DE2532823A1 - Neue polypeptide - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Polypeptide, insbesondere auf Polypeptide mit mindestens 4 und bis zu etwa 8 Aminosäuren, sowie auf deren pharmakologisch annehmbare Derivate und Salze. Diese Verbindungen werden oral und parenteral als Kontrazeptive bei Mensch und Tier verwendet.

Die Hauptklasse von Verbindungen, die zur Zeit für Mensch und Tier als Kontrazeptive verwendet u/erden, sind steroidaler Natur. Die am häufigsten verwendeten Mittel sind Kombinationen aus Progestogenen, wie Norethindron und Ethynodiol, mit Gstrogenen, wie Ethinylöstradiol und Mestranol. Die Verwendung dieser oralen Kontrazeptive ist mit einem bestimmen Maß an bekanntem Risiko verbunden. Die Hauptgefahr besteht im Auftreten von Thromboernbolien, obgleich auch andere Nebenwirkungen, wie erhöhter Blutdruck und Veränderungen im Stoffwechsel von Lipiden und Kohlehydraten sowie verschiedene andere Symptome, wie Kopfschmerzen, Zurückhaltung _UQn Flüssigkeit und Salz, Aufgeschwemmtwerden und Übelkeit, auftreten können.

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Man ist daher seit langem interessiert, einen geeigneten Ersatz für steroidale Kontrazeptive zu finden.

Es wurde nun ein neues Tetrapeptid aus den Zwei- bis Vier-Zellen-Entwicklungsstufen in den Eileitern von prograviden Hamstern isoliert. Dieses Tetrapeptid und bestimmte verwandte Peptide, Derivate und Salze sind bei oraler oder parenteraler Uerab-. reichung u/ertvolle Kontrazeptive. Das isolierte Produkt ist Threonyl-prolyl-arginyl-lysin.

Der Einfachheit halber u/erden im folgenden die üblichen Abkürzungen für Aminosäuren verwendet, nämlich

Thr - Threonin Ser - Serin

Pro - Prolin HyPro - Hydroxyprolin

Arg - Arginin Orn - Ornithin

Lys - Lysin His - Histidin

Somit würde das obige Tetrapeptid als

Thr-Pro-Arg-Lys

bezeichnet. Dies ist die Grundeinheit, auf welcher die vorliegende Erfindung beruht. Zur Bildung anderer wertvoller Verbindungen können bestimmte, im folgenden beschriebene Modifikationen verwendet werden. Die Grundeinheit ist jedoch immer eine hydroxyI-substituierte Aminosäure als endständige Aminosäure. Diese kann entweder Thr oder Ser sein.
Modifikationen der Grundeinheit umfassen:

1. Thr ersetzt durch Ser unter Bildung von

Ser-Pro-Arg-Lys

2. Pro ersetzt durch HyPro unter Bildung von

Thr-HyPro-Arg-Lys Ser-HyPro-Arg-Lys

5 O 9 8 ft 7 / 1 f) 8 5

3. Arg'ersetzt durch Lys unter Bildung von

Thr-Pro-Lys-Lys Ser-Pro-Lys-Lys Thr-HyPro-Lys-Lys Ser-HyPro-Lys-Lys

4« Lys ersetzt durch Arg unter Bildung von Thr-Pro-Arg-Arg Ser-Pro-Arg-Arg Thr-HyPro-Arg-Arg Ser-HyPro-Arg-Arg

5. Lys ersetzt durch Arg und Arg ersetzt durch Lys unter Bildung

Thr-Pro-Lys-Arg

Ser-Pro-Lys-Arg

Thr-HyPro-Lys-Arg

Ser-HyPro-Lys-Arg

6. Arg ersetzt durch Orn unter Bildung vorn

Thr-Pro-Orn-Lys

Ser-Pro-Qrn-Lys

Thr-HyPro-Orn-Lys

Ser-HyPro-Orn-Lys

Thr-Pro-Drn-Orn

Ser-Pro-Orn-Orn

Thr-HyPro-Orn-Orn "

Ser-HyPro-Orn-Orn

Thr-Pro-Lys-Orn

Ser-Pro-Lys-Orn

Thr-HyPro-Lys-Orn

Ser-HyPro-Lys-Orn

7. Arg ersetzt durch His unter Bildung von

Thr-Pro-His-Lys Ser-Pro-His-Lys Thr-HyPro-His-Lys Ser-HyPro-His-Lys

1Π8Β.

- 4 - ■

Thr-Pro-His-His

Ser-Pro-His-His

Thr-HyPro-His-His

Ser-HyPro-His-His

Thr-Pro-Lys-His

Ser-Pro-Lys-His

8. Lys ersetzt durch Orn unter Bildung von

Thr-Pro-Arg~Orn

Ser-Pro-Arg-Orn

Thr-HyPro-Arg-Orn

Ser-HyPro-Arg-Drn

Thr-Pro-Lys-Orn

Ser-Pro-Lys-Orn

Thr-HyPro-Lys-Orn

Ser-HyPro-Lys-Orn

Thr-Pro-Orn-Arg

Ser-Pro-Orn-Arg

Thr-HyPro-Orn-Arg

Ser-HyPro-Orn-Arg

9. Lys ersetzt durch His unter Bildung von

Thr-Pro-Arg-His

Ser-Pro-Arg-Kis

Thr-HyPro-Arg-His

Sör-HyPrO'-Arg-His

Thr-Pro-Lys-His

Ser-Pro-Lys-His

Thr-HyPro-Lys-His

Ser-HyPro-Lys-His

Thr-Pro-His-Arg

Ser-Pro-His-Arg

Thr-HyPro-His-Arg

Ser-HyPro-His-Arg

10. Lys ersetzt durch Orn und Arg ersetzt durch His unter Bildung von

Thr-Pro-His-Orn

Ser-Pro-His-Orn

Thr-HyPro-His-Grn Ser-HyPro-His-Orn Thr-Pro-Orn-His

Ser-Pro-Orn-His

Thr-HyPro-Orn-His Ser-HyPro-Orn-His Thr-Pro-Orn-His

Ser-Pro-Orn.-His

Thr-HyPro-Orn-His Ser-HyPro-Drn-His

Geeignete Derivate der obigen Tetrapeptide können nach üblichen chemischen Verfahren hergestellt werden. Die meisten dieser Derivate werden durch Reaktionen hergestellt, in welchen aktive Wasserstoffatome, z.B. iri freien Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppen teilhaben. ^o können z.B. freie Hydroxyl-, Amino- oder Guanidinostickstoffatome mit Acylgruppen mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen acyliert werden. Solche Modifikationen, insbesondere, wenn die Acylgruppe 10 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, erhöhen die Lipidlöslichkeit der Verbindung und erleichtern den Transport über die Zellbarrieren. Der Argininteil kann nitriert sein.

Weiterhin kann man eine freie Hydroxyl- oder Aminogruppe mit einer

kann
anderen Aminosäure acylieren^ so/die Hydroxylgruppe im Thr, Ser oder HyPro; die Guanidingruppe im Arg; oder die £-Aminogruppe in Lys mit einer anderen Aminosäure, wia Glycin, Phenylalanin, Lysin usw. zu einem Derivat umgesetzt werden. Dieses Verfahren ist besonders geeignet, wenn die Verbindung oral verabreicht werden soll, da die Anwesenheit zusätzlicher Aminosäuren beim Schutz der Grundeinheit gegen den Angriff durch proteolytische

Enzyme des Verdauungssystems hilft.

Auch die Carboxylgruppe im' endständigen Carboxylteil der Grundeinheit oder die Aradnogruppe im endständigen Aminoteil der Grundeinheit können als Reaktionsstelle für die Addition von Aminosäuren zur Verlängerung der Tetrapeptidgrundeinheit unter Bildung von Peptiden tftit bis zu etwa 8 Aminosäuren dienen. Die Einheit kann durch Kombination der Carboxylgruppe auf dem endständigen Lysinteil eines Tetrapeptids mit der £-Aminogruppe auf dem endständigen Lysinteil eines anderen, identischen Tetrapeptids wiederholt werden»

Die endständdge Aminogruppe kann auch mit der Carboxylgruppe von Cystein kombiniert u/erden. Die Oxidation des erhaltenen Pentapeptids bildet ein durch Cystin verbundenes Nonapeptid-dimeres.

Die Hydrophilität kann erhöht werden, indem man freie Hydroxylgruppen mit Saeehariden, insbesondere Monosacchariden, uiie Glucose,. Galactose,. Mannose usw., unter Hemiacetaibildung zu entsprechenden Derivaten umsetzt.

Freie Carboxylgruppen· können durch Umwandlung in Amide oder Ester stabilisiert werden..

Die bei der Bildung d-ieser verschiedenen Derivate angewendeten Reaktionen sind bekannt.»

Ein besonderer Vorteil aus der amphoteren Natur der erfindungsgemäßen Peptide besteht darin, daß sie in Form pharmakologisch annehmbarer Salze verwendet werden können. Diese Salze haben den l/orteil einer erhöhten IVasserlöslichkeit und sind besonders geeignet zur parenteralen Verabreichung. Von den Metallsalzen

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werden die Alkali- und Erdalkalimetallsalze) insbesondere die TJatriumsalze aufgrund ihrer leichten Herstellung, bevorzugt.

Die Säuren, die zur-Herstellung der erfindungsgemäßen, pharmakologisch annehmbaren Säure-Additionsalze verwendet werden können, enthalten nicht-toxische Anionen und umfassen z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Gluconsäure, Saccharinsäure und ähnliche Sauren.

Aus der Untersuchung der oben Gesagten geht hervor, daß die erfindungsgemäßen produkte als Polypeptide mit mindestens 4 und bis zu etiua 8 Aminosäuren definiert werden können, wobei die 4 Aminosäuren

(1) aus der Gruppe von Thr, Pro, Arg, Lys,3er, HyPro, Om und His ausgewählt sind und

(2) in einer Tetrapeptideinheit gebildet werden, deren endständiger Aminoteil Thr oder Serist, wobei Thr oder Serin einer Peptidbindung durch ihre Carboxylgruppe an die Aminogruppe von Pro oder

HyPro gebunden sind;

Amino-

die restlichen beiden/Säuren des Tetrapeptids werden aus der Gruppe von Ar, Ly, Orn und His ausgewählt. Unter die Definition der erfindungsgemäßen Produkte fallen auch die pharmakologisch annehmbaren Salze und Derivate der Polypeptide.

Obgleich gewöhnlich bevorzugt wird, daß die zusätzlichen, an die Grundpeptideinheit gebundenen Aminosäuren von den oben genannten 8 Aminosäuren oder Cystein ausgewählt werden, braucht dies nicht unbedingt der Fall zu sein, und man kann jede bekannte Aminosäuren wählen.

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Die bevorzugten Aminosäuren für alle erfindungsgemäß verwendeten Peptide sind die natürlich vorkommenden L-Aminosäuren.

Von Standpunkt der Aktivität und Herstellungskosten sind die
besonders bevorzugten Gruhdtetrapeptide solche, in u/elchen die amino-enständige Aminosäure Thr oder Ser, die nächste benachbarte Aminosäure Pro oder HyPro und die abschließenden beiden
Aminosäuren Arg und Lys in dieser Reihenfolge sind.

Die erfindungsgemäßen Produkte können allein verabreicht werden;
gewöhnlich erfolgt jedoch die Verabreichung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger, dessen Anteil durch
die Eignung und chemische Natur desselben, die gewählte" Verabreichungsweise und die übliche pharmazeutische Praxis bestimmt wird. So können z.B. die erfindungsgemäßen Produkte oral in Form von Tabletten oder Kapseln verabreicht werden, die als Streckmittel Stärk©, Milchzucker, bestimmte Arten von Ton usw. enthalten. Sie können enterisch überzogen sein, so daß sie beständiger sind gegen die Magensäure und die Verdauungsenzyme. Zur intravenösen und
intramuskulären Verabreichung können sie in Form einer sterilen
Lösung verwendet werden, die andere Solute, z.B. ausreichend Kochsalzlösung oder Glucose, enthält, um die Lösung isotonisch zu machen, Weiter können sie in einem Ölträger, wie Sesamöl, verabreicht
werden.

Die erfindungsgemäßen Produkte sind wertvolle therapeutische Mittel für Mensch und Tier. Die zweckmäßgste Dosis wird von Arzt oder Tierarzt bestimmt. Sie kann von Fall zu Fall in Abhängigkeit von den üblichen, zu berücksichtigenden Faktoren variieren.

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Geeignet sind Dosiseinheiten von etwa 0,15-0,5 mg. Eine typische Therapie zur subkutanen Verabreichung an eine Frau üblicher Größe beträgt etwa 0,2 mg pro Tag. Die'Dosis kann bei oraler l/erabreichung erheblich variieren, da ein Teil des aktiven Materials im Verdauungstrakt hydrolysiert werden kann. Wie oben erwähnt, kann jedoch die Tetrapeptidgrundeinheit durch Bildung von Derivaten, insbesondere Peptiden mit zusätzlichen Aminosäuren, gegen eine vorzeitige Hydrolyse geschützt werden.

Ein besonderer V/orteil der erfindungsgemäßen Produkte besteht darin, daß aufgrund ihres relativ niedrigen Molekulargewichtes keine Gefahr eines Immunansprechens besteht.

Das erfindungsgemäße Tetrapeptid gibt es als Teil eines größeren Moleküls im Hamster und vermutlich in anderen Arten. Dieses große Molekül ist selbst nicht therapeutisch wertvoll. Ein Grund dafür ist u.a. daß es im Gastindividuum ein Antigen-Antikörper-Ansprechen auslöst. Ein anderer Grund ist seine zu schmierige Isolierung in geeigneten Mengen. Andererseits kann das Tetrapeptid in geeigneten therapeutischen Mengen zu vernünftigen Kosten leicht chemisch synthetisiert werden.

Das Isolierungsverfahren für das erfindungsgemäße Tetrapeptid ist ujie folgt:

Die Eileitern von 10 prograviden Hamstern wurden 40 Stunden nach dam Koitus entfernt und im Gebiet der-Ampulle mit einem Fiikromesser geöffnet. Bai direkter und indirekter Beleuchtung unter Verwendung eines 70-fach auflösenden Mikroskops konnte man die Ziuei-Zellen-Stadien sehen. Die Zellen wurden mit einer Augentropfpipette aus zugefügtem ionen-freiem Wasser

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gesammelt, bei 3.00 G zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen* Der Rückstand wurde in 0,02M Ammoniumacetat gewaschen, dann in eine Homogenisierungsvorrichtung aus Teflon und Glas eirtgespült, homogenisiert und aus einem Lyophilisierungsrohr lyophilisiert.

Der Rückstand wurde mit 0,02M Ammoniumacetat rekonstituiert und auf eine 0,9 χ 71 cm G-10 "Sephadex"-Kolonne (3 Waschen mit einem Gesamtvolumen von 1 ecm) gegeben. Die Kolonne wurde mit 0,02M Ammoniumacetat eluiert. Es wurden 1-ccm-Aliquote gesammelt und die breiten Gebiete erneut eluiert. Aufeinanderfolgende Eluierungen ergaben die Isolierung von 4 Spitzen bei 260-280 nm;I, IA, II und III» Die Spitze I erschien unmittelbar nach dem Hohlraumvolumen und wurde von einer sehr geringen IA Spitze gefolgt.

Die IA Fraktion., ist die aktive Fraktion. Dies wurde bestimmt, indem man 3 Tiere 4 Tage lang, beginnend am Morgen nach dem dritten aufeinanderfolgenden Heißwerden, mit 0,1 ccm/Tag injizierte. Die Eierstocke wurden am Tag 5 entfernt und auf Corpora lutea und reife G-raaf'sche Follikel analysiert. Im Fall der biologisch aktiven Fraktion wurde nichts gefunden.

Die Fraktion IA wurde auf einer Beckman/Spince 120 Aminosäure-Analysevorrichtung unter Verwendung von sauren und basischen Kolonnen auf Aminosäuregehalt analysiert. Wie festgestellt wurde, waren als Aminosäuren Thr, Pro, Lys und Arg anwesend. Zur Feststellung der Aminosäuren-Reihenfolge wurde eine Edman-Zersetzung mit Dansylierung der freien endständigen J-Gruppen

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angewendet.

Die erfindungsgemäßen Peptide können nach verschiedenen, derzeit zur Synthese von einfachen und komplexen Polypeptiden und auch relativ niedrig molekularen Proteinen zur Verfügung stehenden Verfahren hergestellt werden. Gewöhnlich erfolgen diese Verfahren mit stufenweise Synthese durch aufeinanderfolgende Additionen von Aminosäuren unter Bildung progressiv größerer Moleküle. Die Aminosäuren werden durch Kondensation zwischen der Carboxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe einer anderen Aminosäure unter Bildung einer Peptidbindung miteinander verbindung. Zur Kontrolle dieser Reaktionen muß die Aminogruppe der einen Säuren und die Carboxylgruppe der anderen Säure geblockt werden, wobei die blockierenden Gruppen selbstverständlich leicht entfernbar sein müssen. Die gesamte Reaktionsfolge muß ohne Eintreten einer Racemisierung der Produkte erfolgen.

Zur Synthese von Polypeptiden sind zahlreiche Verfahren vorgeschlagen worden, und es sind viele verschiedene Blocloarungsmittel bekannt. Die meisten dieser Verfahren sind auf die Synthese der erfindungsgemäßen Polypeptide anwendbar, wobei diese nicht im einzelnen beschrieben zu werden brauchen.

Zwei geeignete Verfahren sind das Merrifield-Verfahren und das N-Carboxy-anhydrid-Verfahren. Beim ersteren wird eine Aminosäure zuerst an ein Harzteilehen, z.B. durch Esterbindung, gebunden, und das Peptid wird in stufenweise Folge durch aufeinanderfolgende Additionen von geschützten Aminosäuren an die wachsende Kette gebildet. Beim letzt-genannten Verfahren wird ein N-Carboxylaminosäureanhydrid mit der Aminogruppe einer

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zuzeiten Aminosäure oder eines Peptids unter solchen Bedingungen umgesetzt, daß die einzige Aminogruppe, die in merklicher Konzentration in reaktionsfähiger Form während des Reaktionsverlaufes anwesend ist, die Aminogruppe ist, die an der Reaktion teilnimmt. Diese Kontrolle erreicht man durch Wahl von Konzentration, Temperatur, Zeit und Wasserstoffionen-Konzentration Die Kupplungsreaktion erfolgt normal erweise unter alkalischen Bedingungen, gewöhnlich bei einem pH-Wert von etwa 8,5-11. Dann wird das Carbamatzwischenprodukt durch Verringern des pH-Wertes auf etwa 3-5 decarboxyliert. Das gebildete Produkt kann ohne Isolierung und unter praktisch denselben Bedingungen mit einem anderen N-Carboxyaminosäureanhyerid umgesetzt werden. Dies ist ein·sehr schnelles Verfahren zur Bildung von Polypeptiden.

Salze der Peptide werden durch übliche Verfahren, z.B. durch Titrieren mit wässriger Säure oder Base, hergestellt.

Die in Fig. 1 dargestellte Synthese zeigt eines von vielen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Tetrapeptidgrundeinheit. In den Gleichungen werden die üblichen Standard-Abkürzungen verwendet, wie z.B.
BOC = tert.-Butoxy
DCC = Dicyclohexylcarbodiimid
Cbz = Carbobenzoxy
TFA = Trifluoressigsäure
R = Harz
Bz = Benzyl.

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₁₃ _ 2532873

Die dargestellte Synthese ist auf die Herstellung aller oben aufgeführten Tetrapeptide anwendbar. Obgleich sie die Verwendung von Lys, Arg, Pro.und Thr zeigt, ist sie auch auf die Herstellung von Tetrapeptiden anwendbar, die HyPro, Ser, Orn und His enthalten. Die Hydroxylgruppe des HyPro und die Iminogruppe des His brauchen nicht geschützt zu werden. Es ist jedoch zweckmäßig und vermutlich besser, die Hydroxylgruppe mit einer Bz Gruppe und die Aminogruppe mit einer Cbz Gruppe zu schützen. Beide schützenden Gruppen können durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Orn ist ähnlich wie Lys und kann praktisch in derselben Weise behandelt werden. Ser ist ähnlich wie Thr und kann ebenfalls in genau derselben Weise behandelt werden.

Beispiel 1 zeigt das Verfahren, angewendet auf die Herstellung zahlreicher erfindungsgemäßer Tetrapeptide. Selbstverständlich ist dies keine Einschränkung, denn, wie oben erwähnt, können viele bekannte Peptidsynthesen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden.

Zur Herstellung von Peptiden mit mehr als,4 Aminosäuren läßt sich das dargestellte Verfahren leicht auf jedes Ende des Tetrapeptids anwenden. So könnte z.B. die an das Harz gebundene Aminosäure Leucin sein. Dann wäre das Produkt:

Thr-Pro-Arg-Lys-Leu

Die Kette könnte auch von der endständigen Aminogruppe durch Addition einer Aminosäure, wie Alanin, oder sogar eines Peptids, wie Lys-Arg, verlängert werden.

Die erfindungsgemäßen empfängnisverhütenden Verbindungen sind bei Mensch und Tier zur Verhütung von Schwangerschaften verwend-

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In einer Untersuchung mit Hamstern uiurde Thr-Pro-Arg-Lys als Diacetat subkutan in isatonischer Lösung in Dosierungen von 2, 10 und 100 Flikrogramm pro g Körpergewicht pro Tag einmal täglich, beginnend am Tag des Eisprungs .( "postovulatory discharge") (-4) vor der Begattung verabreicht. Die Behandlung wurde bis zum 4. Tag nach der Ovulation fortgesetzt. Die Tiere wurden begattet und denn am 10. Tag geschlachtet. Der Uterus wurde geöffnet und die Anzahl der Nidationen gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Test - weibliche Antifruchtbarkeit \l l/ersuchstier - Hamster Verabreichungsweise - subkutan Tag der Begattung - Tag 0 Tag der Autopsie - Tag 10 Träger - Kochsalzlösung

Behandlungsschema - einmal täglich 4 Tage lang bis zur Begattung, beginnend am Tag des Eisprungs

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Tabelle 1

tägl.Dosis Behandl. Gesamtzahl ■ug/100 g dauer; begatteter ' Tage Tiere

Anzahl d.Tiere Gesamtzahl Gesamtzahl mit Nidationen der norm. resorb.

Foeti Foeti

durchschnittl, Anzahl von Nidationen

2,0

10,0

100,0

10/10 10/10 10/10 9/10* 9 1 4 4

82 5

46 53

ein Hamster: kein Sperma gefunden, 5 Eier festgestellt
bei den anderen Tieren wurde Sperma gefunden

2 0 3 1

9,1 0,5 4,6 5,9

NJ CX) V)

- 16 - 25328P3

In einem u/eiteren Test wurden Hamster subkutan in derselben Weise mit angegebenen Mengen derselben Verbindung bei pH 7,1 in Phosphatpuffer behandelt. Berechnet als freie Base lagen die verabreichten Mengen zwischen etwa 0,35-70 ,ug/iOQ g/Tag. Die Fruchtbarkeitsregelung wurde bestimmt, indem man die Eileitern nach 10 Tagen entfernte und die Anzahl der Corpora lutea mit einem Durchmesser von mindestens 0,4 mm histologisch zählte. Es wurde gefunden, daß die Anzahl von Nidationen pro Tier bei einer wirksamen Dosis von 0,7 mcg/g/Tag auf weniger als 1 verringert werden konnte. Bei oraler Verabreichung von 35-50 ,ug/100 g/Tag wurde die Anzahl der Schwangerschaften auf 0 verringert.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1_

Thr-Pro-Arg-Lys

13,8 Millimol N -Cbz-Lys wurden mit 10 g Chlormethylharz (PoIystyroldivinylbenzolchlormethylharz; 2,2 Millimol Chlorid pro g Harz) in einer Mischung aus 12,4 Millimol Triäthylamin und 30 ecm Äthanol 24 Stunden unter ständigem magnetischem Rühren bei 80 C. umgesetzt. Dann wurde das Harz gründlich mit Essigsäure, mit abs. Äthanol, Wasser mit einer erhöhten Äthanolkonzentration und schließlich mit abs. Äthanol sowie Methanol und Methylenchlorid gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum auf ein konstantes Gewicht getrocknet.

1,5 g Harz entsprechend . 0,45 Millimol N^-Cbz-Lys wurden in ein Merrifield-Gefaß mit fester Phase gegeben, das mittels einer Klammer auf den Schaft eines 180° Pendelmotors montiert war. Alle folgenden Arbeiten erfolgten bei Zimmertemperatur mit einer

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einer Schüttelbewegung von 180 , so daß das Harz ständig beiuagt luurde. Die schützende t.-BOC Gruppe wurde mit 15 ecm 5G-/oiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid bei 30 Minuten langer Reak tionszeit abgespalten. Dann wurde das Harz mit Methylenchlorid und anschließend dreimal mit je 15 ecm Chloroform gewaschen; 1 ecm Triäthylamin plus 9 ecm Chloroform u/urden zum Harz zugefügt, und zum Neutralisieren des Hydrochlorids wurde 10 Minuten geschüttelt. Dann wurde wieder wie vorher mit Chloroform und Fiethylenchlorid gewaschen. 1,35 Millimol t-BQC-N -nitroArg in 15 ecm Methylenchlorid wurden an das N uon Lys mit 1,35 Millimo Dicyclohexylcarbodiimid 2 Stunden unter ständigem Schütteln gekuppelt. Das Harz wurde mit Äthanol, Chloroform und 3 Mal mit je 15 ecm· Methylenchlorid gewaschen. Die t-BOC Gruppe wurde uom Lys mit 50-/oiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt, und wie vorher gewaschen und mit Triäthylamin neutralisiert. In ähnlicher Weise wurden 1,35 Millimol t-BOC-Pro an Arg gekuppelt, die schützende Gruppe entfernt, neutralisiert, worauf 1,35 Millimol N -t-BOC-O-Benzylthreonin an das von der schützenden Gruppe befreite N von Pro gekuppelt wurde. So wurden die Stufen der Entfernung der schützenden Gruppen (Abspaltung des t-BÜC allein) mit Trifluoressigsäure, Waschen, Neutralisieren mit Triäthylamin, Waschen und Kuppeln mit Dicyclohexylcarbodiimid in identischer Jeise für jeden 'Aminosäureester wiederholt.

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30 mg des Tetrapeptidharzes wurden mit 6N Salzsäure in Dioxan 18 Stunden hydrolysiert und das Produkt in einer Analysevorrichtung für Aminosäuren analysiert. Es zeigte ein Verhältnis von Thr 1, Lys .1, Pro 1, Arg 1. Der Wert für Arg ist die Summe von Arg, Orn und nitroArg. Das Tetrapeptid wurde mit Bromwasserstoff in Trifluoressigsäure bei Zimmertemperatur 1,5 Stunden vom Harz abgespalten, dann unter Vakuum getrocknet, zweimal mit Wasser gewaschen und lyophilisiert. Sein Gewicht von 176 mg stellt eine 78-^ige Ausbeute, bezogen auf Lys, dar. Dann wurde es in 10 ecm Methanol mit 10 % Essigsäure aufgenommen und der katalytischen Hydrierung mit dem Zweifachen seines Gewichtes, nämlich 350 mg Palladium-auf-Bariumsulfat in einer Wasserstoffatmosphäre bei 4,2 kg/cm Druck unter ständigem Schütteln 24 Stunden unterworfen, wobei kein nitroArg bei 271 m/U, der Absorptionsspitze, festgestellt wurde. Ein Aliquot wurde wiederum mit 6U Salzsäure in Wasser hydrolysiert und analysiert, wodurch man ähnliche Zahlen für Thr, Lys, Pro und Arg erhielt.

Das in Form des Diacetatsalzes vorliegende Tetrapeptid wurde dann durch Zugabe von drei Äquivalenten Natriumhydroxid in das Matriumsalz umgewandelt. Die endgültige Ausbeute betrug etwa 65 %.

Das Verfahren wurde zur Bildung des Tetrapeptide mit allen Aminosäuren in der D-Form wiederholt. Es wurde ein zweites Mal mit Ser anstelle von Thr wiederholt. Es wurden alle L- und D-Formen hergestellt.

In ähnlicher Weise erhielt man die folgenden Verbindungen:

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Thr-HyPro-Arg-Lys

Ser-HyPro-Arg-Lys

Ser-Pro-Lys-Lys

3er-HyPro-Lys-Lys

Ser-Pro-Arg-Arg

Ser-HyPro-Arg-Arg

Thr-Pro-Lys-Arg

Ser-Pro-Lys-Arg

Ser-HyPro-Lys-Arg

Ser-Pro-Orn-Lys

S er-HyP r ο-Om-Ly s

Ser-Pro-Orn-Orn

Thr-Pro-Lys-Orn

Ser-HyPro-Lys-Orn

Ser-HyPro-His-Lys

Thr-Pro-Lys-His

Thr-Pro-Arg-Orn

Ser-Pro-Arg-Grn

Thr-Pro-Lys-Jrn

Thr-Pro-Arg-His

Thr-HyPro-Arg-His

Thr-Pro-Lys-His

Ser-Pro-Lys-His

Thr-Pro-His-Orn

Thr-HyPro-His-Orn

Beispiel

Stearyl-Thr-Pro-Arg-Lys

0,45 Hillimol 0-Bz-Thr-Bcz-Pro-N⁹-WitroArg-N -Lys-Harzester auf 1,3 g Harz uiurden mit 1,5 Millimol Stearinsäure unter Ueriuendung von 1,5 Millimol Dicyclohexylcarbodiimid in 1:1 Chloroform/Dimethylformamid gekuppelt. Das restliche Verfahren zur Abspaltung vom Harz mit HDr in CF,COUH, Entfernung der schützenden Gruppen von Thr und Lys und katalytischen Hydrierung von fJitroArg in Arg und Ammoniak erfolgte wie in Beispiel 1. Die endgültige Ausbeute

- 20 - 2537823

betrug 63-71 %, Ähnliche Ergebnisse erhielt man mit den anderen Fettsäuren bei Ausbeuten zu/ischen 37-67 %, nämlich z.B. mit Essig-, Propion-, Butter-, Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Öl-, Leinöl- und Linolensäure. Im Fall der letzten drei - ungesättigten Fettsäuren konnte keine Hydrierung erfolgen, da diese die olefinische Ungesättigtheit verringern würde. Statt dessen wurde das Peptidharz mit Fluorwasserstoff unter wasserfreien Bedingungen zur Entfernung alier schützenden Gruppen behandelt. Die Ausbeute an Endprodukten mit den ungesättigten Fettsäuren war etwas geringer, nämlich 48-55 %.

5098 8 7/10

Claims (7)

1. _ 21 - 2532873

   Patentansprüche

   1,- Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens v/ier und bis zu etwa acht Aminosäuren enthalten, wobei vier derselben

   (1) aus der Gruppe von Threonin, Prolin, Arginin, Lysin, Serin, Hydroprolin, Ornithin und Histidin ausgeu/ählt und

   (2) zu einer Tetrapeptideinheit gebildet u/erden, deren endständige Aminogruppe die Aminosäure Threonin oder Serin ist, u/obei Threonin oder Serin in einer Peptidbindung durch ihre Carboxylgruppe an die Aminogruppe von Prolin oder Hydroxyprolin gebunden werden:

   und wobei die restlichen zwei Aminosäuren in der Tetrapeptideinheit aus der Gruppe von Arginin, Lysin, Ornithin und Histidin ausgewählt sind.
2. 2.- Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie nur 4 Aminosäuren enthalten.
3. 3.- Polypeptide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die restlichen beiden Aminosäuren der Tetrapeptideinheit Arginin und Lysin sind.
4. 4.- Polypeptide nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die

   Reihenfolge der restlichen beiden Säuren in der Tetrapeptideinheit aus
   /Arginin, das durch seine Carboxylgruppe an die e(-Aminogruppe von

   Lysin gebunden wird, gebildet wird.
5. 5.- Polypeptide nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die

   Reihenfolge der restlichen beiden Säuren der Tetrapeptideinheit aus

   Lysin, das durch seine Carboxylgruppe an die Aminogruppe von Arginin gebunden wird, gebildet wird.

   509887/1085
6. 6,- Polypeptide nach Anspruch 1, nämlich Thr-Pro-Arg-Lys, Thr-Pro-Lys-Arg, Thr-HyPro-Arg-Lys, Thr-HyPro-Lys-Arg und die pharmakologisch annehmbaren Salze und Derivate dieser Polypeptide,
7. 7.- Heilmittel, enthaltend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und mindestens ein Polypeptid nach Anspruch 1 bis 6,

   Der Patentanwalt:

   6 0 9 B B 7 / 1 0 8 δ

   Lee

   rs e ί t e