DE2446005C2 - Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R'-R²-R³-Arg-Pro-NH-R⁴

in der R¹, R², R³ und R⁴ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise L-Pyroglutaminsäure oder ein der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz entsprechendes, N-terminal einen L-Pyroglutaminsäurerest aufweisendes Peptidfragment mit einer Aminkomponente, die dem restlichen Teil des gewünschten Nonapeptidamids entspricht, kondensiert, wobei die Reaktionspartner gegebenenfalls eine oder mehrere Schutzgruppen enthalten und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen abspaltet

Die Erfindung betrifft neue Nonapeptidamide mit starker ovulationsinduzierender Wirksamkeit welche

die allgemeine Formel

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R'-R²-R³-Arg-Pro-NH-R⁴-

worin Ri Tyr oder Phe, R² D-Leu, D-IIe, D-NIe, D-VaI, D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr oder D-Met, R³ Leu, He oder Nie und R⁴ Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-n-pro pyl oder 3-Hydroxy-n-propyl, bedeuten und Verfahren zu deren Herstellung.

Im folgenden werden die Aminosäuren und Peptide mit Abkürzungen bezeichnet weiche auf diesem Gebiet allgemein üblich sind und vom Committee on Biochemi cal Nomenclature of IUPAC-IUB empfohlen bzw. bewilligt wurden. Die Aminosäuren haben, wenn nicht anders angegeben, jeweils L-Konfiguration.

Nachstehend sind Beispiele für die im folgenden verwendeten Abkürzungen angeführt:

Abu: a-Aminobuttersäure

a-Aibu: a-Aminoisobuttersäure

Arg: Arginin BOC: t-Butoxycarbonyl

BzI: Benzyl

DCC: N.N'-Dicyclohexylcarbodümid

GIy: Glycin

His: Histidin HONB: N-Hydroxy-5-norbornen-2,S-di-

carboximid

HOSu: N-Hydroxysuccinimid IBOC: Isobornyloxycarbonyl He: Isoleucin

Leu: Leucin

Nie: Norleucin Nva: Norvalin Met: Methionin OMe: Methyl-Ester OBzI: Benzyl-Ester

ONB: N-Hydroxy-5-norbornen-2^-dicarboximid-Ester

OSu: N-Hydroxysuccinimid-Ester Phe: Phenylalanin Phg: a-Phenylglycin

Pro: Prolin

(Pyr)Glu: Pyroglutaminsäure

Ser: Serin

Thr: Threonin

Tos: Tosyl

Trp: Tryptophan Tyr: Tyrosin

VaI: Valin

Z: Benzyloxycarbonyl

Als Beispiele für die mit R⁴ bezeichnete gerad- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 —3 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls durch eine Hydroxylgruppe substituiert sein kann, seien Methyl, Äthyl, n-Propyl, i-Propyl, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-n-propyl, 3-Hy-

6n droxy-n-propyl, genannt.

Es ist schon lange bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, weiche auf höherer Ebene die Sekretion von tropischen Hormonen durch die Hypophyse steuern. Kürzlich wurde folgend auf die Isolierung eines Thyrotropin freisitzenden Hormones (TRH) ein Hormon, welches die Freisetzung von Gelbkörperbildung induzierendem, »luteinisierendem« Hormon fördert in reiner Form aus Schweinen und Schafen

extrahiert Es erwies sich als ein Dekapeptid der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

(A, V, Schally et al, Biochem, Biophys. Res, Commun., 43,1334 (1971): R. Guillemin et al. Proc. Nat Acad. Sei, USA, 69,278 (1972)).

Aufgrund dieser Erkenntnis wurde eine Anzahl von ähnlichen Pepriden hergestellt, an welchen biologische Untersuchungen vorgenommen wurden. Dennoch wird die physiologische Wirksamkeit der Peptide durch selbst geringfügige Modifikationen der oben angeführten Aminosäurezusammensetzung stark beeinträchtigt und die oben angeführte chemische Struktur ist als wesentlich zur Entfaltung der maximalen physiologischen Wirksamkeit anzusehen (A. V. Schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun, 4,366 (1972)).

Es ist nun gelungen, die Nonapeptidamide der Formel (I) herzustellen, und es wurde überraschend gefunden, daß diese Verbindungen eine wesentlich stärkere ovulationsinduzietpode Wirkung besitzen als die in der Natur vorkommenden Decapeptide. Weiters wurde gefunden, daß diese Verbindungen durch ihre Wirkung auf die Hypophyse der Ausscheidung von luteinisierendem und follikelstimulierendem Hormon fördern. Es wurde weiters gefunden, daß diese Verbindungen nicht nur als Medikamente für den menschlichen Gebrauch, z. B. für die Diagnose der Hypophysenfunktion, gegen Gonadotropinmangel und für die Therapie von Amenorrhöe, sondern auch als tierärztliche Medikamente, vor allem für die Tierzucht, verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen unerwarteten Erkenntnissen.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände.

Zur Vereinfachung wird mit Reaktionskomponente (A) L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment mit einer N-endständigen L-Pyroglutaminsäure-Einheit, das gleichzeitig von dort an die Aminosäuren-Sequenz der allgemeinen Formel (I) aufweist und die mit der Reaktionskomponente (A) zu kondensierende Amin-Komponente Reaktionskomponente (B), die dem Rest des Nonapeptidamidderivates der allgemeinen Formel (I) entspricht, bezeichnet. Dabei können die Reaktionskomponenten (A^und (B) gegebenenfalls geschützt sein.

Aus der nachstehenden Tabelle sind grundsätzliche Kombinationen der Reaktionskomponenten (A) und (B) ersichtlich.

Tabelle 1

Kombination

Reagens (A)

(B)

Kombi	Reagens	(B)
nation	(A)	H-His-Trp-Ser-R,-
1	(Pyr)Glu-OH	RrR3-Arg-Pro-
		NH-R,
		H-Trp-Ser-R,-Rr
2	(Pyr)GIu-His-OH	Rj-Arg-Pro-NH-R,
		H-Ser-R,-RrRr
3	(Pyr)Glu-His-Trp-OH	Arg-Pro-NH-R^
		H-R,-RrR,-Arg-
4	(Pyr)Glu-His-Trp-	Pm-N H-R,
	Ser-OH	H-RrR,-Arg-Pro-
5	(Pyr)Glu-His-Trp-	NH-R4
	Ser-R|-OH	H-Rj-Arg-Pro-
6	(Pyr)Glu-His-Trp-	NH-R4
	Ser-R.-Rj-OH

H-Arg-Pro-NH-R,

H-Pro-NH-R,

NH₂-R₁

7 (Pyr)Glu-His-Trp-

Ser-R_rR₂-R₃-OH

8 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,-R₂-R₃-Arg-OH

9 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,-R₂-R₃-Arg-Pro-OH

Es war weiterhin bekannt, daß eine geschützte Glutamylgruppe der allgemeinen Formel

R₅CO-Ch₂-CH₂CH(NH₂)CO- (U)

worin Rs eine Alkoxygruppe, wie z. B. Methoxy, Äthoxy, i-Propoxy, N-Propoxy, n-Butoxy od. dgl, eine Aralkyloxygruppe, wie z.B. Benzyloxy od.dgl. oder Amino bedeutet, leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden kann:

N,

und zwar durch Behandlung mit einer Base, wie z. B. Ammoniak od. dgl, oder einer Säure, wie z. B. Essigsäure od. dgL, und daß die Gruppe der allgemeinen Formel (II) in dieser Hinsicht der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist Auf Grund des erfindungsgemäßen Verfahrens ist anzunehmen, daß das L-Pyroglutamyl (d.h. (Pyr)GIu-) der Reaktionskomponente (A) nicht nur die L-Pyroglutamylgruppe selbst, sondern auch die geschützte L-GIutamylgruppe der Formel (II) umfaßt Wenn das (Pyr)Glu- der Reaktionskomponente (A) die Gruppe der Formel (II) bedeutet, kann die Gruppe (II) nach an sich bekannten Verfahren leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden.

Die erfindungsgemäße Kondensationsreaktion kann nach jedem beliebigen, für die Herstellung von Peptidbindungen üblichen Kondensationsverfahren durchgeführt werden. Dazu gehören das Azid-, Chlorid-, Säureanhydrid-, gemischte Säureanhydrid-, DCC-, akti ve Ester-Verfahren, das Verfahren mit Wcodwardrea- gens K, das Carbodiimidazol-Verfahren, das Oxidations-Reduktions-Verfahren (The Peptides, Vol. I (1966), Schröder and Lubke, Academic Press, New York), das DCC/HNONB-Verfahren (BE-PS 7 96 399).

Vor der Kondensationsreaktion können die Carboxyl- und Aminogruppen, welche an der beabsichtigten Reakiion nicht teilhaben sollen, geschützt werden, auch ist es möglich, die an der Reaktion teilnehmenden Carboxyl- und/oder Aminogruppen naci an sich bekannten Verfahren zu aktivieren. Die Carboxylgruppen im Ausgangsmaterial können in Form von Metallsalzen (wie z. B. von Natrium- oder Kaliumsalzen) oder von Estern (wie z. B. Methyl-, Äthyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, tert-Butyl- oder tert-Ainyl-Estern)

so geschützt werden.

Als Schutzgruppen für die Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können alle bei der Herstellung von Peptiden üblichen Schutzgruppen für Aminogruppen, wie z. B. Benzyloxycarbonyl, tert-Butoxycarbonyl,

6» Isobornyloxycarbonyl od.dgl, verwendet werden. Die Hydroxylgruppe des Serins kann durch eine herkömmliche Schutzgruppe wie Benzyl, tert.-Butyl und andere ätherbildende Gruppen geschützt werden. Die Hydro-

xylgruppe des Tyrosine kann ebenfalls durch Benzyl, tert-Butyl und andere ätherbildende Gruppen geschützt werden. Die Guanidingruppe des Arginins kann mit Gruppen wie z. B. Nitro, Tosyl, Carbobenzoxy, Isobornyloxycarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl geschützt werden. Als Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in den Ausgangsreagentien sind die entsprechenden Säureanhydride, Azide und aktiven Ester (Ester mit Alkoholen, wie z. B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-DinitrophenoI, Cyanmethylalkohol, p-Nitro-

Tabelle 2

phenol, N-Hydroxy-S-Norbornen^a-Dicarboximid, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxybenztriazol od. dgl.), zu nennen. Die aktivierten Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können z. ß. in Form des entsprechenden Phosphorsäureamides vorliegen.

Aus der folgenden Tabelle sind Beispiele für Kombinationen derartiger Formen von Carboxyl- und Aminogruppen w den Materialien (A) und (B) ersichtlich.

Kombinationsbeispiele

Reaktionsmittel

(A)

COOH

NH,

(B) COOH

NH₂

frei

aktiviert

frei

geschützt geschützt geschützt geschützt

frei

geschützt

frei
frei
aktiviert

Anmerkung:

In dem mit * bezeichneten Fall ist im Reaktionssystem vorzugsweise ein Dehydratisierungsmittel wie z. B. ein Carbodiimidreagenz wie Dicyclohexylcarbodiimid vorhanden. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann wie folgt dargestellt werden:

(Pyr)Glu-His-Trp + Ser-R_rSchutzgruppe

I Kondensation (z.B. DCC/HONB)

(PyrJGlu-His-Trp-Ser-Ri-Schutzgruppe

Entfernung der Schutzgruppe (z. B. katalytische Reduktion mit Pd-Katalysator)

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,

NO₂

Z-R₂-R₃-Arg -Pr₀-NH-R₄

Entfernung der Schutzgruppe (z. B. in Gegenwart von HBr)

NO₂

R₂-R₃-Arg-Pr₀-NH-R₄

Kondensation (z. B. in Gegenwart von DCC-HONB oder DCC/1-Hydroxybenztriazol)

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,-R₂-R₃-Arg-Pr_O-NH-R₄

Entfernu-ji der Schutzgruppe (z. B. in Gegenwart von SnCI₂ in Ameisensäure/Wasser, katalytische Reduktion mit Pd-Katal* sator oder HF)

(PyOGIu-HiS-TrP-SCr-R₁-R₂-R₃-ArS-PrO-NH-R₄

Diese Reaktion kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden, welches als geeignet für die Kondensationsreaktion zur Herstellung von Peptiden bekannt ist. So z. B. können wasserfreies oder wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran und geeignete Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur wird innerhalb eines Bereiches gewählt, welcher für Reaktionen zur Bildur.g von Peptidbindungen geeignet ist, d. h. üblicherweise innerhalb eines Bereiches von etwa -2O⁰C bis etwa + 30⁰C. Die Ausgangsmaterialien (geschützten Peptide) der erfindungsgemäßen Verbindungen können leicht

nach Festphase .Syntheseverfahren hergestellt werden.

Nach Beendigung der gewünschten Kondensation¹-reaktion können die gegebenenfalls im Produkt vorhandenen Schut/.grtippen nach an sich bekannten Verfahren wieder entfernt werden. Als Beispiele für solche Verfahren sind katalytische Reduktion in Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumsehw.ir/. Palladium auf Kohle, Platin. Solvolyse mit Fluorwasserstoff. Trifluoressigsäure und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak zu nennen.

Das so hergestellte Peptid der allgemeinen Formel (I) kann aus dom Gemisch der Reaktionsprodukte n.u h fur die Gewinnung von IVptiden bekannten Verfahren w e F'Atraktion. Verteilung. Säulenchromatographie od. d^l. gewonnen werden.

Die Peptide der allgemeinen Formel (I) können auch in Form eines Salzes gewonnen werden. Beispiele fiir Sauren, welche mit Peptiden der

ngC^iFiiiivn r ϋΓικΟι ₍r/ fill/*

!n' \< Γ

anorganische Säuren wie Salzsäure. Bromwasserstoffsaiirc. Perchlorsäure, (rauchende) Salpetersäure, Thio cviinsäure. Schwefel- und Phosphorsäute und organische Säuren wie Ameisen- F.ssig·. Propion-, Glycol-. Milch-, Brenzlrauben-, Ch.il-, Malon-, Bernstein-, Malein-. Fumar-. Anihranvi . Zimt-, Naphthalinsulfon- oder Suifaniisäure.

Die erfindung'gcniäßcn Polypeptide der allgemeinen Formel (I) besitzen LH-RH-Wirkung (d h. die Wirkung eines cir. luteinisierendes Hormon freisetzenden Hormons) und können daher die Ausscheidung von LH (luteinisierendem Hormon) und FSH (follikelstimiilierendem Hormon) fördern. Die Polypeptide der !tilgemeinen Formel (I) werden daher als Medikamente zur Ovulationsfördening bei Frauen und Tieren wie Ratten. Schafen. Schweinen, Kühen. Stuten. Wachteln oder Hennen verwendet. Sie können auch fiir andere pharmazeutische /necke verwendet werden, fiir weiche bisher herkömmliche I.H-RII-. I.H- und f SI I-Präparate eingesetzt wurden.

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• >\ ul.il'on-lordernd..' Wirksamkeit der Nonapeptidamide !!email der l.rrmd'.mg.
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P-Le.:

I eu Leu i. -.; Li Leu

Athvl	»..52<i
Äthyl	- SlD
Ath>l	.S.2"ii
Methyl	1.525
Propvl	.V644
Äthyl	4.5SiI
hopropyl	2."5(i
Äthyl	4.135
Äthyl	> 4(Kl
Äthyl	6.14(1
Äthyl	; <2<
Äih\i	2. "fid
Äthvi	4 2^!i

Nv.ι ^: N'irv.ilin. NIe - Norieucn. Abu - Xmin'ibjtic-iiurc D:e ov ulatinnsfördernde Wirk-amkeit wurde nach !er :n J Med. Chem. 16. 11JJ (1¹J"3. be-.".'^ebenen NIethode bestimmt und mi! de- von LH-RH verglichen. LH-RH - iP>riGlu-Mis-Trp-Ser-Tyr-GI;.-!.eu- \ig-Pr >-(>' - -N! 1 wobei die I berlegenhe;: gegenüber in Bmch^.n. B'',rhvv Pe- C'ommun. J°. l^u"2. Sl·? - ° ten.ir-ten jna.-en \ erbindungen .iu-. den Zahlen eindeutig her\orgeht.

Verbindung des
Versuchsberichts

Physikalische Daten

(4)

(5)

[ir]:: = -30.6" (C = 0.5 in 5 - Essigsäure)
Rf"= 0.14. Rf -0.4"

Aminosäureanalyse; His. 1.00: Arg. 1.02: Trp. 0.84: Ser. 0.91; Giu. 1.04: Pro. l.CO: Leu. 2.04: Tyr. 1.00; Methylamin. 1.10 (Ausbeute 92'-.ι
[α]~Ρ = -35.0' (C = 0.5 in 5^r-< Essigsäure)

Rf = 0.15. Rf = 0.51

Aminosäureanaiyse: His. 0.93: Arg. LOO: Trp. 0.83: 5er. 0.91: GIu. 0.88: Pro. 1.0Ö: Leu. 1.80: Tyr. 0.86: Propvlamin. 1.03 (Ausbeute 89'-1

Ii )Πμ.-1 /iiii'j

K)

I¹InMk,libelle D.iIlT.

(¹M

(12)

M₁₁' 3.1.6" (C (1.5 in 5% Hssigsiiure) Rf 0.15. Kl' 0.4^l>

Aminosäureanalyse. llis. 1.03; Arg. 1.03; Trp. 0.79; Scr, 0.97; (Hu. 1.00: Pro. 1.06; Leu. 1.97; Tyr. 0.97; Isopropylamin, 1.05 (Airbeute 85.5"'-)

lij-Jv; ⁷IS' (C (I 2 in 5% Fssigsaure)

Rl' 0.7(1. Rf (K. I

Aminosiiureanalyse. Mis. 1.01; Arg. 0.97; Irp. 0.92; Scr. 0.98;

(ilu. 1.00; I'm. 0.99. ι.,-ιι. |.(i(); |'he. 2.03: Äthylamin. 1.02

(Ausbeute S7^f,.)

1(/1'J',' 47.2'(C 0.5 in >"« Lssigsaure)

Rf'¹ 0.62. Rl" 0.43

Amiii(isäurcanal>so: Hk 1.00; Ära. 0.92: Trp. 0.89; Scr. 1 89;

(ilu. 1.00; Pro. 0.98; Leu. 1.02; Tyr. 0.96; \thylamiii. 0.97

(Ausheule ⁷⁰*.,)

i)a die I HRH Wirkung tier Polypeptide der allgemeiner f-V.rmel (I) etw.i τ- bis 60mal großer ist ,ils lene der in der Natur vorkommenden, kann die Dosierungsmenge fiir jede Anwendung auf der Basis des ob( ι angeführten Vielfachen bestimmt werden, wobei auch andere Faktoren wie der Empfänger der Verabreichung und die Krankheitsart in Betracht gezogen werden. Line geeignete Dosierungsmenge kann / B. innerhalb eines Bereiches von etwa 2 ng bis 2 jig pro Kilogramm Körpergewicht und Tag gewählt werden.

Die Polypeptide c'er allgemeinen Formel (I) werden üblicherweise nicht peroral, sondern durch Injektion, rektal oder vaginal verabreicht, obgleich sie in manchen Fällen auch peroral verabreicht werden.

Als Beispiele für geeignete Dosierungsformen sind Injektionen. Suppositorien Pessare und Pulver zu nennen. Die Injektionen können durch Lösen von etwa 10 c bis 100 r des Polypeptides der allgemeinen Formel (I) in 1 ml physiologischer Salzlösung hergestellt werden. Die Polypeptide der allgemeinen Formel (I) können auch unter Zugabe von Mannitol als Hülle in lyophilisierte Ampullenprodukte übergeführt werden und sind in dieser Form jederzeit als Injektionen verwendbar.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsstoffe eingesetzten Peptide können nach jedem beliebigen, für die Herstellung von Peptiden geeigneten Verfahren oder nach einem angepaßten Verfahren hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert

In den Beispielen bedeuten folgende Abkürzungen den Rf-Wert bei Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit den folgenden Lösungsmittelsystemen:

Rf: Chloroform : Methanol: Essigsäure,

9 :1 :0,5 RP: Äthyl-acetat: Pyridin : Essigsäure : Wasser,

30:10:3:5 RP: n-Butanol: Äthylacetat: Essigsäure : Wasser, 1:1:1:1

Nachstehend werden die in den Beispielen verwendeten, eingetragenen Handelsnamen erläutert:

Biogel P-2:
Sephadex LH-JO:

Amberlite XAD-2:
Amberlite IR-45:

Amberlite IRA-410:
Amberlite CG-410:
Amberlite CG-45:

Materialien fiir Gelfiltration, hergestellt von BIO-RAD USA
Verestertes Dextran-Gel. hergestellt von Pharmacia Fina Chemicals. Schweden
Polystyrolharz

schwach basisches A η ionenaustauscherharz

stark basisches Anionenaustau· scherharz

stark basisches Anionenaustau scherharz

schwach basisches Anionenaustauscherharz

Alle diese Harze werden von Rohm & Haas Co.. USA. hergestellt.

Beispiel 1

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- D-Leu-Leu-Arg-PrO-NH-CH₂CH 3

a) Herstellung von Z-D-Leu-Leu-Arg(NO₂)-Pm-NH-CH₂-CH₃

In 50 ml Dichiormethan werden 1,58 g Z-D-Leu-OH(Ol) und Ug HONB gelöst und nachher 2,8 g H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH3 zugegeben. Die Mischung wird auf 0⁰C gekühlt, nachher werden 1,4 g DCC zu der Mischung zugegeben, und es wird dann die Mischung bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt Der ais Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung wird zweimal mit 4%iger wässeriger Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und schließlich unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird aus

ti

Äthylacetat/Petroleumbcnzm umgefüllt. Ls werden 3,6 g der gewünschten Verbindung erhalten.

Fp.: 134"C (Zersetzung).

[\] -47,3" Cc·= 0,54 in Methanol);

Rf" =0,57

F.lementaranalyse fiii CuHmOhNj
Berechnet: ' C 56,31. 117.59. N 17,91,
gefunden: C 56.08, 117,82. N 17.69.

b) Herstellung von (Pyr)Glu-HisTrp-Ser-Tyrr >-l.eu-l..cu-Arg(NO,)-Pro-NH-CH.'-CH,

In JOmI 25%igem HBR-Eisessig werden 3,6 g /-D-l.eu-Leti-Arg(Nf).)-ProNHCH.-CHi gelöst, und die Lösung wird bei Raumtemperatur 50 min lang gerührt. Zu der Lösung werden 300 ml Äther zugegeben, und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert Nach dem Trocknen wird der Niederschlag in 50 ml Wasser gelöst und über eine (2.5 χ 20 cm}-Kolonne. Amberlite CG-410 (freie Base), geleitet. Die Säule wird mit 30°/oig wäßrigem Methanol gut gewaschen. Der F.ffluent und die Waschwässer werden vereinigt und unter verhindertem Druck zur F.ntfernung des Methanols eingeengt, wonach Lyophilisierung erfolgt Hs werden 3,1 g der freien Base von H-D-Leu-I.eu-Arg(NOj)-Pro-NH-CH;-CHi erhalten

RR = 0,24: Rf) = 0.68.

In 4 ml Dimethylformamid werden 228 g des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes und 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst, und danach werden 144 mg HONB zugegeben. Die erhaltene Mischung wird auf -10"C gekühlt, und es werden 90 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird dann bei -10^rC zwei Stunden lang, bei O'C 4 Stunden lang und bei Raumtemperatur weitere 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wird danach zur Entfernung des entstandenen Dicyclohexylharnstoffes filtriert. Nach der Zugabe von Äthylacetat zu dem Filtrat wird dabei der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Dieser Niederschlag wird getrocknet und in 2O°/oig wässerigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird über eine Kolonne. Amberlite XAD-2 (200 Mesh, 3 χ 20 cm), geleitet, und danach erfolgt eine Gradienten-Elution mit 20⁰/oigem Äthanol und absolutem Äthanol (jeweils 300 ml). Das gewünschte Produkt ist in den (260—360 ml)-Fraktionen enthalten. Diese Fraktionen werden bei vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Es werden 346 mg des gewünschten Produktes erhalten.

[\] -38.28" (c=0.\ in 0.5% Methanol);

RP = 0.235. RP = 0.765.

c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-

D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCHj

In 20 ml 60%iger wäßriger Ameisensäure werden 300 mg der gemäß (b) erhaltenen NOj-Verbindung gelöst, und danach werden 600 mg SnCh · H2O zugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden lang auf 80 bis 85°C erhitzt und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit 50 ml warmem Wasser (80° C) extrahiert und der Extrakt filtriert Das erhaltene Filtrat wird über eine (3 χ 20 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200 Mesh), geleitet Nach dem Waschen mit Wasser erfolgt Gradienten-Elution mit Wasser und absolutem Äthanol (jeweils 40OmI). Das gewünschte Produkt ist in den (150—260 ml)-Fraktionen enthalten. Die Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Entfernung ties Äthanos eingeengt. Das Konzentrat wird über eine (2 χ ^^ cm)-Kolonne. Carboxjmethylcel lulosc. geleitet, und danach erfolgt Gradienten-Llution mit 0.005 M bis 0.2 M Ammoniumacetat (pH 6.8). Das gewünschte Peptid befindet sich in den (330—520 m!)-Fraktionen. Die Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Es werden 282 mg eines weißen flaumigen Pulvers erhalten.

[>]■· -32,66" (c=0,545in5% wäßriger Essigsäure):

RP = O,IO.Rf' = O.75.

Aniinosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 η HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His. 1,00; Arg. 0.96; Trp. 0,96; Scr. 1,00: GIu. 1.00:

Pro. 1.04; Leu. 2.00; Tyr. 1.00.

Beispiel 2

I lerstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-T>ra-Aibu-Leu-Arg-Pro-N H-ClL-CH,

a) 1 lerstellung von Z-a-Aibu-L.eu-Arg(NO?)-Pro-NH-CH.-CH,

In 7 ml Dimethylformamid werden 0.6 g Z-a-Aibu-OH und 0.9g H-Leii-Arg(NO_;)-Pro-NI!-

: ClL-CHi gelöst. Die Lösung wird auf 0"C gekühlt, es werden 0.71 g l-Äthyl-3-(3-dimethylaminoprnpyl)-carbodiimid (ein wasserlösliches Carbodiimid) zugegeben, und danach wird 12 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand in

;.. 100 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wird mit 4°/oiger Natriumhydrogencarbonat-l.ösung und 1 N Salzsäure gewaschen, mit Wasser nachgewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert, und der

,- Rückstand wird mit Äther behandelt, wobei ein Pulver erhalten wird, das .'ibfiltriert wird. Das Pulver wird aus Äthylaeetat/Äther umgefällt, und es werden 473 nie des gewünschten Produktes erhalten.
Fp.:104-107^rC.

:■ [\] ' -45,8' (f=0.55in DMF).

Rf" =0.50.

Elementaranalyse für Ci;Hy)OsNj · O ■ 5 HiO Berechnet: C 54.28. H 7,50, N 18.38; gefunden: C 54.32. H 7,32. N 17.97.

b) Herstellung von BOC-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-ArgfNO:)-PrO-NH-CH₂-CH₃

In 3 ml 25%igem HBR-Eisessig werden 423 mg

,.. Z-a-Aibu-Leu-Arg(NO;)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst, und die Mischung wird dann bei Raumtemperatur 40 min lang gerührt, wonach 50 ml trockener Äther zugefügt wird. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxyd in einem Exsikkator getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 3 mi DMF gelöst und die Lösung mit 0,24 ml N-Äthylmorpholin neutralisiert, wonach auf 0⁼C ge kühlt wird. Hernach erfolgt die Zugabe von 557 mg BOC-Tyr(Bzl)-OH und 298 g HONB, und schließlich werden noch 280 g DCC zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 6 Tage lang gerührt Der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das DMF unter vermindertem Druck abdestilliert Der Rückstand wird ;n 100 ml Chloroform gelöst die Lösung mit 1 N HCl und 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, mit Wasser nachgewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und danach unter vermindertem Druck zur Trockene

eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird aus .Allylacetat umgefüllt.

Ausbeute: 275 mg.

Γρ.: !27-129'C.

[\] ■ -27.6' (ι = 0.54 in DMT):

Rf -=0.60.

F-'Icmentaranalyse für C.MHh:OiiiNiii ■ H..O Berechnet:' C 57.82. Il 7.61. N 15.32; gefunden: C 58.32. Il 7.51. N 15.10.

c) Herstellung von BOC-Ser-Tyr(Bzl)-,i-Aihii-l.en-ATfJ(NO..)-Pro-Nil-C! I.-CH ι

In i ml Tiifluorcssigsa'ure. welche 0.1 ml Anisol enthalt, werden 250 mg ßOC-Tyr(R/l)-a-Aibu-l.eu-AIg(NOj)-Pm-NH-CIL-CHi gelöst, und diese Lösung wird bei Raiimieniperaiur 30 min lang gerührt. Dann w erden 10 ml trockener \thcr zugegeben, und der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrockrh ,Ιι

Pulve
....

l I1M1. <»ρ|Λ«.Ι

die 1.KSUiIf; mit 0,08 ml N-Äthylmorpholin neutralisiert. Dann w^-den 150mg (BOC-Ser-)Tricn!orphenylesier zugegeben und die Lösung 2 Tage lang gerührt. Das DMF wird abdestilliert, und der Rückstand wird mil Äther behandelt, wobei ein Pulver erhalten wird. Dieses wird abfiltriert und zweimal aus Äthylacetat umgefällt.

Ausbeute: 100 mg;

Fp.: 140- l42"C(Zersetzung):

[\] -34,8--(C= 0.44 in DMF):

Rf =0.74.

FJementaranalysefürO:H-:0:.N·: ■ 3 H_:O Berechnet: C 54.43. H 7.58. N 14.84: gefunden: C 54.66. H 7.45. N 14.91.

d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyra-Aibu-Leu-Arg'-Pro-NH-CHrCH ι

In 3 ml Trifluoressigsäiire, welche 0.1 ml Anisol enthält, werden 77 mg BOC-Ser-Tyr(Bzl)-a-Aibu-Leu-ATg(NOj)-PrO-NH-CH₂-CHj gelöst, und die Lösung wird bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Dann werden 30 ml trockener Äther zugegeben, der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 3 ml DMF gelöst, und die Lösung wird mit 0,21 ml einer 10%igen Lösung von N-Äthylmorpholin in DMF neutralisiert. Dann werden zu dieser Mischung 37 mg Kristalle von (Pyr)Glu-His-Trp-OH zugegeben, die Mischung wird auf -10^rC gekühlt, wonach die Zugabe von 21 mg HONB und 30 mg DCC erfolgt. Diese Mischung wird bei 0^:C 12 Stunden lang gerührt, danach wird der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, und das Filtrat wird sodann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 2O°/oigem Äthanol gelöst und an einer (1 χ 10 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2, adsorbiert. Die Elution wird nach dem Gradienten-Verfahren unter Verwendung von 20%igem bis absolutem Äthanol (jeweils 200 ml) durchgeführt. Die Fraktionen, welche das gewünschte Produkt angereichert enthalten, entsprachen den Konzentrationsbereichen des Äthanols von 40 bis 70%. Sie werden gesammelt und danach unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Es werden 30 mg des geschützten Monapeptids (RP = 031) erhalten. Unter Zugabe von 0,1 ml Anisol und 0,1 ml Mercaptoathanol wird dieses geschützte Monapeptid mit 3 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt, und die Mischung wird danach bei 0°C 60 min lang gerührt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der entstandene Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dreimal mit je 2 ml Äther extrahiert, und die wäßrigen Schichten werden vereinigt und über ·> eine (2 χ 4 cm)-Kolonne. Amberlite CG-410 (Acetat-Γι,πη). geleitet, welche Kolonne danpch mit Wasser gewaschen wird. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und über eine Kolonne. Carboxymethylcellulose, und Amberlite XAD-2. wie in Beispiel I ■ ■ beschrieben, geleitet.

Nach Lyophilisierung werden 14 mg eines weißen flaumigen Pulvers erhalten.

[\] -54.Γ (V =0.31 in 5% wäßriger Essigsäure); Rf-'= 0.099; Rf = 0.7 15.

'■ Aminosäiireanal.vsc (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglykolsäure):

His 0.94: Arg 0Λ>7_; Trp 0.81: Scr 1.06; GIu 0,?7; Pro 0.97; Leu 1.03:Tvr 1.03; a-Ai'nu 1.00.

Hirsteilung von (Pyr)Glu-llis-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Leu-Arg-Pro-Nl I-Cl L-CH₁

a) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH

!n 100 ml Methanol werden 4.0 g Z-Ser-Phs-OMe gelöst, und dieses wird bei Atmosphärendruck unter Einsatz von 500 mg Palladiumschwarz als Katalysator 1,5 Stunden lang reduziert. Der Katalysator wird

in abfiltriert, und das Methanoi wird dann rasch unter vermindertem Druck abdcstilliert. Der Rückstand wird in 25 ml DMF gelöst, und es werden 4,1 g kristallines (Pyr)Glu-His-Trp-OH zugegeben. Die Mischung wird auf -5^CC gekühlt, wonach 3.8 g HONB und 3 g DCC

','■ zugefügt werden. Die so erhaltene Mischung wird dann bei -5"C 2 Stunden, bei O⁰C 2 Stunden lang und zuletzt bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt. Der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfilmen, und das Filtrat wird unter vermindertem

-" Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthylacetat behandelt, und das erhaltene Pulver wird abfiltriert (6.7 g). Dieses Pulver wird in 30 ml 15°/oigem Methanol/Chloroform gelöst und die Lösung über eine (6 χ 12 cm)-Kolonne. Silikagel. welche mi· 15%igem

j- Methanolchloroform konditioniert ist.geleitet.

Die Elution wird ausgeführt, indem 600 ml 15%iges Methanol/Chloroform, 1 1 25%iges Methanol/Chloroform und 1 I 30%iges Methanol/Chloroform eingesetzt werden. Die Fraktionen zwischen 400 ml der 25°/oigen

ν. Methanol/Chloroform-Lösung und 700 ml der 30%igen Methanol/Chloroform-Lösung werden vereinigt unc unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Äthylacetat behandelt, und das entstandene Pulver wird abfiltriert. Es werden 4,2 g des gewünschten Produktes erhalten.

RP = 0,29.

In 20 ml Methanol werden 35 g dieses Methylesters suspendiert, und bei 0^cC werden 8 ml INNaOH zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde lang gerührt und danach mit 8 ml IN HCl neutralisiert Das Methanol wird unter reduziertem Druck abdestilliert, und es erfolgt danach Zugabe von 20 ml kaltem Wasser. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gewonnen, mit gekühltem Wasser und danach mit

Äthanol/Äther (4:6) gewaschen und getrocknet Es werden 232 g des gewünschten Produktes erhalten. jYp — 33⁼ (c= 0,55 in Eisessig); RH=0,61

b) Herstellung \on(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Fhe-D-Leu-Leu Arg-Pro-NH-CH-CH₃

In 4 ml DMF werden 29ö mg (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Phe-OH und 228 mg H-D-Leu-Leu-Arg(NO₃)-Pro-NH-CHrCH₃ gelöst, wonach die Zugabe von 140 mg HONB erfolgt. Die Mischung wird auf — 10⁼C gekühlt, und danach werden 90 mg DCC zugegeben. Diese Mischung wird bei - 10³C 2 Stunden lang, bei 0T3 Stunden lang und letztlich bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt, in genau derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wird diese Reaktionsmischung einer Säulenchromatographie mit Amberlite XAD-2 unterworfen. Dabei werden 342 mg des gewünschten Produktes erhalten.

[\] -4<.,:4^C (c= 0,115 in Methanol):

Rf-' = 0.265, RP = 0.78.

In 20 ml einer 6O°/oigen wäßrigen Ameisensäure-Lösung werden 300 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelöst, wonach 600 mg SnCIj · H>O zugegeben werden. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei 80—85° C stehengelassen, wonach sie unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt wird. Dann wird in genau derselben Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, das Konzentrat mittels einer Kolonne, Amberlite XAD-2_T und einer Kolonne. Carboxymethylcellulose, gereinigt. Dabei werden 211 r.ig eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten.

[\]? -38,49° (c= 0.53 in 5% wäßriger Essigsäure); RP = 0,12; RP = 0.74.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1,00; Arg 1,04; Trp 058; Ser 032; GIu 1,00; Pro 1,00; Leu l,04;Phe 1,00;Tyr038.

Beispiel 4

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH₃

a) Herstellung von Z-D-Phg-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CHrCH₃

In einer Mischung von 10 ml Dimethylformamid und 20 ml Dichlormethan werden 580 mg Z-D-Phg-OH und 1,14 g H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst. Zu dieser Mischung werden 400 mg HONB und unter Kühlung mit Eis werden 500 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt und das dabei entstandene Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, wonach das Filtrat zur Trockene eingeengt wird. Der Rückstand wird in IOD ml Äthylacetat gelöst, die erhaltene Lösung wird mit 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, danach über trockenem Natriumsulfat getrocknet und zum Entfernen des Äthylacetats destilliert. Der Rückstand wird aus Äthylacetat/Petroläther umgefällt, und es werden 1,4 g eines Pulvers erhalten.

RH =0.65; RP = 0.83.

[\] ■ -80,2" (c=0,5in Methanol).

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phg-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 20 ml Essigsäure werden 150 mg Z-D-Phg-I.eu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH, gelöst. Nach Zugabe von 100 mg Palladiumschwarz wird bei Atmosphärendruck Wasserstoffgas durch die Lösung geleitet, wobei die Reduktion stattfindet

Nach 4 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, und es werden 0,4 ml 1 N HCl zugegeben. Die Lösung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und das erhaltene Konzentrat wird in 20 ml Wasser gelösi und lyophilisiert Das erhaltene Pulver wird in 8 ml Dimethylformamid gelöst, und es werden 0,25 ml !0%ige Lösung von N-Äthylmorpholin in Dimethylformamid tropfenweise zugesetzt. Dann werden 141 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Oh zugegeben, wonach die Zugabe von 50 mg 1-Hydroxybenzotriazo! und letztlich von 40 mg DCC bei - 5° C erfolgt.

Die Mischung wird bei -5° C 2 Stunden lang, bei 0⁰C weitere 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur letztlich 8 Stunden lang gerührt Danach wird Äther zur Reaktionsmischung zugegeben, der erhaltene Niederschlag wird filtriert und in 20 ml Wasser gelöst Die unlöslichen Anteile werden abfältriert, das Filtrat übet eine Kolonne, Amberlite I RA-410(Acetatform), geleitet welche Kolonne danach mit Wasser gewaschen wird Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinig! und über eine (14 * 25 cm)-KoIonne, Carboxymethylcellulose, geleitet Danach erfolgt die Gradienten-Elutior unter Verwendung von 0,005 M Ammoniumacetat und 0,175 M Ammoniumacetat (pH 6,8) (jeweils 300 ml). Das gewünschte Produkt Defindet sich in den (170—240 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden vereinigt und über eine (2 χ 20 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 geleitet Das dort absorbierte, gewünschte Produkt wird nacii dem Gradientenverfahren unter Verwendung vor Wasser (250 ml) und Äthanol (280 ml) eluiert, wobei sich die reine Verbindung in den (190—240 ml)-Fraktioner befindet Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Es werden 110 mg des gewünschten Produktes erhalten.

RP = 0,098; RP = 0.73.

[λ]? -57,0° (c= 0,56 in 5% wässeriger Essigsäure). Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 0,96; Arg 1,04; Trp 052; Ser 0,93; GIu 1,00; Pro 1,00; Leu 1,01; Phg 0,98; Tyr 1,01.

Beispiel 5

Herstellung von (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-5« D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

a) Herstellung von Z-D-Ser-Leu-Arg(NO₂)-Pr₀-NH-CH₂-CH₃

5i In einer Mischung von 10 ml Dioxan und 10 ml Dimethylformamid werden 955 mg Z-D-Ser-OH. 1,82 g H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CHj-CHjund 788 mg HONB gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt, und es werden 907 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0°C 2

Mi Stunden lang und danach bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt. Das anfallende Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml

hi Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 0,5 N HCI und 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung in der erwähnten Reihenfolge gewaschen, über Magnesiumsulfat getro^net und unter vermindertem

230 211/195

Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther behandelt, das erhaltene Pulver wird abfiltriert und aus Äthanol/Äther umgefällt

Ausbeute: 2,4 g;

Fp.: 123-126° C (Zersetzung); =>

[_Λ]V -49,8^C (c= 0,5 in Methanol).

Elementaranalyse für C30H47O9N9 · H₂O
Berechnet: C 51,79, H 7,09, N !8,12;
gefunden: C 52,01, H 6,96, N 18,04.

Rfi =0,40.

Beispiel 6

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

In einer Mischung aus 20 ml Methanol und 1 ml Eisessig werden 334 mg Z-D-Ser-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CHrCH₃ gelöst und unter Einsatz von Palladiumschwarz als Katalysator wird bsi Raumtemperatur und Atmosphärendruck 4 Stunden lang katalytisch reduziert Danach wird de- Katalysator abfiltriert, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird durch Zugabe von 9,6 ml 0,1 N HCI gelöst und lyophilisiert.

Das dabei erhaltene trockene Pulver und 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH werden in 3 ml DMF gelöst,und es werden 100 mg 1-Hydroxybenztriazol und [λ]? —51,2° (c=

0,615 ml einer 10%igen Lösung von N-Äthylmorpholin Rf¹ =0,66.

in DMF zugegeben.

Die Mischung wird auf -5^CC gekühlt, und es werden dann 165 mg DCC zugegeben. Die erhaltene Mischung wird bei —5° C 4 Stunden lang und bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt Der als Nebenprodukt anfallende Harnstoffderivat wird abfiltriert und das a Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst, und die unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat selbst wird dann auf eine Kolonne (10 ml), Amberlite IRA-410 (Acetatform), aufgebracht, der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und über eine (1,5 χ 27 cm)-Kolonne, Carboxymethylcellulose, geleitet. Die Elution erfolgt nach dem Gradientenverfahren unter Verwendung von 0,005 M Ammoniumacetatpuffer (300 ml) und 0,15 M Ammoniumacetat +3 (300 ml). Die erhaltene Verbindung befindet sich in den (280—322 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert, wobei 135 mg eines Rohproduktes erhalten werden. Dieses wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und auf eine (1,5 χ 17 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2, aufgegeben. Die Elution wird nach de;n Gradientenverfahren unter Verwendung von 5%ig wässerigem Alkohol (300 ml) und 60%ig wässerigem Alkohol (330 ml) durchgeführt. Die (196 ml-231 ml)-Fraktionen werden gesammelt und nach Entfernung des Äthanols durch Destillation lyophilisiert.
Ausbeute: 62 mg.

Das Produkt wird in 0,1 N wäßriger Essigsäure gelöst und einer Gelfiltration auf einer (1 χ 54 cm)-Kolonne, Sephadex LH-20, unterworfen. Nach Lyophilisierung ^n werden 40 mg des gewünschten, reinen Produktes erhalten.

[-φ -46,4° (c=0,5 in 5% wäßriger Essigsäure);
RP = 0,055, RP = 0,70.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegen- *> wart von Thioglycolsäure):

His 1,00; Arg 1,04; Trp 1,00; Scr 1,81; GIu 1,00; Pro 1.00; Leu 1,04; Tyr 0,96; Äthylamin 1,04.

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCHj

a) Herstellung von Z-D-Abu-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH₃

In 5 ml Dimethylformamid werden 03 g Z-D-Abu-OH und 0,45 g H-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CHrCH₃gelöst

Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt, und es werden 0,25 g HONB und 0,29 g DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0⁰C 1 Stunde lang und bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt. Das Harnstoffderivat wird abfiltriert, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der Rückstand Ή\τά in 80 ml Chloroform gelöst und danach mit 1 N hCl und einer 4%igen Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen.

Nach dem Waschen mit Wasser wird über Magnesiumsulfat getrocknet und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt Der erhaltene Rückstand wird danach mit Äther behandelt, das dabei erhaltene Pulver abfikriert und aus Äthylacetat/Petroleumbenzin umgefällt
Ausbeute :489 mg;

0,6 in Methanol);

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

Z-p-Abu-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CHrCH₃ wird mit 25°/oigem HBr-Eisessig behandelt und tnit Äther gefällt. Der Niederschlag wird über eine Kolonne, Amberlite CG-410 (freie Base), geleitet, um HBr zu entfernen. In 3 ml DMF werden 220 mg der freien Base des so erhaltenen H-D-Abu-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH₃ gelöst, und danach werden 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH sowie 150 mg HONB zugegeben. Die Mischung wird auf -10" C gekühlt, und 85 mg DCC werden zugegeben. Die so erhaltene Mischung wird bei - 10⁰C 2 Stunden lang und letztlich bei Raumtempera -tür 7 Stunden lang gerührt. Zur Reaktionsmischung wird dann Äthylacetat zugegeben, und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Dieser Niederschlag wird danach in 20%igem wäßrigem Methanol unter Erhitzen gelöst, die Lösung wird abgekühlt, wobei ein Niederschlag ausfällt. Dieser wird abfiltriert.

Ausbeute: 284 mg;

RP=0,240, RP = 0,772.

(In beiden Lösungsmitteln enthält das Produkt etwa 10% Verunreinigungen, welche «inen kleineren Rf-Wert aufweisen.)

In 15 ml 60%iger wäßriger Ameisensäure werden 200 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelöst, wonach 400 mg SnCI₂ · H₂O zugegeben werden. Die Mischung wird dann auf 80—85°C 2 Stunden lang erhitzt, danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und der dabei entstandene Rückstand wird sodann mit 50 ml warmem Wasser extrahiert.

Die unlöslichen Anteile werden dann abfiltriert, das Filtrat über eine Kolonne, Amberlite XAD-2, Carboxymethylcellulose und Sephadex LH-20, in der beschriebenen Reihenfolge geleitet, wonach eine Lyophilisierung erfolgt. Es werden 104 mg eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten.

[λ]·? -43,6° fc=0,50 in 5% wäßriger Essigsäure);

RP = 0,08.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 0,98; Arg 0,96; Trp 0,94; Ser 0,92; GIu 1,00; Pro

1,00;Leu0,98; Abu l,00;Tyr l,00;ÄthyIamin !,02.

Beispiel 7

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nva-Leu-A^-PrO-NH-CH₂-CH₃

a) Herstellung von Z-D-Nva-OH

In üblicher Weise wird H-D-Nva-OH mit Carbobenzoxychlorid in 2 N Natriumhydroxid umgesetzt, und die dabei entstandene Verbindung wird aus Äthylacetat/Petroleumbenzin umkristallisiert Dabei werden Nadeln erhalten.

Fp.: 83-84° C.

[α]? + 12,1° (C= 1,0 in Methanol).

Elementaranalyse für CuHuO₄N
Berechnet: C62.14, H 6,82, N 5,57;
gefunden: C 62,17, H 6,88, N 5,62.

Beispiel 8

b) Herstellung von Z-D-Nva-Leu-Arg(NC>2)-PrO-NH-CH₂-CH₃

In 5 ml DMF werden 376 mg Z-D-Nva-OH, 685 mg H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH3 und 295 mg HONB gelöst, und danach werden bei 0°C 340 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0"'C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur 8 Stunden lang gerührt. Das als Nebenprodukt anfallende Harnstoffderivat wird abfiltriert, und es werden 100 ml Äthylacetat zu dem Filtrat zugegeben, die Mischung wird mit 0,5 N HCl und 4°/oiger Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen. Danach wird die Lösung mit Wasser gewaschen und über trockenem Natriumsulfat getrocknet Die Lösung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und danach mit Äther behandelt. Das dabei entstehende Pulver wird abfiltriert und zur Reinigung aus Äthylacetat/Äther umgefällt.

Ausbeute: 900 mg;

Fp.: 105-107°C(Zersetzung);

[λ]? -5\2" (c= 1 in Methanol);

Rf =0,60.

Elementaranalyüe für C32H51O8N9
Berechnet: C55,71, H 7,45, N 18,27;
gefunden: C55,54, H 7,62, N 18,09.

c) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ü-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCHj

Ausgehend von Z-D-Nva-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₂-CH₃ (wie in b) beschrieben, erhalten und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH wird dieselbe Reaktion und derselbe Reinigungsvorgang wie in Beispiel 6b) beschrieben, durchgeführt, und es wird die gewünschte Verbindung erhalten.

[\\; -39,8" (c=0,51 in 5% wäßriger Essigsäure);

RP = 0,094; RP = 0,74.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1,00; Arg 0,98; Trp 0.93; Ser 0,94; GIu 1,08; Pro 1,02; Nva 0,98; Leu l,00;Tyr 0,98; Äthylamin 1,04.

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH₂-CH₃

a) Herstellung von Z-D-Nva-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH₂-CH₃

In 2 ml 25°/oigem H Br-Eisessig werden 720 nig

Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-N H-CH₂-CH₂-CH₃ gelöst, und die

ι« Lösung wird 40 min lang geschüttelt Dann werden 20 ml trockener Äther zugegeben, und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert Der Niederschlag wird mit trockenem Äther gut gewaschen. Danach wird er über Natriumhydroxid unter vermindertem Druck in einem Exsiccator getrocknet

Nach dem Trocknen wird das Produkt in 5 ml DMF gelöst, und es werden 250 mg Z-D-Nva-OH zugegeben, wonach die Zugabe von 0,15 ml Triethylamin und 200 mg HONB erfolgt Die Mischung wird auf 0⁰C gekühlt, es werden weiters 230 mg DCC zugegeben, und danach wird 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt Dann erfolgt die Zugabe von 80 ml Äthylacetat, und die dann zurückbleibenden unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit 1 N HCl, 4%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen und danach über Natriumsulfat getrocknet

Es wird dann bei vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird mit Petroläther behandelt Das erhaltene Pulver wird aus Äthylacetat/ Petroläther umgefällt.
Ausbeute: 718 mg.
[λ]:· -51,0° (c= 1,0 in Methanol);
Rf =0,64.

Elementaranalyse für

³' Berechnet: C56.23, H 7,58, N 17,89;
gefunden: C 56,14, H 7,70, N 17,58.

b) Herstellung von (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Phe-D-Nva-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH2-CH₃

In 3 ml 25%igem HBr-Eisessig werden 500 mg Z-D-Nva-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2-CH₂-CH₃ gelöst und die erhaltene Lösung 50 min lang geschüttelt. Dann werden 60 ml trockener Äther zugegeben, der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und in 40 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dann über eine (1 χ 14cm)-Kolonne, Amberlite CG-410 (freie Phase), geleitet, die dann mit 30%ig wäßrigem Methanol gewaschen wird. Der Effluent und die Waschwässer werden vereinigt, wonach das Methanol unter vermindertem Druck abdestil'iert wird. Der Rückstand wird lyophilisiert, und es werden 320 mg der freien Base H-D-Nva-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2-CH2-CH₃ erhalten. In 2 ml DMF werden 225 mg dieses Produkts und 280 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH gelöst, wonach die Zugabe von 130 mg HONB erfolgt. Die Mischung wird auf - 10°C gekühlt, und es werden 87 mg DCC zugegeben. Diese Mischung wird bei - 10°C 3 Stunden lang, bei 0°C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur schließlich 6 Stunden lang gerührt. Dann werden 40 ml Äthylacetat zugegeben, der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert und dann in 30%ig wäßrigem Äthanol unter Erhitzen gelöst. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert, das Filtrat wird gekühlt, wobei ein Niederschlag erhalten wird, welcher abfiltriert und mit kaltem Wasser gewaschen und schließlich getrocknet wird.

Ausbeute: 340 mg.
In 20 ml 60%ig wäßriger Ameisensäure werden 300 mg

des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes gelöst, wonach die Zugabe von 580 mg SnCI₂ · H₂O erfolgt. Die Mischung wird dann 2 Stunden lang auf 85°C erhitzt, und danach erfolgt ein Einengen zur Trockene unter vermindertem Druck, wonach die Mischung mit warmem Wasser extrahiert wird.

Der Extrakt wird durch Chromatographie auf Amberlite XAD-2, Carboxymethylcellulose und Biogel P-2 gereinigt Es werden 170 mg des gewünschten Produktes erhalten.

[λ];· -37,7° fc= 0,505 in 5% wäßriger Essigsäure);

Rf2 = 0,13,RP=0,76.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1,02; Arg 0,98; Tirp 0,97; Ser 0,9S; GIu 1,02; Pro 1,00; Leu 1,00; Nva 1,02; Phe 0,98.

Beispiel 9

Herstellung von (Pyr)GIu- His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-PiO-NH-CH(CU^:3)₂

a) Herstellung von Z-D-Abu-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH(CH₃J₂

In 3 ml 25%igem H Br-Eisessig werden 700 mg Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH(CH3)₂ gelöst, und die Lösung wird 60 min lang heftig gerührt, wonach 50 ml trockener Äther zugefügt werden. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiitriert und getrocknet, das getrocknete Produkt wird dann in 6 ml DMF gelöst, und zu dieser Lösung werden 240 mg Z-D-Abu-GH zugefügt Danach erfolgt Neutralisation dieser Lösung mit 0,15 ml Triethylamin.

Es werden dann 200 mg HONB zugegeben, und die Mischung wird auf 0⁰C gekühlt, worauf die Zugabe von 230 mg DCC erfolgt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt. Dann werden 100 ml Äthylacetat zugegeben und die unlöslichen Anteile abfiltrien. Das Filtrat wird mit 0,5 N HCI und 4%iger Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen, getrocknet und danach über Natriumsulfat getrocknet. Es wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wird aus Äthylacetat/Äther umgefällt.

Ausbeute: 725 mg.

[_Λ]> -52,0° (c= 0,5 in Methanol);

Rf =0,62.

Beispiel 10

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-

D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHj-CHjdurch

Fest-Phase-Verfahren

a) Herstellung von BOC-Pro-Harz

In 50 ml DMF werden 15 g chlormethyliertes Harz (Chlorgehalt 9,45 mMol) eingebracht, wonach die in Zugabe von 6,1 g BOC-Pro-OH und 333 ml Triethylamin erfolgt. Die Mischung wird 5 Tage lang geschüttelt. Das Harz wird danach filtriert, gut mit DMF, Äthanol, Wasser, Äthanol und Äther in der genannten Reihenfolge gewaschen und getrocknet.
r, Ausbeute: 17,55 g.

Die Aminosäureanalyse ergibt, daß dieses Harz 0,314 m/Mol/g BOC-Pro enthält.

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Ty-;Bzl)-

D-Leii-Leü-ÄrgiTos)-Frc··' !arz

Elementaranalyse	für C32H5	lOgNg	N	18,27;
Berechnet:	C 55,71,	H 7,45,	N	18,01.
gefunden:	C 55,42,	H 7,59,

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Abu-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH₃)₂

Aus dem wie in a) beschrieben erhaltenen Z-D-Abu-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH(CH₃)₂ und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH wird die oben angeführte Verbindung nach ganz demselben Verfahren, wie in Beispiel 5 beschrieben, erhalten.

[\]' -41.0° fc=0,62 in 5% wäßriger Essigsäure);

RP = 0,11; RH = 0,74.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1.00; Arg 0,?Γ; Trp 0.87; Ser 0.97: GIu 1.00; Pro 0.94; Abu 1,00: Leu 1.02:Tvr0,96.

Das Reaktionsgefäß eines automatischen Peptid-Synthetisators (Simadzu Seisakusho, Modell APS-300) wird mit 3,145 g BOC-Pro-Harz (wie in a) beschrieben erhalten) gefüllt. Das Harz wird mit Dichlormethan innerhalb von 12 Stunden angequollen, wonach Aminosäuren im folgenden Zyklus zugeführt wurden.

Dichlormethan (3 min x3)-> 50% Trifluoressigsäure/

jo Dichlormethan (10 min und 30 min) -► Dichlormethan (3 min χ 3) -» Äthanol (3 min χ 3) -► Dichlormethan (3 min χ 3) — 10% Triäthylamin/Chloroform

(10 min) -► Chloroform (3 min χ 3)-♦ Dichlormethan (3 min χ 2) — BOC-Aminosäure-anhydrid (synthetisiert aus BOC-Aminosäure und DCC auf herkömmliche Weise) (30 min und 60 min) -► Acetylierung (Dichlormethan, Triäthylamin und Essigsäureanhydrid) (1 Stunde) — Dichlormethan (3 min χ 3) ((PyrKJIu-OH allein wird direkt mit DCC in DMF kondensiert).

Danach wurde das Harz mit Äthanol, Chloroform, Dimethylformamid und Äther gewaschen und getrocknet.

Ausbeute :3,89 g.

c) Herstellung von (Pyr)G!u-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr-(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-

PrO-NH-CH₂-CH₃

In 20 ml Methanol werden 3,52 g des wie in b) beschrieben erhaltenen Harzes suspendiert, und die

Suspension wird auf 20° C gekühlt. Äthylamin, welches durch Erhitzen von 80%ig wäßrigem Äthylamin in einem warmen Wasserbad erhalten wurde, wurde nach Durchlesen durch Natriumhydroxid in die Suspension eingebracht. Nach genügender Sättigung wurde die Mischung 40 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wird durch Filtration gewonnen, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, und es werder 835 mg eines pulvrigen Rohproduktes

bo erhalten. Dieses Rohprodukt enthält einen großen Anteil einer Verunreinigung, welche vermutlich der Methylester ist. Daher werden 503 mg dieses Produktes in Methanol/DMF (jeweils 8 ml) gelöst und in derselben Weise wie oben beschrieben, wird Äthylamin in die

b-) Lösung eingeleim".. Die Lösung wird 34 Stunden lang gerührt, wobei der Methylester verschwindet.

Die Lösung wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und der dabei erhaltene Rückstand

wird mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wird abfiltriert.

Ausbeute: 465 mg.

d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH,

In Gegenwart von 0,4 ml Aiiisol und 0,4 ml Mercaptoäthanol werden 327,8 mg des wie in c) beschrieben erhaltenen Rohproduktes in 8 ml wasserfreier HF gelöst. Die Lösung wird bei 0°C eine Stunde lang n gerührt, wonach sie unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt wird. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst, und die unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird dann über eine (1.5 χ 20 cm)-Kolonne. Amberlite IRA-410 (Acetatform), geleitet und ι dann auf chromatographischem Wege an Carboxymethylcellulose und Amberlite XAD-2 gereinigt. Dann wrtu UdS so ciiMiterrc riuuuki einei Geiintraiioii auf einer Kolonne. Sephadex LH-20. unterworfen. Es werden 98 mg des gewünschten Produkter, erhalten.

[\] -32.0" (c-0.52 in 5% wäßriger Essigsäure);

RP = OJO: Rf = 0.75.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 0.98; Arg 1.00: Trp 0.87; Ser 0.90: GIu 1,02; Pro :

1.02: Leu 2,oi:TvrO.98:Äthvlamin 1.10.

Bei

Il

i s ρ i e I

Herstellung von(Pyr)Glu-His-Trp-.Ser Tyr-DNIe Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH,

a) Herstellung von BOC-D-Nle-l.e;i-Arg(NO>)-Pro-NH CH:-CH,

In 10 ml DMF werden 346 mg BOC-D-NIe-OH und 820 mg H-Leu-Arg(NO:)-Pro-NH-CH:-CH, gelöst. Die Mischung wird auf 0"C gekühlt, wonach die Zugabe von 322 mg HONB und 371mg DCC erfolgt. Die so erhaltene Mischung wird bei OC 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Harnstoffverbindung, welche als Nebenprodukt anfällt, wird abfiltriert, das Filtrat wird danach mit IO ml Chloroform extrahiert, der Extrakt wird mit 0.1 N HCI. 5°/oiger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, wonach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wird. Das Chloroform wird abgedampft, der Rückstand wird mit Äther angerieben und aus -V.hano! Äther umgefällt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird.

Ausbeute: 811 mg.

Fp: 124- 126"C(Zersetzung).

[x] -46.2" ^c = 0.5 in Methanol).

Eiementaranalyse für Ci-iH
Berechnet: C53.08,
gefunden: C 53.07.

sOgN? · 1/2 HjO
H831. N 18,57;
H 8.27. N 19,05.

b) Herstellung von (PyrJGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CHj

BOC-D-Nle-Leu-ArgiNOjJhPro-NH-CFb-CHj. weiches wie oben unter a) beschrieben erhalten wurde, wird mit Trifluoressigsäure behandelt und danach mit Äther gefällt und abfiltriert. Das Produkt wird danach über eine Kolonne. Amberlite CG-45 (freie Base), zur Entfernung der Trifiuoressigsäure geleitet In 2 ml DMF werden 190 mg der Verbindung H-D-Nle-Leu-Arg-(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ und 168 mg(Pyr)G!u-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst. Die Mischung wird auf 0⁼C abgekühlt, wonach die Zugabe von 65 mg HONB und 75 mg DCC erfolgt. Die Mischung wird bei 0⁰C 2 Stunden lang und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Harnstoffverbindung, welche als Nebenprodukt anfällt, wird abfiltriert und Äthylacetat zu dem « Filtrat zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gewonnen und mit 4 ml wasserfreiem HF in Gegenwart von 0,1 ml Anisol. 0.1 ml Mercaptoäthanol bei 0⁰C I Stunde lang behandelt. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand gut getrocknet und in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird dann über eine Kolonne, Amberlite IRA-410 (Acetatform), geleitet, und der Effluent wird an einer (1.2 χ 22 cm)-Kolonne. Carboxymethylcellulose, adsorbiert. Es wird danach eine Gradienten-Elution mit 0.005 M Ammoniumacetat (200 ml) und 0.15 M Ammoniumacetat (200 ml) durchgeführt. Die (147— 168 ml)-Fraktionen werden gesammelt ιιιιιί iyupmimei i.

Ausbeute: 40 mg.

[y] -42.2° (¹C = 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure);

RP = OJ I. Rf = 0.755.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1.05; Arg 1.00; Trp 0.93; Ser 0.89: Tyr 1.00; GIu 1,00; Pro 1,02; Leu 1,00; Nie 1,00: Äthylamin 1,05.

Beispiel 12

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CH:-CH,

a) Herstellung von H-D-Phe-Leu-Arg(NO>)-Pro-NH-CHrCHj

Zu einer Mischung von 10 ml Dichlormethan und 1 ml DMF werden 600 mg Z-D-Phe-OH. 500 mg HONB und 950 mg H-Leu-Arg(NO;)-Pro-NH-CH;-CHi zugegeben, und die Mischung wird erwärmt. Danach wird auf 0^rC abgekühlt, und es werden 500 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird dann 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, und der als Nebenprodukt anfallende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Die Lösung wird zweimal in 4%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen und danach über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, wonach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt wird. Dann wird der Niederschlag sofort in 2 ml Eisessig gelöst. Nach Zugabe von 5 ml 25%igem HBr-Eisessig wird die Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt, wonach die Zugabe von 50nif trockenem Äther erfolgt. Der Niederschlag, welcher sich abscheidet, wird abfiltriert und gut mit Äther gewaschen und danach getrocknet Dieser Niederschlag wird dann in 10 ml 30%ig wässerigem Methanol gelöst. Die Lösung wird über eine Kolonne. Amberlite !RA-410 (freie Form), geleitet welche danach mit 100 ml 30%ig wäßrigem Methanoi eluiert wird. Der Effluent wird gesammelt und zur Entfernung des Methanols eingeengt

Bei der Lyophilisierung des Rückstandes wird die gewünschte Verbindung H-D-Phe-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₂-CH₃ als weißes Pulver erhalten.

Ausbeute: 1,67 g.

[\]r -94.26= (c= 1.01 in Methanol).

Elementaranalyse für C^RisOeNa ■ H₂O

Berechnet: C 54.09. H 7.62. N 20.28:
gefunden: C 53.84. H 7.79. N 19.91.

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Phe-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCHi

In 6 ml DMF werden 290 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH und 240 mg HD-Phe-Leii-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ gelöst, wonach die Zugabe von 150 mg HONB erfol«r'. Die Mischung wird auf — 10"C gekühlt, und 90 mg DCC werden zugegeben. Die Mischung wird bei - 1O⁰C 2 Stunden lang, bei O⁰C weitere 2 Stunden lang und danach bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt. Die als Nebenprodukt anfallende Harnstoffverbindung wird abfiltriert, und es werden 40 ml Äther zu dem Filtrat zugegeben. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Bei IJmfällung aus Äthanol/Äthylacetat wird ein rohes geschütztes Peptid erhalten.

Ausbeute: 510 mg.

Dieses Roh-Peptid wird in 40 ml 60%ig wäßriger Ameisensäure gelöst. Nach Zugabe von I g SnCb · H>O zu dieser Lösung wird die Mischung bei 80 —85¹C 2 Stunden lang stehengelassen. Diese Mischung wird dann unter vermindertem Druck /ur Trockene eingeengt, nach Zugabe von 50 ml Wasser zu dem Rückstand wird die Mischung mit wäßriger Ammoniaklösung auf den pH 0,7 eingestellt. Der Niederschlag wird abfiltriert, das Filtrat wird dann auf einer Kolonne, Amberlite XAD-2 und Carboxymethylcellulose, gereinigt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, lyophilisiert. wobei die gewünschte Verbindung in Form eines weißen, flaumigen Pulvers erhalten wird.

Ausbeute: 392 mg.

[\]· -71,8° (t=0.195in5% wäßriger Essigsäure);

RP = O₁M. RP = 0.76.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 0.98: Arg 1.00; Trp 0,97; Ser 0,93: GIu 1.00; Pro 0,98; Leu 1,00; Phe 1.96.

Beispiel 13

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-Pro-NH-CH-rCHj

a) Herstellung von BOC-D-Thr-Leu-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH₃

In 10 ml Acetonitril werden 438 g BOC-D-Thr-OH (ölige Substanz) und 18 mg HONB gelöst, wonach 912 mg H-Leu-Arg(NO₂)-Pm-NH-CH₂-CH₃ zugegeben werden. Die Mischung wird auf O⁰C gekühlt, und dann werden 494 mg DCC zugegeben. Die so erhaltene Mischung wird bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt, und die unlöslichen Anteile werden danach filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und der dabei entstehende Rückstand mit 100 ml Äthylacetat extrahiert Der Extrakt wird mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, 10%iger wäßriger Zitronensäurelösung und Wasser, in der genannten Reihenfolge gewaschen und danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet Er wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, und der erhaltene Rückstand wird aus Äthanol/Äther umgefällt Es werden 900 mg der gewünschten Verbindung erhalten.

Fp.: 199 -121' C (Zersetzung);

[λ]? -38,6= (c=0,5 in Methanol);

RP =0,45.

ElementaranaiysefürCaHsiOoNs - H2O
Berechnet: C 49,76, H 730, N 18,65;
gefunden: C 49,64, H 7,70, N 18,46.

b) Herstellung von (Pyr)Glu-HisTrp-Ser-Tyr-D-Thr-Leu-Arg-ProNH-CH₂-CH)

In IO ml Trifluoressigsäure werden 657 mg BOC-D- -, Thr-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CHi gelöst, und die Lösung wird 40 min lang geschüttelt. Dann werden 60 ml Äther zugegeben, und der dabei erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und mit 30 ml Wasser gewaschen. Die wäßrige Lösung wird über eine mi (I χ 10cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Base), geleitet, welche dann selbst mit 30%igem wäßrigem Methanol gewaschen wird. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und /ur Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird lyophilisiert, und es werden 471 mg D-Thr-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH, erhalten. In 2 ml DMF werden 167 mg des so erhaltenen Produktes und 175 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH gelöst, wonach eine Zugabe von 67 mg HONB erfolgt. Die :n Mischung wird auf -5°C gekühlt, und 77 mg DCC werden zugegeben. Diese Mischung wird bei -5°C 3 Stunden lang und dann bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt. Die unlöslichen Anteile werden abfiltriert, und es werden dann 50 ml Äthylacetat dem Fittrat y. zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird filtriert und aus DMF-Äthylacetat umgefällt.

Ausbeute: 290 mg.

160 mg dieses Produktes werden in 10 ml 60%ig wäßriger Ameisensäure gelöst, und unter Zugabe von in 400 mg SnCl₂ · H₂O wird die Lösung bei 80° C 2 Stunden lang behandelt. Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Dann werden 10 ml Wasser zugegeben, und die unlöslichen Anteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird i\ auf chromatographischem Wege auf Amberlite XAD-2. Carboxymethylcellulose und Bio-gel P-2 gereinigt. Es werden 65 mg des gewünschten Produktes erhalten.

[\] -37,4" (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure):

RP = 0,12, RP = 0,68.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1,00: Arg 0,97; Trp 0,94; Thr 1.03: Ser 0,90; GIu 1,00; Pro 1,06; Leu 1.06;Tyr 1.00;Äthylamin 1,10.

4-, Be is pi el 14

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ile-Arg-Pro-NH-CHrCH,

a) Herstellung von Z-lle-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH,

In 12 ml einer 25%igen HBr-Eisessiglösung werden 1,43 g Z-Ar^NO₂J-PrO-NH-CH₂-CH₃ gelöst, und die Mischung wird bei Raumtemperatur 40 min lang geschüttelt Zu dieser Lösung werden 300 ml trockener Äther zugegeben, und der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet Das erhaltene Pulver wird in 25 ml DMF gelöst und die Lösung wird mit 0,84 ml Triethylamin neutralisiert, wonach Kühlung auf 0⁰C erfolgt Dann werden 795 mg Z-IIe-OH, 590 mg HONB und 680 mg DCC zugegeben, und die Mischung wird dann bei 0^cC 5 Stunden lang und schließlich 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt Diese Reaktionsmi-

b5 schung wird abnitriert, und das Filtrat wird eingedampft Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst danach mit 0,1 N HCl 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, wonach eine

Trocknung über Magnesiumsulfat erfolgt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand aus Äthylacetat/Ätlier umgefällt. Nach der Umfällung aus Äthanol/Äther werden 1,1 g des gewünschten Produktes erhalten.

Fp.: IO3-1O5X'.

[\] -58.Γ (c=~ 1.0 in Methanol). Rf =0,48.

Elementaranalyse für C₂₇H₄JO₇Ns ■ 1/2 H₂O
Berechnet: C 54,08, H 7,23. N 18.68;
gefunden: C 53.80. H 7.15. N 18,84.

b) Herstellung von ZD-Leu-lle-Arg(NO₂)-PrO-NH-CH₂-CH,

In 4 ml 25°/oigem HBR-Eisessig werden 590 mg Z-IIe-Ar₈(NO₂)PrO-NH-CH₂-CH, gelöst und die Mischung bei Raumtemperatur 40 min heftig gerührt. Zu dieser Lösung werden 50 ml trockenen Äthers zugegeben, und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und hernach in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 8 ml DMF gelöst, und die Lösung wird mit 0.14 ml Triethylamin behandelt, wonach eine Kühlung auf 0⁰C erfolgt. Dann werden 264 mg Z-D-Leu-OH, 216 mg HONB und 247 mg DCC zugegeben, und die Mischung wird bei 0⁰C 2 Stunden lang, danach bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann, wie in Beispiel a) beschrieben, weiterbehandelt, und es werden 620 mg des gewünschten Produktes erhalten.
Fp.:l12—113"C.
[i] -47.8° (c=0.5 in Methanol). Rf =0.53.

Elementaranalyse für CijHüOsNii ■ H₂O
Berechnet: C54.91. H 7,68. N 17.47:
gefunden: C 54.72. H 7,52, N 17,19.

c) Herstellung von (Pvr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-lle-Arg-"Pro-NH-CH₂-CH,

In 3 ml 25°/oigem HBr-Eisessig werden 220 mg Z-D-Leu-[le-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ gelöst, und die Lösung wird bei Raumtemperatur 50 min lang heftig gerührt. Zu dieser Lösung werden 50 ml trockener Äther zugegeben, und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet. Dieses Material wird dann in einer kleinen Menge Wasser gelöst und über eine (1,2x7 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), geleitet. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und lyophilisiert. Dieses Material wird dann in 5 ml DMF zusammen mit 230 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH und 108 mg HONB gelöst Die Mischung wird auf -10⁰C gekühlt, und es werden 124 mg DCC zugegeben. Diese Mischung wird bei -10° C 2 Stunden lang, bei 0⁰C weitere 2 Stunden lang und schließlich 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wonach abfiltriert wird. Das Filtrat wird eingeengt und der Rückstand auf einer (I,8x20cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200— 300 Mesh), mittels Gradientenelution mit 5%ig wäßrigem Äthanol bis 80%ig wäßrigem Äthanol (jeweils 250 ml) gereinigt. Das gewünschte Produkt befindet sich in den (150 bis 350 ml)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingeengt und iyophiiisiert Das so erhaltene Material wird in 7 ml 60%ig wäßriger Ameisensäure gelöst, und es weiden 450 mg SnCb · H2O zugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden lang auf 80—85°C erhitzt Die unlöslichen

Anteile werden abfü/riert, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird dann mit 30 ml warmem Wasser (80"C) extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und das Filtrat auf eine (1.8 χ 15 cm)-Kolonne, Amberlite XAD-2 (200 bis 300 mesh), aufgegeben. Die Kolonne wird danach mit Wassergut gewaschen. Für die Elution wird die Linear-Gradienten-Methode unter Einsatz von wäßrigem Äthanol (20-80%, 250 ml/250 ml) eingesetzt. Die gewünschte Verbindung befindet sich in den (100 ml — 230 ml)Fraktionen. Diese Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Entfernung des Äthanols eingeengt. Das Konzentrat wird dann auf eine (1.2 χ 40 cm)-Kolonne, Carboxymethylcellulose, aufgebracht. Danach wird das Produkt nach der Linear-Gradienten-Elutionsmethode (0.005 M —0.2 M Ammoniumacetat, pH 6.8, 200 ml/200 ml) eluiert. Das gewünschte Peptid wird in den (180 ml — 290 ml)-Fraktior.en erhalten. Diese Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.

Ausbeute: 130 mg.

[\] - 39,2° (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure);

RP = OJI.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 0,97; Arg 1.02: Trp 0,92; Ser 0.94; GIu 1,00; Pro 1,05; He 1,00; Leu l,00;Tyr 0,97.

Beispiel 15

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CHrCH,

a) Herstellung von Z-Nle-Arg(NO₂)-Pro-NH-CHrCH,

In 10 ml 25%igev HBr-Eisessigsäure werden 715 mg Z-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH₃ gelöst, und die Mischung wird be^; Raumtemperatur 30 min lang heftig gerührt. Dieser Lösung werden 250 ml trockener Äther zugegeben, und der entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsinkator über Natriumhydroxid getrocknet. Das so erhaltene Pulver wird in 15 ml DMF zusammen mit 400 mg NIe-OH gelöst, und die Lösung wird auf O⁰C gekühlt. Dann werden 0.45 ml Triethylamin. 295 mg HONB sowie 340 mg DCC zugegeben. Die Mischung wird bei 0^cC 3 Stunden lang und danach 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann, wie in Beispiel 14a beschrieben, weiterbehandelt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird.

Ausbeute: 824 mg.

Fp.: 109-110'C.

[λ]ϊ -50,4° (c=05 in Äthanol);

Rf =0,41.

Elementaranalyse für C27H42O7N8 · 1/2 H2O
Berechnet: C 54,08, H 7,23, N 18,68;
gefunden: C 53,79, H 7,09, N 1834.

b) Herstellung von Z-D-Leu-NIe-Arg(NO2)-PrO-NH-CHrCH₃

In 5 ml 25%igem HBr-Eisessig werden 590 mg Z-Nle-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH2-CH3 gelöst, und die Mischung wird 40 min bei Raumtemperatur geschüttelt Es werden 200 mi trockener Äther zugegeben, und der dabei entstandene Niederschlag wird durch Ritration gesammelt und über Natriumhydroxid in einem Exsikkator getrocknet Das Produkt wird dann in 5 ml

DM F gelöst und die Lösung mit 0,14 ml Triethylamin boi 0°C neutralisiert. Dann werden 264 mg Z-D-Leu-OH zugegeb.-!i, weitere 216 mg HONB und 247 mg DCC bei 0°C. Die Mischung wird dann 2 Stunden lang bei 0"C gerührt, wonach IO Stunden lang bei Raumtemperatur weitergerührt wird. Sie wird dann wie in Beispiel b) beschrieben weiterbehandelt. Es werden 594 mg des gewünschten Produktes erhalten.

Fp.: 101-103⁰C.

[x] -45,2° (c=0.5in Methanol);

Rf =0,55.

Elementaranalyse für C'hHmOsNq ■ H₂O

Berechnet: C54.91. H 7.68, N 17,47;
gefunden. C 54,63, H 7.54. N 17,08.

c) Flerstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Nle-Arg-Pro-NH-CHj-CH,

iii 4 ini

UIgCiVi ί iui -TiscSSig wciucii JjO in;;

ZD Leu-Nie-ArgiNO^-Pro-NH-CH.-CH, gelöst, und die Mischung wird 40 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt. Zu dieser Mischung werden 300 ml trockener Äther zugegeben, und der dabei entstandene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und in einem Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet.

Das erhaltene Produkt wird in 2 ml Wasser gelöst und diese Lösung über eine (1.2 χ 7 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), geleitet. Die Kolonne wird danach gut mit Wasser gewasche; Der Effluent und die Waschlösungen werden kombiniert und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wird dann mit 345 ;ng (P>r)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH in 6 ml DMF in Gegenwart von 180 mg FiONB und 206 mg DCC gekuppeil. Die aufgearbeitete Mischung und das erhaltene Produkt werden auf chromatographischem Wege auf Amberlite XAD-2, wie in Beispiel 14c) beschrieben, gereinigt. Die Entfernung der Nitrogruppe und die Reinigung des gewünschten Peptides werden in ähnlicher Weise, wie in Beispiel 14c) beschrieben, durchgeführt.

Ausbeute: 213 mg.

[\] ' -38,6° (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure).

RP = O₁IO.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 0,98; Arg 1,00; Trp 0.91; Ser 0.95; GIu 1,00; Pro 1.08; Leu 1.00; Nie 1.00; Tyr 0,96.

Beispiel 16

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Val-Leu-Arg-Pro-NH-CH_rCH₃

a) Herstellung von BOC-D-VaI-LeU-ArS(NO₂)-Pr₀-NH-CH₂-CH₃

Zu einer Lösung von 540 mg BOC-D-VaI-OH(Ol) und 1,14 g H-LeU-Ar₈(NOj)-Pr₀-NH-CH₂-CH₃ in 10 ml DMF werden 537 mg HONB und 620 mg DCC bei 0⁰C zugegeben. Die Mischung wird 3 Stunden lang bei 0⁰C und danach bei Raumtemperatur 10 min lang seriihrt. Dann wird abfiltriert. Das Filtrat wird bei vermine¹ . tem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rücl :and wird in 100 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 0,1 N HCl und 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, getrocknet und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird mit Petroläther angerieben und gibt ein Rohprodukt, welches aus Athylacetat/ Äther umgefällt wird.

Ausbeute: 1,1 g;
Fp.: l44-l46°C(Zersetzung);
[\] -43,7" (C= 1,0 in Methanol);
Rf =0,55.

Elementaranalyse für C₂^H
Berechnet: C 52,39,
gefunden: C 52,40,

O₈Nq 1/2 H₂O
H8,i8, N 13.96;
H 8,32, N 18,52.

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tvr-DVal-Leu-Arg-Pro-NH-CH.-CH,

In 5 ml Trifluoressigsäure werden JOO mg BOC-D-Val-Leii-Arg(NO>)-Pro-NH-CHj-CHi gelöst, unü die Mischung wird 30 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt, dann werden 50 ml trockener Äther zugegeben, iii'iu uii.·) Oriiiiiicne. weiuc feste rtouuki wird gesammelt und unter vermindertem Druck in einem Exsikkator über NaOII getrocknet. Das Material, das so erhalten wird, wird in 20 ml 20%ig wäßrigem Methanol gelöst, und die Lösung wird auf eine (1 χ 5 cm)-Kolo:ine, Amberlite IR-45 (freie Form), aufgebracht. Die Säule wird dann mit demselben Lösungsmittel gewaschen. Der Effluent und die Waschlösungen werden kombiniert, zu einem kleinen Volumen eingeengt und lyophilisiert. Es werden 165 mg Produkt erhalten. Davon werden 150 mg in 2 ml DMF zusammen mit 168 mg (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH und 65 mg HONB gelöst, und die Mischung wird auf 0°C gekühlt. Dann werden 75 mg DCC zugegeben, und die Mischung wird 2 Stunden lang bei O⁰C und danach 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert und mit 50 ml Athylacetat verdünnt. Der durch Filtration gewonnene Niederschlag wird getrocknet tirel durch Säulenchromatographie auf Silikagel (4 g) gerein.ft. Für die Elution wird das RP-Lösungsmittelsystem verwendet. Die Fraktionen, welche Jas geschützte Nonapeptid enthalten, werden miteinander vereinigt und das Lösungsmittel soweit eingedampft, daß das Produkt trocken ist. Es werden 140 g Produkt erhalten. Von dem erhaltenen, geschützten Nonapept A werden 110 mg mit 4 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von 0.1 ml Anisol und 0.02 ml Mercaptoäthanol bei 0⁼C 1 Stunde lang behandelt. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit 20 ml Wasser extrahiert. Der Extrakt wird mit Äther gewaschen und über eine (i.5x3cm)-Kolonne, Amberlite IRA-400 (Acetat-Form), geleitet, wonach die Kolonne selbst mit Wasser gewaschen wird. Der Effluent und die Waschlösungen werden vereinigt und lyophilisiert. Das Material wird in einer kleinen Menge gelöst, und die Lösung wird auf eine I,2x30cm-Kolonne, Carboxymethylcellulose, aufgebracht. Für die Elution wird das Lineargradienten-EIutions-Verfahren unter Einsatz von Ammoniumacetat (0,005 Μ—0,2M, 150 ml—150 ml) verwendet. Das gewünschte Produkt befindet sich in den (110— 13OmI)-Fraktionen. Diese Fraktionen werden miteinander vereinigt und lyophilisiert.
Ausbeute: 87 mg.

OJ/ -40,8° (c= 0.5 in 5% wäßriger Essigsäure);
P

b5 Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCl in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1,00; Arg 1,02; Trp 0,85; Ser 0.95; GIu 058; Pro 1,02; VaI 0,91: Leu 0,95:Tyr l.oo_: Äthylamin 1,01.

	17	24	46	005	32
31				Beispiel 18
Beispiel

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH_rCH₃

a) Herstellung von BOC-D-Met-Leu-ArgfNOj)-FrO-NH-CH₂-CH₃

BOC-D-Met-Leu-ArglNO^-Pro-NH-CHrCHj wird hergestellt in ganz ähnlicher Weise wie es in Beispiel 16a) beschrieben ist, nämlich aus 623 mg BOC-D-Met-OH, 1,14 g H-Leu-ArgiNO^Pro-NH-C^-CH:!, 537 mg HONB und 620 mg DCC.

Ausbeute: 1,1 g.

Fp.: 125-130⁰C (Zersetzung);

[λ>" -51,5° (c= 1,0 in Methanol); Rf' =0,59.

Elementaranalyse CaHs₃OsNsS

Berechnet: C 50,64, H 7,77, N 18,32, S 4,65; gefunden: C 50,51, H 7,52, N 18,54, S 430.

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-He-Leu-Arg-Pro-NH-CHrCH₃

a) Herstellung von BOC-D-Ile-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH₃

BOC-D-Ile-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2-CH₃ wird ir

ähnlicher Weise, wie in Beispiel 16a) beschrieben, au<

ίο 579 mg BOC-D-He-OH, 1,14 g H-Leu-Arg(NO₂)-Pro·

NH-CH₂-CH₃, 537 mg HONB und 620 mg DCC

hergestellt

Ausbeute: 03 g· Fp.: 127 -13 Γ C (Zersetzung). [λ]? - 483° (c= 1,0 in Methanol).

Elementaranalyse für C₃₀H; Berechnet: C 53,79, gefunden: C 53,81,

b) Herstellung von (Kyrjoiu-His-1 rp-Ser-1 yr-D-Met-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CHj

In 3 ml Trifluoressigsäure werden 300 mg BOC-D-Met-Leu-Arg/NOzVPro-NH-CHz-CHj gelöst, und die Mischung wird 20 min lang bei Raumtemperatur heftig gerührt. Dann werden 40 ml trockener Äther hinzugefügt, und der erhaltene, weiße Niederschlag wird abnitriert und getrocknet Dieses Material wird in die freie Form übergeführt, indem es über eine (1x5 cm)-Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), wie in Beispiel 16b) beschrieben, geleitet wird. Das erhaltene, teilweise geschützte Tetrapeptid H-D-Met-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH₂-CH₃ (147 mg) wird sodann mit 171 mg (Pyr)GIJU-His-Trp-Ser-T)T-OH in Gegenwart von 67 mg j5 HONB und 77 mg DCC umgesetzt, wobei ein teilweise geschütztes Nonapeptid erhalten wird. Diese Verbindung wird auf einer AmberIite-XAD-2-Kolonne gereinigt und danach mit SnCl₂ · H₂O in 60% wäßriger Ameisensäure 2 Stunden lang bei 80 bis 85° C behandelt Das erhaltene Endprodukt wird chromatographisch auf Amberlite XAD-2 und Carboxymethyl-Cellulose gereinigt Alle diese Vorgänge sind ähnlich den in Beispiel 16b) beschriebenen.

Ausbeute: 79 mg.

[«]? -39,6° (c 0,5 in 5% wäßriger Essigsäure); RP-.0.16.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegenwart von Thioglycolsäure):

His 1,02; Arg 1,00; Trp 030; Ser 0,89; GIu 1,00; Pro 1,00; Met 0,91; Leu 0,98; Tyr l,02;Äthylamin 1,00.

H 8,27, H 831,

N 18,18; N 18,65.

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-lie-Leu-Arg-Pro-NH-CH₂-CH₃

In 3 ml Trifluoressigsäure werden 300 mg BOC-D lle-Leu-Arg(NO₂)-Pro-NH-CH₂-CH3 gelöst, und di< Mischung wird 25 min lang bei Raumtemperatu geschüttelt Dann werden 40 ml trockener Äthe zugegeben, und der erhaltene Niederschlag win abfiltriert und getrocknet. Dieses Material wird dann ii die freie Form übergeführt, indem es über eini (1x5 cm)· Kolonne, Amberlite IR-45 (freie Form), wie ii Beispiel lob) beschrieben, geleitet wird. Das erhaltene teilweise geschützte Tetrapeptid H-D-Ile-Leu Arg(NO₂) PrO-NH-CH₂-CH₃ (142 mg) wird mit 171 mj (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH,67 mg HONB und 77 m| DCC umgesetzt, wobei ein teilweise geschützte Nonapeptid erhalten wird. Diese Verbindung wird au einer AmberIite-XAD-2-Säule gereinigt und danach mi SnCI₂ · H;>O in 60%ig wäßriger Ameisensäure ; Stunden lang bei 80 bis 85°C behandelt. Das s< erhaltene, gewünschte Produkt wird chromatogra phisch auf Amberlite XAD-2 und Carboxymethyl-Cellu lose gereiinigt Alle Vorgänge sind ähnlich den ii Beispiel 16<b) beschriebenen.

Ausbeute: 93 mg.

[λ]? -413° (c= 0,5 in 5% wäßriger Essigsäure).

Rf 2=0,13, RP = 0,66.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 6 N HCI in Gegen wart von Thioglycolsäure):

His 038; Arg 1,00; Trp 0,89; Ser 0,91; GIu 035; Pro

1,00; He 1,00; Leu 1,00; Tyr 1,00; Äthylamin 1,01.

230 211/1!

Claims (12)

Patentansprüche:

1. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R'-R²-R³-Arg-Pro-NH-R⁴

worin R¹ Tyr oder Phe, R² D-Leu, D-He, D-NIe, D-VaI, D-Nva, D-Abu, a-Aibu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr oder D-Met, R³ Leu, He oder Nie und R* eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, 2-Hydroxyäthyl, 2-Hydroxy-n-propyl oder 3-Hydroxy-n-propyl, bedeuten.

2. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel I, worin R² D-Leu, D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phg, D-Phe, a-Aibu oder D-Ser bedeutet und R¹, R³ und R⁴ die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen haben.

3. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel I, worin R² D-VaI, D-He, D-Thr oder D-Met bedeutet und R¹, R³ und R⁴ die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen haben.

4. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel I, worin R⁴ Äthyl bedeutet

5. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R¹ Tyr, R² D-Leu, R³ und R⁴ Äthyl bedeuten.

6. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R' Phe, R² D-Leu, R³ Leu und R⁴ Äthyl bedeuten.

7. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R' TjT, R² D-Ser, R³ Leu und R⁴ Äthyl bedeuten.

8. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R¹ Tyr, R² D-Abu, R³ Leu und R⁴ Äthyl bedeuten.

9. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R¹ Tyr, R² D-Nva, R³ Leu und R⁴ Äthyl bedeuten.

10. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin Ri Tyr, R² D-Thr, R³ Leu und R⁴ Äthyl bedeuten.

11. Nonapeptidamid der allgemeinen Formel I, worin R" Tyr, R² D-Leu, R³ He und R⁴ Äthyl bedeuten.

12. Verfahren zur Herstellung der Nonapeptidamide der allgemeinen Formel