DD147942A1 - Verfahren zur herstellung von cystin-peptiden mit insulinaehnlicher wirkung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Cystin -Peptiden, in welchen ein Halbcystin Bestandteil eines Sequenzabschnittes der Insulin-B-Kette, das andere Halbcystin Bestandteil eines Sequenzabschnittes der Insulin-A-Kette darstellt. Diese Disulfide des im Formelschema wiedergegebenen Typs werden durch getrennten Aufbau des jeweiligen A- bzw. B-Ketten-Peptides unter Anwendung saeurelabiler Schutzgruppen sowie der S-Aethylmerkaptogruppe als Schutz fuer das Cystein-Thiol und anschlieszende acidolytische Deblockierung beider Komponenten im Gemisch erhalten. Hierbei wird durch saeurekatalysierten Disulfidaustausch der Cystein-S- Aethylmerkaptogruppen gleichzeitig die Disulfidbruecke zwischen den beiden Sequenzabschnitten geknuepft. Die auf diese Weise zugaenglichen Disulfide zeigen bei Einhaltung bestimmter struktureller Voraussetzungen eine reduzierte, aber deutlich nachweisbare Insulin-Wirkung.

Description

-1- 2 f

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit ineulinähnlicher Wirkung .

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cystin-Peptiden mit speziellen Strukturmerkmalen, die eine ineulinähnliche Wirkung aufweisen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Um günstigere therapeutische Eigenschaften, wie z.B. verbes-Berte Verträglichkeit oder verlängerte Wirkung zu erzielen, wurden zahlreiche, vom Pankreashormon Insulin abgeleitete Sequenzanaloge, Substitutionsprodukte und Modifizierungen untersucht. Diese konnten entweder totaleynthetisch oder durch seüiisynthetische Abwandlung des NativmolekUls unter Einbeziehung biochemischer Methoden gewonnen werden (Zusammenfassung: R.Geiger, Chem. Ztg. 1oo, 111 (1976)). Aus den so gewonnenen Struktur-Wirkungsrelationen ergab sich, daß vor allem im Bereich der B-Kette bestimmte Veränderungen der Priraärstruktur wie Verkürzung oder Austausch einzelner Aminosäuren erlaubt sind, ohne daß dabei die biologische Aktivität wesentlich beeinträchtigt wird. So gelten insbesondere bestimmte Abschnitte im C- und N-terminalen Bereich der B-Kette als entbehrlich für die Insulin-Wirkung. Derartige Sequenzvereinfachungen zeigten jedoch gegenüber dem Nativmolekül weder ökonomische Vorteile noch verbesserte

pharmakologische Eigenschaften. Die pharmaKologische^Priffimg anderer Sequenzanaloger bzw. Substitutions- oder Hodifizierungsprodukten dee Insulins erbrachte darüber hinaus entweder erheblichen Wirkungsabfall oder erhöhte Antigenität. Angesichts dieser Ergebnisse erscheint es vorteilhaft, die Insulin-Struktür weitgehend bis zur Größenordnung von solchen Oligopeptiden zu vereinfachen, welche aufgrund ihres Vereinfachungsgrades mit ökonomisch vertretbarem Aufwand durch Totalsynthese zugänglich sind und die im Vergleich zum Nativmolekül noch deutlich antidiabetische Wirkung aufweisen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Entwicklung neuer totalsynthetisch zugänglicher Antidiabetike. mit verminderter Antigenität.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, stark vereinfachte, von der rezeptorbindenden Region des Insulins abgeleitete Cystin-Oligopeptide zu gewinnen, die relativ einfach durch Totalsynthese erhalten werden können und die therapeutisch verwertbare Insulinwirkungen bei gleichzeitig guter Verträglichkeit aufweisen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Wie aus der Literatur bekannt ist, sind an der rezeptorbindenden Region des Insulins aus der B-Kette die Abschnitte B 12- B 26 mit den Aminosäuren VaI B 12, Tyr B 16, Arg B 22, GIy B 23, Phe B 24 und B 25 und aus der Α-Kette bestimmte Aminosäuren im Abschnitt A 1-7 sowie der Bereich A 19-21 einschließlich der Disulfidbrücke A 2o - B 19 beteiligt (R.A.Pullen, D.G.Lindsay, S.P.Wood, I.J.Ticke, T.L.Blundell, A.Wollmer, G.Krail, D.Brandenburg, H.Zahn, J.Gliemann und S.Gammeltoft, Nature, 259,369 (1976)). Hiervon ausgehend beschreibt das Verfahren die Herstellung einer Reihe von

-3-

5100 -³-

Disulfiden des Typs

- Cy s - GIy B

—— Cyθ - Asn A

in welchem die beiden Halbcystine Bestandteil eines für die biologische Wirkung essentiellen Ausschnittes der natürlichen B-Kette (B) bzw. natürlichen Α-Kette (A) darstellen. Für die B-Kette betrifft dies vorzugsweise die Sequenz B 15—27 bzw. davon abgeleitete weiter vereinfachte Aminosäurefolgen, für die Α-Kette Sequenzen aus dem Abschnitt A 1-7 oder A 19-21, Charakteristisch für das Verfahren ist folgendes Vorgehen; Die beiden Sequenzabschnitte aus dem Bereich der B- bzw. Α-Kette werden getrennt nach den üblichen Prinzipien der Peptidsynthese aufgebaut, wobei erfindungsgemäß jedoch für den Schutz der endständigen Punktionen und der Seitenketten ausschließlich acidolytisch entfernbare Gruppen und für den Schutz der Cystein - Thiole die S-Äthylmerkaptogruppe angewandt werden. So wird z.B. die B-Ketten-Region 15-27, in welcher Threonin B 27 der natürlichen Sequenz gegen Alanin ersetzt ist (B 15-27 (AIa 27)), bequem aus den Untereinheiten 1-3 in der geschützten Form 4 erhalten.

(1) Boc-Phe~Phe-Tyr(Bzl)-Ala-OBzl

(2) Boc-Glu(0Bzl)-Arg(H⁺)-Gly-OH

(3) Boc-Ieu-TyrCBzD-Leu-Val-Cy S(SEt)-GIy-OH

15 16 17 18 19 2o 21 22

(4) Boc-Leu-Tyr(BzI)-Leu-Val-Cys(SEt)-GIy-GIu(OBzI)-Arg(H⁺)-23 24 25 26 27 Gly»Phe-Phe~Tyr(Bzl)-Ala-OBzl

Zweckmäßigerweise gewinnt man hierzu die Teilfragmente 2 und 3 nach den in den Patentschriften 12o o14 bzw. 123 456 der Deutschen Demokratischen Republik beschriebenen Darstellungsvorechriften und kombiniert diese zur geschützten Sequenz 4 entsprechend den Prinzipien, wie sie in der DD-¹TS 132 861 dargestellt sind

In entsprechend derivatisierter Form wird auch der Sequenz-

-4-

ausschnitt aus der Α-Kette aufgebaut. So läßt sich beispielsweise die geschützte A-Ketten-Teilsequenz 19-21 (5)

19 2o 21

<5) Boc-Tyr(Bzl)-Cys(SEt)-Asn-OBzl

durch schrittweise. Verlängerung von Asparaginbenzylester durch die nachfolgenden entsprechend derivatisierten Aminosäuren erhalten.

Das Verfahren ist nun dadurch charakterisiert, daß die beiden Peptidderivate aus dem Bereich der B- und Α-Kette im Gemisch einer Acidolyse unter Anwendung von HP, vorzugsweise aber mittels HBr/Trifluoressigsäure unterworfen werden« Hierbei werden alle Schutzgruppen quantitativ entfernt, ausgenommen die Cystein-S-Äthylmerkaptofunktionen,- welche entsprechend Schema 1 einem partiellen Disulfidaustausch unterliegen. ' -

Schema 1

B 15

15

15

SEt

S ι

27	V	• A	19	—Τ*"	- 21
	1	.j.
27			19		- 21
			S

19 -1... 21

15

I S

S 19-1- 21

(6)

Et

Et

Dabei entsteht aus dem B- und A-Ketten-Peptid ein Gemisch von Disulfiden, unter denen der asymmetrische Typ (6) das gewünschte Produkt mit stark vereinfachter insulinähnlicher Struktur ist und welches sich leicht säulenchromatografisch abtrennen läßt. Um die Ausbeute an (6) zu erhöhen, erweist es sich erfindungsgemäß als zweckmäßig, das leicht zugängliche

niedermolekulare A~Ketten-Peptid (5) im Überschuß einzusetzen und den Disulfid-Austausch durch eine Nachbehandlung mit HBr/Eisessig zu vervollständigen.

Nach dem gleichen Prinzip lassen sich bei Anwendung genannter Schutzgruppenanordnung beliebige Cystein-Peptide aus dem Bereich der Insulin-B- und-A-Kette in entsprechende CystinDerivate überführen.

Unter den so zugänglichen Cystin-Peptiden trat gegenüber Insulin reduzierte, aber durch Mäusekrampftest und Radioimmunassay eindeutig nachweisbare Insulinaktivität auf, wenn als B-Kettenkomponente Sequenzfolgen aus dem Bereich B 15-27, als A-Kettenkomponente solche aus dem Bereich A 1-7 oder A 19-21 gewählt werden.

Ausführungsbeispiel

1.a) Boc-Tyr(BzI)-Cys(SEt)-Asn~OBzl (A 19-21) (5)

485 mg (1,o mMol) Boc-Cys(SEt)-Asn-OBzl (F = 99-1o2 ⁰C) werden unter Zugabe von 1,2.(2o ml) C₂HLSH mit 3o ml 4 η HCl/ Dioxan 3o min. behandelt. Anschließend engt man im Vakuum zur Trockne ein, setzt CH₂Cl₂ hinzu, destilliert es bei 1o Torr, 3o ⁰C, wieder ab und wiederholt diese Operation mehrfach. Der Rückstand wird 2 Stunden bei o,1 Torr über KOH getrocknet.

R_f β o,22 (n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1}1 auf Kieselgel)

Das so erhaltene N⁰^-deblockierte Dipeptidderivat wird unter Zugabe von 1o1 mg (1,o mMol) Et-N in 1o, ml CH₂Cl₂ gelöst und bei ~1o ⁰C unter Rühren mit 42o mg (1,1 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-OH, 27o mg (2,ο mMol) HOBt sowie 229 mg (1,1 mMol) DCC, letzteres in 2ml CH₂Cl₂ gelöst, versetzt.· Der Ansatz wird 3 Stunden bei -1o ⁰C, 15 Stunden bei O ⁰C gerührt, über Nacht bei 2o ⁰C stehengelassen und aufgearbeitet

Ausbeute: 0,65 g = 88 % d.Th

ρ _β 148-150 ⁰C

Rx.= o,91 (n-Butanol/Eisessig/Waseer 4:1:1 auf Kieselgel) Aminosäureanalyse: Tyr 1,o (1); Cys o,85 (1);¹ Asp 1,o (1)

-6-

. ^m£ 1 D 1 U V

1.b) Boc-Ieu-Tyr(Bzl)-Leu-Val-Cys^SEt)-Gly-GltiOBzl)-Arg(ECl)#i Gly-Phe~Phe-Tyr(BzI)-AIa-OBzI (B15-27) (Ala 27) (4)

DaB geschützte Tridecapeptidderivat aus dem Sequenzbereich 15-27 der B-Kette, jedoch durch Alanin ausgetauschtem Threonin in Position 27, wird aus dem Teilfragment Boc-Leu-Tyr(Bzl)-Leu-Val-Cys(SEt)-GIy-OH (3), gewonnen nach def DE-I⁵S 123 456, dem Teilfragment Boc-Glu-Arg(H⁺)-GIy-OH (2), gewonnen nach der DD>*P5 I2o o14, sowie dem Teil fragment Boc-Phe-Phe-Ty r (BzI)-Ala-OBzl (1) (Fe183-185 ⁰C; ^⁰ » -4,8 ° (c=1,o in Eisessig); Rx. s o,93 (n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1 si auf Kieselgel) unter Anwendung der in der· DD'?5 132 861 und der dort wiedergegebenen verfahrenschemischen Prinzipien dargestellt, P β 252-256 ⁰C

^⁰ = -18,6 ° (^0,3 in DMP) R-, »o,62 (n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:1 auf Kieselgel)

Lc) Disulfid aus dem B-Kettenausschnitt 15-27 mit Alanin-Substitution in Position 27 und dem A-Kettenausschnitt 19-21 (B 15-27(AIa 27) - A 19-21).

145 mg (o,2 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-Cys(SEt)-Asn-OBzl (5) und 21 mg (o,o1 mMol) Boc-Leu-Tyr(Bzl)-Leu-Val-Cys(SEt)-Gly-Glu(OBzl)-Arg(HCl)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Ala-OBzl (4) werden in 2o ml TPA und 2 ml Anisol gelöst und durch Einleiten eines trockenen, bromfreien HBr-Stromes 1,5 Stunden bei 2o ⁰C deblockiert. Anschließend engt man im Vakuum bei 25 ⁰C auf ca. 2 ml ein, fällt durch Zugabe von absolutem Äther, zentrifugiert den Niederschlag ab, wäscht mehrfach mit absolutem Äther, trocknet 2 Stunden bei o,1 Torr über KOH und behandelt das Produkt 3o min. mit 6 η HBr/HOAc nach. Man engt dann erneut im Vakuum ein und trocknet 3 Stunden bei 3o°C über KOH. .' . ; . ..

Zur Auftrennung der Bisulfide versetzt man das Gemisch mit 1 ml konzentrierter NapCO,-Lösung, löst portionsweise in insgesamt I0-I5 ml 3o-proz. Essigsäure auf, zentrifugiert Unlösliches ab und chromatografiert an Sephadex G 25 (7ox2,3cm, 15-proz. Essigsäure, 2o ml/Stunde, 60 mg Substanz). Der

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Fraktionsbereich 2oo-=215 ml wird euf 5 ml eingeengt und lyophilisiert.

Ausbeute? 17,5 mg = 77 % d.Th.

Aminosäurenanalyse: Leu 1,9 (2)} Tyr 2,9 (3); VaI 1,1 (1)j

Cys 1,7 (2); GIy 2,ο (2); GIu 1,0 (1);

Arg 1,1 (1)} Phe 1,9 (2); AIa 1,1 (1);

Asp 1,o (1) Elektrophoretisch einheitlich.

2. Disulfid aus dem B-Kettenausschnitt 15-27 mit Alanin-Substitution in Position 27 und dem A-Kettenausschnitt 2o-21 (B 15-27 (AIa 27) - A 2o-21).

Die Umstellung erfolgte analog wie unter Beispiel 1,c) beschrieben eus 97 mg (o,2 mMol) Boc~Cys(SEt)-Asn-OBzl und 21 mg (o,o1 mMol) Boc~Leu~Tyr(Bzl)~Leu-Vfcl-Cys(SEt)-Gly-Glu(OBzl)-Arg(HCl)-Gly-Phe-.Phe-"Tyr(Bzl)-Ala--OBzl (4), ebenso die Aufarbeitung und Sephadex-G-25-Chroinatografie, wobei das gewünschte Produkt im Elutionsbereich von I6o-2oo ml erhalten wird

Ausbeute: 15,3 mg = 79 % d.Th, Aminosäurenanalyaej Leu 1,9 (2); Tyr.1,8 (2); VaI 1,1 (1);

Cys 1,6 (2); GIy 2,ο (2); GIu ο,9 (D;

Arg 1,o (1); Phe 2,ο (2); Ala o,9 (D;

Asp 1,o (1) Elektrophoretisch einheitlich.

3. Disulfid aus dem B-Kettenausschnitt 15-2o und dem A-Kettenausschnitt 19-21 (B 15-20 - A 19-21).

Zur Darstellung wurde von 97 mg (o,2 mMol) Boc-Tyr(Bzl)-Cys(SEt)-Asn-OBzl (5) und 19 mg (o,o2 mMol) Boc-Leu-Tyr(Bzl)-Leu-Val-Cys(SEt)-GIy-OH (3), beschrieben in der DD-'PS'¹ 123 456, ausgegangen und wie unter Beispiel 1,c) weiter verfahren.

Das gewünschte Produkt tritt im Elutionsbereich von 19o-23o ml der Sephadex-G-25-Säule aus.

Ausbeute: 17,2 mg = 81 % d.Th.

Aminosäureanalyse: Leu 2,ο (2); Tyr 1,8 (2); VaI 1,1 (1);

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Cye 1,6 (2); GIy 1,0 (1); AsrT 1,f (1) Elektrophoretisch einheitlich.

Die unter Beispiel 1 "bis 3 gewonnenen asymmetrischen Disulfide mit stark vereinfachter Insulin-Struktur zeigten im Mäueekrampftest und Radioimmunassay deutlich nachweisbare Insulinaktivität.

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Claims (1)

1. 2 1 5 100 -ί/~

   Erfindungsanspruoh

   Verfahren zur Herstellung von Cystin-Peptiden mit insulinähnlicher Wirkung und mit einer von Insulin abgeleiteten, stark vereinfachten Struktur, gekennzeichnet dadurch, daß cystinhaltige Teilsequenzen aus der B-Kette, vorzugsweise dem Abschnitt B15 - 27 sowie cystinhaltige Teilsequenzen aus der Α-Kette, vorzugsweise dem Abschnitt A1 -* 7 und A19 - 21 unter ausschließlicher Anwendung säurelabiler Schutzgruppen sowie der S-Ethylmerkaptogruppe als Cystin-Schutz eingesetzt werden, die geschützten Peptide aus dem Bereich der B- und Α-Kette werden hierbei acidolytisch deblockiert, wobei gleichzeitig durch Disulfidaustausch der Cystein~S-Ethylmerkaptogruppen ein leicht auftrennbares Gemisch von Cystin—Peptiden erhalten wird, unter denen sich bei Verwendung mittelständiger Sequenzabschnitte aus der B-Kette und endständiger Sequenzabschnitte aus der A-Kette insulinaktive Verbindungen befinden, wobei der Anteil von gemischtem Disulfid aus B- und A-Ketten-Teilsequenz hierbei erhöht werden kann, wenn eine dieser Teilsequenzen im Überschuß eingesetzt und der Disulfidaustausch durch eine Nachbehandlung des Gemisches mittels HBr/Eisessig vervollständigt wird,

   Hierzu 1 Seite Formeln

   ο r; λ uir-)ο ο η -^ υ π α λ λ

   -Ιο-

   Formel schema

   Leu-Tyr-Leu-Val-Cy s-GIy «Glu~Arg~Gly-Phe-Phe~Tyr«Ala B

   Tyr-Cys-Aen

   -11-