DE2446005C2 - Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R'-R2-R3-Arg-Pro-NH-R4
in der R1, R2, R3 und R4 die in Anspruch 1
angegebenen Bedeutungen haben, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise
L-Pyroglutaminsäure oder ein der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz entsprechendes,
N-terminal einen L-Pyroglutaminsäurerest aufweisendes Peptidfragment mit einer Aminkomponente,
die dem restlichen Teil des gewünschten Nonapeptidamids entspricht, kondensiert, wobei die Reaktionspartner gegebenenfalls eine oder mehrere Schutzgruppen enthalten und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen abspaltet
Die Erfindung betrifft neue Nonapeptidamide mit starker ovulationsinduzierender Wirksamkeit welche
die allgemeine Formel
(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R'-R2-R3-Arg-Pro-NH-R4-
worin Ri Tyr oder Phe, R2 D-Leu, D-IIe, D-NIe, D-VaI,
D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr
oder D-Met, R3 Leu, He oder Nie und R4 Alkyl mit 1 bis 3
Kohlenstoffatomen, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-n-pro
pyl oder 3-Hydroxy-n-propyl, bedeuten und Verfahren
zu deren Herstellung.
Im folgenden werden die Aminosäuren und Peptide mit Abkürzungen bezeichnet weiche auf diesem Gebiet
allgemein üblich sind und vom Committee on Biochemi
cal Nomenclature of IUPAC-IUB empfohlen bzw.
bewilligt wurden. Die Aminosäuren haben, wenn nicht anders angegeben, jeweils L-Konfiguration.
Nachstehend sind Beispiele für die im folgenden verwendeten Abkürzungen angeführt:
a-Aibu: a-Aminoisobuttersäure
BzI: Benzyl
GIy: Glycin
carboximid
Leu: Leucin
ONB: N-Hydroxy-5-norbornen-2^-dicarboximid-Ester
Pro: Prolin
(Pyr)Glu: Pyroglutaminsäure
Ser: Serin
Tos: Tosyl
VaI: Valin
Als Beispiele für die mit R4 bezeichnete gerad- oder
verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe
substituiert sein kann, seien Methyl, Äthyl, n-Propyl,
i-Propyl, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-n-propyl, 3-Hy-
6n droxy-n-propyl, genannt.
Es ist schon lange bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, weiche auf höherer Ebene die
Sekretion von tropischen Hormonen durch die Hypophyse steuern. Kürzlich wurde folgend auf die Isolierung
eines Thyrotropin freisitzenden Hormones (TRH) ein Hormon, welches die Freisetzung von Gelbkörperbildung induzierendem, »luteinisierendem« Hormon fördert in reiner Form aus Schweinen und Schafen
extrahiert Es erwies sich als ein Dekapeptid der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
(A, V, Schally et al, Biochem, Biophys. Res, Commun.,
43,1334 (1971): R. Guillemin et al. Proc. Nat Acad. Sei,
USA, 69,278 (1972)).
Aufgrund dieser Erkenntnis wurde eine Anzahl von ähnlichen Pepriden hergestellt, an welchen biologische
Untersuchungen vorgenommen wurden. Dennoch wird die physiologische Wirksamkeit der Peptide durch
selbst geringfügige Modifikationen der oben angeführten Aminosäurezusammensetzung stark beeinträchtigt
und die oben angeführte chemische Struktur ist als wesentlich zur Entfaltung der maximalen physiologischen Wirksamkeit anzusehen (A. V. Schally et al,
Biochem. Biophys. Res. Commun, 4,366 (1972)).
Es ist nun gelungen, die Nonapeptidamide der Formel
(I) herzustellen, und es wurde überraschend gefunden, daß diese Verbindungen eine wesentlich stärkere
ovulationsinduzietpode Wirkung besitzen als die in der
Natur vorkommenden Decapeptide. Weiters wurde gefunden, daß diese Verbindungen durch ihre Wirkung
auf die Hypophyse der Ausscheidung von luteinisierendem und follikelstimulierendem Hormon fördern. Es
wurde weiters gefunden, daß diese Verbindungen nicht nur als Medikamente für den menschlichen Gebrauch,
z. B. für die Diagnose der Hypophysenfunktion, gegen Gonadotropinmangel und für die Therapie von
Amenorrhöe, sondern auch als tierärztliche Medikamente, vor allem für die Tierzucht, verwendet werden
können. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen unerwarteten Erkenntnissen.
Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände.
Zur Vereinfachung wird mit Reaktionskomponente (A) L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment mit
einer N-endständigen L-Pyroglutaminsäure-Einheit, das
gleichzeitig von dort an die Aminosäuren-Sequenz der allgemeinen Formel (I) aufweist und die mit der
Reaktionskomponente (A) zu kondensierende Amin-Komponente Reaktionskomponente (B), die dem Rest
des Nonapeptidamidderivates der allgemeinen Formel (I) entspricht, bezeichnet. Dabei können die Reaktionskomponenten (A^und (B) gegebenenfalls geschützt sein.
Aus der nachstehenden Tabelle sind grundsätzliche Kombinationen der Reaktionskomponenten (A) und (B)
ersichtlich.
Kombination
Reagens
(A)
(B)
| Kombi | Reagens | (B) |
| nation | (A) | H-His-Trp-Ser-R,- |
| 1 | (Pyr)Glu-OH | RrR3-Arg-Pro- |
| NH-R, | ||
| H-Trp-Ser-R,-Rr | ||
| 2 | (Pyr)GIu-His-OH | Rj-Arg-Pro-NH-R, |
| H-Ser-R,-RrRr | ||
| 3 | (Pyr)Glu-His-Trp-OH | Arg-Pro-NH-R^ |
| H-R,-RrR,-Arg- | ||
| 4 | (Pyr)Glu-His-Trp- | Pm-N H-R, |
| Ser-OH | H-RrR,-Arg-Pro- | |
| 5 | (Pyr)Glu-His-Trp- | NH-R4 |
| Ser-R|-OH | H-Rj-Arg-Pro- | |
| 6 | (Pyr)Glu-His-Trp- | NH-R4 |
| Ser-R.-Rj-OH | ||
H-Pro-NH-R,
NH2-R1
7 (Pyr)Glu-His-Trp-
Ser-RrR2-R3-OH
8 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,-R2-R3-Arg-OH
9 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,-R2-R3-Arg-Pro-OH
Es war weiterhin bekannt, daß eine geschützte Glutamylgruppe der allgemeinen Formel
worin Rs eine Alkoxygruppe, wie z. B. Methoxy, Äthoxy,
i-Propoxy, N-Propoxy, n-Butoxy od. dgl, eine Aralkyloxygruppe, wie z.B. Benzyloxy od.dgl. oder Amino
bedeutet, leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst
umgewandelt werden kann:
N,
und zwar durch Behandlung mit einer Base, wie z. B.
Ammoniak od. dgl, oder einer Säure, wie z. B. Essigsäure od. dgL, und daß die Gruppe der allgemeinen
Formel (II) in dieser Hinsicht der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist Auf Grund des erfindungsgemäßen Verfahrens ist anzunehmen, daß das L-Pyroglutamyl (d.h. (Pyr)GIu-) der Reaktionskomponente (A)
nicht nur die L-Pyroglutamylgruppe selbst, sondern
auch die geschützte L-GIutamylgruppe der Formel (II)
umfaßt Wenn das (Pyr)Glu- der Reaktionskomponente (A) die Gruppe der Formel (II) bedeutet, kann die
Gruppe (II) nach an sich bekannten Verfahren leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden.
Die erfindungsgemäße Kondensationsreaktion kann nach jedem beliebigen, für die Herstellung von
Peptidbindungen üblichen Kondensationsverfahren durchgeführt werden. Dazu gehören das Azid-, Chlorid-,
Säureanhydrid-, gemischte Säureanhydrid-, DCC-, akti
ve Ester-Verfahren, das Verfahren mit Wcodwardrea-
gens K, das Carbodiimidazol-Verfahren, das Oxidations-Reduktions-Verfahren (The Peptides, Vol. I (1966),
Schröder and Lubke, Academic Press, New York), das DCC/HNONB-Verfahren (BE-PS 7 96 399).
Vor der Kondensationsreaktion können die Carboxyl- und Aminogruppen, welche an der beabsichtigten
Reakiion nicht teilhaben sollen, geschützt werden, auch ist es möglich, die an der Reaktion teilnehmenden
Carboxyl- und/oder Aminogruppen naci an sich
bekannten Verfahren zu aktivieren. Die Carboxylgruppen im Ausgangsmaterial können in Form von
Metallsalzen (wie z. B. von Natrium- oder Kaliumsalzen) oder von Estern (wie z. B. Methyl-, Äthyl-, Benzyl-,
p-Nitrobenzyl-, tert-Butyl- oder tert-Ainyl-Estern)
so geschützt werden.
Als Schutzgruppen für die Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können alle bei der Herstellung
von Peptiden üblichen Schutzgruppen für Aminogruppen, wie z. B. Benzyloxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl,
6» Isobornyloxycarbonyl od.dgl, verwendet werden. Die
Hydroxylgruppe des Serins kann durch eine herkömmliche Schutzgruppe wie Benzyl, tert.-Butyl und andere
ätherbildende Gruppen geschützt werden. Die Hydro-
xylgruppe des Tyrosine kann ebenfalls durch Benzyl, tert-Butyl und andere ätherbildende Gruppen geschützt
werden. Die Guanidingruppe des Arginins kann mit Gruppen wie z. B. Nitro, Tosyl, Carbobenzoxy, Isobornyloxycarbonyl
oder Adamantyloxycarbonyl geschützt werden. Als Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in
den Ausgangsreagentien sind die entsprechenden Säureanhydride, Azide und aktiven Ester (Ester mit
Alkoholen, wie z. B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol,
2,4-DinitrophenoI, Cyanmethylalkohol, p-Nitro-
phenol, N-Hydroxy-S-Norbornen^a-Dicarboximid,
N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxybenztriazol od. dgl.), zu nennen. Die aktivierten
Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können z. ß. in Form des entsprechenden Phosphorsäureamides
vorliegen.
Aus der folgenden Tabelle sind Beispiele für Kombinationen derartiger Formen von Carboxyl- und
Aminogruppen w den Materialien (A) und (B) ersichtlich.
Kombinationsbeispiele
(A)
COOH
NH,
(B)
COOH
NH2
frei
aktiviert
frei
geschützt geschützt geschützt geschützt
frei
geschützt
frei
frei
aktiviert
frei
aktiviert
Anmerkung:
In dem mit * bezeichneten Fall ist im Reaktionssystem vorzugsweise ein Dehydratisierungsmittel wie z. B. ein Carbodiimidreagenz wie Dicyclohexylcarbodiimid vorhanden. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann wie folgt
dargestellt werden:
(Pyr)Glu-His-Trp + Ser-RrSchutzgruppe
I Kondensation (z.B. DCC/HONB)
(PyrJGlu-His-Trp-Ser-Ri-Schutzgruppe
Entfernung der Schutzgruppe (z. B. katalytische Reduktion mit Pd-Katalysator)
(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,
NO2
Entfernung
der Schutzgruppe
(z. B. in Gegenwart
von HBr)
NO2
Kondensation (z. B. in Gegenwart von DCC-HONB
oder DCC/1-Hydroxybenztriazol)
(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,-R2-R3-Arg-PrO-NH-R4
Entfernu-ji der Schutzgruppe (z. B. in Gegenwart
von SnCI2 in Ameisensäure/Wasser, katalytische
Reduktion mit Pd-Katal* sator oder HF)
(PyOGIu-HiS-TrP-SCr-R1-R2-R3-ArS-PrO-NH-R4
Diese Reaktion kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden, welches als geeignet für
die Kondensationsreaktion zur Herstellung von Peptiden bekannt ist. So z. B. können wasserfreies oder
wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran
und geeignete Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.
Die Reaktionstemperatur wird innerhalb eines Bereiches gewählt, welcher für Reaktionen zur Bildur.g
von Peptidbindungen geeignet ist, d. h. üblicherweise innerhalb eines Bereiches von etwa -2O0C bis etwa
+ 300C. Die Ausgangsmaterialien (geschützten Peptide) der erfindungsgemäßen Verbindungen können leicht
nach Festphase .Syntheseverfahren hergestellt werden.
Nach Beendigung der gewünschten Kondensation1-reaktion
können die gegebenenfalls im Produkt vorhandenen Schut/.grtippen nach an sich bekannten
Verfahren wieder entfernt werden. Als Beispiele für solche Verfahren sind katalytische Reduktion in
Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumsehw.ir/. Palladium auf Kohle, Platin. Solvolyse mit Fluorwasserstoff.
Trifluoressigsäure und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak zu nennen.
Das so hergestellte Peptid der allgemeinen Formel (I)
kann aus dom Gemisch der Reaktionsprodukte n.u h fur
die Gewinnung von IVptiden bekannten Verfahren w e
F'Atraktion. Verteilung. Säulenchromatographie od. d^l.
gewonnen werden.
Die Peptide der allgemeinen Formel (I) können auch in Form eines Salzes gewonnen werden.
Beispiele fiir Sauren, welche mit Peptiden der
ngC^iFiiiivn r ϋΓικΟι (r/ fill/*
!n' \< Γ
anorganische Säuren wie Salzsäure. Bromwasserstoffsaiirc.
Perchlorsäure, (rauchende) Salpetersäure, Thio
cviinsäure. Schwefel- und Phosphorsäute und organische
Säuren wie Ameisen- F.ssig·. Propion-, Glycol-. Milch-, Brenzlrauben-, Ch.il-, Malon-, Bernstein-, Malein-.
Fumar-. Anihranvi . Zimt-, Naphthalinsulfon- oder
Suifaniisäure.
Die erfindung'gcniäßcn Polypeptide der allgemeinen
Formel (I) besitzen LH-RH-Wirkung (d h. die Wirkung eines cir. luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormons)
und können daher die Ausscheidung von LH (luteinisierendem Hormon) und FSH (follikelstimiilierendem
Hormon) fördern. Die Polypeptide der !tilgemeinen Formel (I) werden daher als Medikamente zur
Ovulationsfördening bei Frauen und Tieren wie Ratten.
Schafen. Schweinen, Kühen. Stuten. Wachteln oder Hennen verwendet. Sie können auch fiir andere
pharmazeutische /necke verwendet werden, fiir
weiche bisher herkömmliche I.H-RII-. I.H- und
f SI I-Präparate eingesetzt wurden.
! Ut_ (I UIiKI
fuhrt:
• >\ ul.il'on-lordernd..' Wirksamkeit der Nonapeptidamide !!email der l.rrmd'.mg.
.P'.Mdl . Ili-Irp-Ser R -R -K-.-Ar.ü-Pn-Ni I-R.
.P'.Mdl . Ili-Irp-Ser R -R -K-.-Ar.ü-Pn-Ni I-R.
ι )\ ■jl.itiiin^
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nun
Tvr
Ph e
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I)-Nv.ι
D-Leu
D-Leu
D-I. ei;
D-Leu
D-Leu
D-Ihr
iJ-Phe
D-Ser
D-\a!
P-Le.:
I eu Leu i. -.; Li
Leu
| Athvl | »..52<i |
| Äthyl | - SlD |
| Ath>l | .S.2"ii |
| Methyl | 1.525 |
| Propvl | .V644 |
| Äthyl | 4.5SiI |
| hopropyl | 2."5(i |
| Äthyl | 4.135 |
| Äthyl | > 4(Kl |
| Äthyl | 6.14(1 |
| Äthyl | ; <2< |
| Äih\i | 2. "fid |
| Äthvi | 4 2^!i |
Nv.ι : N'irv.ilin. NIe - Norieucn. Abu - Xmin'ibjtic-iiurc D:e ov ulatinnsfördernde Wirk-amkeit wurde nach
!er :n J Med. Chem. 16. 11JJ (11J"3. be-.".'^ebenen NIethode bestimmt und mi! de- von LH-RH verglichen.
LH-RH - iP>riGlu-Mis-Trp-Ser-Tyr-GI;.-!.eu- \ig-Pr
>-(>' - -N! 1 wobei die I berlegenhe;: gegenüber in Bmch^.n.
B'',rhvv Pe- C'ommun. J°. lu"2. Sl·? - ° ten.ir-ten jna.-en \ erbindungen .iu-. den Zahlen eindeutig her\orgeht.
Verbindung des
Versuchsberichts
Versuchsberichts
Physikalische Daten
(4)
(5)
[ir]:: = -30.6" (C = 0.5 in 5 - Essigsäure)
Rf"= 0.14. Rf -0.4"
Rf"= 0.14. Rf -0.4"
Aminosäureanalyse; His. 1.00: Arg. 1.02: Trp. 0.84: Ser. 0.91;
Giu. 1.04: Pro. l.CO: Leu. 2.04: Tyr. 1.00; Methylamin. 1.10
(Ausbeute 92'-.ι
[α]~Ρ = -35.0' (C = 0.5 in 5r-< Essigsäure)
[α]~Ρ = -35.0' (C = 0.5 in 5r-< Essigsäure)
Rf = 0.15. Rf = 0.51
Aminosäureanaiyse: His. 0.93: Arg. LOO: Trp. 0.83: 5er. 0.91:
GIu. 0.88: Pro. 1.0Ö: Leu. 1.80: Tyr. 0.86: Propvlamin. 1.03
(Ausbeute 89'-1
Ii )Πμ.-1 /iiii'j
K)
I1InMk,libelle D.iIlT.
(1M
(12)
M11' 3.1.6" (C (1.5 in 5% Hssigsiiure)
Rf 0.15. Kl' 0.4l>
Aminosäureanalyse. llis. 1.03; Arg. 1.03; Trp. 0.79; Scr, 0.97;
(Hu. 1.00: Pro. 1.06; Leu. 1.97; Tyr. 0.97; Isopropylamin, 1.05
(Airbeute 85.5"'-)
lij-Jv; 7IS' (C (I 2 in 5% Fssigsaure)
Rl' 0.7(1. Rf (K. I
Aminosiiureanalyse. Mis. 1.01; Arg. 0.97; Irp. 0.92; Scr. 0.98;
(ilu. 1.00; I'm. 0.99. ι.,-ιι. |.(i(); |'he. 2.03: Äthylamin. 1.02
(Ausbeute S7f,.)
1(/1'J',' 47.2'(C 0.5 in >"« Lssigsaure)
Rf'1 0.62. Rl" 0.43
Amiii(isäurcanal>so: Hk 1.00; Ära. 0.92: Trp. 0.89; Scr. 1 89;
(ilu. 1.00; Pro. 0.98; Leu. 1.02; Tyr. 0.96; \thylamiii. 0.97
(Ausheule 70*.,)
i)a die I HRH Wirkung tier Polypeptide der
allgemeiner f-V.rmel (I) etw.i τ- bis 60mal großer ist ,ils
lene der in der Natur vorkommenden, kann die
Dosierungsmenge fiir jede Anwendung auf der Basis des
ob( ι angeführten Vielfachen bestimmt werden, wobei
auch andere Faktoren wie der Empfänger der Verabreichung und die Krankheitsart in Betracht
gezogen werden. Line geeignete Dosierungsmenge kann / B. innerhalb eines Bereiches von etwa 2 ng bis
2 jig pro Kilogramm Körpergewicht und Tag gewählt
werden.
Die Polypeptide c'er allgemeinen Formel (I) werden üblicherweise nicht peroral, sondern durch Injektion,
rektal oder vaginal verabreicht, obgleich sie in manchen Fällen auch peroral verabreicht werden.
Als Beispiele für geeignete Dosierungsformen sind Injektionen. Suppositorien Pessare und Pulver zu
nennen. Die Injektionen können durch Lösen von etwa 10 c bis 100 r des Polypeptides der allgemeinen Formel
(I) in 1 ml physiologischer Salzlösung hergestellt werden. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I)
können auch unter Zugabe von Mannitol als Hülle in lyophilisierte Ampullenprodukte übergeführt werden
und sind in dieser Form jederzeit als Injektionen verwendbar.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsstoffe eingesetzten Peptide können nach jedem
beliebigen, für die Herstellung von Peptiden geeigneten Verfahren oder nach einem angepaßten Verfahren
hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert
In den Beispielen bedeuten folgende Abkürzungen den Rf-Wert bei Dünnschichtchromatographie an
Silikagel mit den folgenden Lösungsmittelsystemen:
9 :1 :0,5
RP: Äthyl-acetat: Pyridin : Essigsäure : Wasser,
30:10:3:5
RP: n-Butanol: Äthylacetat: Essigsäure : Wasser,
1:1:1:1
Nachstehend werden die in den Beispielen verwendeten,
eingetragenen Handelsnamen erläutert:
Biogel P-2:
Sephadex LH-JO:
Sephadex LH-JO:
Amberlite XAD-2:
Amberlite IR-45:
Amberlite IR-45:
Amberlite IRA-410:
Amberlite CG-410:
Amberlite CG-45:
Amberlite CG-410:
Amberlite CG-45:
Materialien fiir Gelfiltration, hergestellt von BIO-RAD USA
Verestertes Dextran-Gel. hergestellt von Pharmacia Fina Chemicals. Schweden
Polystyrolharz
Verestertes Dextran-Gel. hergestellt von Pharmacia Fina Chemicals. Schweden
Polystyrolharz
schwach basisches A η ionenaustauscherharz
stark basisches Anionenaustau· scherharz
stark basisches Anionenaustau scherharz
schwach basisches Anionenaustauscherharz
Alle diese Harze werden von Rohm & Haas Co.. USA. hergestellt.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-
D-Leu-Leu-Arg-PrO-NH-CH2CH 3
a) Herstellung von Z-D-Leu-Leu-Arg(NO2)-Pm-NH-CH2-CH3
In 50 ml Dichiormethan werden 1,58 g Z-D-Leu-OH(Ol) und Ug HONB gelöst und nachher 2,8 g
H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 zugegeben. Die
Mischung wird auf 00C gekühlt, nachher werden 1,4 g
DCC zu der Mischung zugegeben, und es wird dann die Mischung bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt
Der ais Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem
Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung wird zweimal mit
4%iger wässeriger Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und schließlich unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird aus
ti
Äthylacetat/Petroleumbcnzm umgefüllt. Ls werden
3,6 g der gewünschten Verbindung erhalten.
Fp.: 134"C (Zersetzung).
[\] -47,3" Cc·= 0,54 in Methanol);
Rf" =0,57
F.lementaranalyse fiii CuHmOhNj
Berechnet: ' C 56,31. 117.59. N 17,91,
gefunden: C 56.08, 117,82. N 17.69.
Berechnet: ' C 56,31. 117.59. N 17,91,
gefunden: C 56.08, 117,82. N 17.69.
b) Herstellung von (Pyr)Glu-HisTrp-Ser-Tyrr >-l.eu-l..cu-Arg(NO,)-Pro-NH-CH.'-CH,
In JOmI 25%igem HBR-Eisessig werden 3,6 g
/-D-l.eu-Leti-Arg(Nf).)-ProNHCH.-CHi gelöst, und
die Lösung wird bei Raumtemperatur 50 min lang gerührt. Zu der Lösung werden 300 ml Äther zugegeben,
und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert Nach dem Trocknen wird der Niederschlag in 50 ml
Wasser gelöst und über eine (2.5 χ 20 cm}-Kolonne.
Amberlite CG-410 (freie Base), geleitet. Die Säule wird
mit 30°/oig wäßrigem Methanol gut gewaschen. Der
F.ffluent und die Waschwässer werden vereinigt und unter verhindertem Druck zur F.ntfernung des Methanols
eingeengt, wonach Lyophilisierung erfolgt Hs werden 3,1 g der freien Base von H-D-Leu-I.eu-Arg(NOj)-Pro-NH-CH;-CHi
erhalten
RR = 0,24: Rf) = 0.68.
In 4 ml Dimethylformamid werden 228 g des wie oben
beschrieben erhaltenen Produktes und 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst, und danach werden
144 mg HONB zugegeben. Die erhaltene Mischung
wird auf -10"C gekühlt, und es werden 90 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird dann bei -10rC zwei
Stunden lang, bei O'C 4 Stunden lang und bei Raumtemperatur weitere 4 Stunden lang gerührt. Die
Reaktionsmischung wird danach zur Entfernung des entstandenen Dicyclohexylharnstoffes filtriert. Nach der
Zugabe von Äthylacetat zu dem Filtrat wird dabei der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Dieser Niederschlag
wird getrocknet und in 2O°/oig wässerigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird über eine Kolonne. Amberlite
XAD-2 (200 Mesh, 3 χ 20 cm), geleitet, und danach
erfolgt eine Gradienten-Elution mit 200/oigem Äthanol und absolutem Äthanol (jeweils 300 ml). Das gewünschte
Produkt ist in den (260—360 ml)-Fraktionen enthalten. Diese Fraktionen werden bei vermindertem Druck
eingeengt und lyophilisiert. Es werden 346 mg des gewünschten Produktes erhalten.
[\] -38.28" (c=0.\ in 0.5% Methanol);
RP = 0.235. RP = 0.765.
c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-
In 20 ml 60%iger wäßriger Ameisensäure werden 300 mg der gemäß (b) erhaltenen NOj-Verbindung
gelöst, und danach werden 600 mg SnCh · H2O
zugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden lang auf 80 bis 85°C erhitzt und danach unter vermindertem Druck zur
Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit 50 ml warmem Wasser (80° C) extrahiert und der
Extrakt filtriert Das erhaltene Filtrat wird über eine (3 χ 20 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200 Mesh),
geleitet Nach dem Waschen mit Wasser erfolgt Gradienten-Elution mit Wasser und absolutem Äthanol
(jeweils 40OmI). Das gewünschte Produkt ist in den
(150—260 ml)-Fraktionen enthalten. Die Fraktionen
werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Entfernung ties Äthanos eingeengt. Das Konzentrat
wird über eine (2 χ ^^ cm)-Kolonne. Carboxjmethylcel
lulosc. geleitet, und danach erfolgt Gradienten-Llution mit 0.005 M bis 0.2 M Ammoniumacetat (pH 6.8). Das
gewünschte Peptid befindet sich in den (330—520 m!)-Fraktionen.
Die Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Es werden 282 mg eines weißen flaumigen
Pulvers erhalten.
[>]■· -32,66" (c=0,545in5% wäßriger Essigsäure):
RP = O,IO.Rf' = O.75.
Aniinosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 η HCI in Gegenwart
von Thioglycolsäure):
His. 1,00; Arg. 0.96; Trp. 0,96; Scr. 1,00: GIu. 1.00:
Pro. 1.04; Leu. 2.00; Tyr. 1.00.
I lerstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-T>ra-Aibu-Leu-Arg-Pro-N
H-ClL-CH,
a) 1 lerstellung von Z-a-Aibu-L.eu-Arg(NO?)-Pro-NH-CH.-CH,
In 7 ml Dimethylformamid werden 0.6 g Z-a-Aibu-OH und 0.9g H-Leii-Arg(NO;)-Pro-NI!-
: ClL-CHi gelöst. Die Lösung wird auf 0"C gekühlt, es
werden 0.71 g l-Äthyl-3-(3-dimethylaminoprnpyl)-carbodiimid (ein wasserlösliches Carbodiimid) zugegeben,
und danach wird 12 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand in
;.. 100 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wird mit 4°/oiger Natriumhydrogencarbonat-l.ösung und
1 N Salzsäure gewaschen, mit Wasser nachgewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel
wird unter vermindertem Druck abdestilliert, und der
,- Rückstand wird mit Äther behandelt, wobei ein Pulver
erhalten wird, das .'ibfiltriert wird. Das Pulver wird aus
Äthylaeetat/Äther umgefällt, und es werden 473 nie des
gewünschten Produktes erhalten.
Fp.:104-107rC.
Fp.:104-107rC.
:■ [\] ' -45,8' (f=0.55in DMF).
Rf" =0.50.
Elementaranalyse für Ci;Hy)OsNj · O ■ 5 HiO
Berechnet: C 54.28. H 7,50, N 18.38; gefunden: C 54.32. H 7,32. N 17.97.
b) Herstellung von BOC-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-ArgfNO:)-PrO-NH-CH2-CH3
In 3 ml 25%igem HBR-Eisessig werden 423 mg
,.. Z-a-Aibu-Leu-Arg(NO;)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst, und
die Mischung wird dann bei Raumtemperatur 40 min lang gerührt, wonach 50 ml trockener Äther zugefügt
wird. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und
unter vermindertem Druck über Natriumhydroxyd in einem Exsikkator getrocknet. Das erhaltene Pulver wird
in 3 mi DMF gelöst und die Lösung mit 0,24 ml
N-Äthylmorpholin neutralisiert, wonach auf 0=C ge
kühlt wird. Hernach erfolgt die Zugabe von 557 mg BOC-Tyr(Bzl)-OH und 298 g HONB, und schließlich
werden noch 280 g DCC zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 6 Tage lang gerührt Der als
Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird
abfiltriert und das DMF unter vermindertem Druck abdestilliert Der Rückstand wird ;n 100 ml Chloroform
gelöst die Lösung mit 1 N HCl und 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, mit Wasser nachgewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und
danach unter vermindertem Druck zur Trockene
eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird aus .Allylacetat
umgefüllt.
Ausbeute: 275 mg.
Γρ.: !27-129'C.
[\] ■ -27.6' (ι = 0.54 in DMT):
Rf -=0.60.
F-'Icmentaranalyse für C.MHh:OiiiNiii ■ H..O
Berechnet:' C 57.82. Il 7.61. N 15.32;
gefunden: C 58.32. Il 7.51. N 15.10.
c) Herstellung von BOC-Ser-Tyr(Bzl)-,i-Aihii-l.en-ATfJ(NO..)-Pro-Nil-C!
I.-CH ι
In i ml Tiifluorcssigsa'ure. welche 0.1 ml Anisol
enthalt, werden 250 mg ßOC-Tyr(R/l)-a-Aibu-l.eu-AIg(NOj)-Pm-NH-CIL-CHi
gelöst, und diese Lösung wird bei Raiimieniperaiur 30 min lang gerührt. Dann
w erden 10 ml trockener \thcr zugegeben, und der dabei
entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrockrh
,Ιι
Pulve
....
....
l I1M1. <»ρ|Λ«.Ι
die 1.KSUiIf; mit 0,08 ml N-Äthylmorpholin neutralisiert.
Dann w^-den 150mg (BOC-Ser-)Tricn!orphenylesier
zugegeben und die Lösung 2 Tage lang gerührt. Das DMF wird abdestilliert, und der Rückstand wird mil
Äther behandelt, wobei ein Pulver erhalten wird. Dieses
wird abfiltriert und zweimal aus Äthylacetat umgefällt.
Ausbeute: 100 mg;
Fp.: 140- l42"C(Zersetzung):
[\] -34,8--(C= 0.44 in DMF):
Rf =0.74.
FJementaranalysefürO:H-:0:.N·: ■ 3 H:O
Berechnet: C 54.43. H 7.58. N 14.84: gefunden: C 54.66. H 7.45. N 14.91.
d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyra-Aibu-Leu-Arg'-Pro-NH-CHrCH
ι
In 3 ml Trifluoressigsäiire, welche 0.1 ml Anisol
enthält, werden 77 mg BOC-Ser-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-ATg(NOj)-PrO-NH-CH2-CHj
gelöst, und die Lösung wird bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Dann
werden 30 ml trockener Äther zugegeben, der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das
erhaltene Pulver wird in 3 ml DMF gelöst, und die Lösung wird mit 0,21 ml einer 10%igen Lösung von
N-Äthylmorpholin in DMF neutralisiert. Dann werden zu dieser Mischung 37 mg Kristalle von (Pyr)Glu-His-Trp-OH
zugegeben, die Mischung wird auf -10rC gekühlt, wonach die Zugabe von 21 mg HONB und
30 mg DCC erfolgt. Diese Mischung wird bei 0:C 12 Stunden lang gerührt, danach wird der als Nebenprodukt
anfallende Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, und das Filtrat wird sodann unter vermindertem Druck zur
Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 2O°/oigem Äthanol gelöst und an einer (1 χ 10 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2, adsorbiert. Die Elution wird
nach dem Gradienten-Verfahren unter Verwendung von 20%igem bis absolutem Äthanol (jeweils 200 ml)
durchgeführt. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt angereichert enthalten, entsprachen den
Konzentrationsbereichen des Äthanols von 40 bis 70%. Sie werden gesammelt und danach unter vermindertem
Druck eingeengt und lyophilisiert. Es werden 30 mg des geschützten Monapeptids (RP = 031) erhalten. Unter
Zugabe von 0,1 ml Anisol und 0,1 ml Mercaptoathanol wird dieses geschützte Monapeptid mit 3 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt, und die Mischung wird
danach bei 0°C 60 min lang gerührt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck abdestilliert und
der entstandene Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dreimal mit je 2 ml Äther extrahiert,
und die wäßrigen Schichten werden vereinigt und über ·> eine (2 χ 4 cm)-Kolonne. Amberlite CG-410 (Acetat-Γι,πη).
geleitet, welche Kolonne danpch mit Wasser
gewaschen wird. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und über eine Kolonne. Carboxymethylcellulose,
und Amberlite XAD-2. wie in Beispiel I ■ ■ beschrieben, geleitet.
Nach Lyophilisierung werden 14 mg eines weißen flaumigen Pulvers erhalten.
[\] -54.Γ (V =0.31 in 5% wäßriger Essigsäure);
Rf-'= 0.099; Rf = 0.7 15.
'■ Aminosäiireanal.vsc (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart
von Thioglykolsäure):
His 0.94: Arg 0Λ>7; Trp 0.81: Scr 1.06; GIu 0,?7; Pro
0.97; Leu 1.03:Tvr 1.03; a-Ai'nu 1.00.
Hirsteilung von (Pyr)Glu-llis-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Nl
I-Cl L-CH1
a) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH
!n 100 ml Methanol werden 4.0 g Z-Ser-Phs-OMe
gelöst, und dieses wird bei Atmosphärendruck unter Einsatz von 500 mg Palladiumschwarz als Katalysator
1,5 Stunden lang reduziert. Der Katalysator wird
in abfiltriert, und das Methanoi wird dann rasch unter
vermindertem Druck abdcstilliert. Der Rückstand wird in 25 ml DMF gelöst, und es werden 4,1 g kristallines
(Pyr)Glu-His-Trp-OH zugegeben. Die Mischung wird auf -5CC gekühlt, wonach 3.8 g HONB und 3 g DCC
','■ zugefügt werden. Die so erhaltene Mischung wird dann
bei -5"C 2 Stunden, bei O0C 2 Stunden lang und zuletzt
bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt. Der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird
abfilmen, und das Filtrat wird unter vermindertem
-" Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit
Äthylacetat behandelt, und das erhaltene Pulver wird abfiltriert (6.7 g). Dieses Pulver wird in 30 ml 15°/oigem
Methanol/Chloroform gelöst und die Lösung über eine (6 χ 12 cm)-Kolonne. Silikagel. welche mi· 15%igem
j- Methanolchloroform konditioniert ist.geleitet.
Die Elution wird ausgeführt, indem 600 ml 15%iges Methanol/Chloroform, 1 1 25%iges Methanol/Chloroform
und 1 I 30%iges Methanol/Chloroform eingesetzt werden. Die Fraktionen zwischen 400 ml der 25°/oigen
ν. Methanol/Chloroform-Lösung und 700 ml der 30%igen Methanol/Chloroform-Lösung werden vereinigt unc
unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Äthylacetat behandelt,
und das entstandene Pulver wird abfiltriert. Es werden 4,2 g des gewünschten Produktes erhalten.
RP = 0,29.
In 20 ml Methanol werden 35 g dieses Methylesters
suspendiert, und bei 0cC werden 8 ml INNaOH
zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde lang gerührt und danach mit 8 ml IN HCl neutralisiert Das
Methanol wird unter reduziertem Druck abdestilliert, und es erfolgt danach Zugabe von 20 ml kaltem Wasser.
Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gewonnen, mit gekühltem Wasser und danach mit
Äthanol/Äther (4:6) gewaschen und getrocknet Es werden 232 g des gewünschten Produktes erhalten.
jYp — 33= (c= 0,55 in Eisessig);
RH=0,61
b) Herstellung \on(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Fhe-D-Leu-Leu
Arg-Pro-NH-CH-CH3
In 4 ml DMF werden 29ö mg (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Phe-OH
und 228 mg H-D-Leu-Leu-Arg(NO3)-Pro-NH-CHrCH3
gelöst, wonach die Zugabe von 140 mg HONB erfolgt. Die Mischung wird auf — 10=C gekühlt, und
danach werden 90 mg DCC zugegeben. Diese Mischung wird bei - 103C 2 Stunden lang, bei 0T3 Stunden lang
und letztlich bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt, in genau derselben Weise wie in Beispiel 1
beschrieben, wird diese Reaktionsmischung einer Säulenchromatographie mit Amberlite XAD-2 unterworfen.
Dabei werden 342 mg des gewünschten Produktes erhalten.
[\] -4<.,:4C (c= 0,115 in Methanol):
Rf-' = 0.265, RP = 0.78.
In 20 ml einer 6O°/oigen wäßrigen Ameisensäure-Lösung
werden 300 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelöst, wonach 600 mg
SnCIj · H>O zugegeben werden. Die Mischung wird 2
Stunden lang bei 80—85° C stehengelassen, wonach sie
unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt wird. Dann wird in genau derselben Weise, wie in
Beispiel 1 beschrieben, das Konzentrat mittels einer Kolonne, Amberlite XAD-2T und einer Kolonne.
Carboxymethylcellulose, gereinigt. Dabei werden 211 r.ig eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten.
[\]? -38,49° (c= 0.53 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = 0,12; RP = 0.74.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 1,00; Arg 1,04; Trp 058; Ser 032; GIu 1,00; Pro 1,00; Leu l,04;Phe 1,00;Tyr038.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH3
a) Herstellung von Z-D-Phg-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CHrCH3
In einer Mischung von 10 ml Dimethylformamid und
20 ml Dichlormethan werden 580 mg Z-D-Phg-OH und 1,14 g H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst. Zu
dieser Mischung werden 400 mg HONB und unter Kühlung mit Eis werden 500 mg DCC zugegeben. Die
Mischung wird bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt und das dabei entstandene Nebenprodukt
Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, wonach das Filtrat zur Trockene eingeengt wird. Der Rückstand
wird in IOD ml Äthylacetat gelöst, die erhaltene Lösung
wird mit 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, danach über trockenem
Natriumsulfat getrocknet und zum Entfernen des Äthylacetats destilliert. Der Rückstand wird aus
Äthylacetat/Petroläther umgefällt, und es werden 1,4 g eines Pulvers erhalten.
RH =0.65; RP = 0.83.
[\] ■ -80,2" (c=0,5in Methanol).
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3
In 20 ml Essigsäure werden 150 mg Z-D-Phg-I.eu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH,
gelöst. Nach Zugabe von 100 mg Palladiumschwarz wird bei Atmosphärendruck Wasserstoffgas durch die Lösung geleitet, wobei die
Reduktion stattfindet
Nach 4 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, und
es werden 0,4 ml 1 N HCl zugegeben. Die Lösung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und
das erhaltene Konzentrat wird in 20 ml Wasser gelösi
und lyophilisiert Das erhaltene Pulver wird in 8 ml Dimethylformamid gelöst, und es werden 0,25 ml
!0%ige Lösung von N-Äthylmorpholin in Dimethylformamid
tropfenweise zugesetzt. Dann werden 141 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Oh zugegeben, wonach die
Zugabe von 50 mg 1-Hydroxybenzotriazo! und letztlich von 40 mg DCC bei - 5° C erfolgt.
Die Mischung wird bei -5° C 2 Stunden lang, bei 00C
weitere 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur letztlich 8 Stunden lang gerührt Danach wird Äther zur
Reaktionsmischung zugegeben, der erhaltene Niederschlag wird filtriert und in 20 ml Wasser gelöst Die
unlöslichen Anteile werden abfältriert, das Filtrat übet
eine Kolonne, Amberlite I RA-410(Acetatform), geleitet
welche Kolonne danach mit Wasser gewaschen wird Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinig!
und über eine (14 * 25 cm)-KoIonne, Carboxymethylcellulose,
geleitet Danach erfolgt die Gradienten-Elutior unter Verwendung von 0,005 M Ammoniumacetat und
0,175 M Ammoniumacetat (pH 6,8) (jeweils 300 ml). Das
gewünschte Produkt Defindet sich in den (170—240 ml)-Fraktionen.
Diese Fraktionen werden vereinigt und über eine (2 χ 20 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2
geleitet Das dort absorbierte, gewünschte Produkt wird nacii dem Gradientenverfahren unter Verwendung vor
Wasser (250 ml) und Äthanol (280 ml) eluiert, wobei sich die reine Verbindung in den (190—240 ml)-Fraktioner
befindet Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Es werden 110 mg des
gewünschten Produktes erhalten.
RP = 0,098; RP = 0.73.
[λ]? -57,0° (c= 0,56 in 5% wässeriger Essigsäure).
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 0,96; Arg 1,04; Trp 052; Ser 0,93; GIu 1,00; Pro
1,00; Leu 1,01; Phg 0,98; Tyr 1,01.
Herstellung von (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-5«
D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3
a) Herstellung von Z-D-Ser-Leu-Arg(NO2)-Pr0-NH-CH2-CH3
5i In einer Mischung von 10 ml Dioxan und 10 ml
Dimethylformamid werden 955 mg Z-D-Ser-OH. 1,82 g H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CHj-CHjund 788 mg HONB
gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt, und es werden 907 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0°C 2
Mi Stunden lang und danach bei Raumtemperatur 5
Stunden lang gerührt. Das anfallende Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, und das Filtrat
wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml
hi Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit
0,5 N HCI und 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung in der erwähnten Reihenfolge gewaschen, über
Magnesiumsulfat getro^net und unter vermindertem
230 211/195
Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther behandelt, das erhaltene Pulver wird
abfiltriert und aus Äthanol/Äther umgefällt
Ausbeute: 2,4 g;
Fp.: 123-126° C (Zersetzung); =>
[Λ]V -49,8C (c= 0,5 in Methanol).
Elementaranalyse für C30H47O9N9 · H2O
Berechnet: C 51,79, H 7,09, N !8,12;
gefunden: C 52,01, H 6,96, N 18,04.
Berechnet: C 51,79, H 7,09, N !8,12;
gefunden: C 52,01, H 6,96, N 18,04.
Rfi =0,40.
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3
In einer Mischung aus 20 ml Methanol und 1 ml
Eisessig werden 334 mg Z-D-Ser-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CHrCH3
gelöst und unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator wird bsi Raumtemperatur und
Atmosphärendruck 4 Stunden lang katalytisch reduziert Danach wird de- Katalysator abfiltriert, und das
Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird durch Zugabe von 9,6 ml
0,1 N HCI gelöst und lyophilisiert.
Das dabei erhaltene trockene Pulver und 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH werden in 3 ml DMF
gelöst,und es werden 100 mg 1-Hydroxybenztriazol und [λ]? —51,2° (c=
0,615 ml einer 10%igen Lösung von N-Äthylmorpholin Rf1 =0,66.
in DMF zugegeben.
Die Mischung wird auf -5CC gekühlt, und es werden
dann 165 mg DCC zugegeben. Die erhaltene Mischung wird bei —5° C 4 Stunden lang und bei Raumtemperatur
8 Stunden lang gerührt Der als Nebenprodukt anfallende Harnstoffderivat wird abfiltriert und das a
Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in 20 ml
Wasser gelöst, und die unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat selbst wird dann auf eine Kolonne
(10 ml), Amberlite IRA-410 (Acetatform), aufgebracht,
der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und über eine (1,5 χ 27 cm)-Kolonne, Carboxymethylcellulose,
geleitet. Die Elution erfolgt nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,005 M Ammoniumacetatpuffer
(300 ml) und 0,15 M Ammoniumacetat +3 (300 ml). Die erhaltene Verbindung befindet sich in den
(280—322 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wobei 135 mg eines Rohproduktes
erhalten werden. Dieses wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und auf eine (1,5 χ 17 cm)-Kolonne,
Amberlite XAD-2, aufgegeben. Die Elution wird nach de;n Gradientenverfahren unter Verwendung von
5%ig wässerigem Alkohol (300 ml) und 60%ig wässerigem Alkohol (330 ml) durchgeführt. Die (196 ml-231
ml)-Fraktionen werden gesammelt und nach Entfernung des Äthanols durch Destillation lyophilisiert.
Ausbeute: 62 mg.
Ausbeute: 62 mg.
Das Produkt wird in 0,1 N wäßriger Essigsäure gelöst und einer Gelfiltration auf einer (1 χ 54 cm)-Kolonne,
Sephadex LH-20, unterworfen. Nach Lyophilisierung ^n
werden 40 mg des gewünschten, reinen Produktes erhalten.
[-φ -46,4° (c=0,5 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = 0,055, RP = 0,70.
RP = 0,055, RP = 0,70.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegen- *>
wart von Thioglycolsäure):
His 1,00; Arg 1,04; Trp 1,00; Scr 1,81; GIu 1,00; Pro
1.00; Leu 1,04; Tyr 0,96; Äthylamin 1,04.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCHj
a) Herstellung von Z-D-Abu-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2-CH3
In 5 ml Dimethylformamid werden 03 g Z-D-Abu-OH und 0,45 g H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CHrCH3gelöst
Die Lösung wird auf 00C gekühlt, und es werden
0,25 g HONB und 0,29 g DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 00C 1 Stunde lang und bei Raumtemperatur 5
Stunden lang gerührt. Das Harnstoffderivat wird abfiltriert, und das Filtrat wird unter vermindertem
Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand Ή\τά in
80 ml Chloroform gelöst und danach mit 1 N hCl und
einer 4%igen Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen.
Nach dem Waschen mit Wasser wird über Magnesiumsulfat getrocknet und danach unter vermindertem
Druck zur Trockene eingeengt Der erhaltene Rückstand wird danach mit Äther behandelt, das dabei
erhaltene Pulver abfikriert und aus Äthylacetat/Petroleumbenzin
umgefällt
Ausbeute :489 mg;
Ausbeute :489 mg;
0,6 in Methanol);
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3
Z-p-Abu-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CHrCH3 wird mit
25°/oigem HBr-Eisessig behandelt und tnit Äther gefällt. Der Niederschlag wird über eine Kolonne, Amberlite
CG-410 (freie Base), geleitet, um HBr zu entfernen. In
3 ml DMF werden 220 mg der freien Base des so erhaltenen H-D-Abu-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3
gelöst, und danach werden 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH sowie 150 mg HONB zugegeben. Die
Mischung wird auf -10" C gekühlt, und 85 mg DCC werden zugegeben. Die so erhaltene Mischung wird bei
- 100C 2 Stunden lang und letztlich bei Raumtempera -tür 7 Stunden lang gerührt. Zur Reaktionsmischung wird
dann Äthylacetat zugegeben, und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Dieser Niederschlag wird
danach in 20%igem wäßrigem Methanol unter Erhitzen gelöst, die Lösung wird abgekühlt, wobei ein Niederschlag ausfällt. Dieser wird abfiltriert.
RP=0,240, RP = 0,772.
(In beiden Lösungsmitteln enthält das Produkt etwa 10% Verunreinigungen, welche «inen kleineren
Rf-Wert aufweisen.)
In 15 ml 60%iger wäßriger Ameisensäure werden 200 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes
gelöst, wonach 400 mg SnCI2 · H2O zugegeben werden.
Die Mischung wird dann auf 80—85°C 2 Stunden lang
erhitzt, danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und der dabei entstandene Rückstand
wird sodann mit 50 ml warmem Wasser extrahiert.
Die unlöslichen Anteile werden dann abfiltriert, das Filtrat über eine Kolonne, Amberlite XAD-2, Carboxymethylcellulose
und Sephadex LH-20, in der beschriebenen Reihenfolge geleitet, wonach eine Lyophilisierung
erfolgt. Es werden 104 mg eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten.
[λ]·? -43,6° fc=0,50 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = 0,08.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 0,98; Arg 0,96; Trp 0,94; Ser 0,92; GIu 1,00; Pro
1,00;Leu0,98; Abu l,00;Tyr l,00;ÄthyIamin !,02.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-A^-PrO-NH-CH2-CH3
a) Herstellung von Z-D-Nva-OH
In üblicher Weise wird H-D-Nva-OH mit Carbobenzoxychlorid
in 2 N Natriumhydroxid umgesetzt, und die dabei entstandene Verbindung wird aus Äthylacetat/Petroleumbenzin
umkristallisiert Dabei werden Nadeln erhalten.
Fp.: 83-84° C.
[α]? + 12,1° (C= 1,0 in Methanol).
Elementaranalyse für CuHuO4N
Berechnet: C62.14, H 6,82, N 5,57;
gefunden: C 62,17, H 6,88, N 5,62.
Berechnet: C62.14, H 6,82, N 5,57;
gefunden: C 62,17, H 6,88, N 5,62.
b) Herstellung von Z-D-Nva-Leu-Arg(NC>2)-PrO-NH-CH2-CH3
In 5 ml DMF werden 376 mg Z-D-Nva-OH, 685 mg
H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 und 295 mg HONB gelöst, und danach werden bei 0°C 340 mg DCC
zugegeben. Die Mischung wird bei 0"'C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt. Das
als Nebenprodukt anfallende Harnstoffderivat wird abfiltriert, und es werden 100 ml Äthylacetat zu dem
Filtrat zugegeben, die Mischung wird mit 0,5 N HCl und
4°/oiger Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen. Danach wird die Lösung mit Wasser gewaschen und
über trockenem Natriumsulfat getrocknet Die Lösung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt
und danach mit Äther behandelt. Das dabei entstehende Pulver wird abfiltriert und zur Reinigung
aus Äthylacetat/Äther umgefällt.
Ausbeute: 900 mg;
Fp.: 105-107°C(Zersetzung);
[λ]? -5\2" (c= 1 in Methanol);
Rf =0,60.
Elementaranalyüe für C32H51O8N9
Berechnet: C55,71, H 7,45, N 18,27;
gefunden: C55,54, H 7,62, N 18,09.
Berechnet: C55,71, H 7,45, N 18,27;
gefunden: C55,54, H 7,62, N 18,09.
c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ü-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCHj
Ausgehend von Z-D-Nva-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3
(wie in b) beschrieben, erhalten und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH wird dieselbe Reaktion und
derselbe Reinigungsvorgang wie in Beispiel 6b) beschrieben, durchgeführt, und es wird die gewünschte
Verbindung erhalten.
[\\; -39,8" (c=0,51 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = 0,094; RP = 0,74.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 1,00; Arg 0,98; Trp 0.93; Ser 0,94; GIu 1,08; Pro
1,02; Nva 0,98; Leu l,00;Tyr 0,98; Äthylamin 1,04.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-CH3
a) Herstellung von Z-D-Nva-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2-CH2-CH3
In 2 ml 25°/oigem H Br-Eisessig werden 720 nig
Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-N H-CH2-CH2-CH3 gelöst, und die
ι« Lösung wird 40 min lang geschüttelt Dann werden 20 ml trockener Äther zugegeben, und der erhaltene
Niederschlag wird abfiltriert Der Niederschlag wird mit trockenem Äther gut gewaschen. Danach wird er über
Natriumhydroxid unter vermindertem Druck in einem Exsiccator getrocknet
Nach dem Trocknen wird das Produkt in 5 ml DMF gelöst, und es werden 250 mg Z-D-Nva-OH zugegeben,
wonach die Zugabe von 0,15 ml Triethylamin und 200 mg HONB erfolgt Die Mischung wird auf 00C
gekühlt, es werden weiters 230 mg DCC zugegeben, und danach wird 8 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt Dann erfolgt die Zugabe von 80 ml Äthylacetat, und die dann zurückbleibenden unlöslichen Anteile
werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit 1 N HCl, 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen
und danach über Natriumsulfat getrocknet
Es wird dann bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird mit Petroläther
behandelt Das erhaltene Pulver wird aus Äthylacetat/ Petroläther umgefällt.
Ausbeute: 718 mg.
[λ]:· -51,0° (c= 1,0 in Methanol);
Rf =0,64.
Ausbeute: 718 mg.
[λ]:· -51,0° (c= 1,0 in Methanol);
Rf =0,64.
Elementaranalyse für
3' Berechnet: C56.23, H 7,58, N 17,89;
gefunden: C 56,14, H 7,70, N 17,58.
gefunden: C 56,14, H 7,70, N 17,58.
b) Herstellung von (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-CH3
In 3 ml 25%igem HBr-Eisessig werden 500 mg Z-D-Nva-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH2-CH3 gelöst
und die erhaltene Lösung 50 min lang geschüttelt. Dann werden 60 ml trockener Äther zugegeben, der erhaltene
Niederschlag wird abfiltriert und in 40 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dann über eine (1 χ 14cm)-Kolonne,
Amberlite CG-410 (freie Phase), geleitet, die dann mit
30%ig wäßrigem Methanol gewaschen wird. Der Effluent und die Waschwässer werden vereinigt,
wonach das Methanol unter vermindertem Druck abdestil'iert wird. Der Rückstand wird lyophilisiert, und
es werden 320 mg der freien Base H-D-Nva-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH2-CH3
erhalten. In 2 ml DMF werden 225 mg dieses Produkts und 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH gelöst, wonach die Zugabe
von 130 mg HONB erfolgt. Die Mischung wird auf - 10°C gekühlt, und es werden 87 mg DCC zugegeben.
Diese Mischung wird bei - 10°C 3 Stunden lang, bei 0°C
2 Stunden lang und bei Raumtemperatur schließlich 6 Stunden lang gerührt. Dann werden 40 ml Äthylacetat
zugegeben, der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert und dann in 30%ig wäßrigem Äthanol unter
Erhitzen gelöst. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert, das Filtrat wird gekühlt, wobei ein Niederschlag
erhalten wird, welcher abfiltriert und mit kaltem Wasser gewaschen und schließlich getrocknet wird.
Ausbeute: 340 mg.
In 20 ml 60%ig wäßriger Ameisensäure werden 300 mg
In 20 ml 60%ig wäßriger Ameisensäure werden 300 mg
des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelöst,
wonach die Zugabe von 580 mg SnCI2 · H2O erfolgt.
Die Mischung wird dann 2 Stunden lang auf 85°C erhitzt, und danach erfolgt ein Einengen zur Trockene
unter vermindertem Druck, wonach die Mischung mit warmem Wasser extrahiert wird.
Der Extrakt wird durch Chromatographie auf Amberlite XAD-2, Carboxymethylcellulose und Biogel
P-2 gereinigt Es werden 170 mg des gewünschten Produktes erhalten.
[λ];· -37,7° fc= 0,505 in 5% wäßriger Essigsäure);
Rf2 = 0,13,RP=0,76.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 1,02; Arg 0,98; Tirp 0,97; Ser 0,9S; GIu 1,02; Pro
1,00; Leu 1,00; Nva 1,02; Phe 0,98.
Herstellung von (Pyr)GIu- His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-PiO-NH-CH(CU:3)2
a) Herstellung von Z-D-Abu-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH(CH3J2
In 3 ml 25%igem H Br-Eisessig werden 700 mg
Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH(CH3)2 gelöst, und die
Lösung wird 60 min lang heftig gerührt, wonach 50 ml trockener Äther zugefügt werden. Der dabei entstandene
Niederschlag wird abfiitriert und getrocknet, das getrocknete Produkt wird dann in 6 ml DMF gelöst, und
zu dieser Lösung werden 240 mg Z-D-Abu-GH zugefügt Danach erfolgt Neutralisation dieser Lösung
mit 0,15 ml Triethylamin.
Es werden dann 200 mg HONB zugegeben, und die Mischung wird auf 00C gekühlt, worauf die Zugabe von
230 mg DCC erfolgt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt. Dann werden 100 ml
Äthylacetat zugegeben und die unlöslichen Anteile abfiltrien. Das Filtrat wird mit 0,5 N HCI und 4%iger
Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen, getrocknet und danach über Natriumsulfat getrocknet. Es
wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und mit Äther behandelt. Das erhaltene
Pulver wird aus Äthylacetat/Äther umgefällt.
Ausbeute: 725 mg.
[Λ]> -52,0° (c= 0,5 in Methanol);
Rf =0,62.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-
D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHj-CHjdurch
Fest-Phase-Verfahren
a) Herstellung von BOC-Pro-Harz
In 50 ml DMF werden 15 g chlormethyliertes Harz (Chlorgehalt 9,45 mMol) eingebracht, wonach die
in Zugabe von 6,1 g BOC-Pro-OH und 333 ml Triethylamin
erfolgt. Die Mischung wird 5 Tage lang geschüttelt. Das Harz wird danach filtriert, gut mit DMF, Äthanol,
Wasser, Äthanol und Äther in der genannten Reihenfolge gewaschen und getrocknet.
r, Ausbeute: 17,55 g.
r, Ausbeute: 17,55 g.
Die Aminosäureanalyse ergibt, daß dieses Harz 0,314 m/Mol/g BOC-Pro enthält.
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Ty-;Bzl)-
D-Leii-Leü-ÄrgiTos)-Frc··' !arz
| Elementaranalyse | für C32H5 | lOgNg | N | 18,27; |
| Berechnet: | C 55,71, | H 7,45, | N | 18,01. |
| gefunden: | C 55,42, | H 7,59, | ||
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH3)2
Aus dem wie in a) beschrieben erhaltenen Z-D-Abu-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH(CH3)2
und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH wird die oben angeführte Verbindung nach ganz demselben Verfahren, wie in Beispiel 5
beschrieben, erhalten.
[\]' -41.0° fc=0,62 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = 0,11; RH = 0,74.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart
von Thioglycolsäure):
His 1.00; Arg 0,?Γ; Trp 0.87; Ser 0.97: GIu 1.00; Pro
0.94; Abu 1,00: Leu 1.02:Tvr0,96.
Das Reaktionsgefäß eines automatischen Peptid-Synthetisators (Simadzu Seisakusho, Modell APS-300) wird
mit 3,145 g BOC-Pro-Harz (wie in a) beschrieben erhalten) gefüllt. Das Harz wird mit Dichlormethan
innerhalb von 12 Stunden angequollen, wonach Aminosäuren im folgenden Zyklus zugeführt wurden.
Dichlormethan (3 min x3)-> 50% Trifluoressigsäure/
jo Dichlormethan (10 min und 30 min) -► Dichlormethan
(3 min χ 3) -» Äthanol (3 min χ 3) -► Dichlormethan
(3 min χ 3) — 10% Triäthylamin/Chloroform
(10 min) -► Chloroform (3 min χ 3)-♦ Dichlormethan
(3 min χ 2) — BOC-Aminosäure-anhydrid (synthetisiert aus BOC-Aminosäure und DCC auf herkömmliche
Weise) (30 min und 60 min) -► Acetylierung (Dichlormethan, Triäthylamin und Essigsäureanhydrid) (1 Stunde)
— Dichlormethan (3 min χ 3) ((PyrKJIu-OH allein wird direkt mit DCC in DMF kondensiert).
Danach wurde das Harz mit Äthanol, Chloroform, Dimethylformamid und Äther gewaschen und getrocknet.
Ausbeute :3,89 g.
c) Herstellung von (Pyr)G!u-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr-(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-
PrO-NH-CH2-CH3
In 20 ml Methanol werden 3,52 g des wie in b) beschrieben erhaltenen Harzes suspendiert, und die
Suspension wird auf 20° C gekühlt. Äthylamin, welches durch Erhitzen von 80%ig wäßrigem Äthylamin in
einem warmen Wasserbad erhalten wurde, wurde nach Durchlesen durch Natriumhydroxid in die Suspension
eingebracht. Nach genügender Sättigung wurde die Mischung 40 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt.
Das Harz wird durch Filtration gewonnen, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene
eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, und es werder 835 mg eines pulvrigen Rohproduktes
bo erhalten. Dieses Rohprodukt enthält einen großen
Anteil einer Verunreinigung, welche vermutlich der Methylester ist. Daher werden 503 mg dieses Produktes
in Methanol/DMF (jeweils 8 ml) gelöst und in derselben
Weise wie oben beschrieben, wird Äthylamin in die
b-) Lösung eingeleim".. Die Lösung wird 34 Stunden lang
gerührt, wobei der Methylester verschwindet.
Die Lösung wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und der dabei erhaltene Rückstand
wird mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wird abfiltriert.
Ausbeute: 465 mg.
d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH,
In Gegenwart von 0,4 ml Aiiisol und 0,4 ml Mercaptoäthanol
werden 327,8 mg des wie in c) beschrieben erhaltenen Rohproduktes in 8 ml wasserfreier HF
gelöst. Die Lösung wird bei 0°C eine Stunde lang n gerührt, wonach sie unter vermindertem Druck zur
Trockene eingeengt wird. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst, und die unlöslichen Anteile werden
abfiltriert. Das Filtrat wird dann über eine (1.5 χ 20 cm)-Kolonne.
Amberlite IRA-410 (Acetatform), geleitet und ι dann auf chromatographischem Wege an Carboxymethylcellulose
und Amberlite XAD-2 gereinigt. Dann wrtu UdS so ciiMiterrc riuuuki einei Geiintraiioii auf
einer Kolonne. Sephadex LH-20. unterworfen. Es werden 98 mg des gewünschten Produkter, erhalten.
[\] -32.0" (c-0.52 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = OJO: Rf = 0.75.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 0.98; Arg 1.00: Trp 0.87; Ser 0.90: GIu 1,02; Pro :
1.02: Leu 2,oi:TvrO.98:Äthvlamin 1.10.
Bei
Il
i s ρ i e I
Herstellung von(Pyr)Glu-His-Trp-.Ser Tyr-DNIe Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH,
a) Herstellung von BOC-D-Nle-l.e;i-Arg(NO>)-Pro-NH
CH:-CH,
In 10 ml DMF werden 346 mg BOC-D-NIe-OH und
820 mg H-Leu-Arg(NO:)-Pro-NH-CH:-CH, gelöst. Die
Mischung wird auf 0"C gekühlt, wonach die Zugabe von 322 mg HONB und 371mg DCC erfolgt. Die so
erhaltene Mischung wird bei OC 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Harnstoffverbindung,
welche als Nebenprodukt anfällt, wird abfiltriert, das Filtrat wird danach mit IO ml Chloroform
extrahiert, der Extrakt wird mit 0.1 N HCI. 5°/oiger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen,
wonach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wird. Das Chloroform wird abgedampft, der
Rückstand wird mit Äther angerieben und aus -V.hano! Äther umgefällt, wobei das gewünschte Produkt
erhalten wird.
Ausbeute: 811 mg.
Fp: 124- 126"C(Zersetzung).
[x] -46.2" ^c = 0.5 in Methanol).
Eiementaranalyse für Ci-iH
Berechnet: C53.08,
gefunden: C 53.07.
Berechnet: C53.08,
gefunden: C 53.07.
sOgN? · 1/2 HjO
H831. N 18,57;
H 8.27. N 19,05.
H831. N 18,57;
H 8.27. N 19,05.
b) Herstellung von (PyrJGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CHj
BOC-D-Nle-Leu-ArgiNOjJhPro-NH-CFb-CHj. weiches
wie oben unter a) beschrieben erhalten wurde, wird mit Trifluoressigsäure behandelt und danach mit Äther
gefällt und abfiltriert. Das Produkt wird danach über eine Kolonne. Amberlite CG-45 (freie Base), zur
Entfernung der Trifiuoressigsäure geleitet In 2 ml DMF werden 190 mg der Verbindung H-D-Nle-Leu-Arg-(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3
und 168 mg(Pyr)G!u-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst. Die Mischung wird auf 0=C
abgekühlt, wonach die Zugabe von 65 mg HONB und 75 mg DCC erfolgt. Die Mischung wird bei 00C 2
Stunden lang und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Harnstoffverbindung, welche als Nebenprodukt
anfällt, wird abfiltriert und Äthylacetat zu dem « Filtrat zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird
durch Filtration gewonnen und mit 4 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von 0,1 ml Anisol. 0.1 ml Mercaptoäthanol
bei 00C I Stunde lang behandelt. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck
abgedampft und der Rückstand gut getrocknet und in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dann über eine
Kolonne, Amberlite IRA-410 (Acetatform), geleitet, und
der Effluent wird an einer (1.2 χ 22 cm)-Kolonne. Carboxymethylcellulose, adsorbiert. Es wird danach
eine Gradienten-Elution mit 0.005 M Ammoniumacetat (200 ml) und 0.15 M Ammoniumacetat (200 ml) durchgeführt.
Die (147— 168 ml)-Fraktionen werden gesammelt
ιιιιιί iyupmimei i.
Ausbeute: 40 mg.
[y] -42.2° (1C = 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = OJ I. Rf = 0.755.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 1.05; Arg 1.00; Trp 0.93; Ser 0.89: Tyr 1.00; GIu
1,00; Pro 1,02; Leu 1,00; Nie 1,00: Äthylamin 1,05.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CH:-CH,
a) Herstellung von H-D-Phe-Leu-Arg(NO>)-Pro-NH-CHrCHj
Zu einer Mischung von 10 ml Dichlormethan und 1 ml DMF werden 600 mg Z-D-Phe-OH. 500 mg HONB und
950 mg H-Leu-Arg(NO;)-Pro-NH-CH;-CHi zugegeben,
und die Mischung wird erwärmt. Danach wird auf 0rC
abgekühlt, und es werden 500 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird dann 4 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt, und der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird
unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Die Lösung
wird zweimal in 4%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen und danach
über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, wonach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt
wird. Dann wird der Niederschlag sofort in 2 ml Eisessig gelöst. Nach Zugabe von 5 ml 25%igem
HBr-Eisessig wird die Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt, wonach die Zugabe von 50nif
trockenem Äther erfolgt. Der Niederschlag, welcher sich abscheidet, wird abfiltriert und gut mit Äther
gewaschen und danach getrocknet Dieser Niederschlag wird dann in 10 ml 30%ig wässerigem Methanol gelöst.
Die Lösung wird über eine Kolonne. Amberlite !RA-410
(freie Form), geleitet welche danach mit 100 ml 30%ig
wäßrigem Methanoi eluiert wird. Der Effluent wird gesammelt und zur Entfernung des Methanols eingeengt
Bei der Lyophilisierung des Rückstandes wird die
gewünschte Verbindung H-D-Phe-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3
als weißes Pulver erhalten.
Ausbeute: 1,67 g.
[\]r -94.26= (c= 1.01 in Methanol).
Elementaranalyse für C^RisOeNa ■ H2O
Berechnet: C 54.09. H 7.62. N 20.28:
gefunden: C 53.84. H 7.79. N 19.91.
gefunden: C 53.84. H 7.79. N 19.91.
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCHi
In 6 ml DMF werden 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH
und 240 mg HD-Phe-Leii-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3
gelöst, wonach die Zugabe von 150 mg HONB erfol«r'. Die Mischung wird auf — 10"C gekühlt, und
90 mg DCC werden zugegeben. Die Mischung wird bei - 1O0C 2 Stunden lang, bei O0C weitere 2 Stunden lang
und danach bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt. Die als Nebenprodukt anfallende Harnstoffverbindung
wird abfiltriert, und es werden 40 ml Äther zu dem Filtrat zugegeben. Der dabei entstandene Niederschlag
wird abfiltriert. Bei IJmfällung aus Äthanol/Äthylacetat wird ein rohes geschütztes Peptid erhalten.
Ausbeute: 510 mg.
Dieses Roh-Peptid wird in 40 ml 60%ig wäßriger Ameisensäure gelöst. Nach Zugabe von I g SnCb · H>O
zu dieser Lösung wird die Mischung bei 80 —851C 2
Stunden lang stehengelassen. Diese Mischung wird dann unter vermindertem Druck /ur Trockene eingeengt,
nach Zugabe von 50 ml Wasser zu dem Rückstand wird die Mischung mit wäßriger Ammoniaklösung auf den
pH 0,7 eingestellt. Der Niederschlag wird abfiltriert, das Filtrat wird dann auf einer Kolonne, Amberlite XAD-2
und Carboxymethylcellulose, gereinigt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, lyophilisiert. wobei die gewünschte
Verbindung in Form eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten wird.
Ausbeute: 392 mg.
[\]· -71,8° (t=0.195in5% wäßriger Essigsäure);
RP = O1M. RP = 0.76.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 0.98: Arg 1.00; Trp 0,97; Ser 0,93: GIu 1.00; Pro
0,98; Leu 1,00; Phe 1.96.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Pro-NH-CH-rCHj
a) Herstellung von BOC-D-Thr-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2-CH3
In 10 ml Acetonitril werden 438 g BOC-D-Thr-OH
(ölige Substanz) und 18 mg HONB gelöst, wonach 912 mg H-Leu-Arg(NO2)-Pm-NH-CH2-CH3 zugegeben
werden. Die Mischung wird auf O0C gekühlt, und dann werden 494 mg DCC zugegeben. Die so erhaltene
Mischung wird bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt, und die unlöslichen Anteile werden danach
filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der dabei entstehende
Rückstand mit 100 ml Äthylacetat extrahiert Der Extrakt wird mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung,
10%iger wäßriger Zitronensäurelösung und Wasser, in der genannten Reihenfolge gewaschen und
danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet Er wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene
eingeengt, und der erhaltene Rückstand wird aus Äthanol/Äther umgefällt Es werden 900 mg der
gewünschten Verbindung erhalten.
Fp.: 199 -121' C (Zersetzung);
[λ]? -38,6= (c=0,5 in Methanol);
RP =0,45.
ElementaranaiysefürCaHsiOoNs - H2O
Berechnet: C 49,76, H 730, N 18,65;
gefunden: C 49,64, H 7,70, N 18,46.
Berechnet: C 49,76, H 730, N 18,65;
gefunden: C 49,64, H 7,70, N 18,46.
b) Herstellung von (Pyr)Glu-HisTrp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-ProNH-CH2-CH)
In IO ml Trifluoressigsäure werden 657 mg BOC-D- -, Thr-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CHi gelöst, und die
Lösung wird 40 min lang geschüttelt. Dann werden 60 ml Äther zugegeben, und der dabei erhaltene
Niederschlag wird abfiltriert und mit 30 ml Wasser gewaschen. Die wäßrige Lösung wird über eine
mi (I χ 10cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Base),
geleitet, welche dann selbst mit 30%igem wäßrigem Methanol gewaschen wird. Der Effluent und die
Waschlösungen werden vereinigt und /ur Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck eingeengt.
Der Rückstand wird lyophilisiert, und es werden 471 mg D-Thr-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH, erhalten. In
2 ml DMF werden 167 mg des so erhaltenen Produktes und 175 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst, wonach
eine Zugabe von 67 mg HONB erfolgt. Die :n Mischung wird auf -5°C gekühlt, und 77 mg DCC
werden zugegeben. Diese Mischung wird bei -5°C 3 Stunden lang und dann bei Raumtemperatur 10 Stunden
lang gerührt. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert, und es werden dann 50 ml Äthylacetat dem Fittrat
y. zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert und aus DMF-Äthylacetat umgefällt.
Ausbeute: 290 mg.
160 mg dieses Produktes werden in 10 ml 60%ig
wäßriger Ameisensäure gelöst, und unter Zugabe von in 400 mg SnCl2 · H2O wird die Lösung bei 80° C 2
Stunden lang behandelt. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
Dann werden 10 ml Wasser zugegeben, und die unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird
i\ auf chromatographischem Wege auf Amberlite XAD-2.
Carboxymethylcellulose und Bio-gel P-2 gereinigt. Es
werden 65 mg des gewünschten Produktes erhalten.
[\] -37,4" (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure):
RP = 0,12, RP = 0,68.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 1,00: Arg 0,97; Trp 0,94; Thr 1.03: Ser 0,90; GIu
1,00; Pro 1,06; Leu 1.06;Tyr 1.00;Äthylamin 1,10.
4-, Be is pi el 14
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CHrCH,
a) Herstellung von Z-lle-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2-CH,
In 12 ml einer 25%igen HBr-Eisessiglösung werden
1,43 g Z-Ar^NO2J-PrO-NH-CH2-CH3 gelöst, und die
Mischung wird bei Raumtemperatur 40 min lang geschüttelt Zu dieser Lösung werden 300 ml trockener
Äther zugegeben, und der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert und in einem Exsikkator über
Natriumhydroxid getrocknet Das erhaltene Pulver wird in 25 ml DMF gelöst und die Lösung wird mit 0,84 ml
Triethylamin neutralisiert, wonach Kühlung auf 00C
erfolgt Dann werden 795 mg Z-IIe-OH, 590 mg HONB und 680 mg DCC zugegeben, und die Mischung wird
dann bei 0cC 5 Stunden lang und schließlich 8 Stunden
lang bei Raumtemperatur gerührt Diese Reaktionsmi-
b5 schung wird abnitriert, und das Filtrat wird eingedampft
Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst danach mit 0,1 N HCl 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung
und Wasser gewaschen, wonach eine
Trocknung über Magnesiumsulfat erfolgt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand aus
Äthylacetat/Ätlier umgefällt. Nach der Umfällung aus
Äthanol/Äther werden 1,1 g des gewünschten Produktes erhalten.
Fp.: IO3-1O5X'.
[\] -58.Γ (c=~ 1.0 in Methanol). Rf =0,48.
Elementaranalyse für C27H4JO7Ns ■ 1/2 H2O
Berechnet: C 54,08, H 7,23. N 18.68;
gefunden: C 53.80. H 7.15. N 18,84.
Berechnet: C 54,08, H 7,23. N 18.68;
gefunden: C 53.80. H 7.15. N 18,84.
b) Herstellung von ZD-Leu-lle-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2-CH,
In 4 ml 25°/oigem HBR-Eisessig werden 590 mg Z-IIe-Ar8(NO2)PrO-NH-CH2-CH, gelöst und die Mischung
bei Raumtemperatur 40 min heftig gerührt. Zu dieser Lösung werden 50 ml trockenen Äthers zugegeben,
und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und hernach in einem Exsikkator
über Natriumhydroxid getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 8 ml DMF gelöst, und die Lösung wird mit
0.14 ml Triethylamin behandelt, wonach eine Kühlung auf 00C erfolgt. Dann werden 264 mg Z-D-Leu-OH,
216 mg HONB und 247 mg DCC zugegeben, und die Mischung wird bei 00C 2 Stunden lang, danach bei
Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann, wie in Beispiel a) beschrieben,
weiterbehandelt, und es werden 620 mg des gewünschten Produktes erhalten.
Fp.:l12—113"C.
[i] -47.8° (c=0.5 in Methanol). Rf =0.53.
Fp.:l12—113"C.
[i] -47.8° (c=0.5 in Methanol). Rf =0.53.
Elementaranalyse für CijHüOsNii ■ H2O
Berechnet: C54.91. H 7,68. N 17.47:
gefunden: C 54.72. H 7,52, N 17,19.
Berechnet: C54.91. H 7,68. N 17.47:
gefunden: C 54.72. H 7,52, N 17,19.
c) Herstellung von (Pvr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-lle-Arg-"Pro-NH-CH2-CH,
In 3 ml 25°/oigem HBr-Eisessig werden 220 mg Z-D-Leu-[le-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst, und
die Lösung wird bei Raumtemperatur 50 min lang heftig gerührt. Zu dieser Lösung werden 50 ml trockener
Äther zugegeben, und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem
Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Dieses Material wird dann in einer kleinen Menge Wasser
gelöst und über eine (1,2x7 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), geleitet. Der Effluent und die
Waschlösungen werden vereinigt und lyophilisiert. Dieses Material wird dann in 5 ml DMF zusammen mit
230 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH und 108 mg HONB gelöst Die Mischung wird auf -100C gekühlt,
und es werden 124 mg DCC zugegeben. Diese Mischung wird bei -10° C 2 Stunden lang, bei 00C weitere 2
Stunden lang und schließlich 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wonach abfiltriert wird. Das
Filtrat wird eingeengt und der Rückstand auf einer (I,8x20cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200—
300 Mesh), mittels Gradientenelution mit 5%ig wäßrigem
Äthanol bis 80%ig wäßrigem Äthanol (jeweils 250 ml) gereinigt. Das gewünschte Produkt befindet sich
in den (150 bis 350 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen
werden unter vermindertem Druck eingeengt und iyophiiisiert Das so erhaltene Material wird in 7 ml
60%ig wäßriger Ameisensäure gelöst, und es weiden 450 mg SnCb · H2O zugegeben. Die Mischung wird 2
Stunden lang auf 80—85°C erhitzt Die unlöslichen
Anteile werden abfü/riert, und das Filtrat wird unter
vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird dann mit 30 ml warmem Wasser (80"C)
extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und das Filtrat auf eine (1.8 χ 15 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200 bis
300 mesh), aufgegeben. Die Kolonne wird danach mit Wassergut gewaschen. Für die Elution wird die
Linear-Gradienten-Methode unter Einsatz von wäßrigem Äthanol (20-80%, 250 ml/250 ml) eingesetzt. Die
gewünschte Verbindung befindet sich in den (100 ml — 230 ml)Fraktionen. Diese Fraktionen werden gesammelt
und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Äthanols eingeengt. Das Konzentrat wird dann auf eine
(1.2 χ 40 cm)-Kolonne, Carboxymethylcellulose, aufgebracht. Danach wird das Produkt nach der Linear-Gradienten-Elutionsmethode
(0.005 M —0.2 M Ammoniumacetat, pH 6.8, 200 ml/200 ml) eluiert. Das gewünschte
Peptid wird in den (180 ml — 290 ml)-Fraktior.en erhalten. Diese Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
Ausbeute: 130 mg.
[\] - 39,2° (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = OJI.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 0,97; Arg 1.02: Trp 0,92; Ser 0.94; GIu 1,00; Pro
1,05; He 1,00; Leu l,00;Tyr 0,97.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CHrCH,
a) Herstellung von Z-Nle-Arg(NO2)-Pro-NH-CHrCH,
In 10 ml 25%igev HBr-Eisessigsäure werden 715 mg Z-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst, und die Mischung
wird be; Raumtemperatur 30 min lang heftig gerührt. Dieser Lösung werden 250 ml trockener Äther
zugegeben, und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsinkator
über Natriumhydroxid getrocknet. Das so erhaltene Pulver wird in 15 ml DMF zusammen mit 400 mg
NIe-OH gelöst, und die Lösung wird auf O0C gekühlt. Dann werden 0.45 ml Triethylamin. 295 mg HONB
sowie 340 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0cC 3 Stunden lang und danach 10 Stunden lang bei
Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann, wie in Beispiel 14a beschrieben, weiterbehandelt,
wobei das gewünschte Produkt erhalten wird.
Ausbeute: 824 mg.
Fp.: 109-110'C.
[λ]ϊ -50,4° (c=05 in Äthanol);
Rf =0,41.
Elementaranalyse für C27H42O7N8 · 1/2 H2O
Berechnet: C 54,08, H 7,23, N 18,68;
gefunden: C 53,79, H 7,09, N 1834.
Berechnet: C 54,08, H 7,23, N 18,68;
gefunden: C 53,79, H 7,09, N 1834.
b) Herstellung von Z-D-Leu-NIe-Arg(NO2)-PrO-NH-CHrCH3
In 5 ml 25%igem HBr-Eisessig werden 590 mg Z-Nle-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst, und die Mischung
wird 40 min bei Raumtemperatur geschüttelt Es werden 200 mi trockener Äther zugegeben, und der
dabei entstandene Niederschlag wird durch Ritration gesammelt und über Natriumhydroxid in einem
Exsikkator getrocknet Das Produkt wird dann in 5 ml
DM F gelöst und die Lösung mit 0,14 ml Triethylamin boi
0°C neutralisiert. Dann werden 264 mg Z-D-Leu-OH
zugegeb.-!i, weitere 216 mg HONB und 247 mg DCC bei
0°C. Die Mischung wird dann 2 Stunden lang bei 0"C gerührt, wonach IO Stunden lang bei Raumtemperatur
weitergerührt wird. Sie wird dann wie in Beispiel b) beschrieben weiterbehandelt. Es werden 594 mg des
gewünschten Produktes erhalten.
Fp.: 101-1030C.
[x] -45,2° (c=0.5in Methanol);
Rf =0,55.
Elementaranalyse für C'hHmOsNq ■ H2O
Berechnet: C54.91. H 7.68, N 17,47;
gefunden. C 54,63, H 7.54. N 17,08.
gefunden. C 54,63, H 7.54. N 17,08.
c) Flerstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CHj-CH,
iii 4 ini
UIgCiVi ί iui -TiscSSig wciucii JjO in;;
ZD Leu-Nie-ArgiNO^-Pro-NH-CH.-CH, gelöst, und
die Mischung wird 40 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt. Zu dieser Mischung werden 300 ml
trockener Äther zugegeben, und der dabei entstandene
Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet.
Das erhaltene Produkt wird in 2 ml Wasser gelöst und diese Lösung über eine (1.2 χ 7 cm)-Kolonne, Amberlite
IR-45 (freie Form), geleitet. Die Kolonne wird danach gut mit Wasser gewasche; Der Effluent und die
Waschlösungen werden kombiniert und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wird dann mit 345 ;ng (P>r)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH
in 6 ml DMF in Gegenwart von 180 mg FiONB und 206 mg DCC gekuppeil. Die
aufgearbeitete Mischung und das erhaltene Produkt werden auf chromatographischem Wege auf Amberlite
XAD-2, wie in Beispiel 14c) beschrieben, gereinigt. Die
Entfernung der Nitrogruppe und die Reinigung des gewünschten Peptides werden in ähnlicher Weise, wie in
Beispiel 14c) beschrieben, durchgeführt.
Ausbeute: 213 mg.
[\] ' -38,6° (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure).
RP = O1IO.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 0,98; Arg 1,00; Trp 0.91; Ser 0.95; GIu 1,00; Pro
1.08; Leu 1.00; Nie 1.00; Tyr 0,96.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH3
a) Herstellung von BOC-D-VaI-LeU-ArS(NO2)-Pr0-NH-CH2-CH3
Zu einer Lösung von 540 mg BOC-D-VaI-OH(Ol) und 1,14 g H-LeU-Ar8(NOj)-Pr0-NH-CH2-CH3 in 10 ml
DMF werden 537 mg HONB und 620 mg DCC bei 00C zugegeben. Die Mischung wird 3 Stunden lang bei 00C
und danach bei Raumtemperatur 10 min lang seriihrt. Dann wird abfiltriert. Das Filtrat wird bei vermine1 . tem
Druck zur Trockene eingedampft, und der Rücl :and wird in 100 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird mit
0,1 N HCl und 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, getrocknet und über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird mit Petroläther angerieben
und gibt ein Rohprodukt, welches aus Athylacetat/
Äther umgefällt wird.
Ausbeute: 1,1 g;
Fp.: l44-l46°C(Zersetzung);
[\] -43,7" (C= 1,0 in Methanol);
Rf =0,55.
Fp.: l44-l46°C(Zersetzung);
[\] -43,7" (C= 1,0 in Methanol);
Rf =0,55.
Elementaranalyse für C2^H
Berechnet: C 52,39,
gefunden: C 52,40,
Berechnet: C 52,39,
gefunden: C 52,40,
O8Nq 1/2 H2O
H8,i8, N 13.96;
H 8,32, N 18,52.
H8,i8, N 13.96;
H 8,32, N 18,52.
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tvr-DVal-Leu-Arg-Pro-NH-CH.-CH,
In 5 ml Trifluoressigsäure werden JOO mg BOC-D-Val-Leii-Arg(NO>)-Pro-NH-CHj-CHi
gelöst, unü die Mischung wird 30 min lang bei Raumtemperatur heftig
gerührt, dann werden 50 ml trockener Äther zugegeben, iii'iu uii.·) Oriiiiiicne. weiuc feste rtouuki wird gesammelt
und unter vermindertem Druck in einem Exsikkator über NaOII getrocknet. Das Material, das so erhalten
wird, wird in 20 ml 20%ig wäßrigem Methanol gelöst, und die Lösung wird auf eine (1 χ 5 cm)-Kolo:ine,
Amberlite IR-45 (freie Form), aufgebracht. Die Säule
wird dann mit demselben Lösungsmittel gewaschen. Der Effluent und die Waschlösungen werden kombiniert,
zu einem kleinen Volumen eingeengt und lyophilisiert. Es werden 165 mg Produkt erhalten.
Davon werden 150 mg in 2 ml DMF zusammen mit 168 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH und 65 mg
HONB gelöst, und die Mischung wird auf 0°C gekühlt. Dann werden 75 mg DCC zugegeben, und die Mischung
wird 2 Stunden lang bei O0C und danach 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird
abfiltriert und mit 50 ml Athylacetat verdünnt. Der durch Filtration gewonnene Niederschlag wird getrocknet
tirel durch Säulenchromatographie auf Silikagel (4 g)
gerein.ft. Für die Elution wird das RP-Lösungsmittelsystem
verwendet. Die Fraktionen, welche Jas geschützte
Nonapeptid enthalten, werden miteinander vereinigt und das Lösungsmittel soweit eingedampft, daß das
Produkt trocken ist. Es werden 140 g Produkt erhalten. Von dem erhaltenen, geschützten Nonapept A werden
110 mg mit 4 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von 0.1 ml Anisol und 0.02 ml Mercaptoäthanol
bei 0=C 1 Stunde lang behandelt. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck entfernt und
der Rückstand mit 20 ml Wasser extrahiert. Der Extrakt wird mit Äther gewaschen und über eine (i.5x3cm)-Kolonne,
Amberlite IRA-400 (Acetat-Form), geleitet, wonach die Kolonne selbst mit Wasser gewaschen wird.
Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und lyophilisiert. Das Material wird in einer kleinen
Menge gelöst, und die Lösung wird auf eine I,2x30cm-Kolonne, Carboxymethylcellulose, aufgebracht.
Für die Elution wird das Lineargradienten-EIutions-Verfahren
unter Einsatz von Ammoniumacetat (0,005 Μ—0,2M, 150 ml—150 ml) verwendet. Das gewünschte
Produkt befindet sich in den (110— 13OmI)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden miteinander
vereinigt und lyophilisiert.
Ausbeute: 87 mg.
Ausbeute: 87 mg.
OJ/ -40,8° (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure);
P
P
b5 Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart
von Thioglycolsäure):
His 1,00; Arg 1,02; Trp 0,85; Ser 0.95; GIu 058; Pro
1,02; VaI 0,91: Leu 0,95:Tyr l.oo: Äthylamin 1,01.
| 17 | 24 | 46 | 005 | 32 | |
| 31 | Beispiel 18 | ||||
| Beispiel | |||||
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH3
a) Herstellung von BOC-D-Met-Leu-ArgfNOj)-FrO-NH-CH2-CH3
BOC-D-Met-Leu-ArglNO^-Pro-NH-CHrCHj wird
hergestellt in ganz ähnlicher Weise wie es in Beispiel 16a) beschrieben ist, nämlich aus 623 mg BOC-D-Met-OH, 1,14 g H-Leu-ArgiNO^Pro-NH-C^-CH:!,
537 mg HONB und 620 mg DCC.
Ausbeute: 1,1 g.
[λ>" -51,5° (c= 1,0 in Methanol);
Rf' =0,59.
Berechnet: C 50,64, H 7,77, N 18,32, S 4,65;
gefunden: C 50,51, H 7,52, N 18,54, S 430.
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-He-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH3
a) Herstellung von BOC-D-Ile-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH3
ähnlicher Weise, wie in Beispiel 16a) beschrieben, au<
ίο 579 mg BOC-D-He-OH, 1,14 g H-Leu-Arg(NO2)-Pro·
hergestellt
Ausbeute: 03 g·
Fp.: 127 -13 Γ C (Zersetzung).
[λ]? - 483° (c= 1,0 in Methanol).
Elementaranalyse für C30H;
Berechnet: C 53,79,
gefunden: C 53,81,
b) Herstellung von (Kyrjoiu-His-1 rp-Ser-1 yr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CHj
In 3 ml Trifluoressigsäure werden 300 mg BOC-D-Met-Leu-Arg/NOzVPro-NH-CHz-CHj gelöst, und die
Mischung wird 20 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt. Dann werden 40 ml trockener Äther hinzugefügt, und der erhaltene, weiße Niederschlag wird
abnitriert und getrocknet Dieses Material wird in die freie Form übergeführt, indem es über eine (1x5 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), wie in Beispiel
16b) beschrieben, geleitet wird. Das erhaltene, teilweise
geschützte Tetrapeptid H-D-Met-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 (147 mg) wird sodann mit 171 mg
(Pyr)GIJU-His-Trp-Ser-T)T-OH in Gegenwart von 67 mg j5
HONB und 77 mg DCC umgesetzt, wobei ein teilweise geschütztes Nonapeptid erhalten wird. Diese Verbindung wird auf einer AmberIite-XAD-2-Kolonne gereinigt und danach mit SnCl2 · H2O in 60% wäßriger
Ameisensäure 2 Stunden lang bei 80 bis 85° C behandelt Das erhaltene Endprodukt wird chromatographisch auf
Amberlite XAD-2 und Carboxymethyl-Cellulose gereinigt Alle diese Vorgänge sind ähnlich den in Beispiel
16b) beschriebenen.
[«]? -39,6° (c 0,5 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP-.0.16.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):
His 1,02; Arg 1,00; Trp 030; Ser 0,89; GIu 1,00; Pro
1,00; Met 0,91; Leu 0,98; Tyr l,02;Äthylamin 1,00.
H 8,27,
H 831,
N 18,18;
N 18,65.
b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-lie-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3
In 3 ml Trifluoressigsäure werden 300 mg BOC-D
lle-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst, und di<
Mischung wird 25 min lang bei Raumtemperatu geschüttelt Dann werden 40 ml trockener Äthe
zugegeben, und der erhaltene Niederschlag win abfiltriert und getrocknet. Dieses Material wird dann ii
die freie Form übergeführt, indem es über eini (1x5 cm)· Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), wie ii
Beispiel lob) beschrieben, geleitet wird. Das erhaltene
teilweise geschützte Tetrapeptid H-D-Ile-Leu Arg(NO2) PrO-NH-CH2-CH3 (142 mg) wird mit 171 mj
(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH,67 mg HONB und 77 m| DCC umgesetzt, wobei ein teilweise geschützte
Nonapeptid erhalten wird. Diese Verbindung wird au einer AmberIite-XAD-2-Säule gereinigt und danach mi
SnCI2 · H;>O in 60%ig wäßriger Ameisensäure ;
Stunden lang bei 80 bis 85°C behandelt. Das s< erhaltene, gewünschte Produkt wird chromatogra
phisch auf Amberlite XAD-2 und Carboxymethyl-Cellu lose gereiinigt Alle Vorgänge sind ähnlich den ii
Beispiel 16<b) beschriebenen.
[λ]? -413° (c= 0,5 in 5% wäßriger Essigsäure).
Rf 2=0,13, RP = 0,66.
Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegen wart von Thioglycolsäure):
1,00; He 1,00; Leu 1,00; Tyr 1,00; Äthylamin 1,01.
230 211/1!
Claims (12)
1. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel
(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R'-R2-R3-Arg-Pro-NH-R4
worin R1 Tyr oder Phe, R2 D-Leu, D-He, D-NIe,
D-VaI, D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser,
D-Thr oder D-Met, R3 Leu, He oder Nie und R* eine
Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-n-propyl oder 3-Hydroxy-n-propyl, bedeuten.
2. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel I,
worin R2 D-Leu, D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phg,
D-Phe, a-Aibu oder D-Ser bedeutet und R1, R3 und
R4 die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen haben.
3. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel I, worin R2 D-VaI, D-He, D-Thr oder D-Met bedeutet
und R1, R3 und R4 die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen haben.
4. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel I, worin R4 Äthyl bedeutet
5. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R1 Tyr, R2 D-Leu, R3 und R4 Äthyl bedeuten.
6. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R' Phe, R2 D-Leu, R3 Leu und R4 Äthyl
bedeuten.
7. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R' TjT, R2 D-Ser, R3 Leu und R4 Äthyl
bedeuten.
8. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R1 Tyr, R2 D-Abu, R3 Leu und R4 Äthyl
bedeuten.
9. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R1 Tyr, R2 D-Nva, R3 Leu und R4 Äthyl
bedeuten.
10. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin Ri Tyr, R2 D-Thr, R3 Leu und R4 Äthyl
bedeuten.
11. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I,
worin R" Tyr, R2 D-Leu, R3 He und R4 Äthyl
bedeuten.
12. Verfahren zur Herstellung der Nonapeptidamide der allgemeinen Formel
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10995173A JPS5314072B2 (de) | 1973-09-29 | 1973-09-29 | |
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