FI105816B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

105816

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää uusien peptidien val-5 mistamiseksi, joilla on insuliinivaikutus ja jotka sopivat diabetes mellituksen hoitoon.

Insuliinit koostuvat kahdesta polypeptidiketjusta, A-ketjusta, joka sisältää 21 aminohapporyhmää, ja B-ket-justa, jossa on 30 aminohapporyhmää. A- ja B-ketju ovat 10 liittyneet yhteen kahden disulfidisillan välityksellä, jolloin kysteiiniryhmät asemassa A7 ja B7 sekä A20 ja B19 ovat liittyneet toisiinsa. Kolmas disulfiäisiltä on välillä A6 - Ali. Eläinten ja ihmisten insuliineja muodostuu haimassa preproinsuliineina. Ihmisen preproinsuliini muo-15 dostuu esimerkiksi esipeptidistä, jossa on 24 aminohappo-ryhmää, siihen liittyy proinsuliini, jossa on 86 aminohapporyhmää ja jolla on seuraava konfiguraatio: esipeptidi-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, jolloin C on aminohappoketju, jossa : on 31 ryhmää. Langerhansin saarekkeista erittymisen aikana • · · 20 esipeptidi lohkeaa ja syntyy proinsuliinia. Sen jälkeen C- : ketju lohkeaa proteolyyttisesti ja syntyy tehokas ihmisen ; insuliini.

• « · ·

Insuliinilla on suuri määrä vaikutuksia insuliinil- M · le herkkään kudokseen. Silmiinpistävä vaikutus on nisäk- • « « 25 käiden glukoosipeilin nopea aleneminen, kun käytetään in- ... suliinia. Tämä saa aikaan glukoosin nopean oton verestä » ♦ *** lihas- ja rasvasolujen välityksellä. Insuliini aktivoi • · ·;·’ lisäksi glykogeenisyntetaasia ja estää lipolyysiä. Insu- liini edistää proteiinisynteesiä aminohapoista ja vahvis-30 taa glykokinaasin ja fosfofruktokinaasin induktiota ja • · · estää tiettyjen glukoneogeneesin entsyymien, esimerkiksi • · ♦ ’·* ] pyruvaattikarboksylaasin ja fruktoosidifosfataasin muodos tumista.

Tyypin II diabetekseen, ei insuliinista riippuvaan 35 diabetekseen, kuuluu perifeerisen kudoksen kuten lihas- 2 105816 tai rasvakudoksen insuliiniresistenssi. Siten vähentynyt glukoosin hyväksikäyttö aiheutuu glukoosinkuljetuksen ja sitä seuraavien metabolisten prosessien puuttuvasta insu-liinistimulaatiosta. Tähän moninkertaiseen resistenssiin 5 voi liittyä häiriö reseptoritasolla ja reseptorin jälkei sellä tasolla, eli ennen "second messenger'in" tuottamista (Garvey, Diabetes/Metabolism Reviews, 5, (1989), 727-742).

Nyt keksittiin yllättävästi, että lyhyillä peptideillä voi olla insuliinivaikutus ja ne sopivat diabetes 10 mellituksen hoitoon.

Keksintö koskee siten menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava II, 15 X-Q-Cys-D (II) jossa Q on Tyr, TyrtR1), Phe(R2), Trp (R2) tai Nai, • · : D on Asp, Asn, D-Asp, D-Asn, β-Ala tai atsagly-NH2, ja : ·.* 20 X on a) vety, b) R'-co, j .·. c) (C1-C18)-alkoksi-CO, « · · · d) (C3-C18) -sykloalkoksi-CO tai * · t·;., e) (C6-C14) aryyli-(Cj^-Ca)-alkoksi-CO, * 2 5 R1 on 1.1 (Ci-Cxg)-alkyyli, *···* 1.2 (C3-C18) -sykloalkyyli, ···' 1.3 (C6-C14)-aryyli, ·*·., 1.4 (C6-C14)-aryyli, joka on substituoitu yksin- tai 30 moninkertaisesti • t g*t 1.4.1 (Cx-Cg) -alkyylillä tai • · · '·' ' 1.5 (Οχ-Cg) -alkyyli, joka on substituoitu yksin- tai ’ * moninkertaisesti 1.5.1 (C6-C14) -aryylillä, 3 5 R2 on 3 105816 2.1 (Ci-C^) -alkyyli, 2.2 (C3-C18) -sykloalkyyli, 2.3 (C-L-C-Lg) -alkoksi, 2.4 (C3-C14)-sykloalkoksi, 5 2.5 (C6-C14) -aryyli, 2.6 (C6-C14)-aryyli, joka on substituoitu yksin- tai moninkertaisesti 2.6.1 (Ci-Cg)-alkyylillä, 2.6.2 (C^-Cg) -alkoksilla, 10 2.7 (C8-C14) -aryylioksi, 2.8 (C6-C14) -aryylioksi, joka on substituoitu yksin-tai moninkertaisesti 2.8.1 (C^-Cg) -alkyylillä, 2.8.2 (^-Cg)-alkoksilla, 15 2.9 (Ci-Cg)-alkyyli, joka on substituoitu yksin- tai moninkertaisesti 2.9.1 (C6-C14) -aryylillä, 2.10 (Cg-C8)-alkoksi, joka on substituoitu yksin- • « : ',· tai moninkertaisesti.

I'V 20 2.10.1 (C6-C14)-aryylillä, 2.11 halogeeni, kuten fluori, kloori, bromi tai jo- : *. di, « < « ' IM < 2.12 nitro tai • · ,··,·, 2.13 trifluorimetyyli, • · · 25 tai kaavan II mukaisten peptidien dimeerien valmistamisek- ... si, joissa kystiini on dimeroivana komponenttina, niiden • ·

mahdollisesti stereoisomeeristen muotojen tai kaavan II

9 9 ···* mukaisten peptidien fysiologisesti siedettävien suolojen * valmistamiseksi, sekä yhdisteen Asn-Tyr-Cys-Asn-OH valmis-3 0 tamiseksi. "="r 9 9 .........-......

• · ·

Edullisia ovat peptidit Asn-Tyr-Cys-Asn ja Tyr-Cys- t · · • · · - • Asn. _____ ' * Käsitteellä aminohapot tarkoitetaan esimerkiksi stereoisomeerisiä muotoja eli seuraavien yhdisteiden D-35 tai L-muotoja: 4 105816 alaniini glysiini proliini kysteiini histidiini glutamiini asparagiinihappo isoleusiini arginiini glutamiinihappo lysiini seriini 5 fenyylialaniini leusiini treoniini raetioniini väliini asparagiini tryptofaani tyrosiini 2 -aminoadipi inihappo 2-aminoisovoihappo 10 3-aminoadipiinihappo 3-aminoisovoihappo β-alaniini 2-aminopimeliinihappo 2 -aminovoihappo 2,4-diaminovoihappo 4-aminovoihappo desmosiini piperidiinihappo 2,2-diaminopimeliinihappo 15 6-aminokapronihappo 2,3-diaminopropionihappo 2-aminoheptaanihappo N-etyyliglysiini 2-(2-tienyyli)glysiini 3-(2-tienyyli)alaniini penisillamiini ; V N-etyyliasparagiini sarkosiini 20 hydroksi lysiini N-metyyli-isoleusiini allo-hydroksilysiini 6-N-metyylilysiini : 3-hydroksiproliini N-metyylivaliini • · · · ....: 4-hydroksiproliini norvaliini • · ... isodesmosiini norleusiini tai • · · « · * 25 allo-isoleusiini ornitiini N-metyyliglysiini • · • · • · · • · · « · ...· Aminohappojen lyhennetty kirjoitustapa noudattaa |\t yleisesti tunnettua kirjoitustapaa (vrt. Schröder, Lubke, .···. The Peptides, osa I, New York 1965, sivut XXII-XXIII; Hou- • · #·^ ben-Weyl, Methoden der Org. Chemie, osa XV/l ja 2, Stutt- :.J : 5 gart 1974) .

Aminohappo pGlu tarkoittaa pyroglutamyyliä, Nai 3-(2-naftyyli)alaniinia, atsagly-NH2 yhdistettä, jolla on kaava NH2-NH-CONH2 ja D-Asp asparagiinihapon D-muotoa. Pep- 5 105816 tidit ovat kemiallisen luonteensa mukaan happoamideja ja hajoavat hydrolysoitaessa aminohapoiksi.

Sykloalkyylillä tarkoitetaan myös alkyylillä subs-tituoituja ryhmiä, kuten esimerkiksi 4-metyylisykloheksyy-5 li tai 2,3-dimetyylisyklopentyyli.

C6-C14-aryyli on esimerkiksi fenyyli, naftyyli, bi-fenyyli tai fluorenyyli; edullisia ovat fenyyli ja naftyy-li. Vastaava koskee myös niistä johdettuja ryhmiä, kuten esimerkiksi aryylioksi, aralkyyli ja aralkoksi. Aralkyy-10 Iillä tarkoitetaan esimerkiksi Ci-Cg-alkyyliin liittynyttä substituoimatonta tai substituoitua C6-C14-aryyli ryhmää, kuten esimerkiksi bentsyyli, 1- ja 2-naftyylimetyyli, ha-logeenibentsyyli ja alkoksibentsyyli, jolloin aralkyyli ei kuitenkaan rajoitu mainittuihin ryhmiin.

15 Käsitteellä alkyyli tarkoitetaan suoraketjuisia tai haaroittuneita hiilivetyketjuja. Vastaava koskee niistä johdettuja ryhmiä, kuten esimerkiksi alkoksi, aralkyyli ja alkanoyyli.

; V Kaavan II mukaisen yhdisteen fysiologisesti siedet- • · · ..... _ : ·; 20 tävillä suoloilla tarkoitetaan erityisesti farmaseuttises- ti käyttökelpoisia tai ei-toksisia suoloja. Sellaisia suo- • j loja muodostetaan esimerkiksi kaavan II mukaisista yhdis- • · · · ___ teistä, jotka sisältävät happamia ryhmiä, esimerkiksi kar- • · <·j·f boksyylin, alkali- tai maa-alkalimetallien kanssa, kuten « * · 25 esimerkiksi Na, K, Mg ja Ca, sekä fysiologisesti siedettyjen orgaanisten amiinien kanssa, kuten esimerkiksi triet- • · yyliamiini ja tris-(2-hydroksietyyli)amiini. Kaavan II mu-kaiset yhdisteet, jotka sisältävät emäksisiä ryhmiä, esi-merkiksi aminoryhmän tai guanidiinoryhmän, muodostavat 30 suoloja epäorgaanisten happojen kanssa, kuten esimerkiksi • · · #*t vetykloridihappo, rikkihappo tai fosforihappo, ja orgaa- I I · nisten karboksyyli- ja sulfonihappojen kanssa, kuten esi-‘ * merkiksi etikkahappo, sitruunahappo, bentsoehappo, maleii- nihappo, fumaarihappo, viinihappo ja p-tolueenisulfonihap-35 po. Yhdisteet, joissa on sama lukumäärä emäksisiä ja hap- 6 105816 pamia ryhmiä, muodostavat sisäisiä suoloja eivätkä tarvitse kolmatta suolakomponenttia.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan II mukaisten peptidien valmistamiseksi on tunnusomaista, että 5 a) segmentti, jossa on C-terminaalinen vapaa kar- boksyyliryhmä, tai sen aktiivinen johdannainen saatetaan reagoimaan vastaavan segmentin kanssa, jossa on N-terminaalinen vapaa aminoryhmä, tai b) rakennetaan vaiheittain peptidi, minkä jälkeen 10 kohdan (a) tai (b) mukaan saadusta yhdisteestä lohkaistaan mahdollisesti yksi tai useampi muiden ryhmien suojaksi väliaikaisesti liitetty suojaryhmä, ja niin saadut kaavan II mukaiset yhdisteet muutetaan mahdollisesti fysiologisesti siedettäväksi suolakseen.

15 Keksinnön mukaisesti saatavat peptidit valmistetaan peptidikemiassa yleisesti tunnettuja menetelmiä käyttäen vaiheittain C-teminaalisesta päästä alkaen tai liittämällä segmenttejä (Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, • · ; \·’ osa 15/1,2). Peptidikytkemiset voidaan suorittaa esimer- 20 kiksi käyttäen seka-anhydridimenetelmää aktiiviesterien • · tai atsidien välityksellä tai karbodi-imidimenetelmää, : .·. erityisesti lisäämällä reaktiota kiihdyttäviä ja rasemi- • · « · soitumista estäviä aineita kuten esimerkiksi 1-hydroksi- · ... bentsotriatsolia, N-hydroksisukkinimidiä, 3-hydroksi-4- • i · ' 25 okso-3,4-dihydro-1,2,3-bentsotriatsiinia, N-hydroksi-5- norborneeni-2,3-dikarboksi-imidiä, lisäksi käyttämällä 1- • t *··.’ hydroksibentsotriatsolin aktiivisia johdannaisia tai fos- ·»· ...· fori-, fosfoni- ja fosf iinihappojen anhydridejä reak- j*.#< tiolämpötilassa, joka on lämpötilan -10 °C ja liuottimen .···. 30 kiehumispisteen välillä, edullisesti välillä -5°C - 40°C.

• · ’·* Tarkoitukseen sopivia liuottimia ovat dimetyylifor- ·*·*· *.* * mamidi, dimetyyliasetamidi, N-metyylipyrrolidoni tai dime- tyylisulfoksidi.

Mikäli komponenttien liukoisuus sen sallii, voidaan 35 käyttää myös sellaisia liuottimia kuin dikloorimetaani, l 7 105816 triklooriinetaani tai tetrahydrofuraani. Mainittuja menetelmiä on kuvattu esimerkiksi teoksessa Meienhofer-Gross: The Peptides, Academic Press, voi. I (1979).

Jos sivureaktioiden välttämiseksi tai erityisten 5 peptidien syntetisoimiseksi on välttämätöntä, aminohappojen sivuketjuissa olevat funktionaaliset ryhmät on suojattava lisäksi sopivilla suojaryhmillä (ks. esimerkiksi T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis), jolloin ensi sijaisesti käytettävissä ovat Arg(Tos), Arg(Mts), 10 Arg(Mtr), Arg(PMC), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys-(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His-(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-Z), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), Thr(But), Trp(Mts), Trp (CHO), Tyr(Br-Z), Tyr(Bzl) tai Tyr(But).

15 Aminosuojaryhminä edullisia ovat katalyyttisen hyd- rauksen vaikutuksesta lohkaistavissa oleva bentsyylioksi-karbonyyli- (Z-)ryhmä, heikkojen happojen avulla lohkaistavissa oleva 2-(3,5-dimetyylioksifenyyli)propyyli(2)oksi-. · : karbonyyli-(Ddz-) tai trityyli- (Trt)-ryhmä ja sekundaa- ·'**: 20 risten amiinien avulla lohkaistavissa oleva 9-fluorenyyli- • * {*". metyylioksikarbonyyli- (Fmoc)-ryhmä. Kysteiinin SH-ryhmä : voi olla suojattu joukolla suojaryhmiä. Edullinen on täi-

• i I

HU löin trityyli- (Trt-)ryhmä ja S-tert.butyyli- (StBu-)ryh- « · ,,, mä. Trityyliryhmä voidaan lohkaista jodihapetuksen avulla, « · · • 25 jolloin muodostuu kystiiniyhdisteitä, tai käyttäen pelkis tävää hapanta lohkaisua kysteiiniyhdisteiksi (Liebigs Ann. Chem. 1979, 227 - 247) .

• · · ’...· S-tert .butyyliryhmä lohkaistaan sitä vastoin par- f, haiten pelkistävästi tributyylifosfiinilla (Aust. J. Chem.

30 19 (1966) 2355 - 2360) . Sivuketjuissa olevat OH- ja COOH- • · *** ryhmät suojataan parhaiten happamasti lohkaistavissa ole- ·«· V * valla tert.butyyli- (tBu-)ryhmällä (ks. myös Meienhofer-

Gross: The Peptides, voi. 3).

Kaavan II mukaiset yhdisteet ja niiden fysiologi-35 sesti siedettävät suolat toimivat ensi sijassa vaikuttavi- 8 105816 na aineina farmaseuttisissa valmisteissa, jotka on tarkoitettu diabetes mellituksen ja insuliinista riippumattoman diabeteksen hoitoon.

Siten kuvataan myös farmaseuttista valmistetta, 5 joka sisältää vähintään yhtä kaavan II mukaista yhdistettä ja/tai vähintään yhtä sen fysiologisesti siedettävistä suoloista liuenneessa, amorfisessa ja/tai kiteisessä -edullisesti amorfisessa ja/tai kiteisessä muodossa.

Farmaseuttiseen valmisteeseen edullisia ovat pepti-10 dit Asn-Tyr-Cys-Asn, Tyr-Cys-Asn ja/tai niiden fysiologisesti siedettävät suolat.

Farmaseuttinen valmiste on edullisesti injektiokäyttöön tarkoitettu liuos tai suspensio, jonka pH-arvo on välillä noin 3,0 - 9,0, edullisesti välillä noin 5,0 - 8,5 15 ja joka sisältää sopivaa isotonointlainetta, sopivaa säilöntäainetta ja mahdollisesti sopivaa puskuria sekä mahdollisesti myös depot-ainetta, jotka kaikki ovat luonnollisesti steriilinä vesiliuoksena tai suspensiona. Valmis-. ’ : teen muiden aineosien kuin vaikuttavan aineen muodostama 20 kokonaisuus toimii valmisteen kantajana.

t *

Sopivia isotonointiaineita ovat esimerkiksi glyse- ; ,·, roll, glukoosi, manniitti, NaCl, kalsium- tai magnesiumyh- • · · disteet kuten esimerkiksi CaCl2 tai MgCl2.

• · ... Sopivia säilöntäaineita ovat esimerkiksi fenoli, m- • · · ·’ * 25 kresoli, bentsyylialkoholi ja/tai p-hydroksibentsoehappo- esterit.

• · · ·...· Puskurointiaineina erityisesti pH-arvon säätöön vä- • · · lille noin 5,0 - 8,5 voidaan käyttää esimerkiksi natrium-asetaattia, natriumsitraattia, natriumfosf aattia jne.

• " .···, 30 Muussa tapauksessa sopivia pH-arvon säätöön ovat myös fy- • · siologisesti vaarattomat laimennetut hapot (tyypillisesti ··· V * HCl) tai emäkset (tyypillisesti NaOH).

Kuvatun valmisteen vaikutusalueen muuttamiseksi voidaan lisätä myös modifioituja (vrt. EP-patenttijulkaisu 35 132 769 ja EP-patenttijulkaisu 132 770) ja/tai modifioi- 9 105816 mattomia insuliineja, edullisesti naudan, sian tai ihmisen insuliinia.

Farmaseuttisia valmisteita valmistetaan siten, että vähintään yhtä kaavan II mukaista yhdistettä ja/ tai vä-5 hintään yhtä sen fysiologisesti siedettävää suolaa saatetaan sopivaan antomuotoon mahdollisesti yhdessä modifioitujen ja/tai modifioimattomien insuliini(johdannaist)en, fysiologisesti siedetyn kantajan sekä mahdollisesti sopivien lisä- ja apuaineiden kanssa.

10 Keksintöä selvennetään nyt lähemmin seuraavien esi merkkien avulla:

Esimerkki 1 H-Tyr-Cys-Asn-OH

la. Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Asn-OtBu 15 Liuokseen, joka sisältää 3,4 g Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 3,95 g (7,4 mmol) H-Cys(Trt)-Asn-OtBu (Liebigs Ann. Chem. 1979, 242) ja 1 g KOH 50 ml: ssa dimetyyliformamidia, lisätään lämpötilassa 0 °C samalla sekoittaen 1,63 g DCC ja sekoitusta jatketaan 1 tunnin ajan lämpötilassa 0 °C ja '·*: 2 0 annetaan seistä yli yön huoneenlämpötilassa. Saostuma ero- · tetaan suodattamalla seuraavana päivänä ja suodos haihdu- : .·. tetaan. Jäännöstä hierretään etyyliasetaatilla. Saanto • · · f'”§| 2,83 g. Emäliuoksesta voidaan eristää vielä 3,63 g. Koko- • · ... naissaanto: 6,46 g (89 %) .

• t · • A · ' 25 C5eH62N408S (975,218) • · • · .....

• · · ··· *...: Sulamispiste: 112-114 °C, [α]οΧ = -15,3° (c = 1, me- ;·. tanolissa) .

• ·· !···, 30 Ib. H-Tyr (tBu)-Cys (Trt)-Asn-OtBu • · Ί* 6 g (6,15 mmol) Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Asn-OtBu • · · ....... _ V * liuotetaan 100 ml:aan dimetyyliformamidia. Siihen lisätään 6,8 g dietyyliamiinia ja annetaan seistä 10 min huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen haihdutetaan suurtyhjössä ja 35 jäännös kromatografoidaan silikageelillä dikloorimetaanin 10 105816 avulla. Dikloorimetaanilla eluoidaan lipofiilinen epäpuhtaus. Aine eluoidaan dikloorimetaanin ja metanolin seoksella 9,5:0,5. Saanto 4,4 g öljyä (95 %).

5 C43HS2N406S (752,976)

le. H-Tyr-Cys-Asn-OH

2,2 g (2,9 mmol) H-Tyr (tBu)-Cys (Trt)-Asn-OtBu liuotetaan seokseen, joka sisältää 25 ml trifluorietikkahappoa 10 ja 25 ml etyylimerkaptaania. Neljän tunnin kuluttua annosta ravistellaan 250 ml:n kanssa vettä. Vesiliuosta uutetaan kolme kertaa eetterillä ja suoritetaan pakastekui-vaus. Saanto 1,05 g (91 %).

15 C16H22N406S (3 98,44) [a]” = -1,1° (c = 1 vedessä)

Esimerkki 2

. ‘ : H-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

20 2a. Fmoc-Asn-Tyr (tBu)-Cys (Trt)-Asn-OtBu • »

Liuokseen, joka sisältää 2,2 g (2,9 mmol) H-Tyr (t- : Bu)-Cys (Trt)-Asn-OtBu, 1,04 g Fmoc-Asn-OH, 0,39 g HOBt 30 • · ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään samalla sekoittaen • * ... lämpötilassa 0 °C 0,64 g DCC. Sekoitusta jatketaan 1 tun- • · · * 25 nin ajan lämpötilassa 0 °C ja jätetään seisomaan yön yli huoneenlämpötilaan. Seuraavana päivänä saostuma erotetaan *...’ imusuodatuksen avulla ja suodos haihdutetaan. Jäännös liu- • · · *...· otetaan etyyliasetaattiin ja uutetaan peräkkäin vedellä, kyllästetyllä NaHC03-liuoksella, KHS04-liuoksella ja vedel- ,···, 30 lä, kuivataan Na2S04:11a ja haihdutetaan. Jäännöstä hierre- • ·

*" tään petrolieetterillä. Saanto 1,98 g (63 % ) · C62H68N6O10S

t#t V* (1089,323), [α]β2 = -18,8° (c = 1, metanolissa) 2b. H-Asn-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Asn-OtBu 1,9 g (1,74 mmol) Fmoc-Asn-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Asn-35 OtBu liuotetaan 50 ml:aan dimetyyliformamidia. Siihen li- 11 105816 sätään 1,8 ml dietyyliamiinia ja jätetään seisomaan 15 minuutiksi huoneenlämpötilaan. Sen jälkeen haihdutetaan suurtyhjössä ja jäännöstä hierretään etyyliasetaatin kanssa ja kuivataan alennetussa paineessa. Saanto 0,98 g 5 (65 %) .

C47H58N6°8S (867,081), [aJn1 = -7,2° (c = 1, metanolis-sa)

2c. H-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

0,9 g (1 mmol) edellä valmistettua yhdistettä liuo-10 tetaan seokseen, joka sisältää 10 ml etyylimerkaptaania ja 10 ml trifluorietikkahappoa. Neljän tunnin kuluttua seos kaadetaan 100 ml:aan vettä. Vesiliuosta uutetaan kolmesti eetterillä ja se pakastekuivataan. Saanto 455 mg (89 %).

15 C20H28N6O8S (512,54 7) [a]” = -26,0° (c = 1, vedessä)

Esimerkki 3

Asetyyli-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

• 1 ”·1: 20 Liuokseen, joka sisältää 2,0 g (1,56 mmol) H-Leu- m ·

Glu (OtBu) -Asn-Tyr (tBu) -Cys (Trt) -Asn-OtBu-trifluoriasetaat- ; ,·, tia (Liebigs Ann. Chem. 1979, 243) 30 ml:ssa dimetyylifor- * · 1 f’”#J mamidia, lisätään 0,4 ml N-etyylimorfoliinia ja 0,53 g • i ... asetyyli-N-hydroksisukkinimidiä. Kun reaktio on kestänyt 4 • « · • 25 tuntia huoneenlämpötilassa, suoritetaan haihdutus suurtyh jössä. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja ravistel- ·...1 laan peräkkäin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella, KHS04-li- ··· uoksella ja vedellä. Tällöin muodostuu saostuma, joka ero-tetaan imusuodatuksen avulla. Saanto 1,3 g. Etyyliasetaat- • ·« .···, 30 tifaasi kuivataan Na2S04:lla ja haihdutetaan. Jäännös hier- • · 11 retään dietyylieetterin kanssa ja suoritetaan imusuodatus.

105816 12 ja 30 ml etyylimerkaptaania. Kun reaktio on kestänyt 4 tuntia, seosta ravistellaan 300 ml:n kanssa vettä ja vesi-liuosta uutetaan kolmesti dietyylieetterillä. Vesifaasi pakastekuivataan. Saanto 740 mg (87 %).

5 C33H4eNe013S (798,86) [aio3 = -25,1° (c = 1, vedessä)

Esimerkki 4 10 Kaavan II mukaisten keksinnön mukaisesti saatujen peptidien biologinen aktiivisuus määritetään käyttäen pre-paratiivisia rasvasoluja ja diafragmapalasia rotasta. Käsite tripeptidi tarkoittaa yhdistettä Tyr-Cys-Asn-OH ja heksapeptidi yhdistettä asetyyli-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-15 OH. Käsite "perustaso" tarkoittaa aktiivisuutta ilman sti mulointia, insuliini tarkoittaa ihmisen insuliinia ja dpm tarkoittaa radioaktiivisia hajoamisia minuutissa.

Rasvasolujen preparointi rotasta suoritettiin seu-raavasti: • · :\\ 20 Lisäkiveksen rasvakudosta (Wistar-rotta, 160 180 g, ei ruokintarajoitusta) sulatetaan kollagenaasilla • · · ·’ . ja syntyneet yksittäiset rasvasolut pestään useita kertoja • · * *’* 1 vaahdottamalla.

Diafragmapalasten preparointi rotasta: Useita ker- » i ’·’ * 25 toja pestyistä hemidiafragmoista (Wistar-rotta, 60 - 70 g, ei ruokintarajoitusta) stanssataan pieniä kudospalasia ··· •"S (halkaisija 5 mm) .

'***: Molemmat seuraavat testit koskevat insuliinin sti- »·· ./ muloimaa glukoosin vastaanottoa, joka vaatii funktionsa- • ·· 30 lista insuliinisignaalin siirtoastetta ja glukoosinsiirtoa t · ·*** riippumatta siitä, metaboloituuko glukoosi oksidatiivises- ··· J ti (glykolyysi, pentoosifosfaattireitti) vai ei-oksidatii- *:**: visesti. Seurataan muuttumista lipideiksi, glykogeeniksi tai membraania läpäiseviksi välituotteiksi (glukoosi-6-35 fosfaatti), mutta ei laktaatin syntymistä.

105816 13 a) Rotan rasvasoluja inkuboidaan insuliinin/pepti-din läsnä tai poissa ollessa D-[U-14C]glukoosilla (D-glu-koosin loppukonsentraatio 22 μΜ). Solut erotetaan sentri-fugoimalla väliaineesta silikoniöljykerroksen läpi, eris- 5 tetään uudelleen ja määritetään solujen radioaktiivisuus.

b) Diafragmapalasia inkuboidaan insuliinin/peptidin läsnä tai poissa ollessa D-[U-14C]glukoosilla (D-glukoosin loppukonsentraatio 75 μΜ) . Väliaine erotetaan imusuodatuk-sen avulla. Kudospalaset pestään useita kertoja ja liuote- 10 taan sen jälkeen emäskäsittelyn avulla radioaktiivisuuden määritystä varten.

Tulokset ovat taulukossa 1.

Taulukko 1 15 Glukoosin vastaanotto b) Disfrsgsia a) Rasvasolut

Insuliini Tripaptidi Haksapaptidi Insuliini Tripaptidi Haksapaptidi [dsp] [dpm] (dpa] (dpn] [dpa] [d|a] • « ¥ * l 0,1 mM 7 591 7 429 1 83β 1 488 • * !’.*· 20 0,5 mM 8 540 7 752 2 947 1 917 • « 1 mM 11 588 8 597 6 533 4 218

I I I

· 0,5 ng 10 055 4 379 • · · • · · • * » * , 5 ng 20 841 26 312 * ) M · * · perustaso 7 348 1 235 : 25

Esimerkki 5 • · · ......

:..,ί Glukoosin kuljetus *tt#J Rasvasolut jä diafragmakappaleet valmistetaan kuten ··] esimerkissä 4. Seuraavat testit käsittävät yksinomaan in- • ·· \..t 30 suliinin stimuloiman spesifisen glukoosikuljetuksen (hei- • t ”* potettu diffuusio) plasmamembraanin kautta glukoosikanta-

»M

V * jän avulla mukaan lukien insuliinisignaalin siirtoasteen.

Glukoosiaineenvaihdunnan vaikutus glukoosikuljetukseen suljetaan pois käyttämällä ei-metaboloituvaa glukoosiana-35 logia.

14 105816 a) Rotan rasvasoluja inkuboidaan insuliinin/pepti-din läsnä tai poissa ollessa 2-deoksi-D- [1-3H]glukoosilla (D-glukoosin loppukonsentraatio 0,2 mM) ja L-[1-14C]glukoosilla (ei kuljetettavissa). Radioaktiivisuusmääritystä 5 varten ( [3H] ja [14C]) solut erotetaan väliaineesta sentri- fugoimalla oljykerroksen läpi. Spesifinen stereoselektii-vinen glukoosikuljetus lasketaan erona soluun liittyneen kokonaisradioaktiivisuuden ( [3H]glukoosi) ja diffuusion ja epäspesifisen vaikutuksen avulla liittyneen radioaktiivi-10 suuden ( [l4C]glukoosi) välillä.

b) Diafragmakappaleita inkuboidaan insuliinin/pep-tidin läsnä tai poissa ollessa 2-deoksi-D- [1-3H] glukoosilla (D-glukoosin loppukonsentraatio 0,1 mM) ja L- [1-14C]glukoosilla. Kudoskappaleet erotetaan väliaineesta suodattamalla 15 nopeasti lasikuitusuodattimella ja pestään voimakkaasti.

Radioaktiivisuus mitataan emäksisessä uutteessa. Tulokset ovat taulukossa 2.

V. Taulukko 2 • 9 9 t :v. 2 0 Glukoosin kuljetus • t • >· a) Rasvasolut b) Diafragma • · · • m c # Insuliini Tripeptidi Heksapeptidi insuliini Tripeptidi Heksapeptidi • · · • · t • 1 1 1 [dpm] [dpm] tdpm] [dpm] [dpm] [dpm] • » » » · • · 0,1 mM 2 289 2 216 8 836 8 450 f «i • · · * 25 0,5 mM 3 055 2 842 9 822 Θ 928 1 mM 5 781 3 922 11 252 9 676

• M

S ! 0,5 ng 4 851 10 828 ··· 994 • { 5 ng 20 342 17 750 • t · t • s perustaso 2 311 8 522 • · 9 99 30 999 9 t 9 999 9 999 9 9 9 9 9 9 9 f C ' 105816 15

Esimerkki 6

Esteröityminen in vitro Tämä testi mittaa insuliinin stimuloimaa glyseroli- 3-fosfaatin esteröitymistä lipidituotteiksi (triglyseri-5 dit, fosfolipidit). Siihen ottavat osaa lipidisynteesin entsyymit (esimerkiksi asyyli-CoA: L-glyseriini-3-fosfaat-ti-asyylitransferaasi) ja siihen kuuluu funktionaalinen insuliinisignaalin siirtovaihe. Glukoosikuljetuksella ei ole tällöin mitään osuutta, kuten puuttuva esteröinnin 10 esto sytokalasiini B:n vaikutuksesta osoittaa.

Rotan rasvasoluja, jotka on valmistettu kuten esimerkissä 4, inkuboidaan D-glukoosilla (loppukonsentraatio 33 μΜ) insuliinin/peptidin läsnä tai poissa ollessa ja käsitellään sen jälkeen plasmamembraanin (ilman että häi-15 ritään sisämembraaneja) läpäisevyyden vuoksi pienillä sa- poniinipitoisuuksillä. L-[U-14C]glyseroli-3-fosfaatin lisäyksen jälkeen inkubointia jatketaan. Lisätään tolueeni- • » : liukoinen tuikelaskentaseos ja lipidi erotetaan vesifaa- sista sentrifugoimalla. Lipidin sisältämä tolueenifaasi 20 poistetaan ja sen radioaktiivisuus määritetään. Tulokset : on esitetty taulukossa 3.

• · · * « · · · ________________ • . .

* · ... Taulukko 3 « · · « · » ' Esteröityminen rasvasoluilla 25 Insuliini Tripeptidi [dpm] [dpm] t $ $ **·; 0,1 mM 3 710 0,5 mM 4 422 • · : " 1 mM 5 398 • · '•••* 3 0 0,5 ng . 5 ng 3 640 f ....: perustaso 3 842 16 105816

Esimerkki 7

Lipogeneesi

Rotan rasvasoluja esimerkistä 4 käsitellään insu-liinireseptorien inaktivoimiseksi proteolyyttisesti pie-5 nillä trypsiinipitoisuuksilla. Proteaasi-inhibiittoreiden lisäyksen jälkeen solut pestään kahdesti vaahdottamalla ja inkubointia jatketaan 15 min lämpötilassa 37 °C. Näitä soluja käytetään sen jälkeen lipogeneesin stimuloinnin testaamiseen peptidien avulla. Vertailuinkubointi insulii-10 nilla osoittaa, että trypsiinillä käsitellyillä soluilla on vain hyvin vähäistä insuliinin stimuloimaa lipogeneesiä ja siten vain hyvin rajoitettu määrä funktionaalisia insu-liinireseptoreja (insuliinin sitomiseen nähden). Siten tämä testi mittaa lipogeneesin stimulointia insuliinisig-15 naalin siirtovaiheeseen kytkeytymisten välityksellä insu liinin reseptorisitomisen jälkeen. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

* * • « • ·

Taulukko 4 · 2 0 Lipogeneesi • : Insuliini Tripeptidi ··· · [dpm] [dpm] 0,1 mM 3 250 m · 0,5 mM 4 145 25 1 mM 5 072 0,5 ng > · · ·”*: 5 ng 3 087 p p p .,* perustaso 2 355 p t • · ·

P

p p p P P P P

P P P P

P P P P P P P P P

P

P

P P

Claims (2)

105816 17

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava II, 5 X-Q-Cys-D (II) jossa Q on Tyr, TyrfR1), Phe(R2), Trp (R2) tai Nai, D on Asp, Asn, D-Asp, D-Asn, β-Ala tai atsagly-NH2, ja 10. on a) vety, b) R^CO, c) (Cj-C^)-alkoksi-CO, d) (C3-C18) -sykloalkoksi-CO tai e) (C6-C14) aryyli- (Cj-Cg) -alkoksi-CO,

15 R1 on 1.1 (Cj-Cjg) -alkyyli, 1.2 (C3-C18) -sykloalkyyli, : 1.3 (c6-c14) -aryyli, 1.4 (C6-C14)-aryyli, joka on substituoitu yksin- tai • · 20 moninkertaisesti · · —------- : 1.4.1 (C3-C8)-alkyylillä tai ,**,· 1.5 (Ci-Cg)-alkyyli, joka on substituoitu yksin- tai • · ... moninkertaisesti i « « 1.5.1 (C6-C14) -aryylillä,

25 R2 on • » · 2.1 (C1-C18) -aTkyyli, • · · 2.2 (C3-C18)-sykloalkyyli, 2.3 (C,-C18)-alkoksi, .···. 2.4 (C3-C14)-sykloalkoksi, ’·* 30 2.5 (C6-C14)-aryyli, ··· *.’· 2.6 (C6-C14) -aryyli, joka on substituoitu yksin- tai t _ ’”*· moninkertaisesti 2.6.1 (Ci-Cg)-alkyylillä, 2.6.2 {C1-Ce) -alkoksilla, 35 2.7 (C6-C14) -aryylioksi, 105816 18 2.8 (C6-C14)-aryylioksi, joka on substituoitu yksin-tai moninkertaisesti 2.8.1 (C^-Ca)-alkyylillä, 2.8.2 (Ci-Cg) -alkoksilla, 5 2.9 (Ci-Ca)-alkyyli, joka on substituoitu yksin- tai moninkertaisesti 2.9.1 (C6-C14) -aryylillä, 2.10 (C6-Ca) -alkoksi, joka on substituoitu yksin-tai moninkertaisesti 10 2.10.1 (C6-C14)-aryylillä, 2.11 halogeeni, kuten fluori, kloori, bromi tai jodi, 2.12 nitro tai 2.13 trifluorimetyyli, 15 tai kaavan II mukaisten peptidien dimeerien valmistamisek si, joissa kystiini on dimeroivana komponenttina, niiden mahdollisesti stereoisomeeristen muotojen tai kaavan II mukaisten peptidien fysiologisesti siedettävien suolojen • · valmistamiseksi, sekä yhdisteen Asn-Tyr-Cys-Asn-OH valmis- • · 20 tamiseksi, tunnettu siitä, että • · · a) segmentti, jossa on C-terminaalinen vapaa kar- • · · *" I boksyyliryhmä, tai sen aktivoitu johdannainen saatetaan ... reagoimaan vastaavan segmentin kanssa, jossa on N-termi- • · · naalinen vapaa aminoryhmä, tai 25 b) rakennetaan peptidi vaiheittain, • »t *...· minkä jälkeen kohdan a) tai b) mukaan saadusta yh- • · · *,.,J disteestä mahdollisesti lohkaistaan yksi tai useampi mui- ;·. den ryhmien suojaksi väliaikaisesti liitetty suojaryhmä ja • · · niin saadut kaavan II mukaiset yhdisteet muutetaan mahdol- • · T 30 lisesti fysiologisesti siedettäväksi suolakseen. • · · ·.· · 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, *ϊ**ί tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukai nen peptidi, jolla on sekvenssi Tyr-Cys-Asn. 19 105816 ' 1. Förfarande för framställning av en terapeutiskt användbar peptid med formeln II, 5 X-Q-Cys-D (II) i vilken

10 Q är Tyr, Tyr (R1) , Phe (R2) , Trp (R2) eller Nal, D är Asp, Asn, Π-Asp, D-Asn, β-Ala eller azagly-NH2, och X är a) väte, b) R^CO, c) (C1-C18) -alkoxi-CO, 15 d) (C3-C18) -cykloalkoxi-CO eller e) (C6-C14) aryl - {C^C^ -alkoxi-CO, R1 är 1.1 (Ci-Cn) -alkyl, 1.2 (C3-C18)-cykloalkyl, 20 1.3 (C6-C14) -aryl, • ; ,·, 1.4 (C6-C14)-aryl, som substituerats en- eller fler- fait med ... 1.4.1 (0χ-08)-alkyl, eller '·’ 1.5 (Ci-Cj)-alkyl, som substituerats en- eller 25 flerfalt med • · · 1.5.1 (C6-C14)-aryl, ^ :*! 2.1 (C1-C18)-alkyl, • · · I···. 2.2 (C3-C18) -cykloalkyl, *!* 30 2.3 (C1-C18) -alkoxi, • M ·.· · 2.4 (C3-C14)-cykloalkoxi, 2.5 (C6-C14)-aryl, 2.6 (C6-C14)-aryl, som substituerats en- eller flerfalt med 35 2.6.1 (Ci-C,) -alkyl, 20 1 0 5 8 1 6 2.6.2 <C,-C,)-alkoxi, 2.7 (C6-C14)-aryloxi, 2.8 (C6-C14)-aryloxi, som substituerats en- eller flerfalt med 5 2.8.1 (C1-C8) -alkyl, 2.8.2 (C1-CB) -alkoxi , 2.9 (Ci-Cg)-alkyl, sora substituerats en- eller flerfalt med 2.9.1 (C6-C14) -aryl, 10 2.10 (C6-C8)-alkoxi, som substituerats en- eller flerfalt med 2.10.1 (C6-C14)-aryl, 2.11 halogen, säsom fluor, klor, brom eller jod, 2.12 nitro eller 15 2.13 trifluormetyl, eller för framställning av dimerer av peptiderna med for-meln II, i vilka cystin är den dimeriserande komponenten, . · : eventuella stereosiomera former av dessa samt fysiologiskt ·*·’: godtagbara salter av peptiderna med formeln II, och fö- f · 2. reningen Asn-Tyr-Cys-Asn-OH, kännetecknat : .·. därav, att • · · J a) ett segment med en C-terminal fri karboxy 1 syra, • · ... eller ett aktiverat derivat av detta, bringas att reagera « · « *·* ’ med ett motsvarande segment med en N-terminal fri 25 aminosyra, eller Ml ·...’ b) man bygger stegvis upp peptiden, · · varefter man frän föreningen som erhällits enligt ;·. a) eller b) eventuellt avspjälker en eller flera för andra • · · ,···. grupper temporärt införda skyddsgrupper och de sä erhällna • · *Γ 30 foreningarna med formeln II överförs eventuellt i ett fy- ·«· *.· · siologiskt godtagbart salt av dessa.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att man framställer en peptid med formeln II, och med sekvensen Tyr-Cys-Asn. ! I