DE2451841A1 - Biologisch aktive amide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. D3. SAHDMAIR

PATENTANWÄLTE
8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 86 0245 2451841

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapfund Partner, 8 München 86, P.O. Box 860245

Ihr Zeichen Unser Zeichen 25 If 81 8 MÜNCHEN 80 74 Oktober IQ

Yourref. Ourref. Mauerkircherstraße 45 ·" * ·* '

Anwaltsakte-Nr.: 25 481

THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED London, N.W.1 / England

"Biologisch aktive Amide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung"

Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch wirksame Amide bzw. Peptide,deren Säureadditionssalze und Komplexe der Peptide mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen. Ferner betrifft die Erfindung die Herstellung derartiger Peptide, Säureadditionssalze und Komplexe sowie Formulierungen, welche

_Y, ' 5.09819/1164 '.

derartige Peptide, Salze oder Komplexe enthalten,als auch die Herstellung derartiger Formulierungen. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Peptide, Salze und Komplexe in der Human- und Veterinärmedizin.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Analoga von Luteinisierendes Hormon-Freisetzungsfaktor (LH-RH), einem Decapeptid der Struktur

L-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH .

Die hier für die Aminosäuren und ihre Reste benutzten Abkürzungen sind die in der Peptidchemie üblichen und können beispielsweise in Biochemistry, 11., 1726 (1972) nachgesehen werden. Die vorstehenden und alle nachstehenden Angaben beziehen sich auf die L-Aminosäuren und deren Reste mit Ausnahme des Glycins, es sei denn, daß irgendetwas anderes ausgesagt wird.

LH-RH wird aus dem Säugetier-Hypothalamus in die Venen des hypothalamisch-hypophysären Pfortader-Systems freigesetzt und wirkt auf die Vorderhypophyse derart ein, daß diese veranlaßt wird, zwei gonadotrope Hormone, nämlich luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) freizusetzen. LH stimuliert die Synthese von Steroidhormonen in den Gonaden beider Geschlechter und induziert

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ebenfalls beim weiblichen Geschlecht die Ovulation von geeignet gereiften Eierstockfollikeln. FSH stimuliert (beim weiblichen Geschlecht) das Wachstum und die Reife der Eierstockfollikeln und (beim männlxchen Geschlecht) das Wachstum der Samenkanälchen und die AnfangsStadien der Spermatogenese. Die Reifung der Spermatozoen beim männlichen Geschlecht wird durch Androgene gesteuert, deren Bildung durch das LH geregelt wird.

Es wurde nun im Rahmen von Untersuchungen erkannt, daß, wenn die Sequenz von LH-RH in der Form

u - His - Trp - Ser 1 2 3 4

10 9 8 7 6 H₀N-GIy - Pro - Arg - Leu - GIy

geschrieben wird, zu ersehen ist, daß die Aminosäuren um den Tyrosin-Rest symmetrisch verteilt sind. Die Aminosäuren können als folgende Paare betrachtet werden, wobei Tyrosin und Glycinamid keine formelle Partner besitzen:

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Paar Allgemeine Merkmale

Ser, GIy Kleine Seitenkette, hydrophil, jedoch

neutral

Trp, Leu Hydrophob und neutral His, Arg Hydrophil und basisch u, Pro Mittlere Seitenkette mit 5 gliedrigem

Ring, dazwischenliegende Eigenschaft, jedoch neutral

In Anbetracht der deutlichen Struktursymmetrie ist es nicht unbegreiflich, daß die Struktursymmetrie in der aktiven Konformation evident ist und daß der Rezeptor die gleiche Symmetrie besitzt, übereinstimmend mit diesem Konzept der Symmetrie von LH-RH und dem Rezeptor dafür wurde nun gefunden, daß LH-RH-Analoga der allgemeinen Formel I CGlu-His-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-Pro-W

und Säureadditionssalze davon sowohl in vitro- und in vivo-Versuchen LH-RH-Agonist-Aktivität zeigen. Ein LH-RH-Agonist ist, wie allgemein angenommen und nachfolgend angewandt, eine Verbindung, deren biologische Aktivität der Aktivität des natürlichen Hormons sehr ähnelt. So induzieren die Verbindungen der allgemeinen Formel I und deren Säureadditionssalze eine Erhöhung in der Freisetzung von LH und FSH, wenn

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sie mit isolierten Vorderhypophysen von der Ratte inkubiert werden, im Vergleich zu Kontrollergebnissen, die in Abwesenheit derartiger Verbindungen oder Salze erzielt wurden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I und deren Säureadditionssalze induzieren, wie ebenfalls festgestellt wurde, die Ovulation bei Hamstern, deren Ovulation in der Weise, wie es von Arimura et al., Science, 174, Seiten 511 bis 512 (1971) beschrieben worden ist, durch das Natriumsalz von Phenyläthylbarbitursäure unterdrückt worden war.

In der allgemeinen Formel I sind

die Reste X^ und X^ gleich oder verschieden und jeder ist Phenylalanyl, gegebenenfalls im Benzolring substituiert,

'4 6

die Reste X und X gleich oder verschieden und jeder ausgewählt aus Glycyl, Alanyl (D- oder L-) und Asparaginyl,

7
der Rest X ·βίη Rest einer neutralen, hydrophoben, keinen Schwefel enthaltenden, nicht-heterocyclischen Aminosäure, der Rest X ein Rest einer basischen Aminosäure, und

1 der Rest W ausgewählt aus Glycinamid und einer Gruppe -NR R ,

12 '

worin die Reste R , R und das Stickstoffatom zusammen eine Gruppe umfassen, ausgewählt aus Amino, N-Alkylamino, N,N-Dialkylamino, Pyrrolidino, Morpholino und l-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl, wobei das "Alkyl" von 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt und gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist.

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— D —

Der Benzolring der Reste 1? und J? kann durch eine oder mehrere Gruppen, ausgewählt aus Alkoxy (z.B. Methoxy), Halogen (z.B. Chlor), Alkyl (ζ«Β. Methyl), Hydroxyl, Nitro und.Amino substituiert seinj wenn lediglich eine Substituentengruppe vorhanden ist, ist diese vorzugsweise in der 4-Stellung bezüglich des Restes des Moleküls,

Als Beispiel für den Rest X' kann Leucyl, Isoleucyl, VaIy1 und gegebenenfalls substituiertes Phenylalanyl (wie oben in bezug auf die Reste X-und χ·^ beschrieben) erwähnt werden.

8
Als Beispiele für den Rest X kann Arginyl, Lysyl, Histidyl und Homoarginyl genannt werden.

Insofern, als weder die Seryl- noch die Tryptophyl-Reste in die Struktur der Verbindungen der allgemeinen Formel I eingeschlossen sind,.bieten diese Verbindungen bedeutende Vorteile bezüglich der Leichtigkeit der Synthese, wenn man beide mit LH-RH selbst und mit analogen Verbindungen davon vergleicht, welche entweder einen oder beide dieser Reste enthalten. Eine, bei der Einführung des Serylrestes auftretende, inhärente Schwierigkeit besteht darin, daß die Hydroxylgruppe darin geschützt sein muß, wenn eine 0-Acylierung vermieden werden soll. Demzufolge werden zwei Extrastufen in irgendeinem Verfahrenescheraa benötigt, das die Einführung

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von Seryl einbezieht: der Schutz und die nachfolgende Demaskierung der Hydroxylgruppe, wovon die erstgenannte Stufe typischerweise eine besonders mühselige Verfahrensstufe darstellt. Der Tryptophyl-Rest oxidiert leicht, insbesondere unter sauren Bedingungen, wie sie gewöhnlich bei der Peptidsynthese zur Entfernung von Schutzgruppen angewandt werden, und liefert gefärbte Nebenprodukte, die schwierig zu beseitigen sind. Als Folge davon sind Peptide, wie beispielsweise LH-RH, welche den Tryptophyl-Rest enthalten, charakteristischerweise unstabil, ein Nachteil, der von den Verbindungen der allgemeinen Formel I nicht geteilt wird. Eine Unterklasse innerhalb der allgemeinen Formel I sind die Verbindungen und die Salze davon, in welchen

die Reste X^ und Ύ? gleich oder verschieden sind und jeder Phenylalanyl oder Tyrosyl,
der Rest X Glycyl oder Alanyl (D- oder L-),

der Rest X⁶ Glycyl,

7
der Rest X Leucyl oder Phenylalanyl, der Rest X Arginyl,' Lysyl oder Homoarginyl, und der Rest W N-Alkylamino, worin das Alkyl I oder 2 Kohlenstoff atome besitzt, oder l-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl ist.

Als weitere Unterklasse können die Verbindungen und die Salze davon der allgemeinen Formel

L-Glu-His-Phe-X^1>-Tyr-X⁶-X⁷-Arg-Pro-NH.Alk

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erwähnt werden, in welcher

der Rest X Alanyl oder Glycyl,

der Rest X D-Alanyl oder Glycyl,

7
der Rest X Leucyl oder Phenylalanyl, und Alk Methyl oder Äthyl bedeutet.

Es wurde ferner gefunden, daß die weiteren LH-RH-Analoga der allgemeinen Formel Ia und deren Säureadditionssalze

t-Glu-His-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-Pro-W (Ia) worin die Reste X³, x\ X⁵, X⁶, X⁷ und W die gleiche Bedeutung wie in der allgemeinen Formel I besitzen und der Rest

X Glycyl oder gegebenenfalls substituiertes (wie oben.unter Bezugnahme auf Jr und Χ-* beschrieben) Phenylalanyl ist, ebenso LH-RH-Agonist-Aktivität, wie oben bezüglich der Verbindungen der allgemeinen Formel I beschrieben, aufweisen, und es ist ohne weiteres einzusehen, daß diese Analoga ebenso die weiter oben für diese Verbindungen detailliert beschriebenen Vorteile der Synthese besitzen.

Die Aktivität der Verbindungen der allgemeinen Formeln I und Ia hat ihren Sitz in dem Peptid und die Säure in den Säureadditionssalzen ist von geringerer Bedeutung, obwohl für therapeutische Zwecke für den Patienten pharmakologisch und pharmazeutisch annehmbare Säuren vorgezogen werden. Beispiele derartiger geeigneter Säuren umfassen (a) Mineral-

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säuren: Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Salpetersäure und Schwefelsäuren; (b) organische Säuren: Weinsäure, Essigsäure, Citronensäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Glykolsäure, ßluconsäure, Gulonsäure, Bernsteinsäure und Arylsulfonsäure, beispielsweise p-Toluolsulfonsäuren.

Die pharmazeutisch und pharmakologisch annehmbaren Säureadditionssalze sind zusammen mit denjenigen Salzen, die nicht so annehmbar sind (beispielsweise Salze von Fluorwasserstoffsäure und PerChlorsäuren) brauchbar für die Isolierung und Reinigung der Peptide, und es sind die nichtannehmbaren Salze selbstverständlich auch für die Herstellung der annehmbaren Salze nach Arbeitsweisen, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wertvoll. Diejenigen Peptide, welche eine Vielzahl von freien Aminogruppen enthalten, können in Form von Mono- oder Polysäureadditionssalzen erhalten werden, oder als gemischte Salze einer Vielzahl von Säuren.

Die Verbindungen der allgemeinen Formeln I und Ia können nach einem beliebigen Verfahren, wie sie dem Fachmann für die Herstellung von Verbindungen mit analoger Struktur bekannt sind, hergestellt werden. So können sie durch aufeinanderfolgendes Kuppeln von geeigneten Aminosäuren unter Anwendung entweder klassischer Methoden der Peptidsynthese

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oder Verfahren in fester Phase hergestellt werden, oder durch anfängliche Herstellung und nachfolgendes Kuppeln von· Peptid-Untereinheiten. Derartige Reaktionen können bewirkt werden durch beispielsweise Aktivieren der Carbonsäuregruppe der eintretenden Aminosäure und Schützen der nichtreagierenden Amino- und Carbonsäuregruppen. Derartige Techniken sind Standardverfahren in der Peptidchemie. Details über geeignete aktivierende und schützende (maskierende) Gruppen und über geeignete Reaktionsbedingungen (sowohl für die Kupplungsreaktionen und für die Entfernung der schützenden Gruppen), welche ein Minimum an Racemisierung ergeben, können in den nachfolgenden Literaturstellen gefunden werden, die lediglich als Beispiele aufgezählt werden und weder erschöpfend noch beschränkend sind.

(a) Veröffentlichte britische Patentschriften 1 042 487, 1 048 086 und 1 28l 383;
(bj Schroder und Luebke, "The Peptides" (Academic Press) (1965);

(c) Bellean und Malek₈ Jo Am. Chem. Soc, 90, 165 (1968);

(d) Tilak, Tetrahedron Letters, 849 (1970);

(e) Beyerman, HeIv. Chim. Acta, £6, 1729 (1973);

(f) Stewart und Young., "Solid Phase Peptide Synthesis" (W„H. Freeman and Co*) (1969).

Es ist für den Peptid-Pachmann klar_a daß'die Pyroglutamyl-, 509819/1164 .- ii -

Arginyl- und Homoarginyl-(Har)-Reste nicht allein in die Verbindungen der allgemeinen Formeln I und Ia in der beschriebenen Weise inkorporiert werden können sondern daß sie ebenso in situ in der zusammengesetzten Polypeptidkette, oder in einer Peptid-Untereinhe'it davon, durch Umwandlung einer geeigneten Vorstufe davon, gebildet werden können. Demzufolge können die Arginyl- und Homoarginyl-Reste leicht durch Guanidierung eine's Ornithyl- b«w. Lysyl-Restes unter Verwendung eines Reagenses, wie beispielsweise 1-Guany1-3s5~ dimethylpyrazol, gebildet werden. Der Pyroglutamyl-Rest kann durch Cyclisierung eines Glutamyl- oder Glutaminyl-Restes hergestellt werden, der selbst in einer geeignet geschützten Form in das Polypeptid oder eine Untereinheit davon eingeführt und vor der Cyclisierungsstufe demaskiert werden kann, wie das beispielsweise in J. Med.- Chem., _14 (1971) 469, HeIv. Chim. Acta, 53 (1970) 63, Biochem. Biophys. Res. Comm.,.45 (197D 767, 822 und Chem. Berichte, 105 (1972) 2872, beschrieben wird.

Je nach den Reaktionsbedingungen werden die Verbindungen der allgemeinen Formeln I und Ia in Form der freien Basen (Peptide) oder der Säureadditionssalze davon, erhalten. Die Säureadditionssalze können in die freien Basen oder in Salze von anderen Säuren umgewandelt werden, und die Basen können mittels Techniken bekannter Art in die Säureadditionssalze

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davon überführt werden.

Es sei darauf hingewiesen, daß die hier angeführten Beispiele für die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formeln I und Ia einzig und allein der Erläuterung dienen und in keiner Weise die synthetischen Verfahren und Bedingungen, die man anwenden kann, einschränken sollen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formeln I und Ia bilden mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen, wie beispielsweise Zink, Komplexe, und es zeigen derartige Komplexe in vivo bei parenteraler Verabreichung einen verlängerten Wirkungszeitraum im Vergleich mit den nicht-komplexen Peptiden und deren Säurenadditionssalzen. Derartige Komplexe können nach, den bereits bekannten und beispielsweise in der südafrikanischen Patentschrift 73/2419 beschriebenen Verfahren analogen^ Arbeitsweisen hergestellt werden. So können die Zinkkomplexe beispielsweise hergestellt werden, indem man das Peptid in einer wässerigen Lösung, welche überschüssige Zinkionen und gegebenenfalls auch Phosphationen enthält, auflöst und den pH-Wert mit verdünnter Alkalimetallhydroxid-Lösung einstellt, wodurch der Komplex ausgefällt wird. Die Zinkionen können von einer ionisierbaren Zinkverbindung, wie beispielsweise dem Chlorid oder Sulfat und die Phosphationen können, falls zugegen, von einem Alkalimetallphosphat, wie

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beispielsweise Dinatriumhydrogenphosphat, herrühren. Die Peptide der allgemeinen Formel

worin die Reste X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸ und W die gleiche Bedeutung wie oben in den allgemeinen Formeln I und Ia besitzen, deren Säureadditionssalze und deren Komplexe mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen, können demzufolge durch Kondensieren eines Reagenses II

Y¹ - OH . (II)

worin der Rest Y Pyroglutamyl, eine zu Pyroglutamyl cyclisierbare Gruppe oder eine partielle Restesequenz ist, welche Pyroglutamyl oder eine dazu cyclisierbare Gruppe an ih^· rer N-Endgruppe trägt und von dortfan dem oben definierten Peptidprodukt entspricht, mit einem Reagens III

H-Y² (III)

worin der Rest Y dem Rest des oben definierten Peptidprodukt es entspricht, hergestellt werden, wobei die Reagentien Y-OH und H-Y² an den geeigneten Stellen gegebenenfalls geschützt und/oder aktiviert sind und wobei in den Gruppen Y

und Y davon gegebenenfalls irgendein anwesender Arginyl- oder Homoarginyl-Rest in dem vorstehend definierten Peptidprodukt wahlweise durch eine Ornithyl- bzw. Lysyl-Gruppe er setzt wird,
gefolgt, falls erforderlich und geeigneterweise von einer

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oder mehreren Stufen zur Demaskierung des Produktes, Cyclisierung der N-Endgruppe desselben zu dem Pyroglutamyl-Rest, Guanidierung irgendwelcher Ornithyl- oder Lysyl-Reste darin zu den Arginyl- bzw. Homoarginyl-Resten, Umwandlung des Produktes in das Peptid oder in ein Säureadditionssalz davon, und überführen des Peptides mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall in einen Komplex.

Bei der Auswahl der Peptid-Untereinheiten für die Synthese vor einer endgültigen Kondensationsstufe ist es allgemeine Praxisa die folgenden Faktoren zu berücksichtigen. (i) Racemisierung ist so niedrig wie möglich zu halten, Bruchstücke mit endständigen C-GIycylgruppen sind vorteilhaft.

(ii) Bruchstücke mit sehr niedriger Löslichkeit in den normalerweise in der Peptidsynthese verwendeten Lösungsmitteln sind nachteilig.

(iii) Es ist vorteilhaft, wenn die Bruchstücke kristallin sind.

Bezüglich der Verbindungen der allgemeinen Formeln I und Ia entspricht das vorstehend angegebene Reagens Y -OH vorzugsweise (a) dem N-endständigen Dipeptid-Bruchstück; (b) dem N-endständigen Tetrapeptid-Bruchstück; (c) dem N-endständigen Hexapeptid-Bruchstück; oder (d) dem N-endständigen Hepta-

509819/1164 ' ¹^ ~

peptid-Bruchstück des Peptidproduktes, wobei das Reagens H-Y² geeignet gewählt wird.

Wegen ihrer LH-RH-Agonist-Aktivität·, wie sie oben definiert und beschrieben wurde, können die Peptide der allgemeinen Formel I und Ia, deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze und deren Komplexe mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen für die Behandlung von Säugetieren sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin unter Bedingungen verwendet werden, wo das endogene natürliche Hormon (LH-RH) abwesend ist oder wo es wünschenswert ist, daß die endogenen Schwellenwerte desselben ergänzt werden. Demzufolge schließen spezifische Brauchbarkeiten dieser Peptide, Salze und Komplexe folgendes ein, insoweit als die zu behandelnden Zustände ihren Ursprung in einer hypothalamischen Punktionsstörung haben, (i) Beim weiblichen Geschlecht die Behandlung von menstruellen Zyklusstörungen, wie beispielsweise Amenorrhöe; die Stimulation der Ovulation; und die Therapie in Fällen des Fehlens der Entwicklung der sekundären Geschlechtsmerkmale, (ii) Beim männlichen Geschlecht die Induktion der Reife der Spermatozoen und beim weiblichen Geschlecht die Induktion der Ovulation, beispielsweise bei der Therapie der Unfruchtbarkeit.

Eine weitere Brauchbarkeit dieser Peptide, Salze und Komplexe 509819/1164 - i6 -

umfaßt deren Anwendung, wiederum sowohl in der Human- und Veterinärmedizin, als Diagnostiziermittel für die Unterscheidung zwischen hypothalamischen und vorderhypophysären funktioneilen Störungen oder Schäden.

Es ist offensichtlich» daß ganz abgesehen von ihrem Wert in der Humanmedizin diese Peptide, Salze und Komplexe von besonderem kommerziellen Wert in der landwirtschaftlichen Tierhaltung zur Hervorrufung von Fruchtbarkeit bei unfruchtbaren oder wenig fruchtbaren Tieren sind und demzufolge den Erfolg des Viehzüchters begünstigen. Für jede der vorstehend erwähnten Brauchbarkeiten wird die erforderliche Menge an Peptid, Salz desselben oder Komplex davon (nachfolgend als aktiver Bestandteil bezeichnet) selbstverständlich sowohl mit dem besonderen aktiven Bestandteil, als auch mit dem Verabreichungswege variieren. Im allgemeinen jedoch wird für jede dieser Brauchbarkeiten die Dosierung für nasale oder parenterale Verabreichung im Bereich von 0,005 bis 200 pg pro kg Körpergewicht des Säugetieres, vorzugsweise 0,01 bis 100 yg/kg und optimal 0,02 bis 10 yg/kg betragen; für orale oder vaginale Verabreichung wird die Dosis gewöhnlich im Bereich von 0,005 bis 1000 yg/kg, vorzugsweise 0,05 bis 200 yg/kg und optimal 0,2 bis 50 yg/kg sein [wobei alle Dosen bei der Berechnung auf die Base (Peptid) bezogen sind].

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Obwohl es möglich ist, die aktiven Bestandteile als Rohchemikalie zu verabreichen, wird es im Hinblick auf ihre Wirksamkeit vorgezogen, sie als pharmazeutische Formulierung darzubieten.

Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung, und zwar sowohl solche für die Veterinärmedizin als auch für den menschlichen Gebrauch, umfassen einen aktiven Bestandteil, wie oben definiert, zusammen mit einem oder mehreren annehmbaren Trägern dafür und gegebenenfalls anderen therapeutischen Bestandteilen. Der Träger bzw. die Träger müssen "annehmbar" in dem Sinne sein, daß sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und für den Empfänger nicht schädlich sind. Wünschenswerterweise sollten die Formulierungen keine Oxidationsmittel und andere Substanzen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie mit Peptiden unverträglich sind.

Die Formulierungen umfassen solche, die für eine orale, rektale, nasale, örtliche (bukkale), vaginale oder parenterale (einschließend subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Verabreichung geeignet sind, obwohl der meist geeignetste Weg in irgendeinem gegebenen Fall von dem aktiven Bestandteil abhängen wird. Als eine andere Möglichkeit kann ein aktiver Bestandteil als Depotformulierung mit langsam-

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freisetzenden Eigenschaften dargeboten werden, die ihn für eine Implantation in den Körper des Empfängers geeignet machen, zum Beispiel subkutan, intraperitoneal oder intravaginal. Die Formulierungen können bequemerweise in Einheitsdosis-Form dargeboten und nach irgendeinem, dem Pharmazeuten wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren schließen die Stufe der Vereinigung des aktiven Bestandteils mit dem Träger ein_s der sich aus einem oder mehreren Hilfsbestandteilen zusammensetzt» Im allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und inniges Vereinigen des aktiven Bestandteils mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern, oder beiden, hergestellt und anschließend., falls erforderlich, das Produkt zur gewünschten Formulierung geformt.

Formulierungen gemäß.der vorliegenden Erfindung, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, können als getrennte Einheiten, wie zum Beispiel in Form von Kapseln, Cachets oder Tabletten, dargeboten werden,, von denen jede Einheit eine vorher bestimmte Menge des aktiven Bestandteils enthält; als Pulver oder Granulat; oder als Lösung oder Suspension in einer wässerigen Flüssigkeit oder einer nicht-wässerigen Flüssigkeit; oder als eine flüssige Öl-in-Wasser-Emulsion oder als eine flüssige Wasser-in-öl-Emulsion« Der aktive Bestandteil kann ferner auch als Bolus_s Latwerge oder

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Paste dargeboten werden.

Eine Tablette kann durch Komprimieren oder Verpressen, wahlweise mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen, erzeugt werden. Kompretten können durch Verpressen des aktiven Bestandteils in einer frei-fließenden Form, wie zum Beispiel in Form von Pulver oder Granulat, wahlweise mit einem Bindemittel, Schmiermittel, inerten Verdünnungsmittel, einem Gleit-, oberflächenaktivem oder Dispergiermittel gemischt, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Gepreßte Tabletten können durch Verpressen einer Mischung der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.

Formulierungen für die rektale Verabreichung können als Suppositorium mit üblichen Trägern, wie beispielsweise Kakaobutter, dargeboten werden, während eine geeignete Formulierung für nasale Verabreichung Nasentropfen sind, welche den aktiven Bestandteil in wässeriger· oder öliger Lösung enthalten.

Formulierungen, die für eine örtliche Verabreichung im Mund geeignet sind, umfassen Pastillen, welche den aktiven Bestandteil in einer Aromabasis, gewöhnlich Rohrzucker und Gummiarabicum oder Traganth, enthalten; und Pastillen, welche

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den aktiven Bestandteil in einer inerten Basis, wie beispielsweise in Gelatine oder Glycerin_s oder in Rohrzucker und Gummiarabicunii enthalten.

Formulierungenj die für vaginale Verabreichung geeignet sind, können als Pessare, Cremes, Pasten oder Spray-Formulierungen dargeboten werden, welche außer dem aktiven Bestandteil solche Träger enthalten, die dem Fachmann als geeignet bekannt sind»

Formulierungen, die für parenterale Verabreichung geeignet sind, enthalten passenderweise sterile wässerige Lösungen des aktiven Bestandteils ₉ wobei diese Lösungen bevorzugt isotonisch mit dem Blut des Empfängers sind. Derartige Formulierungen können geeigneterweise durch Auflösen des festen aktiven Bestandteils in Wasser zur Gewinnung einer wässerigen Lösung und Sterilisieren der Lösung hergestellt und anschließend mit dem Blut des Empfängers isotonisch gemacht werden.

Ein geeignetes, langsam-freisetzendes Medium für eine Depot-Formulierung ist Polyathylenglykol„

Es versteht sich von selbst, daß die erfindungsgemäßen Formulierungen außer den vorerwähnten Bestandteilen einen oder

ΟΠΟΊΑ i β a « ι 9 8 la/ I I ο 4

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mehrere zusätzliche Bestandteile., wie beispielsweise Verdünnungsmittel, Puffer., Geschmacksmittel_s Bindemittels oberflächenaktive Mittel., Verdickungsmittel, Gleitmittel, Schutzmittel (einschließlich Antioxidantien) und dergleichen, enthalten können.

Dort wo die Formulierung für den Gebrauch in der Humanmedizin oder in der Veterinärmedizin in Einheitsdosis-Form, zum Beispiel in solchen Einheitsdosis-Formen, wie sie in spezifischer Weise oben erwähnt worden sind, dargeboten wird, enthält jede Einheit davon geeigneterweise den aktiven Bestandteil (wie oben definiert) in den folgenden Mengen, wobei sich alle Angaben auf die Base (Peptid) beziehen. Für nasale oder parenterale Verabreichung: 0,25 yg bis 10 mg, vorzugsweise 0,5 yg bis 5 mg, und optimal 1,0 yg bis 500,0 yg. Für orale oder vaginale Verabreichung: 0,25 yg bis 50 mg, vorzugsweise 2,5 yg bis 10 mg, und optimal 10 yg bis 2,5 mg.

Demzufolge schafft die vorliegende Erfindung in verschiedener Hinsicht folgendes:

(a) Die Peptide der allgemeinen Formeln I und Ia, wie oben definiert, deren Säureadditionssalze und deren Komplexe mit pharmazeutisch annehmbaren Metallen.

(b) Verfahren für die Herstellung der Peptide, Salze und Komplexe wie oben beschrieben.

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O O

(c) Pharmazeutische Formulierungen ₉ enthaltend ein Peptid der allgemeinen Formel I oder Ia₃ ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz davon oder einen Komplex davon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall- zusammen mit einem annehmbaren Träger dafür,

(d) Verfahren aur Herstellung der pharmaseutischen Formulierungen, wie sie im vorstehenden Punkt (c) definiert werden.

(e) Verfahren zur Induktion der Reife der Spermatogoen (bei einem männlichen -Säugetier) oder für die Induktion der emulation (bei einem weiblichen Säugetier), welches die Verabreichung eines Peptids der allgemeinen Formel I oder Ia, eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes davon oder eines Komplexes davon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall·., umfaßt«,

(f) Verfahren sur Behandlung der Unfruchtbarkeit hypothalamischen Ursprungs eines Säugetiers _s welches die Verabreichung eines Peptids der allgemeinen Formel I oder Ia, eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes davon oder eines Komplesses davon mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metalls, umfaßt =

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindungs sollen diese jedoch nicht beschränken. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben»

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Beispiel 1 Herstellung der Verbindung (A)
MHu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH. C₃Ii₅

Diese wurde nach dem in der Tabelle I angegebenen Schema hergestellt, worin die verschiedenen schützenden und aktivierenden Gruppen die folgende Bedeutung haben: Z : Benzyloxycarbonyl,

Bu : tert.-Butyl,
CP : 2,4,5-Trichlorphenyl,

BOC : tert.-Butyloxycarbonyl.

Aktivester-Kupplungen wurden in Dimethylformamid bei Raumtemperatur während 24 Stunden durchgeführt. Dicyclohexylcarbodiimid-Kupplungen wurden in Dimethylformamid ausgeführt; nach einer Anfangsphase von 30 Minuten bei -10⁰C wurde die Reaktionsmischung bei 4 C über Nacht gerührt. 1-Hydroxybenzotriazol (1 Äquivalent) wurde in die Reaktions mischung einbezogen, wenn zwei Peptide gekuppelt wurden.

Das Dipeptid (i) wurde durch sorgfältige Verseifung des entsprechenden Methylesters, gefolgt von Extraktion mit heißem Dimethylformamid und nachfolgender Ümkristallisation aus Methanol erhalten.

Die Synthese des Pentapeptid (ii) wurde vom H-Leu-OBu durch stufenweise Zugabe der geeigneten Z-geschützten Aminosäure-

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trichlorphenylester durchgeführt. Bei jeder Kupplungsstufe wurde die acylierende Komponente in einem leichten Überschuß umgesetzt, um eine vollständige Umwandlung sicherzustellen= Der überschüssige aktivierte Ester wurde dann durch Reaktion mit Dimethylaminopropylamin und nachfolgender Extraktion mit 5 £iger wässeriger Citronensäure entfernt.

Die Entfernung von Trichlorphenol aus den Z-Peptid-tert.-butylestern wurde durch Hydrogenolyse der Z-Gruppe und Verteilung der erhaltenen Mischung von partiell geschütztem Peptid und Trichlorphenol zwischen Äther und 1 #iger Essigsäure erreicht. Die Hydrogenolyse wurde in Methanol bei atmosphärischem Druck unter Verwendung von einem Katalysator aus 10 % Palladium auf Holzkohle, und zwar 0,5 g Katalysator pro 10 mMol Peptid, durchgeführt. Beispielsweise wurde die Mischung von Z-Gly-Leu-OBu und Trichlorphenol hydriert und anschließend in der beschriebenen Weise behandelt. Nach Gefriertrocknung des wässerigen Extraktes und Triturieren des erhaltenen Peststoffes mit Äther wurde H-Gly-Leu-OBu in kristalliner Form erhalten. Das aus der Kupplung von Z-Tyr-OCP mit H-Gly-Leu-OBu resultierende Produkt wurde anfänglich als öl erhalten, das durch Behandeln einer methanolischen Lösung des Rohproduktes mit DOWEX 2 (einem stark basischen Anionenaustauscher-Harz vom Polystyrol-Typ) gereinigt.

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Das Dipeptid (i) und der Pentapeptidester (ii) wurden in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol gekuppelt. Wegen der geringen Löslichkeit von (i) in Dimethylformamid wurde die Reaktion in einer Mischung von Dimethylformamid und Wasser bewerkstelligt.

Die Behandlung des erhaltenen Heptapeptidesters (iii) mit Trifluoressigsäure in Anwesenheit von Anisol ergab (iv), welche Verbindung durch Säulenchromatographie an Kieselerde ■gereinigt wurde.

Das Äthylamid von Z-Pro-QH wurde durch eine Mischanhydrid-Kupplung zwischen Z-Pro-OH und Äthylamin hergestellt. Das Kuppeln von B0C(N0₂)-Arg-0H mit H-Pro-NH.CgEL· ergab eine Mischung des gewünschten geschützten Peptids und des Lactams von BOC(NO₂)-Arg-0H, die durch erschöpfende Extraktion des etwas hydrophileren Dipeptide mit Wasser aus einer Äthylacetat-Lösung der Mischung aufgetrennt wurde. Das durch Lyophilisierung erhaltene Produkt (v) der wässerigen Extrakte war nach Dünnschichtehromatographie rein und hatte die korrekte Elementaranalyse»

Nach Demaskierung von (v) mit Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure wurde das Dipeptid"(vi) mit (iv) in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol gekuppelt.

509819/1164 - 27 -

Das Reaktionsprodukt (vii) wurde dann zum Rohprodukt (A) hydriert, wobei die Bedingungen und der Katalysator wie vorstehend waren, mit der Ausnahme, daß das Lösungsmittel Methanol/Wasser/Essigsäure im Verhältnis von 5:1:1 war. Die Reinigung des Endproduktes' (als Diacetat-Additionssalz) wurde, zuerst durch Säulenchromatographie an Kieselerde und anschließend durch Gradientenelutionschromatographie an Carboxymethylcellulose' bewirkt.

Das Produkt war gegenüber Pauly-Reagens (für His und Tyr) und Sakaguchi-Reagens (für Arg) positiv; tert.-Butylhypochlorit/Kaliumjodid/Stärke (ein allgemeines Reagens für Peptide) zeigte lediglich einen Fleck. Das Produkt (als Diacetat-Additionssalz) lief als einzelne Komponente in der DünnschichtChromatographie mit jedem der folgenden Lösungsmittelsysteme:

Chloroform : Methanol: 0,880 Ammoniak, 60 : 45 : 20;

Chloroform : Methanol: 32 #ige Essigsäure, 60:45:20; n-Butanol: Essigsäure: Wasser: Äthylacetat, 1:1:1:1.

Aminosäure-Verhältnisse nach Hydrolyse (βη-Chlorwasserstoffsäure, 110⁰C, 24 Stunden):

GIu : 1,08 His : 1,02 Phe : 1,00 AIa : 1,02 Tyr : 1,00 GIy : 1,03 Leu : 1,03 Arg : 0,96 Pro : 0,99

Rückgewinnung: 91 % (berechnet als Diacetat)

509819/1164 -28-

Charakterisierende Daten .

(a) Laiu-HiB-OH : Schmelzpunkt 213 bis 215°C; [aj^⁸ = +10,5°

(G = I₉ l$ige Essigsäure)
Analyse für C₁₁H₁₁₁Nj₁O₁₁:

Berechnet: C 49₉6 %₃ H 5,27 %, N 21₃05 %', Gefunden : C 49,47 %₉ H 5*37 %₉ N 21_S28 J{; (b) Verbindung (A): Ca]^ = -7O₉I⁰ (C - 1, 15iige Essigsäure);

Ultraviolett-Absopptionsspektrum (in O_sln-Natriumhydroxid):

: 13000; E₃₉₃ : 2600;

Die Werte für die optische Drehung wurden mit einem Bendix-WPL-Automatic-Polarimeter bestimmt„

Beispiel 2

Nach analogen Methoden wie in Beispiel 1 wurden die folgenden Verbindungen hergestellt und gereinigt:

Qlu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH.C₃H₅ (B) Qlu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Lys-Pro-NH.C₃H₅ (C) CGlu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly»Leu~Lys-Pro-NH.C₂H (D) Im Verlauf der Synthese wurden die Zwisehen-Peptidbruchstücke anfänglich in geschützter Form zusammengesetzt und dann wie folgt zum Endprodukt gekuppelt:

(B) Lßiu-His + Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu +

(i) (ii)

509819/1164

(C) ÜUu-His + Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu + Lys-Pro-NH.C₂H

(i) (ii)

(D) L-Glu-His + Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu + Lys-Pro-NH.CgH,-

Im Gegensatz zu (v) in Beispiel 1 wurde das Dipeptid. Z-(BOC)-Lys-Pro-NH.C₂H₅ ohne Schwierigkeit aus Z-(BOC)-LyS-OCP und H-Pro-NH. CpHp. erhalten. Hydrogenolyse unter Anwendung der Bedingungen des Beispiels 1 und nachfolgende Kupplungen zu den zwei geeigneten Heptapeptiden ergab die analogen Verbindungen (C) und (D).

Jede der Verbindungen (B), (C) und (D) (als Diacetat-Additionssalz) lief als einzelne Komponente in der Dünnschichtchromatographie mit jedem der drei Lösungsmittel-Systeme des Beispiels 1. (B) war gegenüber Sakaguchi-Reagens positiv und (B), (C) und (D) waren gegenüber Pauly-Reagens positiv und gaben einen einzigen Fleck mit tert.-Butylhypochlorit/Kaliumjodid/Stärke.

Aminosäure-Verhältnisse (nach Hydrolyse wie in Beispiel 1): (B) GIu : 1,04 Phe : 0,97 GIy : 2,01 Tyr : 0,97 Leu : 1,00 Pro : 0,95 Rückgewinnung: 95 % (berechnet als Diacetat);

509819/1164 -30-

. 30 -

(C) Gin : 1,00 His : 0,9? Phe : 0,96 Ala s 0,99 Tyr : 0,96 GIy : i_s04 Leu : 1,00 Lys ; O_s98 Pro : O_s93 Rückgewinnung: 90 % (berechnet als Diaeetat);

(D) GIu : 1,03 His : l_s02 Phe : 0,98 GIy : 2_sO3 Tyr : 0,98 Leu : 1,00 Lys : 1,02 Pro : O_s88 Rückgewinnung; 90 % (berechnet als Diacetatjo

Charakterisiereade Daten

oh
(a) Optische Drehung ([α]^ in l^iger Essigsäure);

(B) -5Ο.,2° (C = 1); (C) -63,0° ( C = O,33)i (D) -50,8° (C =1).

(b) Ultraviolett-Absorptionsspektra (in O_sln-Natriumhydroxid) : (B) II5OO; (C) 10400; (D) 11400;

Beispiel 3 Herstellung der Verbindungen

Lilu-His-Phe-Äla-Tyr-Gly-Leu-Har-Pro-NH. C₀H₁- (E)

L-Glu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Har-Pro-NH. C₂H (P)

Diese Verbindungen wurden durch Guanidierung der Lysin-8-Reste in den im vorstehenden Beispiel 2 als (C) bzw. (D) identifizierten Verbindungen hergestellt. Spezifische detaillierte Angaben über die Herstellung der Verbindung (E)

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B09S1Q/1184

werden nachfolgend gegeben.

l-Guanyl-3i5-dimethylpyrazol~nitrat (24 mg) wurden in Dimethylformamid (1 ml) gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 10£igem Triäthylamin in Dimethylformamid auf 9.bis 10 eingestellt. Eine Lösung der Verbindung (C) (70 mg, 0,059 mMol) in Dimethylformamid (1 ml) wurde dann zugesetzt und die Mischung 4 Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt mit Äther trituriert und durch Konzentrationsgradienten-Elutionschromatographie an Carboxymethylcellulose gereinigt (als Diacetat-Additionssalz).

Das gereinigte Material (als Diacetat-Additionssalz) lief als einziger Fleck, der gegenüber Pauly- und Sakaguchi-Reagens positiv warj in jedem der drei Dünnschicht-Chromatographie-Lösungsmittelsysteme des Beispiels 1.

Aminosäure-Verhältnisse (nach Hydrolyse wie in Beispiel 1): GIu : 1,13 His : 0,96 Phe : 0,98 AIa : 1,01 Tyr : 0,96 GIy : 0,99 Leu : 1,00 Har : 0,99.Pro : 0,98 In exakt der gleichen Weise wurde die Verbindung (D) in die Verbindung (P) umgewandelt. Das Produkt (als Diacetat-Additionssalz) war in den drei früher beschriebenen Lösungsmittelsystemen chromatographisch homogen und hatte die folgenden Aminosäure-Verhältnisse nach saurer Hydrolyse in der Weise wie in Beispiel 1:

509819/1164

GIu ; 1,04 His : O_s98 Phe : O_s99 GIy : 1₉95 Tyr ; O₉98 Leu : I₉OO Har : O«,97 Pro : O_s96

Beispiel 4

Herstellung der Verbindung (G)

η
MJlu-His-Phe-Gly-Tyr~Gly-Leu-Arg-Pro-l-methyl-5-amino--

methy!tetrazo!

Das Heptapeptid Ü-lu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-OH (i) wurde in einer stufenweisen Reaktion., ausgehend von der Verbin-

t t

dung Z-Leu-OBu (worin Z und Bu die gleiche Bedeutung wie im Beispiel 1 besitzen) und unter Verwendung der 2,4,5-Trichlorphenylester von Bensyloxycarbonylaminosäuren in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt (vgl» Tabelle I).

l-Methyl-5~aminomethyltetrazol-hydrochlorid wurde mit dem p-Nitrophenylester von Behzyloxycarbonylprolin in Dimethylformamid in Anwesenheit von I Äquivalent Triäthylamin gekuppelt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann su einem kristallinen Produkt aufgearbeitet s das einen Schmelzpunkt von 91»0 bis 92°C hatte. Die Bensyloxycarbony!gruppe wurde durch Hydrogenolyse entfernt und das erhaltene N^-Prolyl-(l~methyl-5-aminomethyl)-tetrazol mit BOC-Arg-OH (worin BOG die gleiche Bedeutung wie

NO₂
im Beispiel 1 besitzt) in Dimethylformamid unter Verwendung

9 8 19/1184

der Diimidmethode gekuppelt« Diese Reaktion war, wie im Beispiel 1 beschriebe^ von einer Lactambildung begleitet und es wurde die Abtrennung des gewünschten Produktes von dem verunreinigendem Lactam durch ein ähnliches Extraktionsverfahren bewirkt. Lyophilisierung der wässerigen Extrakte lieferte ein Produkt (ii), das nach Dünnschichtchromatographie rein war und die korrekte Elementaranalyse aufwies.

Nach Demaskierung von (ii) in n-Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure und Neutralisation mit Triäthylamin wurde das Dipeptid mit (i) in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol gekuppelt. Die Nitrogruppe wurde durch Hydrogenolyse entfernt und das erhaltene Material (als Acetat-Additionssalz) an Carboxymethylcellulose gereinigt.

Das Produkt (als Acetat-Additionssalz) war gegenüber Pauly- und Sakaguchi-Reagens positiv und hatte die folgenden Aminosäure-Verhältnisse nach gemäß Beispiel 1 durchgeführter saurer Hydrolyse.

GIu : 0,97 His : 1,03 Phe : 1,00 GIy : 2,09 Tyr : 0,97 Leu : 1,02 Arg : 0,95 Pro : 0,93 Rückgewinnung: 83 % (berechnet als Acetat).

Charakterisierende Daten

Optische Drehung: Ca]^ - -46,9° (C = 1; ljSig'e Essigsäure).

509819/11S4

Beispiel 5

Herstellung der Verbindungen

L-Glu-His-Phe~Äla=Tyr-Gly~Phe~Arg~Pro~NHo C₃H₅ (H) LGlü-His~Phe=Ala=Tjr=D=-Ala-Leu-Arg~Pro-NH» C₃H₅ (K) Qlu-His-Tyr-Ala-Phe-Gly-Leu-Arg-Pro-NH. C₉H^ (L) L-Glu-His-Phe-D-Ala-Tyr-Gly»Leu-Arg~Pro-NH_o C₀H,- (M)

In den folgenden Verbindungen stellt BOG die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und Bsi die Benzy!gruppe dar.

'Die Synthesen der Verbindungen (H) bis (M) gehen alle von der gemeinsamen Vorstufe BOC-Arg-Pro-NHoCLH,- aus«,

In jedem Fall wurden .die nächsten, fünf Kupplungsstufen unter Anwendung des "Repetitive Excess Mixed Anhydride" (R.E.M.A.)-Verfahren durchgeführt₉ wie es von Tilak (Tetrahedron Letters,, 849 (197O)) .und Beyerman (HeIv₀ Chim. Acta_s jj(5, 1729 (1973)) beschrieben worden ist» Jede Zwischenstufe wurde durch DünnschichtChromatographie auf Reinheit geprüft.

Der Tyrosin-Rest in jeder dieser Verbindungen wurde als . BQC-Tyr(BzI)-OH inkorporiert und es war ein sorgfältiges Waschen erforderlich_s um den Überschuß dieser Verbindung aus dem isolierten Peptid zu entfernen« Die Heptapeptide entsprechend den partiellen Sequenzen 3 bis 9 in den Ver~ bindungen (H) bis (M) wurden dann jedes mit L»Glu-His-OH durch Dicyclohexylcarbodiimid/l-Hydroxybenzotriazol-vermit-

S09S19/1164 "35-

telte Reaktion gekuppelt. Die Abtrennung von irgendwelchen unveränderten Ausgangsmaterialien aus dem Produkt wurde durch Gradientenelution-Chromatographie nach der Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen durch Hydrierung leicht bewirkt.

Spezifische experimentelle Details für die Herstellung der Verbindung (H) sind nachfolgend angegeben.

2,215 g (5 mMol) BOC-Arg-Pro-NH.C₂H₅ wurden in 30 ml n-Chlor-

wasserstoffsäure/Essigsäure 30 Minuten lang bei Raumtemperatur demaskiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum bei 35 C entfernt und der Rückstand durch Triturieren mit Äther verfestigt. Das demaskierte Peptid wurde durch Filtration gesammelt, sorgfältig über Phosphorpentoxid und Natriumhydroxid-Plätzchen getrocknet und dann in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Eine Lösung von 505 mg (5 mMol) N-Methylmorpholin in 2,5 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und die Mischung auf -15°C gekühlt. Das gemischte Anhydrid von BOC-Phe-OH wurde durch Auflösen von 1,99 g (7,5 mMol) BOC-Phe-OH in 10 ml Tetrahydrofuran und Zugabe einer Lösung von 755 mg (7,5 mMol) N-Methylmorpholin in 2,5 ml Tetrahydrofuran hergestellt. Diese Mischung wurde unter Rühren auf -15⁰C gekühlt und eine Lösung von 953 mg (7,0 mMol) Isobutylchloro-

- 36 -

509819/1164

format in 2_S5 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Nach 2 Minuten bei -15⁰C wurde die Dimethylformamid-Lösung der Amino-Komponente zugesetzt und die Mischung bei ~15°C 2 1/2 Stunden lang gerührt» Die Temperatur wurde dann auf O⁰C erhöht und das überschüssige gemischte Anhydrid durch Zusatz von 7*5 ml 2-molarer Kai iuinbicarbonat-Lösung zersetzt» Nach 30 Minuten langem Rühren bei 0⁰C wurde die Mischung auf 200 ml 50$iggesättigter Natriumchlorid-Lösung gegossen und das ölige Produkt in 2 χ 150 ml Äthylacetat extrahiert» Die vereinigten Äthylacetat-Extrakte wurden mit 40 ml 50$iger Natriumchlorid-Lösung und anschließend mit 40 ml Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels wurde das Produkt durch Triturieren mit Äther unter Bildung von BOC-Phe-Arg-pro-NH. C₉H₁- (2_s5O g) verfestigt. Die

I ^ά *
NO,

Reinheit dieses Materials wurde durch DünnschichtChromatographie in den drei_s im Beispiel 1 detailliert angegebenen Lösungsmittel-Systemen geprüft»

Durch eine alternierende Sequenz von Demaskierungen und Kupplungen mit überschüssigem gemischten Anhydrid., ausgeführt in exakt der gleichen Weise wie oben beschrieben, wurden die folgenden Zwischenpeptide in ehromat©graphisch reiner Form hergestellt?

BQC-GXy-Phe-Arg(NO₉)-Pro-NH.C_OH_K 5

- 37 0 9 8 19/1164

BOC-Tyr(BzI)-Gly-Phe-Arg(NO₂)-Pro-NH.C₃H ;

BOC-Ala-Tyr(BzI)-Gly-Phe-Arg(NO₂)-Pro-NH.C₃H₅. Die einzige Variation in der Technik bestand im Verfahren der Aufarbeitung nach der Zersetzung des überschüssigen gemischten Anhydrides. In den Fällen der Hexa- und Heptapeptide wurde die Reaktionsmischung in Wasser gegossen und das Pestprodukt abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Das demaskierte Heptapeptid

H-Phe-Ala-Tyr(Bzl)-Gly-Phe-Arg(NO-)-Pro-NH. C₀H₁-

(als Hydrochlorid-Additionssalz) (1,054 g, 1 mMol) wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 101 mg N-Methylmorpholin in 1 ml Dimethylformamid neutralisiert. L-Glu-His-OH (319 mg, 1,2 mMol) in 4 ml Wasser wurden zusammen mit 1-Hydroxybenzotriazol (162 mg, 1,2 mMol) in 2,5 ml Dimethylformamid zugegeben. Es wurden weitere 6 ml Dimethylformamid zugesetzt und die Mischung auf -15°C vor der Zugabe von 247 mg (1,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde bei -15⁰C 2 Stunden lang und dann weitere 48 Stunden bei 4⁰C gerührt. 0,1 ml Essigsäure wurden zugesetzt und die Temperatur auf 20⁰C für 30 Minuten erhöht, bevor der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wurde. Das FiItrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand nacheinander mit Äther, 5#iger Natriumcarbonat-Lösung und Wasser trituriert.

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Die Seifcenketten-Sehutsgruppen wurden durch 24-stündige Hydrierung in Methanol (30 ml)_s Essigsäure (6 ml) und Wasser (3 ml) in Abwesenheit von 0_s5 g eines Katalysators aus 10 % Palladium auf Holzkohle entfernt» Das rohe_s demaskierte Peptid wurde in 50 ml 2i>iger Essigsäure ,gelöst ₉ zur Entfernung von etwas Dicyclohexy!harnstoff filtriert und auf 100 ml mit Wasser vor der Lyophilisierung verdünnte Das Produkt ' wurde dann an einer Carboxymethylcellulose-Säule durch EIuieren mit Gradienten von Ammoniumacetat_s pH-Wert 5*1» gereinigt. Das Peptid (Verbindung (H)) wurde durch Vereinigen der geeigneten Fraktionen und wiederholte Lyophilisierung zur Entfernung von Ammoniumacetat isoliert„ Es erwies sich durch DünnschichtChromatographie mit jedem der drei im Beispiel 1 detailliert angegebenen Lösungsmittel-Systeme als rein.

Die Verbindungen (K)₃. (L) und (M) wurden aus B0C-Arg(N0₂)-Pro-NH. CpHj- unter Verwendung der R. E.M.A. -Methode bis zur Heptapeptid-Stufe_s und anschließend durch Dicyclohexylcarbodiimid/1-Hydroxybensotriasol-Kupplung mit dem Dipeptid L-Qlu-His-OH in genau der gleichen Weise, wie sie detailliert vorstehend für die Verbindung (H) beschrieben wurde₉ hergestellt. Jede der Verbindungen '(K)₉ (L) und (M) erschien nach der DünnschichtChromatographie mit den drei Lösungsmittel-Systemen., die im Beispiel 1 detailliert beschrieben wurden« als rein.

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Aminosäure-Verhältnis (nach saurer Hydrolyse in der Weise des Beispiels 1).

Verbindung (H) GIu: 1,03 His: O₉97 Phes 2,00 AIa: 0,95

Tyr: 1,04 GIy: O₉97 Arg: 0,94 Pro: 0,96 Rückgewinnung: 85 % (berechnet als Diacetat).
Verbindung (K) GIu: 1,02 His: 0,95 Phe: 0,95 AIa: 2,00

Tyr: 0₉91 Leu: 1,00 Arg: 0,90 Pro: 0,96 Rückgewinnung: 103 % (berechnet als Diacetat).
Verbindung (L) GIu: l_s05 His: 1,03 Tyr: 0,99 AIa: 1,02

Phe: 1,00 GIy: 1₉O7 Leu: 1,00 Arg: 0,94

Pro: 1,02 .

Rückgewinnung: 95 % (berechnet als Diacetat).
Verbindung (M) GIu: 1,02 His: 0,99 Phe: 0,96 AIa: 0,98

Tyr: 0,95 GIy: 0,98 Leu: 1,00 Arg: 0,93

Pro: 0,99

Rückgewinnung: 100 % (berechnet als Diacetat).
Werte für die optische Drehung (c = 1, 15&ige Essigsäure) (H) : [a]^ = -44,5° (K) : [a]^⁸ = -51,8°

(L) : [a]£⁶ = -60,7^Ö (M) : [cx]^⁷ = -36,5°

Beispiel 6 Pharmazeutische Formulierungen

Es wurden zwei Serien von jeder der nachfolgend detailliert beschriebenen Formulierungen hergestellt. In der ersten

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Serie war die Verbindung der allgemeinen Formel I die Verbindung (A) (Beispiel 1) und in der zweiten Serie war die Verbindung der allgemeinen Formel I die Verbindung (K) (Beispiel 5). In jeder Formulierung war die geeignete Verbindung als Diacetat-Additionssalz zugegen, jedoch wurden die Mengen davon_s wie dies nachfolgend angegeben ist, unter Bezugnahme auf die Base (Peptid) berechnet, (i) Tabletten (Zusammensetzung pro Tablette) Verbindung der Formel I : l_s0 mg 5aQ mg 25,0 mg Stärke ι 20_s0 mg 20_s0 mg 20,0 mg

Lactose : -50_s0 mg 5O₃O mg 50,0 mg

Polyvinylpyrrolidon : 8_s0 mg 8_s0 ig 8,0 mg Magnesiumstearat s 2_}0 mg 2_s0 mg 2,0 mg

Die Verbindung der allgemeinen Formel I wurde innig mit der Stärke und der Lactose gemischt und die Mischung unter Verwendung einer Lösung des Polyvinylpyrrolidone in Wasser granuliert. Das Granulat wurde dann getrocknet ₉ das Magnesiumstearat zugesetzt und die Tabletten durch Verprassen hergestellt.

(ii) Pessare (Zusammensetzung pro Pessar) Verbindung der Formel I : O₉5 mg 2₉5 mg 12,5 mg

Kakaobutter : I₃O g I₉O g _c 1,0 g

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Die Verbindung der allgemeinen Formel I wurde zu einer glatten Paste mit einer geringen Menge der geschmolzenen Kakaobutter bei einer Temperatur, die 45°C nicht überstieg, gemischt. Die Paste wurde dann in die restliche geschmolzene Kakaobutter inkorporiert und die Mischung in geeignet gefettete Formen gegossen und absitzen gelassen.

(iii) Vaginaltabletten (Zusammensetzung pro Tablette)
Verbindung der Formel I : 0,5 mg 2,5 mg 12,5 mg Lactose : 500,0 mg 500,0 mg 500,0 mg

Stärke : 450,0 mg 450,0 mg 450,0 mg

Polyäthylenglykol 6000 : 100,0 mg 100,0 mg 100,0 mg Magnesiumstearat : 10,0 mg 10,0 mg 10,0 mg

Die Verbindung der allgemeinen Formel I wurde mit der Stärke und der Lactose innig gemischt und die Mischung unter Verwendung einer Lösung von Polyäthylenglykol 6000 in Wasser granuliert. Das Granulat wurde getrocknet, das Magnesiumstearat zugegeben und die Tabletten durch Verpressen in
einem geeignet geformten Tabletten-Werkzeug ausgeformt.

(iv) Inj ektionslösungen

Verbindung der Formel I : 0,04 g 0,2 g 1,0 g

Verdünnte Essigsäure t Ausreichende Menge zur Einstellung

eines pH-Wertes von .3*0 bis 4,0

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Chlorkresol % O₈Ig O₉Ig 0,1 g

Wasser, für Injektionen : ad 100,0 ml

Die Verbindung der allgemeinen Formel I wurde^gelöst in 9/10 des endgültigen Wasservolumens, mit verdünnter Essigsäure auf einen pH-Wert von 3,0 bis 4,0 eingestellt. Das Chlorkresol wurde anschließend zugegeben und aufgelöst und die Mischung auf das Volumen mit dem restlichen Wasser verdünnt. Die Lösung wurde mittels Durchleiten durch einen Membranfilter von O_S22 um Porengröße sterilisiert und dann aseptisch auf Phiolen von 10 ml Inhalt verteilt. Jede Phiole wurde mit einem sterilen Gunmistopfen verschlossen, der mit einer Aluminiummanschette gesichert war.

Die vorstehend angegebenen drei Lösungen enthielten 0,4 mg, 2 mg bzw. 10 mg pro ml Flüssigkeit an der Verbindung der allgemeinen Formel I.

Beispiel 7 Herstellung der Verbindung (N)
Mjlu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Gly-Pro~NH.C_OH_C

Das Pentapeptid H-Fhe-Ala-Tyr-Gly-Leia-QBu (hergestellt wie im Beispiel 1) wurde mit L-Glu-His-OH in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid/l-HydiOxylbensotriazQl in wässerigem

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Dimethylformamid unter Bildung von L-Glu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-OBu gekuppelt. Dieses wurde in Trifluoressigsäure, welche Anisol enthielt, demaskiert (1 Stunde bei Raumtemperatur) und das Heptapeptid-Produkt durch Trockensäulen-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung der Lösungsmittelmischung Chloroform/Methanol/O, 880 Ammoniak, 60 : 45 : 20,gereinigt. Das gereinigte Material wurde mit H-GIy-OBu (Dicyclohexylcarbodiimid/l-Hydroxybenzotriazol in Dimethylformamid) gekuppelt und das resultierende Octapeptid in Trifluoressigsäure/Anisol unter Entfernung der tert.-Butylestergruppe demaskiert. Eine weitere Kuppelung mit H-Pro-NH.CJH,-(Carbodiimid/Triazol in Dimethylformamid wie vorstehend) ergab das rohe Nonapeptid (N). Die Reinigung wurde zuerst durch Gradientenelutions-Chromatographie an Carboxymethylcellulose und anschließend durch Trockensäulen-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung des Systems Chloroform/Methanol/ 32>Sige Essigsäure, 60 : 45 : 20, bewirkt. Eine abschließende Reinigung wurde mittels Durchleiten durch eine Sephadex G.25" Kolonne und Eluieren· mit 2>6iger Essigsäure erreicht." Das Endprodukt (als Acetat-Additionssalz) war gegenüber Pauly-Reagens positiv und mit jedem der drei Lösungsmittel-Systeme, wie sie detailliert im Beispiel 1 beschrieben worden sind, bei der Dünnschichtchromatographie rein. Aminosäure-Verhältnisse nach saurer Hydrolyse gemäß Beispiel 1:

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GIu : 1,09 His : 1,00 Phe : 0,98 Ala : 0,99 Tyr : 0,95 GIy : 2,02 Leu : 1,00 Pro : 1,01 Rückgewinnung: 85 % (berechnet als Acetat) [α]^² = -60,54° (C = 1, l^ige Essigsäure).

Beispiel 8 Herstellung der Verbindung (P)
Qlu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Phe-Pro-NH.C₂H₅

Das Pentapeptid H-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-OBu¹' (hergestellt wie im Beispiel 2) wurde mit I-Glu-His-OH (Dicyclohexylcarbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol in wässerigem Dimethylformamid) gekuppelt und das Produkt in Trifluoressigsäure/Anisol (1 Stunde bei Raumtemperatur) demaskiert. Das Heptapeptid-Produkt wurde durch Trockensäulen-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung des Systems Chloroform/Methanol/32#ige Essigsäure gereinigt und dann mit H-Phe-OBu (Carbodiimid/ Triazol wie vorstehend) gekuppelt. Nach Demaskierung (Trifluoressigsäure/Anisol) und Kuppeln mit H-Pro-NH.C₂H₁- (Carbodiimid/Triazol) wurde rohes Nonapeptid (P) erhalten.. Dieses wurde durch Gradientenelutions-Chromatographie an Carboxymethylcellulose gereinigt.

Das gereinigte (P) (als Acetat-Additionssalz) war gegenüber Pauly-Reagens positiv und lief mit jedem der drei Lösungs-

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mittel-Systeme, die im Beispiel 1 detailliert angegeben worden waren, als einzige Komponente.

Aminosäure-Verhältnisse (nach saurer Hydrolyse gemäß

Beispiel 1):

GIu : 1,07 His : 1,00 Phe : 2,01 GIy : 2,03 Tyr : 0,99 Leu : 1,00 Pro : 0,87 Rückgewinnung: 96 % (berechnet als Acetat)

[α]ρ² = -44,71° (C = 1, l*ige Essigsäure).

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Claims (54)

1. Patentansprüche

   [1. Peptid der allgemeinen Formel

   MJlu-His-X³-X^-X⁵-X⁶-X⁷-X^fi-Pro-W

   dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall, worin

   die Reste X* und X^ gleich oder verschieden sind und jeder Rest Phenylalanyl, gegebenenfalls im Benzolring substituiert, ist,

   die Reste X und X gleich oder verschieden sind und jeder Rest aus Glycyl-, Alanyl-(D- oder L-) und Asparäginyl-Resten ausgewählt ist,

   der Rest X' ein Radikal einer neutralen, hydrophoben, keinen Schwefel enthaltenden, nieht-heterocyclischen Aminosäure ist,

   der Rest X ein Radikal einer basischen Aminosäure oder Glycyl oder Phenylalanyl, das gegebenenfalls in dem Benzolrihg substituiert ist, bedeutet, und der Rest W ausgewählt ist aus Glycinamid und einer Gruppe

   1 ? 1 ?

   -NR R , worin die Reste R , R und das Stickstoffatom zusammen eine Gruppe bilden, ausgewählt aus Amino, N-Alkylamino, N,N-Dialkylamino, Pyrrolidino, Morpholino und l-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl, wobei das "Alkyl" von 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt und gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, wobei sich alle Angaben auf die

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   L-Aminosäuren und deren Radikale beziehen, mit Ausnahme im Falle von Glycin und sofern nicht etwas anderes ausdrücklich gesagt wird.
2. 2. Peptid der allgemeinen Formel

   L-Glu-His-X³-X^li-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-Pro-W oder ein Säureadditionssalz davon, worin

   die Reste Jr und X^ gleich oder verschieden sind und jeder Rest Phenylalanyl, gegebenenfalls im Benzolring substituiert, ist,

   die Reste X und X gleich oder verschieden sind und jeder Rest ausgewählt ist aus GIycyl, Alanyl und Asparaginyl,

   •7

   der Rest X' ein Radikal einer neutralen, hydrophoben, keinen Schwefel enthaltenden, nicht-heterocyclischen Aminosäure ist,

   der Rest X ein Rest einer basischen Aminosäure bedeutet, und

   der Rest W ausgewählt ist aus Glycinamid und einer Gruppe -NBR , worin die Reste R¹, R² und das Stickstoffatom zusammen eine Gruppe bilden, ausgewählt aus Amino, N-Alkylamino, Ν,Ν-Dialkylamino, Pyrrolidino, Morpholino und l-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl, wobei das "Alkyl" von 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist und gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, wobei sich alle Angaben auf die L-Aminosäuren und deren Reste beziehen, mit Ausnahme im Falle von Glycin.

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3. 3. Peptid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich-

   net, daß der Rest X GIycyl oder Phenylalanyl, das gegebenenfalls im Benzolring substituiert ist, bedeutet.
4. 4. Peptid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex nach einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch g e kennzeichnet , daß zumindest einer der Reste X und X⁶ D-Alanyl ist.
5. 5. Peptid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1,3 und 4, dadurch g e kennzeichnet , daß der Rest X' Leucyl, Isoleucyl, Valyl oder Phenylalanyl, das gegebenenfalls im Benzolring substituiert ist, bedeutet.
6. 6. Peptid oder dessen Säureadditionssalz nach Anspruch 2,

   dadurch gekennzeichnet, daß der Rest

   X¹ Leucyl oder Phenylalanyl, das gegebenenfalls im Benzolring substituiert ist, bedeutet.
7. 7. Peptid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e -

   kennzeichnet , daß der Rest X Arginyl, Lysyl, Histidyl oder Homoarginyl ist.

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8. 8. Peptid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß die als Rest X , X , Χ' oder X vorhandene Phenylalanylgruppe gegebenenfalls im Benzolring durch eine oder mehrere Gruppen, nämlich Methoxy, Chlor, Methyl, Hydroxyl, Nitro und/oder Amino, substituiert ist.
9. 9. Peptid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich-

   •z c

   net, daß die Reste X^ und X^ gleich oder verschieden sind und jeder Phenylalany1 oder Tyrosyl, der Rest X Glycyl oder

   fi 7

   Alanyl (D- oder L-), der Rest X Glycyl, der Rest X' Leucyl oder Phenylalanyl, der Rest X Arginyl, Lysyl oder Homoarginyl, und der Rest W N-Alkylamino, worin das Alkyl I oder Kohlenstoffatome besitzt, oder l-Methyl-5-aminomethyltetrazolyl ist.
10. 10. Peptid, dessen Saureadditionssalz oder dessen Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich-

    T. Il

    net, daß der Rest X^ Phenylalanyl, der Rest X Alanyl

    oder Glycyl, der Rest X^ Tyrosyl, der Rest X D-Alanyl oder

    7

    Glycyl, der Rest X' Leucyl oder Phenylalanyl, der Rest X Arginyl und der Rest W N-Alkylamino ist, worin das Alkyl 1 oder 2 Kohlenstoffatome besitzt.

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11. 11. Mjlu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
12. 12.. Ullu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
13. 13. L-Giu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Lys-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
14. 14. LGiu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Lys-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
15. 15. MJlu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Har-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
16. Π
    16. '-Glu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Har-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
17. 17. LGlu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-l-methyl-5-aminomethyltetrazol gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
18. 18. MJlu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Phe-Arg-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.

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19. 19. '-Glu-His-Phe-Ala-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
20. 20. MUu-His-Tyr-Ala-Phe-Gly-Leu-Arg-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
21. 21. Uilu-His-Phe-D-Ala-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
22. 22. Urlu-His-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Gly-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
23. 23· Uilu-His-Phe-Gly-Tyr-Gly-Leu-Phe-Pro-äthylamid gemäß Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz desselben.
24. 24. Pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz eines Peptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23·
25. 25- Essigsäure-Additionssalz eines Peptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.
26. 26. Komplex mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall eines Peptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis
27. 27· Komplex mit Zink eines Peptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.

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28. 28. Verfahren zur Herstellung eines Peptides, einem Säureadditionssalz davon oder einem Komplex davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27» dadurch gekennzeichnet , daß man ein Reagens der allgemeinen Formel II

    Y¹ - OH (II)

    worin der Rest Y Pyroglutamyl, eine zu Pyroglutamyl cyclisierbare Gruppe oder eine partielle Restesequenz ist, welche Pyroglutamyl oder eine dazu eyclisierbare^ Gruppe an ihrer N-Endgruppe trägt und von dort an dem oben definierten Peptid-Produkt entspricht, mit einem Reagens der allgemeinen Formel III

    H-Y² (III)

    worin der Rest Y dem Rest des oben definierten Peptid-Pro-

    duktes entspricht, kondensiert, wobei die Reagentien Y -OH

    und H-Y an den geeigneten Stellen gegebenenfalls geschützt und/oder aktiviert sind und wobei in den Gruppen Y und Y irgendein gegebenenfalls anwesender Arginyl- oder Homoarginyl-Rest in dem vorstehend definierten Peptid-Produkt wahlweise durch eine Ornithyl- bzw* Lysyl-Gruppe ersetzt wird, gefolgt, falls erforderlich und geeigneterweise von einer oder mehreren Stufen zur Demaskierung des Produktes, Cyclisierung der N-Endgruppe desselben zu dem Pyroglutamyl-Rest, Guanidierung irgendeines Ornithyl- oder Lysyl-Restes darin zu dem Arginyl- bzw. Homoarginyl-Rest, Umwandlung des Pro-

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    duktes in das Peptid oder in ein Säureadditionssalz davon, und überführen des Peptides mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall in einen Komplex.
29. 29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens Y-OH dem N-Endgruppen-Dipeptidbruchstück des Peptid-Produktes entspricht.
30. 30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens Y-OH dem N-Endgruppen-Heptapeptidbruchstück des Peptid-Produktes entspricht.
31. 31. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens Y -OH dem N-Endgruppen-Octapeptidbruchstück des Peptid-Produktes entspricht.
32. 32. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens Y-OH einen Glycyl-Rest am endständigen C-Atom besitzt.
33. 33. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Kondensationsstufe in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol bewirkt wird.

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34. 34. Verfahren nach Anspruch 33» dadurch gekennzeichnet , daß die Kondensationsstufe in Anwesenheit von Dimethylformamid als Lösungsmittel bewirkt wird.
35. 35· Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 34,' dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens Y -OH den Pyroglutamyl-Rest am endständigen N trägt.
36. 36. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 35» dadurch gekennzeichnet, daß die Guanidierungsstufe geeigneterweise unter Verwendung von 1-Guanyl-3,5-dimethylpyrazol durchgeführt wird.
37. 37. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Produkt oder ein Säureadditionssalz davon MJlu-His-Phe-Ala-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-äthylamid gemäß Definition von Anspruch 1 oder ein Säureadditionssalz davon ist.
38. 38. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Komplex des Peptid-Produktes mit Zink durch Auflösen des Peptides in einer wässerigen Lösung, enthaltend überschüssige Zinkionen und Zusetzen einer verdünnten Alkalimetallhydroxid-Lösung, herstellt.

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39. 39. Peptid, dessen Säureadditionssalζ oder dessen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 > dadurch gekennzeichnet , daß es nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 bis 38 hergestellt ist*
40. 40. j-Glu-His-Phe-Ala-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-äthylamid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex, gemäß der Definition des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet j daß es nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 bis 38 hergestellt ist.
41. 41. Pharmazeutische Formulierung, enthaltend ein Peptid, ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz desselben oder einen Komplex desselben mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27» in Verbindung mit einem annehmbaren Träger dafür.
42. 42. Formulierung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet , daß sie.das Peptid oder ein Säureadditionssalz desselben in Verbindung mit einem Träger dafür enthält.
43. 43. Formulierung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet , daß das Peptid als Zinkkomplex vorliegt.

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44. 44. Formulierung nach einem der Ansprüche 41 bis 43» dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid
    Ujlu-His-Phe-Ala-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-äthylamid gemäß Definition des Anspruchs 1 ist.
45. 45. Formulierung nach einem der Ansprüche 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger
    eine Flüssigkeit ist.
46. 46. Formulierung nach einem der Ansprüche 41 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger
    ein Feststoff ist.
47. 47. Formulierung nach einem der Ansprüche 41 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Einheitsdosis-Form vorliegt.
48. 48. Formulierung nach einem der Ansprüche 41 bis 47» dadurch gekennzeichnet, daß sie für nasa·*·
    le, parenterale, orale und/oder vaginale Verabreichung geeignet ist.
49. 49. Formulierung nach Anspruch 47, geeignet für nasale oder parenterale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet , daß sie das Peptid, dessen Säureädditions-

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    salz oder dessen Komplex in einer Menge im Bereich von 0,25 lig bis 10 mg, berechnet als Peptid, pro Einheitsdosis, enthält.
50. 50. Formulierung nach Anspruch 47» geeignet für orale oder vaginale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet , daß sie das Peptid, dessen Säureadditionssalz oder dessen Komplex in einer Menge im Bereich von 0,25 ug bis 50 mg, berechnet als Peptid, pro Einheitsdosis, enthält.
51. 51. Formulierung nach Anspruch 45» dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Tablette ist.
52. 52. Formulierung nach Anspruch 45» dadurch gekennzeichnet , daß sie eine sterile Lösung oder Suspension ist.
53. 53. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung nach einem der Ansprüche 41 bis 52, dadurch gekennzeichnet , daß es das Vermischen des Peptides, dessen Säureadditionssalzes oder dessen Komplexes mit dem annehmbaren Träger dafür, umfaßt.
54. 54. Pharmazeutische Formulierung gemäß einem der Ansprüche

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    4l bis 52, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren des Anspruchs 53 hergestellt ist.

    55« Peptid, Säureadditionssalz desselben oder Komplex desselben mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall, im wesentlichen gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 27 unter besonderer Bezugnahme auf die Beispiele 1 bis 5, 7 und 8, '

    56, Verfahren zur Herstellung eines Peptids, eines Säureadditionssalzes desselben oder eines Komplexes desselben mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 27, im wesentlichen wie vorstehend beschrieben unter besonderer Bezugnahme auf die Beispiele 1 bis 5» 7 und 8.

    57· Pharmazeutische Formulierung, enthaltend ein Peptid, ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz desselben oder einen Komplex desselben mit einem pharmazeutisch annehmbaren Metall gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 27 in Verbindung mit einem annehmbaren Träger dafür, im wesentlichen wie vorstehend beschrieben unter besonderer Bezugnahme auf Beispiel 5.

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