DE2858718C2

DE2858718C2 -

Info

Publication number: DE2858718C2
Application number: DE2858718A
Authority: DE
Inventors: Masahiko Fujino; Mitsuhiro Takarazuka Hyogo Jp Wakimasu; Akira Sendai Miyagi Jp Ohneda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-07-22
Filing date: 1978-07-21
Publication date: 1989-07-06
Also published as: US4206199A; GB2002387A; DE2832090C2; FR2398051B1; GB2002387B; FR2398051A1; DE2832090A1

Description

Die Erfindung betrifft dem im Anspruch 1 angegebenen Antikörper. Der Anspruch 2 betrifft eine Ausgestaltung dieser Erfindung.

Glucagon ist ein Hormon, das eine sehr wichtige Rolle beim Glucosemetabolismus der Tiere spielt, und es ist klinisch von Bedeutung, seine Konzentration im Blut zu bestimmen.

Glucagon kommt in zwei Formen vor, die strukturell ähnlich sein sollen, nämlich pankreatisches Glucagon

und Darm- Glucagon, und das Glucagon, das den Glucosespiegel des Blutes hauptsächlich beeinflußt, soll das pankreatische Glucagon sein. Somit handelt es sich bei den klinisch erforderlichen Daten hauptsächlich um die Konzentration des Pankreas-Glucagons im Blut, jedoch ist es bekannt, daß die Erzeugung eines Antikörpers durch das Konjugat des verfügbaren Pankreas- Glucagons mit Rinder-Serumalbumin kaum zu einem klinisch brauchbaren Antikörper führt, der spezifisch für Pankreas- Glucagon ist, sondern hauptsächlich ein Antikörper-Kreuzungs- Reagenz mit sowohl Pankreas- als auch Darm-Glucagonen ergibt. Zur Erzeugung eines Antigens, das bei der Produktion eines Antikörpers verwendet werden kann, der spezifisch für Pankreas- Glucagon ist, wurden nun mehrere verschiedene Peptide synthetisch hergestellt, und ihre Charakteristika wurden untersucht. Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, daß ein Pentadecapeptid für den vorstehenden Zweck sehr geeignet ist, welches einem Fragment von dem Aminosäurerest in der 15-Stellung bis zum endständigen C des Glucagons entspricht. Hierauf basiert die vorliegende Erfindung.

Die Erfindung betrifft daher neue Antikörper, die spezifisch reaktiv für Pankreas-Gruppen sind und erhalten werden durch Verabreichung von einem Produkt, hergestellt durch Konjugation eines Glucagon-Fragments (15-29) der Formel:

H-Asp-Ser-Arg-Arg-Al-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- Thr-HO (I)

mit Rinder-Serumalbumin mittels Glutalaldehyd (bzw. Glutaraldehyd) an ein Säugetier.

Sämtliche Abkürzungen, die in der vorliegenden Beschreibung für Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppe, aktive Gruppen usw. verwendet werden, wurden im Einklang mit der Nomenklatur der IUPAC-IUB Commission on Biological Nomenclature oder mit der auf diesem Gebiet üblichen Terminologie gewählt. Im folgenden wird eine Teil-Liste für derartige Abkürzungen angegeben. Es versteht sich, daß, falls Aminosäuren usw. optische Isomere aufweisen, sie die L-Isomeren darstellen, falls nicht anders angegeben.

Arg: Arginin
Trp: Tryphtophan
Asn: Asparagin
Asp: Asparaginsäure
Thr: Threonin
Ser: Serin
Glu: Glutaminsäure
Gln: Glutamin
Ala: Alanin
Val: Valin
Met: Methionin
Met(O): Methionsulfoxid
Leu: Leucin
Nle: Norleucin
Phe: Phenylalanin
Z: Carbobenzoxy
Boc: tert.-Butyloxycarbonyl
OBu^t: tert.-Butylester
OBzl: Benzylester
ONB: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester
MBS: p-Methoxybenzolsulfonyl
HONB: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
DCC: N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid
DCU: N,N′-Dicyclohexylharnstoff
DMF: N,N-Dimethylformamid
NMP: N-Methyl-2-pyrrolidon
TFA: Trifluoressigsäure
THF: Tetrahydrofuran
TEA: Triäthylamin
DCHA: Dicyclohexylamin
CMC: Carboxymethylcellulose
BSA: Rinder-Serumalbumin
Hpa: p-Hydroxyphenylessigsäure
Hpp: p-Hydroxyphenylpropionsäure

Das Peptid (I) kann hergestellt werden durch Verfahrensweisen, die gewöhnlich auf dem Gebiet der Peptid-Synthese angewendet werden. So können sowohl die Synthesemethoden in fester Phase als auch die Synthesemethoden in flüssiger Phase verwendet werden, wobei jedoch in vielen Fällen die Synthese in flüssiger Phase vorteilhaft ist. Derartige Methoden zur Peptid-Synthese wurden beispielsweise beschrieben von Schröder und Lübke in "The Peptides", Band 1 (1966), Academic Press, New York, U.S.A., und von Neurath und Hill in "The Proteins", Band 2 (1976), Academic Press, New York, U.S.A. So können das Azid-Verfahren, das Säurechlorid-Verfahren, das Säureanhydrid-Verfahren, das Gemischte-Säureanhydrid-Verfahren, das DCC-Verfahren, das Aktive Ester-Verfahren, das Verfahren unter Einbeziehung der Anwendung des Woodward's Reagens K, das Carbodiimidazol-Verfahren, das Redox-Verfahren, das DCC/Additiv (z. B. HONB, HOBt, HOSu)-Verfahren usw. genannt werden.

a) Glucagon-Fragment (15-29)

Die Verbindung (I) kann hergestellt werden durch Kondensation eines Ausgangsmaterials mit einer reaktiven Carboxylgruppe, das einem der beiden Fragmente von (I), bei Aufspaltung an einer beliebigen Peptidbindung, entspricht, mit einem passenden Ausgangsmaterial mit einer reaktiven Aminogruppe, das dem zweiten der beiden Fragmente entspricht, in üblicher Weise, und, falls das resultierende Kondensationsprodukt eine Schutzgruppe oder Schutzgruppen trägt, Entfernung dieser Schutzgruppe oder Schutzgruppen in üblicher Weise.

Bei Durchführung der Reaktion zur Herstellung des Peptids (I) wird normalerweise bevorzugt Asp vorher geschützt. In vielen Fällen erhält man das in Betracht gezogene Produkt (I) in der Endstufe durch Entfernung der Schutzgruppen aus dem Peptid (I), das an mindestens einem der Aminosäurerest-Bausteine des Peptids (I) geschützt ist. Der Schutz der funktionellen Gruppen, die an der Reaktion nicht beteiligt werden sollten und die in den Ausgangsmaterialien vorhanden sein können, die für diesen Zweck geeigneten Schutzgruppen, die Entfernung dieser Schutzgruppen, die Aktivierung funktioneller Gruppen, die in die Reaktion einbezogen werden sollen, usw. können in üblicher Weise durchgeführt werden oder aus den bekannten Gruppen gewählt werden.

Als Beispiele für die zum Schutz der Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien geeigneten Aminoschutzgruppen können genannt werden Carbobenzoxy, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, Adamathyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Formyl, o-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothionyl usw. Als Beispiele für Carboxylschutzgruppen können esterbildende Gruppen genannt werden, wie die, die geeignet sind zur Bildung von Alkylestern (z. B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, tert.-Butyl- usw. -estern), des Benzylesters, des p-Nitrobenzylesters, p-Methoxybenzylesters, p-Chlorbenzylesters, Benzhydrylesters usw., und Hydrazid-bildende Gruppen, wie die Gruppen, die geeignet sind zur Bildung von Carbobenzoxyhydrazid, tert.-Butyloxy-carbonylhydrazid, Tritylhydrazid usw.

Als Gruppen zum Schutz der Guanidinogruppe des Arginins können genannt werden Nitro, Tosyl, p-Methoxybenzolsulfonyl, Carbobenzoxy, Isobornyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl usw. Die Guanidinogruppe kann auch geschützt werden in Form eines Salzes mit einer Säure (z. B. Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure usw.).

Die Hydroxylgruppe des Threonins kann geschützt werden beispielsweise durch übliche Veresterung oder Ätherbildung. Als Beispiele für Gruppen, die für diese Veresterung geeignet sind, können genannt werden niedrig-Alkanoylgruppen (z. B. Acetyl), Aroylgruppen (z. B. Benzoyl) und Gruppen, die sich von Kohlensäure ableiten, wie Benzyloxycarbonyl, Äthyloxycarbonyl usw. Als Gruppen, die für diese Verätherung geeignet sind, können genannt werden Benzyl, Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl usw. Die Hydroxylgruppe des Threonins muß jedoch nicht notwendigerweise geschützt werden. Methionin kann vorausgehend in Form eines Sulfoxids geschützt werden. Als Beispiele für die aktivierte Carboxylgruppe in dem Ausgangsmaterial können genannt werden das entsprechende Säureanhydrid, -azid, der aktive Ester (z. B. Ester mit Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid usw.). Einige Reaktionen zur Bildung der Peptid-Bindungen können in Anwesenheit eines dehydratisierenden Mittels durchgeführt werden (wie Carbodiimid-Reagentien, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid; Carbodiimidazol usw.). Die Kondensationsreaktion zur Herstellung des erfindungsgemäßen Peptids (I) kann in Anwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann ausgewählt werden aus den Lösungsmitteln, von denen bekannt ist, daß sie für Peptid-bildende Kondensationsreaktionen geeignet sind. So können beispielsweise erwähnt werden trockenes oder wäßriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Äthylacetat, N-Methylpyrrolidon usw. sowie geeignete Gemische davon.

Die Reaktionstemperatur kann aus dem Bereich gewählt werden, der für die Zwecke der Peptid-bildende Kondensationsreaktionen bekannt ist. So liegt sie normalerweise im Bereich von etwa -40°C bis etwa 60°C und vorzugsweise von etwa -20°C bis etwa 0°C.

Nach der Kondensationsreaktion kann jede Schutzgruppe oder können alle Schutzgruppe, die in dem Peptidprodukt (I) vorhanden sein kann bzw. können, durch übliche Verfahrensweisen entfernt werden. Als Beispiele für derartige bekannte Verfahren können reduktive Verfahren (z. B. die Hydrierung mit einem Katalysator, wie Palladiumruß, Reduktion mit Natriummetall in flüssigem Ammoniak), Acidolyse (z. B. Acidolyse mit einer starken Säure, wie Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure usw.) und so fort genannt werden.

Das Peptid (I), das in vorstehender Weise hergestellt wurde, kann aus dem Reaktionsgemisch durch bekannte Peptid-Abtrennungsverfahren (z. B. Extraktion, Verteilung, Säulenchromatographie usw.) isoliert werden.

Da das Peptid (I) Argininreste enthält, kann es in der Form eines Salzes isoliert werden. Als Beispiele für Säuren, die zur Bildung solcher Salze geeignet sind, können anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure usw., und organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Citronensäure, Oxalsäure, Maleinsäure usw., genannt werden.

Die Ausgangsmaterialien für die Herstellung des Peptids (I) können auch durch die vorstehend genannten üblichen Verfahrensweisen für die Peptid-Synthese hergestellt werden, d. h. durch Kondensation von Aminosäuren in Übereinstimmung mit der Aminosäuren-Sequenz für jedes Ausgangsmaterial.

b) Konjugation des Glucagon-Fragments (15-29) mit Rinder-Serumalbumin mittels Glutalaldehyd (bzw. Glutaraldehyd) und c) ein neuer Antikörper der für das Pankreas-Glucagon spezifisch reaktiv ist

Die Konjugation des so erhaltenen Pentadecapeptids (I) mit Rinder-Serumalbumin kann durchgeführt werden nach dem bekannten Glutalaldehyd- bzw. Glutaraldehyd-Verfahren [z. B. M. Reichlin, J. J. Schnure und K. Vance, "Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine" 128, 347-350 (1968)]. Rinder-Serumalbumin wird als Antigenträger verwendet, und in einigen Fällen kann es ersetzt werden durch andere Proteine, die für diesen Zweck geeignet sind. Das optimale Verhältnis des Glucagon-Fragments (I) zum Rinder-Serumalbumin beträgt 10 mg bis etwa 20 mg, und in vielen Fällen werden zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn der Reaktions-pH-Wert etwa in der Nähe von 7,3 liegt. In vielen Fällen ist bei Raumtemperatur eine Reaktionszeit von 2 bis 6 Stunden angebracht, jedoch erweist sich häufig eine Reaktionszeit von etwa 3 Stunden als besonders günstig.

Das so erhaltene Konjugat kann gegen Wasser bei etwa 4°C dialysiert werden und zu Lagerungszwecken in bekannter Weise lyophilisiert werden.

Das erfindungsgemäße Konjugat ist zur wirksamen Erzeugung eines Antikörpers geeignet, der hochreaktiv und spezifisch für Pankreas-Glucagon ist, wenn es Säugetier (z. B. Kaninchen, Maus) in üblicher Weise verabreicht wird. Das Glucagon-Fragment (I) kann in einer gerade ausreichenden Menge für die Antikörpererzeugung verwendet werden, und in einigen Fällen können fünf subkutane Verabreichungen von jeweils etwa 2 mg in Intervallen von 2 Wochen den Antikörper erzeugen.

Es ist bekannt, daß die Bestimmung des Blutgehalts an Pankreas- Glucagon durch radionimmunologische Untersuchung die Anwendung nicht nur eines Antikörpers, der spezifisch reaktiv für Pankreas-Glucagon ist, erfordert, sondern auch des mit radioaktivem ¹²⁵I oder ¹³¹I jodierten Hormons, das ebenfalls spezifisch reaktiv für den Antikörper ist.

Bei der bekannten radioimmunologischen Untersuchung zur Bestimmung des Blutgehalts an Pankreas-Glucagon wird Jod- Glucagon verwendet. Das Jod-Glucagon jedoch neigt zur Reaktion mit unspezifischen Antikörpern, die kreuzweise reaktiv mit Darm-Glucagon und Pankreas-Glucagon sind. Es ist so bekannt, daß eine selektive Bestimmung des Pankreas-Glucagons allein eine schwierige Aufgabe darstellt.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Antikörper können mit J-markierten Verbindungen, die spezifisch reaktiv mit den erfindungsgemäßen Antikörpern sind und die allgemeine Formel II und II′ aufweisen, zur Bestimmung des Pankreas-Glucagongehaltes im Blut eingesetzt werden.

Das Peptid mit der allgemeinen Formel II

(worin R₁ und R₂ jeweils Wasserstoff oder radioaktives I darstellen; R₃ ein Alkanrest mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ist, der gegebenenfalls NH₂ oder OH enthalten kann; R₄ ein Peptid- Fragment entsprechend den 1 bis 5 Aminosäureresten, die mit 19-Alanyl des Pankreas-Glucagon enden, darstellt; R₅ Met oder Nle bedeutet) reagiert spezifisch mit den erfindungsgemäßen Antikörpern und das Peptid der Formel (II′):

(worin entweder einer der Reste R′₁ und R′₂ radioaktives I bedeutet und der andere H darstellt oder beide Reste R′₁ und R′₂ jeweils radioaktives I bedeuten; R₃ ein Alkanrest mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ist, der gegebenenfalls NH₂ oder OH enthalten kann; R₄ ein Peptid-Fragment darstellt, das den 1 bis 5 Aminosäureresten entspricht, die mit 19-Alanyl des Pankreas- Glucagons enden; R₅ Met oder Nle darstellt) ist wertvoll als diagnostisches Mittel für die radionimmunologische Untersuchung des Pankreas-Glucagons.

Das Peptid II und II′ ist Gegenstand der Stammanmeldung DE-OS 28 32 090.3-42.

Trotz des Einsatzes nur eines Glucagon-Fragments (15-29) zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Antikörper werden Antikörper erhalten, die hochreaktiv spezifisch für Pankreas- Glucagon sind. Dabei ist die Länge des Fragments halb so groß wie die des Glucagons. Außerdem ist das Glucagon-Fragment (15-29) nicht geeignet zur Erzeugung eines Antikörpers, der reaktiv für Darm-Glucagon ist, wenn das Fragment an ein Säugetier verabreicht wird.

In den folgenden Beispielen wurden dünnschichtchromatographische Daten erhalten unter Anwendung der Kieselsäuregel-Platte 60 F₂₅₄ oder der Cellulose-Platte Avicel SF und der folgenden Lösungsmittelentwicklungs-Systeme.

Rf¹= Chloroform-Methanol-Essigsäure= 9 : 1 : 0,5
Rf²= Chloroform-Methanol-Wasser= 7 : 3 : 0,5
Rf³= n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser= 30 : 20 : 6 : 24

Beispiel 1 (1) Verfahren zur Herstellung von Boc-Asn-Thr-OBzl

In 300 ml TFA wurden 112 g Boc-Thr-OBzl gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten geschüttelt. Zu der Lösung wurden 30 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure gefügt, und die Lösung wurde unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in 1 l THF gelöst, und nach dem Kühlen mit Eis wurde die Lösung mit 50 ml TEA neutralisiert. Zu dieser Lösung wurden 76,7 g Boc-Asn-OH zusammen mit 64,5 g HONB und 74,3 g DCC gefügt. Das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt. Nach der Entfernung des ausgefällten Nebenprodukts DCU durch Filtrieren wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde in 1 l Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 10% wäßriger Citronensäure (3×300 ml), gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat (3×300 ml) und Wasser (3×300 ml) in der angegebenen Reihenfolge gewaschen, worauf über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wurde. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und 1 l Äther wurde zu dem Rückstand gefügt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und aus Acetonitril umkristallisiert. Ausbeute 105,1 g (75,2%); Fp. 165-166°C [α] -13,9° (c= 0,9, DMF); Rf¹ 0,51.

Analyse: C₂₀H₂₉O₇N₃
Berechnet:
C 56,75, H 6,90, N 9,92
Gefunden:
C 57,01, H 6,89, N 9,94

(2) Herstellung von Boc-Met(O)-Asn-Thr-OBzl

Zu 50,0 g Boc-Asn-Thr-OBzl wurden 170 ml TFA gefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten geschüttelt. Das Gemisch wurde konzentriert, und 500 ml Äther wurden zu dem Rückstand gefügt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Das Pulver wurde in 400 ml THF gelöst, und nach dem Kühlen mit Eis wurden 20 ml TEA zugesetzt. Anschließend wurde Boc-Met(O)-ONB [hergestellt wie folgt: 31,3 g Boc-Met(O) · OH und 23,3 g HONB wurden in 200 ml THF gelöst, und nach dem Kühlen mit Eis wurden 26,8 g DCC zugesetzt, worauf 4 Stunden gerührt wurde] zu dem Pulver gefügt, und das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert, 200 ml Äthylacetat und 200 ml Äther wurden zugesetzt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und aus Acetonitril erneut ausgefällt. Ausbeute 48,5 g (72,0%); Fp. 145-147°C; [α] -6,5° (c= 1,1, DMF); Rf¹ 0,19.

Analyse: C₂₅H₃₈O₉N₄S
Berechnet:
C 52,62, H 6,71, N 9,82, S 5,62
Gefunden:
C 52,44, H 6,73, N 9,60, S 5,15

(3) Herstellung von Boc-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl

Zu 15,0 g Boc-Met(O)-Asn-Thr-OBzl wurden 45 ml TFA gefügt, und das Gemisch wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Gemisch wurde konzentriert, und 100 ml Äther wurden zugesetzt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtration gewonnen und getrocknet. Es wurde in 50 ml DMF gelöst, und nach Kühlung mit Eis wurden 5,7 ml TEA zugesetzt. Zu dieser Lösung wurde Boc-Leu-ONB (hergestellt aus 6,69 g Boc-Leu-OH, 5,70 g HONB und 6,56 g DCC) gefügt, und das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und 200 ml Äthylacetat wurden zu dem Rückstand gefügt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtration gesammelt und erneut aus Acetonitril-Äthylacetat ausgefällt. Ausbeute 15,0 g (83,4%); Fp. 134-136°C; [α] -15,1° (c= 1,0, DMF); Rf¹ 0,25.

Analyse: C₃₁H₄₉O₁₀N₅S
Berechnet:
C 54,45, H 7,22, N 10,24, S 4,69
Gefunden:
C 54,62, H 7,60, N 9,89, S 3,95

(4) Herstellung von Z-Gln-Trp-OBzl

In 500 ml THF wurden 50,0 g H-Trp-OBzl-p-toluolsulfonat gelöst, und unter Eiskühlung wurden 15,4 ml TEA, 28,0 g Z-Gln-OH, 19,7 g HONB und 22,7 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt. Das ausgefällte DCU wurde abfiltriert, das Filtrat wurde konzentriert, und der Rückstand wurde in 300 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigtem wäßrigen Natriumhydrogencarbonat (2×150 ml), 10%iger wäßriger Citronensäure (2×150 ml) und Wasser (2×150 ml) in der angegebenen Reihenfolge gewaschen. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels wurde der Rückstand in 300 ml THF gelöst, und der unlösliche Anteil wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert, und es wurden 500 ml Äther zugesetzt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und aus Acetonitril umkristallisiert. Ausbeute 46,1 g (82,8%); [α] +5,8° (c= 1,0, DMF); Rf¹ 0,60.

Analyse: C₃₁H₃₂O₆N₄
Berechnet:
C 66,89, H 5,80, N 10,07
Gefunden:
C 66,79, H 5,71, N 10,20

(5) Herstellung von Z-Val-Gln-Trp-OH

In 700 ml Methanol wurden 50,0 g Z-Gln-Trp-OBzl gelöst, und es wurde eine katalytische Hydrierung (Katalysator: Palladiumruß) während 5 Stunden durchgeführt. Die resultierenden Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen, in 300 ml DMF suspendiert und durch Zugabe von 13 ml TEA gelöst. Der Katalysator wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde zu 37,6 g Z-Val-ONB gefügt, und das Gemisch wurde 10 Stunden gerührt und mit 100 ml 1n-Chlorwasserstoffsäure neutralisiert.

Zu dieser Lösung wurden 500 ml Wasser gefügt, und das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und gut mit Methanol gewaschen. Ausbeute 43,0 g (84,7%); Fp. 246-247°C; [α] +12,4° (c= 0,9, DMF); Rf¹ 0,14.

Analyse: C₂₉H₃₅O₇N₅
Berechnet:
C 61,58, H 6,24, N 12,38
Gefunden:
C 61,86, H 6,30, N 12,36

(6) Herstellung von Z-Phe-Val-Gln-Trp-OH

In 100 ml Essigsäure wurden 5,1 g Z-Val-Gln-Trp-OH gelöst, und es wurde 3 Stunden lang katalytisch hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde konzentriert. Der Rückstand wurde in 200 ml DMF suspendiert, und Z-Phe-ONB (hergestellt aus 2,70 g Z-Phe-OH) und 2 ml TEA wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 7 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und Essigsäure-Wasser wurde zu dem Rückstand gefügt. Das resultierende Gel wurde durch Filtrieren gewonnen und aus Methanol erneut ausgefällt. Ausbeute 5,50 g (84,5%); Fp. 240°C; [α] +4,1° (c= 1,0, DMF); Rf¹ 0,15.

Analyse: C₃₈H₄₄O₈N₆ · 1/2 H₂O
Berechnet:
C 63,23, H 6,28, N 11,64
Gefunden:
C 63,11, H 6,29, N 11,80

(7) Herstellung von Boc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH

In einem Gemisch von 150 ml DMF und 50 ml Essigsäure wurden 8,5 g Z-Phe-Val-Gln-Trp-OH gelöst, und es wurde 5 Stunden lang katalytisch hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde konzentriert. Zu dem Rückstand wurden 100 ml Methanol gefügt, und die resultierenden Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen und in 200 ml DMF suspendiert. Zu der Suspension wurden 3,0 ml TEA und Boc-Asp(OBzl)ONB [hergestellt aus 3,9 g Boc-Asp(OBzl)-OH, 2,4 g HONB und 2,7 g DCC] gefügt. Das Gemisch wurde 10 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und Essigsäure-Wasser wurden zu dem Rückstand gefügt. Das resultierende Gel wurde durch Filtrieren gewonnen und erneut aus DMF-Wasser ausgefällt. Ausbeute 6,3 g (58,1%); Fp. 191-192°C (Zers.); [α] -6,2° (c= 1,1, DMF); Rf¹ 0,11.

Analyse: C₄₆H₅₇O₁₁N₇ · 3/2 H₂O
Berechnet:
C 60,64, H 6,63, N 10,76
Gefunden:
C 60,30, H 6,48, N 11,34

(8) Herstellung von Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH

In einem Stickstoffgas-Strom wurden 50 ml TFA zu 6,0 g Boc- Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH gefügt. Das Gemisch wurde 10 Minuten geschüttelt und konzentriert. Zu dem Konzentrat wurde Äther gefügt, und das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und in 100 ml DMF gelöst. Zu der Lösung wurden 2,0 ml TEA gefügt, worauf Boc-Gl-ONB (hergestellt aus 1,76 g Boc-Gln-OH, 1,34 g HONB und 1,54 g DCC) zugesetzt wurden und das Gemisch 15 Stunden gerührt wurde. Zu diesem Gemisch wurde Essigsäure-Wasser gefügt, und das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und erneut aus Acetonitril und Wasser ausgefällt. Ausbeute 5,50 g (82,6%); Fp. 210-212°C (Zers.); [α] -10,1° (c= 1,1, DMF); Rf¹ 0,09.

Analyse: C₅₁H₆₅O₁₃N₉
Berechnet:
C 60,52, H 6,47, N 12,46
Gefunden:
C 60,19, H 6,37, N 12,23

(9) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Ala-OBu^t

In 300 ml Methanol wurden 31,0 g Z-Ala-OBu^t gelöst, und es wurde 5 Stunden katalytisch hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat konzentriert. Getrennt davon wurden 53,0 g Z-Arg(MBS)-OH · DCHA in 500 ml Äthylacetat suspendiert, und die Suspension wurde gut mit 200 ml 10%iger Citronensäure geschüttelt. Es wurde anschließend mit Wasser gespült, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in 500 ml THF gelöst. Zu diese Lösung wurde das vorstehend hergestellte H-Ala-OBu^t gefügt, worauf 14,9 g HONB zugesetzt wurden. Unter Eiskühlung wurden 17,1 g DCC zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 Stunden gerührt. Das ausgefällte DCU wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde konzentriert und in 500 ml Äthylacetat gelöst. Anschließend wurde mit 10%iger wäßriger Citronensäure (3×200 ml), mit gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat (3×200 ml) und mit Wasser (3×200 ml) in der angegebenen Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und 300 ml Äther wurden zu dem Rückstand gefügt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen. Ausbeute: 44,5 g (66,8%); Fp. 126-127°C; [α] -6,0° (c= 1,0, DMF); Rf¹ 0,62.

Analyse: C₂₈H₃₉O₈N₅S
Berechnet:
C 55,52, H 6,49, N 11,56, S 5,27
Gefunden:
C 55,71, H 6,49, N 11,81, S 5,29

(10) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OBu^t

In 500 ml Methanol wurden 43 g Z-Arg(MBS)-Ala-OBu^t gelöst, und es wurde 5 Stunden hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, und der Rückstand wurde in 200 ml DMF gelöst. Zu der Lösung wurden Z-Arg(MBS)-OH [hergestellt aus 49,7 g Z-Arg(MBS)-OH · DCHA] und 14,0 g HONB gefügt, und unter Eiskühlung wurden 16,1 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt. Das ausgefällte DCU wurde abfiltriert, das Filtrat wurde konzentriert, und der Rückstand wurde in 500 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde mit 10%iger wäßriger Citronensäure (3×300 ml), gesättigtem wäßrigen Natriumhydrogencarbonat (3×300 ml) und Wasser (3×300 ml) in der angegebenen Reihenfolge gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und 300 ml Methanol wurden zugesetzt. Die resultierenden Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute 52,4 g (79,2%); Fp. 116-118°C; [α] -8,8° (c= 1,0, DMF); Rf¹ 0,42.

Analyse: C₄₁H₅₇O₁₂N₉S₃ · 2 H₂O
Berechnet:
C 50,86, H 6,35, N 13,02, S 6,62
Gefunden:
C 51,05, H 6,08, N 13,11, S 6,62

(11) Herstellung von Boc-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OBu^t

In einem Gemisch von 80 ml DMF und 300 ml Methanol wurden 30,0 g Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OBu^t gelöst, und es wurde 7 Stunden katalytisch hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Methanol wurde unter verringertem Druck abdestilliert. Zu dem Rückstand wurden 7,3 g Boc-Ser-OH und 6,3 g HONB gefügt. Unter Eiskühlung wurden 7,3 g DCC zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 Stunden gerührt. Das ausgefällte DCU wurde abfiltriert, das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde in 500 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigtem wäßrigen Natriumhydrogencarbonat (2×300 ml) und Wasser (2×300 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde in 30 ml Chloroform gelöst und auf eine Säule mit 400 g Siliciumdioxidgel aufgetragen.

Es wurde mit Chloroform-Methanol-Essigsäure (9 : 0,7 : 0,35) eluiert, und die Fraktionen von 800 ml bis 2 l wurden vereint, konzentriert und mit Äther behandelt unter Bildung eines pulverförmigen Produkts. Ausbeute 25,5 g (79,0%); Fp. 85-88°C; [α] -20,9° (c= 1,0, Methanol); Rf¹ 0,33.

Analyse: C₄₁H₆₄O₁₄N₁₀S₂ · H₂O
Berechnet:
C 49,09, N 6,63, N 13,96, S 6,39
Gefunden:
C 48,96, H 6,55, N 13,70, S 5,84

(12) Herstellung von Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OH

Zu 10,5 g Boc-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OBu^t wurden 50 ml TFA gefügt, und das Gemisch wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Es wurde konzentriert und mit 300 ml Äther behandelt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und in 50 ml DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,1 ml TEA und Boc-Asp(OBzl) · ONB [hergestellt aus 3,40 g Boc-Asp(OBzl) · OH, 1,97 g HONB und 2,27 g DCC] gefügt, und das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert. Zu dem Rückstand wurden Essigsäure- Wasser gefügt, und das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen, getrocknet und erneut aus Acetonitril-Äther gefällt. Ausbeute 6,0 g (51,5%); Fp. 126-130°C; [α] +3,5° (c= 1,0, DMF); Rf¹ 0,17.

Analyse: C₄₈H₆₇H₁₇N₁₁S₂ · 2 H₂O
Berechnet:
C 49,26, H 6,12, N 13,17, S 5,48
Gefunden:
C 49,62, H 5,84, N 13,00, S 5,03

(13) Herstellung von Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met- (O)-Asn-Thr-OBzl

Zu 3,25 g Boc-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl wurden 25 ml TFA gefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten geschüttelt. Anschließend wurde konzentriert, und der Rückstand wurde mit 100 ml Äther versetzt. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Das Pulver wurde in 10 ml NMP gelöst und gut mit 2 ml TEA geschüttelt, worauf 100 ml Äther zugesetzt wurden. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren erneut gewonnen und in 100 ml DMF gelöst. Zu der Lösung wurden 4,80 g Boc-Gln-Asp-(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH und 2,70 g HONB gefügt. Unter Eiskühlung wurden 1,55 g DCC zugesetzt, und das Gemisch wurde 58 Stunden gerührt, bis ein gelartiges Reaktionsgemisch erhalten wurde.

Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde gut mit wäßrigem Acetonitril gewaschen. Ausbeute 5,75 g (76,8%); Fp. 234°C (Zers.); [α] -15,8° (c= 0,4; Essigsäure); Rf² 0,63.

Analyse: C₇₇H₁₀₄O₂₀N₁₄S
Berechnet:
C 58,61, H 6,64, N 12,43, S 2,03
Gefunden:
C 59,13, H 6,96, N 12,40, S 1,70

(14) Herstellung von Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala- Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl

Zu 5,20 g Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(O)-Asn- Thr-OBzl wurde 1 ml Anisol gefügt, und in einem Strom von Stickstoffgas wurden 35 ml TFA zugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten gerührt und konzentriert. Der Rückstand wurde mit 100 ml Äther versetzt, und das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen. Das Pulver wurde in 20 ml NMP gelöst und gut mit 2,77 ml TEA geschüttelt, worauf 200 ml Äther zugesetzt wurden. Das resultierende Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und in 150 ml DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurden 3,66 g Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OH und 2,36 g HONB gefügt. Das Gemisch wurde mit Eis-NaCl auf -10°C gekühlt, worauf 1,02 g DCC zugefügt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C während 10 Stunden gerührt und anschließend bei Raumtemperatur während 24 Stunden, das ausgefällte DCU wurde abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und 50 ml Wasser wurden zu dem Rückstand gefügt. Das Pulver wurde durch Filtrieren gewonnen und gut mit wäßrigem Acetonitril gewaschen. Ausbeute 5,3 g (61,1%); Fp. 237°C (Zers.); [α] -7,1° (c= 0,9, Essigsäure); Rf² 0,63.

Analyse: C₁₂₀H₁₆₁O₃₄N₂₅S₃ · 2 H₂O
Berechnet:
C 54,82, H 6,32, N 13,32, S 3,57
Gefunden:
C 54,47, H 6,16, N 13,07, S 3,47

(15) Herstellung von H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val- Gln-Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OH

Zu 400 mg Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-Gln-Asp(OBzl)- Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl wurden 0,25 ml Anisol gefügt. Es wurden 5 ml Methansulfonsäure zugefügt, und das Gemisch wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurden 100 ml Äther zugesetzt, worauf eine ölige Ausfällung erhalten wurde. Der Äther wurde durch Dekantieren entfernt, der Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch eine Säule (1×10 cm) von Amberlite IRA-410 (Acetat-Form) geführt. Der Abstrom (50 ml) wurde mit Eis gekühlt und mit 10 ml 3 n-wäßrigem Ammoniak bei 0°C während 30 Minuten gerührt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 30 ml Wasser gelöst und auf eine Säule (2,2×18 cm) von CMC aufgegossen. Es wurde nach der linearen Gradienten-Methode von Wasser (500 ml) auf 0,2 m-wäßriges Ammoniumacetat (500 ml) eluiert. Die Fraktionen von 150 ml bis 195 ml wurden vereint und lyophilisiert. Ausbeute 150 mg. Dieses Produkt wurde in 20 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde auf eine Säule (1,6×5 cm) von Amberlite XAD-2 aufgegossen. Es wurde nach der linearen Gradienten-Methode von Wasser (200 ml) bis 80% Äthanol (200 ml) eluiert, und die Fraktion von 180 ml bis 225 ml wurden vereint. Das Äthanol wurde abdestilliert, und der Rückstand wurde lyophilisiert. Ausbeute 115 mg; [a] -33,6° (c= 0,6, 50%ige wäßrige Essigsäure); Rf³ 0,54 (Avicel), Aminosäure-Analyse (Hydrolyse mit 5,7 n-HCl, enthaltend 4% Thioglykolsäure): Arg 2,03(2); Trp 0,87(1); Asp 3,03(3); Thr 0,97(1); Ser 0,73(1); Glu 2,13(2); Ala 1,00(1); Val 1,03(1); Met 1,00(1); Leu 1,03(1); Phe 1,03(1) (Peptid-Gehalt 85,7%).

(16) Herstellung von H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val- Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH [Glucagon (15-29)]

In 20 ml 5%iger wäßriger Thioglykolsäure wurden 225 mg H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(O)- Asn-Thr-OH gelöst, und die Lösung wurde 20 Stunden bei 50°C stehengelassen, wobei sich ein Gel abschied. Das Wasser wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde in 5 ml 50%iger Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde auf eine Säule (2,3×118 cm) von Sephadex G-25 aufgegossen, und es wurde mit 50%iger wäßriger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen von 180 ml bis 240 ml wurden vereint und lyophilisiert. Ausbeute 220 mg; [α] -30,0° (c= 0,3, 50%ige wäßrige Essigsäure); Rf³ 0,59 (Avicel); Aminosäure-Analyse (Hydrolyse mit 5,7 n-HCl, enthaltend 4% Thioglykolsäure): Arg 2,15(2); Trp 0,91(1); Asp 3,13(3); Thr 0,99(1); Ser 0,87(1); Glu 2,20(2); Ala 1,05(1); Val 0,96(1); Met 1,00(1); Leu 1,07(1); Phe 1,07(1) (Peptid-Gehalt 79,3%).

Beispiel 2 Herstellung von Glucagon (15-29)-BSA-Konjugat

In 4 ml 0,2 m-Phosphatpuffer (pH 7,3) wurden 10 mg Glucagon (15-29) und 20 mg BSA gelöst, worauf 4 ml 5%iger wäßriger Glutalaldehyd zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt, dialysiert (gegen Wasser, 4×2 l) bei 4°C und lyophilisiert. Ausbeute 38 mg.

Beispiel 3 Herstellung des Antikörpers

In 1 ml destilliertem Wasser wurden 8 mg des Konjugats von Glucagon (15-29) mit BSA [das Konjugat von 2 mg Glucagon (15-29) bis BSA], hergestellt in der gleichen Weise wie in Beispiel 2, gelöst, worauf 1 ml komplettes Freund-Adjuvans zugesetzt wurde. Die Bestandteile wurden gut vermischt zur Bildung einer Emulsion und Kaninchen an verschiedenen Stellen injiziert. Die vorstehende Arbeitsweise wurde fünfmal in Intervallen von 2 Wochen wiederholt, und am 10. auf die Injektion folgenden Tag wurden Blutproben entnommen, und es wurde eine Kontrolluntersuchung vorgenommen. Das Ergebnis zeigte, daß der Glucagon-Antikörper erzeugt war, der spezifisch mit Pankreas-Glucagon reagierte, jedoch nicht mit Darm-Glucagon reagierte und mit einem endgültigen Verdünnungsfaktor vom 63 000-Fachen verwendbar war. Dieser Antikörper reagierte nicht mit verschiedenen Glucagon-Fragmenten [Glucagon (15-23) NH₂, Glucagon (1-14) OMe, Glucagon (25-29)].

Als Reaktionsfähigkeit des resultierenden Peptids (II′) mit Antikörpern spezifisch für Pankreas-Glucagon (G-21A, G-42) wird in der Fig. 1 gezeigt [K. Shima und P. P. Foa, Clin. Chim. Acta 22, 511 (1968)].

G-21A ist ein PG-spezifischer Antikörper, der hergestellt wurde unter Verwendung von Glucagon (Vergleich), wohingegen G-42 ein erfindungsgemäßer PG-spezifischer Antikörper ist, der hergestellt wurde unter Verwendung des Glucagon-Fragments (15-29). In Bezug auf diese beiden Antikörper entwickelt das Peptid (II′) eine Reaktivität gleich der von Jodglucagon.

Claims

1. Spezifisch für Pankreas-Glucagon reaktiver Antikörper, erhalten durch Verabreichung des Produkts, erhalten durch Konjugation des Peptids der Formel H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- Thr-OHmit Rinder-Serumalbumin mittels Glutalaldehyd oder Glutaraldehyd, an ein Säugetier.

2. Antikörper nach Anspruch 1, erhalten durch Verabreichung an Kaninchen.