SU1426455A3

SU1426455A3 - Способ получени пептидов

Info

Publication number: SU1426455A3
Application number: SU843750475A
Authority: SU
Inventors: Эдуард Фредерик Ривье Жан; Шпис Йоахим; Уолкер Вейл Вили
Original assignee: Дзе Салк Институт Фор Биолоджикал Стадиз (Фирма)
Priority date: 1982-10-04
Filing date: 1984-06-01
Publication date: 1988-09-23
Also published as: IE56175B1; PH20333A; NZ205745A; MX7701E; NO167866B; WO1984001379A1; YU45575B; KR850003417A; NO167866C; KR900006712B1; IL69897A; GR79698B; US4563352A; DE3369144D1; EP0105759A2; IE832333L; NO842148L; FI842166A; ES526201A0; RO91186A

Abstract

Изобретение касаетс производства синтетических пептидов, в частности получени соединений общей формулы Н.ТуГ-А1a-Asp-Alа-IIe-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-DAla-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Q, где Q NH,; или Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- -Gly NH , которые могут быть использованы в медицине. Цель- - создание новых укороченных пептидов с низкой токсичностью, способных стимулировать выделение гормона роста. Их синтез ведут реакцией трет-бутилокси- карбонил-Gly с п-метилбензгидриламингидрохлоридной смолой с последующим удалением защитной группы и дальнейшим наращиванием пептидной цепи в соответствии с аминокислотной последовательностью , отвечающей указанной формуле. Затем от полученной пептидной смолы общей формулы X ,Tyr(Xj)- -А1а-Азр(Хз)-А1а-11е-РЬе-ТЬг(Х4)- -Asn(Xi)-Ser(X4)-Tyr(Xi)-Arg(X)- -Lys(X)-Val-Leu-DAla-Gln(Xs)-Leu- -Ser(X4)-Ala-Arg(X4)-Lys(X,)-Leu- -Leu-Gln(X5)-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X4)- -Arg(Xg)-Gln(Xj)-Gln(X5)-Gly-W, где W Xg или -Glu(Xj)-Ser(X)-Asn(Xj- -Gln(Xp-Glu(X5)-Arg(Xj)-Gly-Xg ; X, - тpeт-бyтилoкcикapбoнилj X - 2,6-дихлорбензил; Хз - бензиловый зфиpj X - бензил; X5 - ксантил; X,- толуолсульфоНИЛ; -, - дихлорбензил- оксикарбонил; X g - остаток п-метил- бензгидриламиногидрохлоридной смолы, отщепл ют трет-бутилоксикарбонильную группу обработкой СН jCOOH в среде хлористого метилена. Далее провод т деблокирование и отщепление полимерной смолы с помощью обработки продукта HF в присутствии амизола. Новые пептиды по активности близки к человеческому гормональному вьщелитель- ному фактору (1-44)NH, но более до- ступны, т.к. могут быть получены синтетическим путем. 1 табл. а «о сл с и 1С в5 4 СП СЛ

Description

11

Изобретение относитс к способу получени пептидов .- новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретени - способ получени новых синтетических укороченных пептидов, малотоксичных соединений, обладающих способностью стимулироват выделение гормона роста.

Пример 1. Синтез пептида (D-Ала) - человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор (1-39)-NH2, имеющего формулу

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-DAla-Gln-Se -Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile -Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn -Gln-Glu-Arg-Gly-NH

осуществл ют ступенчатым образом, ис пользу пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидриламин- гидрохлоридной смоле, такой, какую поставл ет фирма Bachem. Inc., имеюще пределы замещени примерно 0,1- 0,5 млмоль/г смолы. Св зывание трет- -бутилоксикарбонил-Gly с 2 г смолы осуществл ют общим способом, в схемах А и В, которые используют во всем синтезе, и это дает замещение примерно 0,35 млмоль СЛу на грамм смолы. Все используемые растворители тщательно обезгаживают путем продувки инертным газом, например гелием или азотом, чтобы гарантировать отсутствие кислорода, который может нежелательно окислить серу остатка Met.

После сн ти защиты и нейтрализа- ции пептидную .цепь выстраивают ступенька за ступенькой на смоле. Сн тие защиты, нейтргшизацию и добавление ка сдой аминокислоты осуществл ют в соответствии со способом по схемам А и В.

Сн тие защиты предпочтительно осуществл ть согласно схеме А.

Реагент

60% трифторуксусной

кислоты / 2% этандитиола

60% трифторуксусной

кислоты / 2% этандитиола

Изопентанол / 1% этадитиола

Триэтиламин (10%) в

МеОН

Триэтиламин (10%) в

CHjCl

МоОН (дважды)

(дважды)

Св зьшание предпочтительно осуществл ть согласно схеме В:

Реагент

Врем смешивани , мин

5

0 5

5

0 5

0

5

N,N -Дициклогексилкарбодиимид- Трет-бутилоксикарбонил-аминокислота50-90

МеОН (дважды)0,5

(дважды)0,5 (3 моль/л) в

CHjCli ,15,0 .

-CHiClj0,5

МеОН0,5

(дважды)0,5

От одного до двух млмолей аминокислоты , защищенной трет-бутилокси- карбонидом, в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом 1,0 мол рного 30 N,N -дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене в течение двух часов, При св зывании трет-бутилоксикарбо- нил-Arg (толуолсульфонил) используют смесь 50% диметилформамида и хлористого метилена..Бензиловый эфир используют в качестве гидроксильной защитной группы боковой цепи дл Ser и Thr. Паранитрофениловый сложный эфир используют дл активации карбоксильного конца Asn или Gin, и, например , трет-бу,тилоксикарбонил-Азп (па- ра-нитрофениловый эфир) св зывают в течение ночи, использу один эквивалент бутилового спирта в 50%-ной смеси диметилформамида и хлористого метилена, причем в этом случае добавл ют дициклогексилкарбонид. Аминогруппу Asn или Glu защищают ксанти- лом, если вместо способа активного эфира используют дициклогексилкарбо- нильное св зывание. Дихлорбензилокси- карбонил используют в качестве защитной группы дл боковой цепи Lys. Толуолсульфонил используют дл защиты гуандиновой группы Arg, а карбоксильную группу Gly или Asp защищают бензилом. Фенольную гидроксильную группу Tgr защищают 2,6-дихлорбензи- лом. В конце синтеза получают пептид

следующего состава X ,-Туг(X2)-Лla- -Asp(X,,)-Ala-I e-Phe-Thr(X4)-Asp(X)- .-Ser(X4)-Tyr(X7)-Arg(X)-Lys(X,)- I -Val-Leu-DAla-Glu(X5)-Leu-Ser(X4)- -Ala-Arg(Xj)-Ly5(X,)-Leu-Leu-Gln(Xj)- Asp(X )-lle-Met-Ser(XO-Arg(XJ- Gln(Xp-Gln(X5)-Gly-Glu(Xз)-Ser()- -Asn(Xi)-Gln(XJ)-Gly(Xp-Arg(X)- -Gly(Xj),

где XT - трет-бутилоксикарбонил, 2,6-дихлорбензил, Xj - бензиповьй эфир, X 4 - бензил, Xj - ксантил, Х - толуолсульфоиил, Х, - дихлорбензилок- сикарбонил, Xj - NH-смол ной носи тель. Ксантил может быть частично или полностью удален обработкой три- фторуксусной кислотой, используемой дл удалени (/-аминозащитной группы.

10

15

фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществл ют с помощью гр диента GHjCN в 0,1%-ной трифторукс ной кислоте. Центральный срез зате лиофилизирутот, получают 107 млг це левого пептида, чистота которого о ло 100%. Величина оптического вращ ни чистого пептида rf D -56,3. Пример 2. GHHTCS пептида D-Aлa J- человеческий панкреатический гормональный вьвделительный фактор (1-32)-NH2, имеющего формул

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu- -Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-6ly-N

осуществл ют ступенчатым образом,

После св зывани со смолой послед-20 пользу пептидный синтезатор Бекмай 990, на параметилбензгидрилами новой смоле по примеру 1. Получают 96,5% пептида 96,5%-ной чистоты пр использовании тонкостенной хромато

него остатка Туг, трет-бутилоксикарбонил удал ют 60%-ной трифторуксус- ной кислотой в -j и получают 3,4 г зап1 1щенной пептидной смолы. Дл отщиплени защитных групп.с остального защищенного пептида-смолы, его обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода на грамм пептида-смолы при -20 С в течение получаса и при в течение получаса. После удалени фтористого водорода под высоким вакуумом остаток смолы-пептида промывают попеременно сухим диэтиловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экст- рагирук т обезгаженным 2 н.водным раствором уксусной кислоты и отдел ют от смолы фильтрованием.

ОтщепленньБ и лишенный защиты пептид затем раствор ют в 0,5%-ной уксусной кислоте и подвергают его очистке, котора может включать тонкую гель-фильтрацию на Сефадексе G-50. Получают около 1,62 г пептида.

Затем пептид подвергают дальнейшей очистке с помощью препаративной или полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Кассетную установку Water Associates prep. h. G-500 заполн ют на 17 микрон Gfg кремнезом, поставл емым фирмой Vudas ЗООА. Градиент CHjGN в ТЕАР создают с помощью градиентног о маркера низкого давлени Eldex. Хромато- графические фракции тщательно отбирают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и собирают только фракции, обладак цие значительной чистотой. Обессоливание очищенных

фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществл ют с помощью градиента GHjCN в 0,1%-ной трифторуксус- ной кислоте. Центральный срез затем лиофилизирутот, получают 107 млг целевого пептида, чистота которого около 100%. Величина оптического вращени чистого пептида rf D -56,3. Пример 2. GHHTCS пептида D-Aлa J- человеческий панкреатический гормональный вьвделительный фактор (1-32)-NH2, имеющего формулу

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Leu- -Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-6ly-NHj,

осуществл ют ступенчатым образом, использу пептидный синтезатор Бекмай 990, на параметилбензгидрилами- новой смоле по примеру 1. Получают 96,5% пептида 96,5%-ной чистоты при использовании тонкостенной хроматографим и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Величина оптического вращени составл ет fo/jD -57,9°.

Пример 3. Gинтeз фрагмента

человеческого панкреатического гормонального выделительного фактора, т.е. человеческого панк15еатического гормонального выделительного фактора (1- 32)-МН г, формулы

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- -Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH,

осуществл ют ступенчатым образом, использу пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидриламино- вой смоле по примеру 1. Этот аналог признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример Д. Gинтeз фрагмента человеческого панкреатического гормо- нального выделительного фактора, т.е. человеческого панкреатического гормонального вьщелительного фактора (1- 39)-NH j, имеющего формулу

-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- -Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Ile- -Met-Ser-Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Ser-Asn- -Gln-Gly-Arg-Gly-NH,

осуществл ют ступенчатым образом, использу пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидриламино вой смоле по примеру 1. Пептид признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии .

Пример 5. Синтез пептида D-Ала - человеческий панкреатический гормональный выделительный фак- т.ор (1-39)-NH2, имеющего формулу

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ale-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- -Sep-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- -Glu-Ser-Asn-Gln-Gly-Arg-Gly-NH, осуществл ют ступенчатым образом, использу пептидный синтезатор Бек- ман 990, на параметилбензгидрилами- новой смоле по примеру 1, Пептид признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии . Проведены биологические испытани полученных соединений.

Дл определени эффективности различных синтетических пептидов при стимул ции выделени гормона провод т анализы in vitro, использу в качестве стандарта синтетический человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор

Кроме испытаний in vitro на секрецию гормона роста, проводили также эксперименты in vivo путем введени синтетического пептида через вживленный катетер в свободно бегающих нормальных самцов крыс, Ж 1вотных предварительно обрабатывают FL А-63, ингибитором допаминовой гидроксилазы, который подавл ет спонтанную секрецию гормона роста, не вли на реакцию к экзогенному гормональному выде (hpGRF(1-40)OH, поскольку он вл ет- ..елъному фактору. Образцы крови бес эквивалентом нативного пептида) при параллельном сравнении с эквимо- л рными концентраци ми природного hpGRF(1-44)КНт и различных других

40

синтезированных аналогов.

Используют культуры, которые включают клетки -гипофиза крысы, удаленного за четыре или п ть дней до этого . Культуры, которые считаютс оптимальными дл выделени гормона рос- 45 та, используют дл сравнительного испытани . Инкубирование испытываемого вещества осуществл ют в течение 3-4 ч, после чего берут аликвоты культураль- ной среды и обрабатывают, чтобы измерить содержание в них иммунрреакци- онного гормона роста хорошо известным способом, радиоиммуноанализа.

Результаты сравнительных испытаний в виде протокола приведены в таблице.

В таблице дан уровень гормона роста в образцах клеточных культур методом радиоиммунного анализа.

рут через этот же катетер непосредственно перед инъекцией и через 5 и 20 мин после HeeJ уровни гормона роста в крови измер ют с помощью радиоиммуноанализа . Результаты показывают, что синтетические пептиды, полученные предлагаемым способом, вл ютс мощными стимул торами секреции питуи- тарного гормона роста и сравнимы по активности с природными гормональными вьщелительными факторами.

Таким образом, проведенные испытани показали, что соединени , полученные предлагаемым способом, вл ютс малотоксичными биологически активными соединени ми, способствующими секреции гормона роста, по активнос- 55 ти они близки человеческому гормональному вьделительному фактору (1-44)Ш5, но доступнее его, поскольку содержат в своей цепи меньшее число аминокислотных остатков (32 и 39)

50

5

0

5

0

При проведении испытаний используют клетки типа PAP/GRF, Культурна среда: 2% FCS + 5 DEX(/5-PI) + Среда инкубировани : 0,1% бис-(тр1тетил- силил)-ацетамид f аскорбинова кис- лота/HDMe;(термин FCS означает эмбриональную тел чью сьгооротку DEX - дексаметазонj термин РАР означает крысиную переднюю долю гипофиза и показывает, что при испытании использовали первичные культуры клеток передней доли гипофиза крысы),

Испытани in vitro этих синтетических пептидов показьгоают, что эффективна концентраци , дающа 50%- ный эффект (, измен етс от 20 до 100-пикомол рной, а сама низка эффективна концентраци составл ет 3-8 пмоль в литре. Максимальна эффективна концентраци дл человечес кого панкреатического гормонального выделительного фактора была примерно 1-наномол рной.

Кроме испытаний in vitro на секрецию гормона роста, проводили также эксперименты in vivo путем введени синтетического пептида через вживленный катетер в свободно бегающих нормальных самцов крыс, Ж 1вотных предварительно обрабатывают FL А-63, ингибитором допаминовой гидроксилазы, который подавл ет спонтанную секрецию гормона роста, не вли на реакцию к экзогенному гормональному выде ..елъному фактору. Образцы крови бе ..елъному фактору. Образцы крови берут через этот же катетер непосредственно перед инъекцией и через 5 и 20 мин после HeeJ уровни гормона роста в крови измер ют с помощью радиоиммуноанализа . Результаты показывают, что синтетические пептиды, полученные предлагаемым способом, вл ютс мощными стимул торами секреции питуи- тарного гормона роста и сравнимы по активности с природными гормональными вьщелительными факторами.

Таким образом, проведенные испытани показали, что соединени , полученные предлагаемым способом, вл ютс малотоксичными биологически активными соединени ми, способствующими секреции гормона роста, по активнос- ти они близки человеческому гормональному вьделительному фактору (1-44)Ш5, но доступнее его, поскольку содержат в своей цепи меньшее число аминокислотных остатков (32 и 39)

и могут быть получены синтетическим путем.

Claims

Формула изобретени

Способ получени пептидов общей формулы I

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- -Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-nAla-Gln- -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Q,

I

где Q - NH -i или Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-NHj ,

отличающийс тем, что тpeт-бy ГилoкcикapбoншI-Gly ввод т во взаимодействие с параметилбензгид- риламингидрохлоридной смолой, уда--: л ют защитную группу и затем провод т постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с аминокислотной последовательностью, отвечающей соединению общей формулы I, и от. полученной пептидной смолы общей формулы II

X, Туг(Xj)-Ala-Asp(Х)-Ala-Ile-Phe- -Thr(X4)-Asn(Xj)-Ser(X)-Tyr(X2)- -Arg(X)-Lys(X7)-Val-Leu-DAla-Gln(Xj)- -Leu-Ser(X4)-Ala-Arg(Xt)-Lys(X7)- -Leu-Leu-Gln(Xj)-Asp(X3)-Ile-Met- -Ser(X4)-Airg(X)-Gln(Xj)-Gln(Xp- -Gly-W,

где W - Xg или -Glu(X3)-Ser(X)- -Asn(Xj)-Gln(Xy)-Glu(X p- -Arg(Xt)-Gly Xj, X,- трет-бутилоксилкарбонил; Xj- 2,6-дихлорбензил; Xj- бензиловый эфир; бензил; Xj- ксантил Х -толуолсульфонил, Х,- дихлорбензилоксикарбонил; Xg- остаток параметилбензгидриламингидрохлоридной смолы отщепл ют трет-бутилоксикарбонильную группу обработкой трифторуксусной кислотой в хлористом метилене и за- тем провод т деблокирование и отщепление полимерной смолы обработкой полученного продукта фтористым водородом в присутствии анизола.