリユ−・ジユニア−
Original assignee: ザ・ソーク・インステチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ
Priority date: 1982-10-04
Filing date: 1983-10-03
Publication date: 1984-11-22
Also published as: ES526201A0; IE56175B1; RO91186B; HU191263B; FI83660B; DE3369144D1; IL69897A; AU566180B2; GR79698B; NO167866B; FI842166A0; ES8606399A1; EP0105759B1; PT77453A; ATE24919T1; DK269284A; NO167866C; NZ205745A; EP0105759A3; YU45575B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト膵臓ＧＲＦ本発明はヒトおよび他の動物（特に哺乳動物）の脳下垂体の機能に影響を及ぼすペプチドに関する。よシ詳細には脳下垂体による成長ホルモンの放出を促進するペプチドに関する。

発明の背景生理学者たちは、視床下部が脳下垂体ホルモンの分泌を誘発する視床下部産生性の特別のポリペプチドで脳下垂体線部の分泌機能をすべて調節していると長期にゎたシ認めてきた。成長ホルモンＣＧ＃）の分泌を阻害する阻害因子はソマトスタチンの形でょシ早い時期にその性状決定がなされた。

脳下垂体ＧＨのための対応する視床下部の放出因子は長い間捜しめられてきており、そして１９８２年に脳下垂体によるＧＨの放出を促進するポリペプチドがヒト膵臓腫瘍の抽出物から単離され、精製され、性状決定がなされ、合成され、そして試験された。この４０個のアミノ酸残基からなるペプチドの式は次の通りである。

Ｈ−Ｔ　３１　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓｎ　−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ− Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌ’／５−Ｌｅ１Ｌ＝Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−１ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ｇ１　ｙ　−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｇｌ　３ｌ−Ａｌａ　−ＯＨ以後本明細書ではこのペプチドｆｈｐＧＲＦ（ヒト膵臓腫瘍からのＧＨ放出因子）と称する。４４個のアミノ酸残基刀）らなるこのペプチドのアミド化体が他の腫瘍から単離され、これはＣ−末端にＡ　ｒ　ｇ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ　−Ｌ　ｅ　ｕを含１５位のグリシン残基の代わシに置換されたＤＡｌａをもつｈｐＧＲＦの合成ペプチド類似体は固有の生物活性をもち、かつ生体内での酵素分解に対してかなりの抵抗性を示して生物学的作用を持続させることが見い出された。ζらに驚くべきことに、ｈｐＧＲＦの２つの断片（それぞれアミド化されたＣ−末端をもつ２９個のＮ−末端アミノ酸残基または３２個のＮ−末端アミノ酸残基を含む）は天然の４０−残基ペプチドの生物学的効力に等しい効力を示すことが見い出された。こうして、本発明は３２個またはそれ以下のアミノ酸残基の合成ｈｐＧＲＦ断片を提供し、これらの断片はＣ−末端でアミド化されておりかつＮ−末端ペプチド配列ならびに生物学的効力を示すに足る追加のアミノ酸残基を含む。

本発明による医薬組成物は薬学的に受容される液体または固体の担体に分散された、このようなｈｐＧＲＦ類似体または生物学的に活性なそれらのアミド化所片、もしくは前記ぜブテド類の無毒性塩を官有する。このような組成物は治療もしくは診断目的で投与するだめのヒトおよび動物の臨床医薬として使用することができる。

ペプチドの定義のために使用される命名法はＳ　ｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅによるＴｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　”、アカデミツクプレス（１９６５年）に定められたものであり、ここでは慣用的な表示法に従ってＮ−末端のアミノ基は左に、そしてＣ−木端のカルボキシル基は右に示される。アミノ酸残基が異性体を有する場合、もし他に指定されなければそれは弄示されたアミノ酸のＬ一体である。

本発明は次式で表わされる合成ｈｐＧＲＦ−！！プチドを提供する。

Ｈ−Ｔｙ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｌ　ａ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓ　ｎ　−８ｅ　ｒ−Ｒ９ｒ−Ａｒ　ｇ　−Ｌ　’／　ｓ　−Ｖａ　１− Ｌｅ　ｕ　−Ｄ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ−Ａｔ　ａ −Ａｒ　ｇ−Ｌ’／　５−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌ’／　−Ｇ　ｌ　ｗ−８ｅ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ　−Ｇ　ｌ　３’　−Ｒ２Ｏ−Ｙ〔式中、Ａ’４０　ｉｊ：　Ａｌ　ａまたはデス−Ｒ４ｏであシ、ＹはＣ−末端のアミノ酸残基のカルボキシル部分を意味しそして−ＣＯＯＲ，、−ＣＲ，Ｏ，−ＣＯＮＨＮＨＲ，、−ＣＯＮ　（ＲＩ　）　（７？！２　）または− ＣＨ２０Ｒ，であシ、ここでＲ１およびＲ２は低級アルキル基または水素原子である。〕メチル基、エチル基およびプロピル基が好適な低級アルキル基である。また前記ペプチドの断片は生物学的効力を有する。

本発明はまた次式で表わされる合成ｈｐＧＲＦ−ｅプチドを提供する。

Ｈ−Ｔ’／　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａ　ｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１１ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓｎ　−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｒｂ −Ｒ，、−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｔｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ−８ｅｒ　Ａｒｇ　Ｒｓｏ　Ｒ３＋　＃３２　Ｙ〔式中、Ｒ１，はＧｌ’／ｉたはｆ）−７１１ａであシ、ＲｓｏはＧｌｎまたはデス−Ｒ３ｏであり、Ｒ３，はＧｌｎ’ｌたはデス−Ｒ３、であシ、Ｒ３ □はＧｌｙｌたはデス−Ｒ３２であり、ＹはＣ−末端のアミノ酸残基のカルボキシル部分を意味しそして−ＣＯＮ　（Ｒ，）　ＣＲ２）であシ、ここでＲ１およびＲ２は低級アルキル基または水素原子である。〕メチル基、エチル基およびプロピル基が好適な低級アルキル基である。また前記ペプチドの断片は生物学的効力を有する。

ペプチドは適当な方法、例えば固相法、部分固相法、断片縮合、古典的な溶液カンプリング、またはＬ−異性体残基のみを含むペプチド断片のだめの最近開発された組み換えＤＮＡ法の使用などによシ合成される。例えば、固相法のみの合成法はＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇによる”　５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”、フリーマン社、サンフラッジスコ（１９６９年）に説明されて８す、またＶａｌｅらによる１９７８年８月８日付米国特許第４１０５６０３号明細書に開示されている。断片縮合法による合成は１９７６年８月３日付米国特許第８９７２８５９号明細書に例示きれる。他の利用しうる合成法は米国特許第３８４２０６７号（１９７４年１０月１５日付）および同第３８６２９２５号（１９７５年１月２８日付）の各明細書に例示される。

本出願のための組み換えＤＮＡ法を使用する合成法は、意図する形のｈｐＧＲＦ断片をコードする構造遺伝子の適切な使用を包含すると理解すべきである。合成ｈｐＧＲＦ断片はこのような構造遺伝子と共にプロモーターおよびオペレーターを含む発現ベクターを使用して微生物を形質転換し、そして形質転換されたその微生物にｈｐＧＲＦ断片を発現せしめることにより得ることができる。ヒト以外の動物も１だ、このような構造遺伝子ならびに米国特許第４２７６２８２号明細書（１９８１年６月３０日付）に記載の一般方法を使用する遺伝子操作によシ、あるいは１９８３年５月２６日発行のＷＯ８８１０１７８３および１９８２年１２月２３日発行のＷＯ８２１０４４４８に開宗テれる胚の顕微注入を使用する遺伝子操作によシ、ｈｐＧＲＦ断片を産生ずるのに使用される。合成ｈｐＧＲＦ断片はまた、上記の２冊のＷＯ刊行物に記載の方法により成長促進が予定される動物において直接産生これる。

化学合成法またはカンプリング合成法では、各種のアミノ酸部分の不安定な側鎖基を適当な保護基（最終的にその保護基が除去されるまでその部位での化学反応の発生を阻止する基）で保護することが通常行われる。丑だ、アミノ酸や啄プチド断片がカルボキシル基の部位で反応する間それらのα−アミン基を保護し、続いてα−アミン基の部位で反応を行わせるためにα−アミン保護基を選択的に除去することも通常行われる。従って、合成法の一段１階として、Ｒプチド鎖中の意図した配列に適当な側鎖保護基をもつアミノ酸残基を含む中間体化合物が製造されることは一般的なことである。

次式で表わされる中間体は不発明の範囲内に含まれると考えられる。

Ｘ’　Ｔ’／ｒ　（￥２）　−Ａｌａ−Ａｓ　ｐ　（￥３）ＡＬａ−Ｉ　Ｌｅ− Ｐｈｅ　−Ｔｈ　ｒ　（、Ｙ’）　−Ａｓ　ｎ　（、￥５）　−８ｅ　ｒ　（Ｘ ’）　−Ｔ’／　ｒ　（￥２）　−Ａｒ　ｇ（Ｘ’）　−Ｚ、Ｙ　ｓ　（、￥７）　−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ　−Ｒ＋ｓ　Ｇ　ｌ　ｎ　（、￥５）−Ｌｅｗ−８ｅ　ｒ　（Ｘ’）　−Ａｌ　ａ−Ａｒ　ｇ　（Ｙ’）−Ｌｙｓ　（、￥７）　−Ｌｅｕ　−Ｌｅ　ｕ　（、￥５１−Ａｓ　ｐ　（、￥３）　−１ｌ　ｇ　−Ｍｅ　ｔ　−Ｓ　ｅ　ｒ　（、￥’）　−Ａｒｇ（、Ｙ’）　−ＧｌｎＣＸ”）−ＧｌｎＡＸ”）　−Ｇｌ’／−ＧｌｎＣＸ３）−８ｅ　ｒ　（Ｙ’）　−Ａｓ　ｎ　（、￥５）　−Ｇｌ　ｎ　（、￥５）　−Ｇｌ　ｕ　ｌ￥”）　−Ａｒｇ（、Ｙ ’　）　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｒ，ｏ−￥８（またはＣ−末端で過当に短縮された配列）ここでＸｌは水素原子またはα−アミノ保護基である。

Ｘｌに含まれるα−アミン保護基は、ポＩＪ−ｅプチドの段階合成法の技術分野で有用であると知られているものである。そのようなα−アミノ保禮基には（１）　アシル型保護基、例えばホルミル基、トリフルオロアセチル基、フタリル基、トルエンスルホニル基（Ｔａ２）、ベンゼンスルホニル基、ニトロフェニルスルフェニル基、トリチルスルフェニルＬ　Ｏ−ニトロフェノキシアセチル基、クロロアセチル基、アセチル基、およびγ−クロロフ゛テＩＪ　）し基；（２）芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、およびｐ− クロロベンジルオキシカルボニルＬ　ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−プロモベンジルオキシ力ルボニル基またはｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基などの置換されたＺ；（３）脂肪族ウレタン型保護基、例えばｔ−プチルオキシ力ルボニルｆ　（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル基、イノプロピルオキ／カルボニル基、エト、キ・／カルボニル基、およびアリルオキシカルボニル基；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばノクロペンチルオキシ力ルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基、および／クロヘキシルオキシカルボニル基；（５）　チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカルボニル基；（６）アルキル型保護基、例えばトリフェニルメチル基（トリチル基）およびベンジル基；（７））ＩＪアルキルシうン基、例えばトリメチル７ラン基；が言壕れる。好適なα−アミノ保護基はＢＯＣである。

￥２はＴｙｒのフェノール性水酸基のための保護基であり、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基、トリチル基、ＢｚＬＸＣＢＺ、４Ｂｒ−ＣＢＺおよび２，６−ジクｏ。

ベンジル基（ＤＣＢ）　よりなる群から選択される。好適な保護基は２，６−ジクロロベンジル基である。￥２は水素原子であることもでき、この場合は水酸基に保護基が存在しないことを意味する。

￥３は水素原子であるか、あるい（ｌｉＡｓｐｌたはＧＬｎのカルボキシル基のだめのエステル形成性保護基であってベンジル基（ＯＢｚｔ）、２．６−ジクロロベンジル基、メ８チル基およびエチル基よりなる群から選択される。

Ｘ４はＴｈｒ　またはＳｅｒの水酸基のための保護基であり、アセチル基、ベンゾイル基、ｔ−ブチル基、トリチル基、テトラヒドロピラニル基、Ｂｚｌ、２　、６−ジクロロベンジル基およびＣＢＺよシなる群から選択される。好適な保護基はｆｌｚＬ−ｃある。Ｘ４は水素原子であることもでき、それは水酸基に保護基が存在しないことを意味する。

Ｘ５は水素原子であるか、あるいはＡｓｎ”！たはＧｉｎの側鎖アミド基のための保護基であって、それは好適にはキサンチル基（Ｘａｎ）である。

Ｘ６はＡｒｇのグアニジノ基のための保護基であって、ニトロ基、ＴｏｓＸＣＢＺ１アダマンチルオキシカルボニル基およびＢＯＣよシなる群から選択されるか、あるいは水素原子である。

Ｘ７は水素原子であるか、あるいはＬｙＳの側鎖アミノ基のだめの保護基である。適当な側鎖アミン保護基の例は２−クロロベンジルオキシカルボニル基（２Ｃ１−Ｚ　）、Ｔｏ８、ｔ−アミルオキシカルボニル基およびＢＯＣでｈる。

１ｖｆｅｔは場合によシ酸素原子で保護されるが、保護しないでおく方が好ましい。

側鎖アミン保護基の選択は特に限定的なものではないが、それは合成中にα−アミン保護基を除去する際に除去されないものでなければならない。それ故、α− アミン保護基と側鎖アミン保護基とは同じものであってはならない。

Ｘ８はＣ−末端カルボキシル基のための保護基（例えばエステル形成性の基Ｘ３）、または固体樹脂支持体へ結合するために固相合成法で使用される定着結合であるか、あるいはデス−Ｘ８であシ、この場合にＣ−末端の残基はカルボキシル部分Ｙ”ｆｒもっ。固体樹脂支持体が使用きれる場合に、それは式：　ＯＣＨ２ −樹脂支持体、−〇−ＣＨ２−ベンジルーポリアミド樹脂支持体、−ＮＨ−ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂支持体、および−ＮＨ−パラメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂支持体で表わされる。ポリアミド重合体は市販されておシ、そしてＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒ’／、８　、８５１〜８７０イージ（１９７９年）に詳しく論じられておシ、そこにはボリア、ミド重合体の好適なものが第６図に示される合成法と関連させて論じられている。それが使用される場合に、側鎖保護基は最初に弗化水素（ＨＦ）処理で開裂され、続いてその４プチドはアンモニア分解でアミドとして樹脂から切り離きれる。非置換のアミドが望１れる場合に、開裂が直接アミドを与えるのでＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂の使用が好適である。Ｎ−メチルアミドが望まれる場合には、それはＮ−メチルＢＨＡ樹脂がら形成することができる。

中間体のための式において、Ｘ基のうち少なくとも１つは保護基であるか、もしくはＸ８は樹脂支持体を含む。

４プチド合成で使用する特足の側鎖保護基を選択する０場合には次の規則に従う＝（ａ）保護基はその保護特性を保有しかつカップリング条件下で開裂してはならない；（ｂ）　保護基は試薬に対して安定であシ、かつＸａｎを除いばれる反応条件下に安定であるべきである；そして（、ｌｊ）側鎖保護基は、意図したアミノ酸配列を含む合成の完了時点で、Ｋプチド鎖を変性させない反応条件下に除去できなければならない。

被プチドは例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによるＪ、Ａｒｎ、Ｃｈｅｍ。

亙証ユ、８５，２１４！１１”−ジ（１９６８年）に記載されるような固相合成法を使用して有利に製造されるが、当該技術分野で知られる他の同様な化学合成法もまた先に述べたごとく使用することができる。固有合成法は保護したα−アミノ酸全適当な樹脂にカンブリングさせることにより被プチドのＣ−末端から開始される。４０−アミノ酸残基ペプチドのためのこのような出発物質は、α−アミノ保護Ａ　ｌ　ａをエステル結合でクロロメチル化１１脂またはヒドロキシメチル樹脂へ結合させる炉、あるいはアミド結合でＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ衝脂へ結合させることにより製造される。ＢＨＡｊ６よびＭＢＨＡ樹脂叉持体は市販されて２す、そして一般にこれらは意図した合成ポリペプチドがＣ−末端に非置換アミドを有する場合のみ使用される。メチル、エチルまたはプロピルアミドが合成ポリペプチド中に組み入れられる場合には、クロロメチル化またはヒドロキシメチル樹脂が使用され、１そして開裂は適当なアミン、例えばエチルアミンを用いて有利に行われる。

ＢＯＣで保護したＡｌａはＡ（ｏｎａｈａｎ　ＳよびＧ１１ｏｎによるＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、１２　、２５１８〜２５１９ページ（１９７８年）に記載の方法に従ってクロロメチル化樹脂にカップリングされる。ＢＯＣ−Ａｌａの樹脂支持体へのカップリング後に、そのα−アミン保護基は例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）、ＴＥＡ単独またはジオキサン中のＨＣｌを用いることによシ除去される。この保護基除去反応は約θ℃ないし室温で実施される。特定のα−アミノ保護基を除去するだめの他の標準的な開裂試薬ならびに条件は、５ｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅによる”　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”　＋　１　＋　７２〜７５　’−ジ、アカデミツクプレス（１９６５年）に記載のごとく使用される。

Ａｌａのα−アミノ保護基の除去後、残シのα−アミノ保護−および側鎖保護− アミノ酸は意図した順序で段階的にカップリングされて先に定義した中間体化合物を得るか、あるいは合成に８いて各アミノ酸を別々に加える代わシに、それらのうちのいくつかを固相反応器に添加する前に互いにカンプリングさせてもよい。適当なカップリング剤の選択は当業者の知るところである。Ｎ　、　Ｎ’−シンクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）はカップリング剤として特に適している。

被プチドの固相合成法で使用これる活性化試薬は被プｌ２チドの技術分野で周知である。適当な活性化試薬の例にはＮ　、　Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−ＣＢ−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミドなどのカルボジイミド類がある。他の活性化試薬ならびにペプチドカップリングにおけるそれらの使用は、５ｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅによる同書、第■章およびＫａｐｏｏｒによるＪ、Ｐｈａｒ、Ｓｃｉ、、　５９　、１〜２７ベージ（１９７０年）に記載されている。

各保護アミノ酸またはアミノ酸配列は約４倍もしくはそれ以上の過剰量で固相反応器に導入され、そしてそのカップリングはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）の媒体中、またはＤＭＦ中、もしくはＣＨ２Ｃｌ。

中で実施される。不完全なカップリングが生ずる場合に、そのカップリング法は次のアミノ酸のカップリングに先立つα−アミノ保誦基の除去前に繰シ返し行われる。各合成段階におけるカップリング反応の完了は、Ｅ、ＫａｉｓｅｒらによるＡｎａｌ　、Ｅｉｏｃｈｅｍ、　＋　８４　＋　５９５　’−ジ（１９７０年）に記載のごとく、ニンヒドリン反応によシ監視される。カップリング反応は、例えばＢｅｃｋｍａｎ　９９０自動合成機で、ＢｉｖｉｅｒらによるＢｉｏｐｏｌｙｒｎｅｒｓ、１７　、１９２７〜１９ｓ８−＝−ジ（１９７８年）に報告されたようなプログラムを使用して、自動的に行うことができる。

意図したアミノ酸配列が完了した後に、その中間体ｄブチドは液状弗化水素のような試薬で処理することにより樹脂支持体力・ら切シ離すことができ、その液状弗化水素はペプチドを樹脂から開裂させるばかりでなく、残存する全ての側鎖保護基Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７、定着結合Ｘ８、ならびにα−アミノ保護基Ｘ１を開裂させて、遊離酸の形のペプチドを与える。例えばエチルアミドが望まれる場合には、乾燥エチルアミンで処理してペプチドを開裂することができる。Ｍｅ　ｔがペプチド配列中に存在するので、ＢＯＣ保護基はにプチドをＨＦで樹脂から切シ離す前にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／エタンジチオールを使用することによシ捷ず最初に開裂しておいて、Ｓ−アルキル化の可能性全除外することが望ましい。

開裂用にＨＦを使用する場合、スキャベンジャ−としてアニソールおよびメチルエチルスルフィドを反応容器に加える。

仄の実施例は固相法でｈｐＧＲＦ全合成するだめの好適な方法全説明する。対応するよシ短いペプチド断片の合成は、ペプチド鎖の両端で必要な数のアミノ酸を単に除外することによシ同じ方法で行われると当然理解されるだろう。しかしながら、生物学的に活性な断片はＮ−末端に辰示した配列を含むべきであると目下のところ考えＨ−Ｔｙ　、ｒ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ　−Ａ　ｓ　ｎ　−８ｅ　ｒ７Ｔ　ｙｒ−Ａｒ　ｇ− Ｌ’ｔ　ｓ　−Ｖａ　ｌ　−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｄ−Ａ、、ｌ　ａ　−Ｇ　ｌ　ｎ　− Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｒ　ｇ−Ｌ’／　５−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｗ　 −Ｇ　ｌ　ｎ　−４Ａｓｐ−１１ｅ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌ’／−Ｇｌｕ −Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈ２で表わされる［Ｄ−Ａｌａ１５〕−んｐＧＲＦ（１４０）ＮＨ２の合成は、Ｂｅｃｋｍａｎ９９０ペプチド合成機を用いて、Ｂａｃｈｅｍ社から市販されているＭＢＨＡ塩酸塩樹脂（樹脂１ｇ当シ約０．１〜０．５　ミＩＪモルの置換範囲をもつ）上で段階法により実施された。ＢＯＣ−Ａｌａの樹脂へのカップリングは合成の間中ずつと使用される下記のスケジュールＡおよびＢに説明される一般方法によシ行われ、それは樹脂ＩＩ当り約０．８！ＭＩＪモルのＡｌ　ａの置換をもたらした。使用される全ての溶剤はＭｅｔ残基の硫黄を酸化する恐れのあるぼ累を排除するために、ヘリウムまたは窒素などの不活性ガスを吹き込むことによシガス抜きした。

保護基の除去ならびに中和後、ペプチド鎖を樹脂上に段階的に形成させた。保護基の除去、中和および各アミノ酸の添加は、Ｖａｌｅ　らによる米国特許第４２９２３１３号明細誉に詳細に説明される方法に従って一般に行われた。

保護基の除去は次のスケジュールＡに従って有利に実５１、６０％ＴＦＡ／２係エタンジチオール　１０２、６０％ＴＦＡ／２％エタンジチオール　１５８、ＩＰＡ７１％エタンジチオール　０．５−４、ＣＨ２Ｃｌ２中ＥｔｓＮ　（、１０％）０．５５、ＭｅＯＨ０，５６、ＣＨ２Ｃ１２中Ｅｔ３Ｎ（１０％）０．５７、ＭｅＯＨ＜２回）０．５８、ＣＨ２Ｃｌ２（２回）０．５カツプリングは次のスケジュールＢに従って有利に実１０、ＢＯＣ−アミノ酸　５０〜９０１１、　Ｍｅ　ＯＨ（２回）０．５１２、ＣＨ２Ｃｌ２（２回）０．５１３、ＣＨ２Ｃｔ２中Ａｃ２０　（３Ｍ）　１５．０１６、ＣＨ２Ｃｌ２（２回）０．５要約すると、塩化メチレン中のＢＯＣ−保護アミノ酸１〜２ミリモルが樹脂１ｇあたシ使用され、２時間の間に塩化メチレン中の１．０モルＤＣＣＩ　１当量が加えられた。Ｂ　ＯＣ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）をカンプリングする場合は５％ＤＭＦ−Ｊ６よび塩化メチレンの混合物を使用した。ＢｚｔエーテルＢＳｅｒおよびＴｈｒのだめのヒドロキシル側鎖保護基として使用した。ｐ−ニトロフェニルエステル（ＯＮｐ）はＡｓｎまたばＧｌｎのカルホキフル末端を活性化するのに使用され、そして例えばＢＯＣ−Ａｓｎ（ＯＮｐ）はＤＭＦおよび塩化メチレンの５０％混合物中でＨＯＢｔ　１当量を使用して一部カツブリングさせた。この場合はＤＣＣＩを添加しなかった。活性エステル化法の代わりにＤＣＣＩカンプリング法を使用する場合には、Ａｓｎ丑たはＧｌｎのアミド基はＸＣＬｎで採掘された。２Ｃ１−ＺはＬｙｓ側鎖のだめの保護基として使用した。ＴｏｓはＡｒｇのグアニジノ基を保護するのに使用され、そしてＧ１１を丑たはＡｓｐのカルボキシル基はＯＢｚｌとして保護した。Ｔｊｌｒのフェノール性水酸基はＤＣＢで保護した。合成終了時に、次の胆成のものが得られた。

Ｘ’　−Ｔ　”／　ｒ　ＬＹ２）　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　（￥３）　−Ａ　ｌ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ　−Ｔｈ　ｒ　（Ｘ’）　−Ａ、ｓ　ｎ　（￥５）’　−８ｅ　７　（Ｘ’）　−Ｔ　３１　ｒ　（￥２）−Ａｒ　ｇ　−（、Ｙ ’）　−Ｌ’／８　（、￥７）　−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ　−Ｄ−Ａ　ｌ　ａ　− Ｇ　ｌ　ｎ　ＣＸＪ−Ｌｅ　ｕ　−８ｅ　ｒ　（Ｘ’）−Ａｌ　ａ−Ａｒ　ｇ　（、￥６）　−Ｌ！　ｓ　（、￥７）　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ　（ＸＪ　−Ａｓ　ｐ　（Ｘ”）　−１Ｌ　ｅ　−Ｍ　ｅ　ｔ−８ｅｓ　（Ｘ’）−Ａｒ　ｇ　（、Ｙ’　）　−Ｇ　ｌ　ｎ　（、￥５）−Ｇｌ　ｎ　（、￥５）　− Ｇ　ｌ　’／　−Ｇ　１ｕｃＸ３）−８ｅ　ｒ　（、￥５）−Ａｓ　ｎ　（、￥５）−Ｇｌ　ｎ　（、￥５）−Ｇｌ　ｕ　（Ｊ＋”’）　−Ａｒｒｔ　＜Ｘ’） −Ｇｌｙ−Ａｌａ−￥８（式中Ｘ１はＢＯＣ，、Ｘ２ＤＣＢ、￥３はベンジルエステル、￥４はＢｚｌ、　￥５はＸａｎ、　Ｘ’はＴｏｓ、　￥７は２Ｃｔ−Ｚ、そして￥６は−ＮＨ−樹脂支持体である）Ｘａｎはα−アミノ保護基を除去する際に使用されるＴＦＡ処理でその一部または全部が除去された。

最後のＴ’ｌｒ残基が樹脂へカップリンダされた後、ＢｏｃはＣＨ２Ｃｌ２中の６（Ｊ％ＴＦＡを用いて除去した。ぼプチド鎖の残シの保護基を除去するために、それはぜプｔドー’ｌｔｆ脂１７あたシアニノール１．５ｍｌ、　メチルエチルスルフィド０．５ｍｌおよびＨＦ１５ｍ１を用いて一２０℃で７時間および０ ℃で〆時間処理した。高真空下にＨＦを排除した後、ペプチド−樹脂残留物を乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホルムで交互に洗浄し、次いでそのＲプチドをガス抜きした２Ｎ酢酸水＠液で抽出し、そして濾過によりその樹脂から分離させた。

その後、保護基を除去しかつ樹脂刀・ら切り離されたペプチドは０〜５％酢酸に溶解して精製（５ｅｐｈａｄｅｚ　Ｇ　−５０微細ゲルｒ過を含む）を行った。

Ａｙｎ、Ｃｈｅｒｎ、Ｓｏｃ、、１０８　、８１．７８ページ（１９′８１年）に記載されるような調製用でたけ半調製用ＨＰＬＣで精製した。簡単に説明すると、Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓｐｒｅｐ　ＬＣ−５００に合うカートリッジにＶ’／１ｉａｃ　（３００Ａ）からの１５〜２０　Ｃｐｓ　シリカを充填した。ＴＥＡＰ８Ｃｈｒｏｒｎａｔ、ｏｇｒａｐｈ’／、　１　、８４８〜８６７ページ（１９７８年）に記載されるような低圧エルデソクスＣＥｌｄｅｘ）ダレジエントメ−カーで調製した。クロマトグラフィー分画はｉｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃで注意深く監視し、本質的に純粋な分画のみを集めた。それぞれ別々に純度を調べた精製分画の脱塩は、０．１％ＴＦＡ中でＣＨ３ＣＮの勾配を使用して達成した。その後中央浴出分を凍結乾燥して意図したペプチドを得、このペプチドの純度は９８％以上であった。

合成はクロロメチル化側脂を使用して繰り返し行われ、ＲｉｖｉｅｒＪ、　によるＪ、Ａｒｎｅｒ、Ｃｈｅｒａ、Ｓｏｃ、　９６　、２９８６〜２９９２ぜ−ジ（１９７４年）に一般的に記載された方法により（Ｄ　−Ａｔα１５〕−ｈｐＧＲＦ　（１−４０）　−ＯＨが製造された。

Ｈ−Ｔ’／ｒ−Ａ−１ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｔ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ− Ａｓ　ｎ−８ｅｒ−Ｔ”／ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ　 −Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌ’／８　Ｌｅｕ−Ｌｅｖ、−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｍｅｔ−８ｅｒ＝Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ　ＮＨ２で表わされる［：　Ｄ　−Ａｔα１５〕−ｈｐＧＲＦ　（１−８２）　−ＮＨ２の合成は、Ｂｅｃｋｍ、ａｎ　９９０　＝ブチド合成機を用いて、ｉＶ　Ｂ　ＨＡ樹脂上で、実施例Ｉに記載の段階法によシ行われた。このにブチドはＴＬＣおよびＨＰＬＣを使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

実施例■ Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｌ　ａ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓ　ｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ｄ−ＡＬａ−Ｇｌｎ−Ｌａｗ−３ｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒ’／ｓ−Ｌｅｗ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ− Ａｓ　ｐ−１１ｅ−Ｍｅ　ｔ−ＮＨ２で表わされるＣ　Ｄ　−Ａｔα１５〕−んｐＧＲＦ（１２７）　ＮＨ２の合成は、Ｂｅｃｋｍａｎ　９９０ペプチド合成磯を用いて、ＭＢＨＡ樹脂上で、実施例■に記載の段階法にょシ行われた。このペプチドはＴＬＣおよびＨＰＬＣを使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

Ｈ−Ｔ　３’　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａ　ｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ　−Ｔ　ｈ　ｒ　−Ａ’ｓ　ｎ−８ｅｒ−Ｔ’／ｒ−Ａｒｇ−Ｌ’／５− Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌ’ｔ−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌ’ ／ｓ−Ｌｅｗ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ　−Ａｓ　ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ　−８ｅ　ｒ−Ａｒ　ｇ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　’／　−Ｈ２で表わさイするｈｐＧＲＦ断片、すなわちｈｐＧＲＦＣｌ−３２）　’ＮＨ２の合成は、Ｂｅｃｋｒｎａｎ、９９０　”プチド合成機を用いて、ＭＢＨＡ樹脂上で、実施例Ｉに記載の段階法によシ行わｎた。この類似体はＴＬＣおよびＨＰＬＣｆ使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

実施例Ｖ次式・Ｈ−Ｔ’１ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｌ　ａ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ− Ａｓ　ｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒ　Ｇｉｎ　−Ｌｅ　ｕ　−８ｅ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｒ　ｇ−Ｌ’／　５−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ａｓｐ−１１ｅ−１ｖｆｅ　ｔ　−ＮＦ２で表わされるｈｐＧＲＦ断片、すなわちｈｐＧＲｐ（ｔ−２７）−ＮＦ２の合成は、Ｂｅｃｋｍ、ａｎ９９０ペプチド合成機を用いて、ＭＢＨＡ樹脂上で、実施例Ｉに記載の段階法にょシ行われた。このペプチドはＴＬＣおよびＨＰＬＣを使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

Ｈ−Ｔ　ｙｒ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａ　ｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｎ　−８ｅ　ｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＬＪｓ　−Ｖａ　１− Ｌｅｒｔ−Ｇｌ　’／−Ｇｌ　ｎ　−Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　５−Ｌｅ　ｕ、−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ａｓ　ｐ−１１ｅ　 −Ｍｅ　ｔ−８ｅ　ｒ−Ａｒ　ｇ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ｇ１　ｙ　−Ｇ　ｌ　ｕ　−８ｅ　ｒ−Ａｓ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ’ｕ−Ａｒ　ｇ　−Ｇ　ｌ　３’　−ＮＦ２で表わされるｈｐＧＲＦ断片、すなわちｈｐＧＲＦ（１−３９） −ＮＩＩ２の合成は、１３ｅｃｋｍａｎ　９９０ペプチド合成機を用いて１．ＭＢＨＡ樹脂上で、実施例Ｉに記載の段階法にょシ行われた。このにブチドはＴＬＣ−ｓよびＨＰＬＣｋ使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

Ｈ−Ｔ’／ｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｒｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＡｓｎＳ　ｅ　ｒ−Ｔｙ　ｒ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ　−Ｖａ　ｌ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｄ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ− Ｌｅｒｂ−Ｇｌｎ　−Ａｓ　ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ　−Ｓ　ｅ　ｒ−Ａｒ　ｇ−Ｇｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｎ−ＧＡ　’ｌ　−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌ’／　ＮＦ２で衣わされるＣＤＡｌａ”３　ｈｐＧＲＦ　（１３９）　ＮＦ２の合成は、ＢｅｃｋｒｒＬａｎ　９９０−！！プチド合成機を用いて、ＭＢＨＡ樹脂上で、実施例■に記載の段階法により行われた。このペプチドはＴＬＣおよびＨｐｒ、ｃ　を使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ＩＩ　ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｎ　−Ｌｅｒｔ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌ’／５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａ　ｓ　ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ　−８ｅ　ｒ−Ａｒ　ｇ　−ＮＦ２で表わされるｈｐＧＲＦ断片、すなわちｈｐＧＲＦ（１−２９）−ＮＦ２の合成は、ＢｅｃｋｒｒＬａｎ　９９０−！！プチド合成磯を用いて、ＭＢＨＡ樹脂上で、実施例Ｉに記載の段階法により行われた。このペプチドはＴＬＣおよびＨＰＬＣｆ使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

合成はクロロメチル化樹脂を使用して繰シ返し行われ、先に示したような遊離ば形の同じペプチドが製造された。

Ｈ−Ｔ’／　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１ｌ　ｅ　−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ　−Ａ　ｓ　ｎ　−８ｅｒ−Ｔ’／ｒ−Ａｒｇ−Ｌ’／５−Ｖａｌ− Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｎ　−２Ｌｅｕ−８ｅ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ−Ｌｙ　５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−にｌ　ｎ　 −Ａｓ　ｐ−１ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ−８ｅ　ｒ　−ＮＦ２で表わされるｈｐＧＲＦ断片、すなわちｈｐＧＲＦ（１−２８）−ＮＦ２の合成は、Ｂｅｃｋｒｒｕｘｎ　９９０−！！プチド合成機を用いて、ＭＢＨＡ樹脂上で、実施例Ｉに記載の段階法により行われた。このにプチドはＴＬＣおよびＨＰＬＣを使用して本質的に純粋であることが確かめられた。

この合成はクロロメチル化樹脂を使用して繰シ返し行われ、実施例Ｉに示したような遊離酸形の同じペプチドが製造された。

実施例Ｉで製造された２種の合成ペプチドは試験管内検定で天然の精製ｈｐＧＲＦと比較きれ、そして同程度のＧＨ分泌効力および固有の生物活性を示すことが見い出された。

各種の合成ペプチドの成長ホルモン放出促進作用を判定するために、合成ｈｐＧＲＦ（１−４０）−ＯＨ（これは天然ペプチドと同等である）を標準として使用して、等モル濃度の合成された種々の類似体および断片と並列比較することにより試験管内検定が行われた。４〜５日前に除去したラット脳下垂体細胞を會む培養物が使用きれた。

成長ホルモンの分泌が最適であると考えられる培養物が、Ｖａｌｅ　らによるＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ’／、９１　、５６２〜５７２に一ジ（１９７２年）に記載の一般方法で比較試験のために使用された。試験すべき物質とのインキュベーションは３〜４時間行われ、そして培地のアリコートｅ採取して処理し、免疫反応性ＧＨ（ｉｒ　ＧＨ）におけるそれらの含有量を放射線免疫検定法で測定した。

ＡｐＧＡ’Ｆ（１４０）ＮＦ２　１１０％ｈｐＧＲＦ（１８２）ＮＦ２　１４０％ｈｐＧＲＦ（１−２９）ＮＦ２　２３０％ｈｐＧＲＦｃ１−２９）−ＯＨ２９％ｈｐＧＲＦ１１２７）ＮＦ２　２０％これらの合成ペプチドの試験管内試験は、そのＥＣ，。

が２θ〜１００ピコモルの範囲であシ、かつ最低有効濃度が３〜８ピコモルであることを示した。ｈｐＧＲＦｃｌ−４０）−ＮＦ２についての最大有効濃度は約１ナノモルであった。

成長ホルモン分泌に関する試験頁内試験に加えて、生体実験が自由に走り回る正常な雄ラットに挿入したカテーテルを介して合成ペプチドを注入することにより行われた。ラットは外因性のＧＲＦへの応答に影響を及ぼすことなく、ＧＨの自然分泌を抑制するドパミンヒドロキシラーゼ阻害剤、ＦＬＡ−６３で前処理された。同じカテーテルを介して血液試料が注入直前、注入後５分３よび注入後２０分に採取ζｎ１血液中のＧＨ量が放射線免疫検定法で測定された。その結果は合成ｈｐＧＲＦ（１−４０）　ＮＨ２およびその他の類似体が脳下垂体ＧＨ分泌の強力な刺激剤であることを示した。体重ｌｋ、９あたり約４０ナノグラムないし約２５マイクログラムの投与量が有効であるとわかった。

さらに、試験は実施例１．　ｎ、ＩＩＩおよび■で合成された合成ｈｐＧＲＦ類似体がｈｐＧＲＦ（１−４０）−０ＨＯ固有の生物学的活性を示すことを立証した。

合成ｈｐＧＲＦ被ブチドは医師がＧＨ産生を高めることを望む場合の用途に対して有用であるだろう。このようなｈｐＧＲＦペプチドによるＧＨ分泌の刺激は、内因性ＧＲＦの産生低下が原因でおこる完全な丑たは相対的なＧＨ不足をかかえる患者にとって興味のあることである。

きらに、ＧＨ分躬の増加ならひにそれに伴っておこる成長促進は、正常のＧＨレベルを有するヒトｉたは動物にも一般に認められる。その上、んｐａＲｐ−ｓｒプチドの投与は体内の脂肪言有量を変化させ、かつ他のＧＨに依存する代謝過程、免疫過程および発生過程を改変するだろう。

例えば、ｈｐＧＲＦ梨プチドは火傷を負った状況下にあるヒトの同化過程を刺激するのに有効であるかもしれない。

他の例では、んｐＧＲＦ−ｅブチドはニワトリ、ブタ、ウシおよびヒツジなどの商業動物の飼育においてその成長を促進させて得られる蛋白質河脂肪の地金増加させるのに有効であるだろう。ヒトへの投与に対しては合成ｈｐＧＲＦＫブチドは少なくとも約９３％、好ましくは少なくとも９８％の純度をもつべきである。

この純度は意図したペプチドが存在する全ての類似ペプチドおよび波ブチド断片の弄示した重量係を構成することを意味する。

成長促進および脂肪量の低下を目的として合成ｈｐＧＲＦ−’プチドを商業動物捷たはその他の動物へ投与するためには、約５％程度に低い純度１だは０．１％程度に低い純度ではえも許容されるかもしれない。

医薬組成物を形成するために薬学的に受容される担体と組合わされた合成ｈｐＧＲＦ被プチドまたはその無毒性塩は、ヒト＝含む動物へ静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内寸たは（有効なカップラーや担体が開発される時には）経口的にさえも投与することができる。本明細書において使用する゛薬学的に受容される”という表現は、”獣医学的に受答される”という意味を包含すると理解されるべきである。治療を受ける患者がＧＨ放出の治療処置を必要とする場合、そのＧＨ放出を刺激するための投与は医師によシ行われる。必要とされる投与量は治療すべき個々の症状、その症状の程度および希望する治療存続期間によって変化するだろう。

このようなペプチドは酸付加塩または金属錯体（例えば亜鉛や鉄との錯体、本出願においてはこれらを塩と考える）などの薬学的に受答される無毒性塩の形でしばしば投与される。このような酸付加塩の例には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コ・・り酸塩、リンゴ酸塩、ア６スコルビン酸塩および酒石酸塩などがある。活性成分が錠剤の形で経口的に投与される場合に、その錠剤はトラガカント、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含むことができる。液体での投与が望まれる場合に、甘味剤および／またはフレーバー剤が用いられ、そして等優良塩液育たは燐酸緩衝液での静脈内投与が行われる。

４プチドは医師の指導のもとてヒトに投与されるべきであシ、そして医薬組成物は通常薬学的に受容される担体と共にペプチドを富有するだろう。一般的に、非経口投与量は患者の体重１に、９あたり約４０ナノグラムないし約２５マイクロダラムのペプチドであるだろう。

当該技術分野において通常の知識を有する者には明らかなように、各種の変更や修正がここに添付の請求の範囲で説明される本発明の範囲から逸脱することなく行われうろことは理解されるだろう。例えば、Ｋブチド鎖における修正、特にペプチドのカルボキシル末端で始丑る欠失は今日１ての既知の実験的プラクテイスに従って行われてペプチドの効力の全部まだは実質的部分を保有する断片が製造され、そしてこのようなペプチドは本発明の範囲内であると考えられる。１位から２７位までのアミノ酸残基９列またはそれらの同等物は存在すべきであると思われるが、その配列内のいくら刀・の欠失は可能であるかもしれない。式らＶこ、付刀口が一方の末端で、または両方の末端で可能であシ、そして／ｌたはペプチド化学の分野において周知でおるごとく、天然に存在するアミノ酸残基の代りにほぼ同等のアミノ酸残基を使用して、本発明ペプチドの効力の少なくとも実質的部分を有する類似体を本発明の範囲から逸脱することなく製造することも可能である。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】（１）次式：％式％〔式中、Ｒ４０はＡｔαまたはデス−Ｒ４ｏ″′Ｃあシ、ＹはＣ−末端アミノ酸残基のカルボキシル部分を意味してＣ０ＯＲ＋、ＣＡｌ＋０１ＣＯＮＨＮＨＲｒ、ＣＱ７Ｖ（Ｒ＋）（Ｒ２）または−ＣＨ２０Ｒ，であシ、ここでＲ１およびＲ２は低級アルキル基または水素原子である〕で表わされる合成４プチド、またはその生物学的に活性な断片、もしくはその無毒性塩。（２）Ｙは一〇〇ＮＨ２、特許請求の範囲第１項に前記の合成波プチド。（３）　Ｒ４０はＡＸαである請求の範囲第２項に記載の合成べＨ−Ｔ　’／　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓｎ　−Ｓ　ｅ　ｒ　−Ｔ　ｙ　ｒ−Ａｒ　ｇ−Ｌ’／　５−Ｖａ　ｌ　 −Ｌ　ｅ　ｕ−ＲＩ５−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｌｅｕ−８ｇ　ｒ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ− Ｌｙ　５−Ｌｅｒｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ　−Ａｓｐ−１ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　’／　−Ｙ〔式中、Ｒ１，はＧｌｙまたはＤ　−Ａｌαであシ、アミノ酸残基２８ないし３２のうちのいずれかまたは全部が欠失されてもよく、ＹはＣ−末端アミノ酸のカルボキシル部分を意味して −ｃｏＮｃＲｒ）　（＆）であシ、ここでＲ８およびＲ２は低級アルキル基または水素原子である〕で表わされる合成４プチド、またはその無毒性塩。（５）アミノ酸残基３０ないし３２は欠失される請求の範囲第４項に記載の合成４プチド。（６）Ｙは−ＣＯＮＨ２、特許請求の範囲第４項に記載の合成ペプチド。（７）　ＲｒｓはＧｌｙである請求の範囲第４項ないし第６項のいずれかに記載の合成４プチド。（８）　ＲＩｓはＤ　−Ａｔαである請求の範囲第４項ないし第６項のいずれかに記載の合成ペプチド。（９）請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記載の釡成ペプチドの有効量と、そのための受容される液体または固体の担体とから成る動物における成長ホルモンの放出を刺激するための組成物。叫　請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記載の合成波プチドの有効量を動物に投与することから成る、動物における成長ホルモンの放出を刺激する方法。 α１）請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記載の合成４プチドの有効量をヒト以外の動物に投与することから成る、上記動物の成長を促進する方法。Ｃ２（α）式（■）：Ｘ’−Ｔ’／　ｒ　ＬＹ２）　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａ　ｓ　ｐ　（、￥３）　−Ａ　ｌ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ　−’Ｊ’ｈ　ｒ　（、￥’）　−Ａｓ　ｎ　（Ｘ’　）　−８ｅ　ｒ　（Ｊｌ”）　−Ｔ’／　ｒ　ＬＹ２）　−Ａｒｇ３０（￥６）　−Ｌ’／　ｓ　（￥７）　−Ｖａ　ｌ　−Ｌ　ｅ　ｕ＝Ｄ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　ｌ　ｎ　（、￥’）−Ｌｅｒｂ−８ｅｒ　（、Ｙ’）−Ａｌａ−Ａｒｇ　（￥６）　−Ｌ’／ｓ　（Ｘ’）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ　（￥５）− Ａｓｐ　ＣＸ３）　−１ｌ　ｅ　−Ｍｅ　ｔ　−８ｅ　ｒ　ＣＸ’）　−Ａｒ　ｇ　（、￥’）　−Ｇ　ｌ　ｎ　（、￥５）　−Ｇ　ｌ　ｎ　（￥５）　−Ｇｌ ’／　−Ｇ　ｌ　ｕ　（、￥３）　−８ｅ　ｒ　（￥４）　−Ａｓ　ｎ　（￥５）−Ｇｌ　ｎ　（￥５）−Ｇｈｔ（、￥３）　Ａｒｙ　（￥６）　ＧＩ　Ｙ　Ｒｈｏ　￥８〔式中、Ｘｌ、￥２、￥３、￥４、￥５、￥６および￥７はそれぞれ水素原子または保護基であり、￥８は保護基、または樹脂支持体への定着結合、もしくはデス−Ｘ８　（この場合にＣ−末端のアミノ酸残基はカルボキシル部分Ｙをもつ）であり、Ｒ４ｏおよびＹは下記定義の通シである〕で表わされかつ少なくとも１個の保護基を有するペプチドを製造し；（ｂ）　式（ＩＩ）で表わこれる上記波プチドから１個またはそれ以上の保護基もしくは定着結合を切り離し：そして（ｃ）　所望により、得られたペプチドをその無毒性付加塩に転化する；ことから成る、式（Ｉ）　：　Ｈ−Ｔｙ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　７ｙ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｈｒ　−Ａ　ｓ　ｎ−８ｅ　ｒ−Ｔ’ｔ　ｒ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ　−Ｖａ　ｌ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−Ｄ−Ａ　ｌ　ａ７Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌ　ｅ　ｕ−８ｅ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ　＝Ａｒｇ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｌ　ｅ　ｗ−Ｇ’ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−１ｌ’ｅ　−Ｍｅ　ｔ　−３ｅ　ｒ　−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇ１３／−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ −Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｒ４４，−Ｙ〔式中、ＲｌｏはＡｌａまたはデス−＆であシ、ＹはＣ−末端アミノ酸残基のカルボキシル部分を意味シて −ＣＯＯＲ＋　、　ＣＲＩＯ，Ｃ０ＮＨＮＨＲ＋、　Ｃ０Ｎ（Ｒ＋　）　（Ｒ２）　または−ＣＨ２０Ｒ，であり、ここでＲ１およびＲ２は低級アルキル基または水素原子である〕で表わされる化合物の製造方法。Ｕ　Ｒ，、ｏはＡｌａである請求の範囲第１２項に記載の方法。（Ｍｌ　Ｙは−Ｃ０ＮＨ２、特許請求の範囲第１２項または第１３項に記載の方法。（至）（ｄ）　式（■）：Ｘ’−Ｔｙｒ　（￥２−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ　（Ｘ３ンーＡ　ｌ　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ　−Ｔｈｒ　（、Ｙ’）　＝Ａｓｎ　（、Ｙ’）−８ｅｒ　（、Ｙ’ ）−Ｔｙｒ　（￥２）　−Ａｒｇ（￥６）　Ｌ’１Ｂ（￥７）　Ｖａｌ　Ｌｅｒｔ　Ｒ＋ｓ　Ｇｌｎ（Ｘ’）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ　（、Ｙ’Ｊ−Ａｌａ−Ａｒｇ　（Ｘ’）　−Ｌｙｓ　（、￥７）　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ　（、￥５）− Ａｓｐ　（￥３）　−１１ｅ　−Ｍｅ　ｔ　−８ｅｒ　（、￥’）−Ａｒｃｉ（￥６）　−ＧｌｎＣＸＪ−ＧｌｎＡＸ５）　−１ｙ−￥８〔式中、Ｘｌ、￥２、￥３、￥４、￥５、￥６および￥７はそれぞれ水素原子または保護基であり、￥８は保護基、またけ樹脂支持体への定着結合、もしくはデス−Ｘｓ　（この場合にＣ−末端のアミノ酸残基はカルボキシル部分Ｙをもつ）であり、Ｒ１５およびＹは下記定義の通シである〕で表わされかつ少なくとも１個の保護基を有する扱ブチドを製造し；（ｂ）　式（ＩＩ）で表わされる上記ペプチドから１個またはそれ以上の保護基もしくは定着結合を切シ離し；そして（ｃ）　所望により、得られたペプチドをその無毒性付加２塩に転化する；ことから成る、式（■）：Ｈ−Ｔｙｒ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａ　ｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ−４Ｊ’ｈｒ　−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔ’／ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、−Ｒ，、−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ａｒ　ｇ −Ｌ’／　５−Ｌｅ　ｗ−Ｌｅ　ｕ　−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−１ｙ−Ｙ〔式中、Ｒ１，はＧｌｙまたはＤ−Ａｌａであシ、アミノ酸残基２８ないし３２のうちいずれかまたは全部が欠失されてもよく、ＹはＣ−末端アミノ酸残基のカルボキシル部分を意味して−ＣＯＮ＜Ｒ，）（Ｒ２）であり、ここでＲ１１６よびＲ２は低級アルキル基または水素原子である〕で表わされる化合物の製造方法。 αＱ　アミノ酸残基３０ないし３２は欠失される請求の範囲第１５項に記載の方法。 σで　アミノ酸残基２８ないし３２は欠失される請求の範囲第１５項に記載の方法。（（２）Ｙは−Ｃ０ＮＨ２、特許請求の範囲第１６項またけ第１７項に記載の方法。（イ））　Ｒ＋ｓはＤ−Ａｌａである請求の範囲第１６項ないし第１８項のいずれかに記載の方法。ｃ２ｏ）　ｘ’は水素原子またはα−アミノ保護基であり；￥２は水素原子またはＴｙｒのフェノール性水酸基のための保護基であシ；￥３は水素原子、もしくはＡｓｐまたはＧｌｕＯカルボキシル基のための保護基であり；￥４は水素原子、もしくはＳｅｒまたはＴんｒのアルコール性水酸基のだめの保護基であシ；Ｘ５は水素原子、もしくはＡｓｎ”ＪたはＧｌｎの側鎖アミド基のための保護基であシ；￥６は水素原子またはＡｒｇのり゛アニジノ基のたぬの保護基であシ；￥７は水素原子またばＬ’ｓの側鎖アミノ基のための保護基であり；そして少なくとも１個のＸ基は保護基であるが、あるいは樹脂支持体を含む、請求の範囲第１２項または第１５項に記載の方法。Ｃ２１）　Ｘ’　ｔｒｉＢＯｃＸＸ２はＤＣＢＸＸ３は０ＢＺｔ、　Ｘ’はＢｉｔ、　￥５はＸａｎ、　￥６はＴｏｓＸＸ７ｕ２−りＯＯベンジルオキシカルボニル基、￥８は−ＮＨ−樹脂支持体である請求の範囲第２０項に記載の方法。し４　次式：％式％（５））（３（１３４〔式中、アミノ酸残基２８ないし４０のうちいずれかまたは全部が欠失されてもよ〈：Ｘ′は水素原子またはα−アミノ保護基であり；Ｘ２は水素原子またはＴｙｒの７エノール性水酸基のための保護基であシ；Ｘ３は水素原子、もしくはＡｓｐまたはＧｌｕＯカルボキシル基のための保護基であシ；Ｘ４は水素原子、もしくはＳｅｒまたはＴｈｒのアルコール性水酸基のための保護基であり；Ｘ５は水素原子、もしくはＡｓｎまたはＧｉｎの側鎖アミド基のための保護基であり；Ｘ６は水素原子またはＡｒｇのグアニジノ基のための保護基であり；Ｘ７は水素原子またはＬｙｓの側鎖アミノ基のだめの保護基であシ：Ｘ８はα−カルボキシル基のための保護基、樹脂支持体への定着結合、またはデス−Ｘ８であり、デス−Ｘ８である場合にＣ−末端アミノ酸残基のカルボキシル部分は−ＣＯＯＲ，、−ＣＲ，Ｏ，−ＣＯＮＨＮＨＲＩ　、−ＣＯＮＣＲ，）　（Ｒ２）ｔたは−ＣＨ２０Ｒ＋＜ここでＲ゛１およびＲ２は低級アルキル基または水素原子である）である；但し少なくとも１個のＸ基は保護基であるか、あるいは樹脂支持体を含む〕で表わされるペプチド中間体。