CN103012564B - 高纯度的曲普瑞林及其纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度的曲普瑞林及其纯化方法。该高纯度的曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸小于0.2%；D-Arg相对于全部精氨酸小于0.2%；乙腈含量低于0.03%；甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丝氨酸经氨基酸组成检测，各氨基酸的相对比值在0.9～1.1之间。纯化方法包括步骤：(a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；(b)将步骤(a)所得滤液加载到离子交换柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；(c)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。本发明方法收率高，产品质量稳定，生产成本低，操作简单，适合大生产。

Description

高纯度的曲普瑞林及其纯化方法

技术领域

本发明涉及一种高纯度的曲普瑞林，该高纯度的曲普瑞林具有杂质含量低、产品纯度高等诸多优点。本发明进一步地涉及该高纯度的曲普瑞林的纯化方法。

背景技术：

曲普瑞林，已以其醋酸盐或者巴莫酸盐的形式应用于临床，临床适应症包括前列腺癌、性早熟、辅助生殖技术(ART)例如体外受精术(IVF)、子宫内膜异位症和子宫肌瘤等，已上市产品例如有达菲林

曲普瑞林英文名为：Triptorelin，别名有：垂普托雷林、色氨瑞林、Decapeptyl等，其CAS登记号为57773-63-4，分子式，C64H82N18O13，分子量1311.45。曲普瑞林的肽序为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂。

曲普瑞林系合成的促性腺激素释放激素(GnRH)的类似物。其结构的改良是将天然分子结构中的第六个左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代以使其促效作用更为显著。曲普瑞林作用与GnRH相同，但其血浆半衰期延长且对GnRH受体的亲和力更强，因此曲普瑞林成为GnRH受体的强力激动剂。曲普瑞林注射后，最初会刺激垂体分泌促性腺激素(Gn)，即黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。当垂体经过长期的刺激后会进入不应期，促性腺激素的释放会减少，因而使性类固醇(睾丸酮或雌激素)降低至去势水平。上述作用是可逆转的。

1974年日本武天化工的Fujino Masahiko等人首先发明促黄体急速释放激素的十肽酰胺类似物的合成工艺。并在日本，德国，美国等国家申请专利，专利号分别为：JP19740027442、DE2446005、US4008209(液相法)。

此后，美国US4010125公开了曲普瑞林及其中间体以及它们的制备方法。该文献所记载的方法包括使用Boc--保护氨基酸为原料，使用二苯甲基胺(Benzhydrylamine)树脂进行固相合成。在每一轮脱帽须用三氟醋酸，并且在最终将十肽从树脂上切除时使用氢氟酸和苯甲醚。

以Fmoc-保护氨基酸为原料制备曲普瑞林亦有相关报道。例如孙永强等(孙永强、钱明霞、严益民、冯晓晖、蒋伟，曲普瑞林的液相合成，中国医药工业杂志，2012，43(7)：532)公开了使用Fmoc-保护氨基酸为原料通过液相合成法来制备曲普瑞林，在该方法中使用HBTU为偶联剂，据报道该工艺中每一次肽链延长步骤的收率仅在77%～86%之间，纯化收率为74%，总收率仅为12.4%。

此外，作为一种由10个氨基酸依序列连接而成的多肽，其在合成过程中需要将10氨基酸依次连接，从而在合成过程中可能产生较多的杂质，特别是有可能形成一些缺少一个或多个氨基酸的更短的肽。

因此，获得一种高纯度曲普瑞林仍然是本领域技术人员极其期待的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备高纯度曲普瑞林的方法，期待该方法可以得到高收率和/或高纯度的曲普瑞林。本发明人令人惊奇地发现，使用特定的工艺条件制备曲普瑞林，不但产率高，而且产品品质优良；本发明人还令人惊奇地发现，使用特定的工艺条件纯化曲普瑞林，不但收率高，而且纯度高产品品质优良。本发明因此而得以完成。

为此，根据本发明的第一方面，提供了一种固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步骤：

(1)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Gly-树脂；

(2)向上一步骤所得的肽偶合树脂(即步骤(1)所得Fmoc-Gly-树脂)中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽(即脱除Fmoc-保护基)；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；

(3)循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸Fmoc-Pro-OH：Fmoc-L-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp(boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-trp(boc)-OH、Fmoc-L-His(trt)-OH和H-Pyr-OH，以最终形成十肽树脂：H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；

(4)向步骤(3)所得十肽树脂中加入切割液进行切肽反应，以使十肽从树脂上切割下来，得到曲普瑞林。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂选自：rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂、knorr树脂、或其组合。这类树脂是可以从商业途径获得的，例如可以从阿拉丁试剂公司(http://www.aladdin-reagent.com)商业公司购得。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：取树脂置于反应器中，加入溶剂(例如二氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合)振荡并充分浸泡(例如浸泡10～200min)，抽除溶剂(必要时，可再用上述溶剂重复清洗，并除去溶剂)。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的：称取一定量树脂于反应器中，然后加入二氯甲烷，振荡并浸泡60分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照CN101357936A说明书第8页第2-3行所述方式进行的。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照US4010125说明书第10栏第35-43行所述方式进行的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂在经浸泡处理后、进行偶联反应之前，还包括对该树脂进行脱帽处理的步骤。增加该脱帽处理步骤，使树脂得以进一步地活化，有助于增加Fmoc-Gly-树脂的收率。该脱帽处理的步骤可以参照步骤(2)中的方式进行。此外，在该脱帽处理期间或者脱帽处理后，可以使用茚三酮检测法检测脱帽完全程度，如果脱帽不完全，可重得进行脱帽处理。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述肽偶联剂例如但不限于：DCC(N,N′-二环己基碳二亚胺，N,N′-Dicyclohexylcarbodiimide)、DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺，N,N′-Diisopropylcarbodiimide)、HATU(英文全称2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium)、HBTU(英文全称O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)、HCTU(英文全称1H-Benzotriazolium1-[bis(dimethylamino)methylene]-5chloro-,hexafluorophosphate(1-),3-oxide)、TATU(英文全称O-(7-Azabenzotriazole-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate)、TBTU(英文全称O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate)、或其组合。肽偶联剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化科技有限公司等商业途径购得。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述酰胺键形成促进剂例如但不限于：HOAT、HOBT、6-Cl-HOBt、或其组合。这些试剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化科技有限公司等商业途径购得。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述有机碱例如但不限于：NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其组合。这些试剂可以容易地从一般的商业途径获得特别是一般的化学试剂公司购得，例如可以从北京化学试剂公司购得。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，用于进行偶联反应的所述溶剂例如但不限于：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剂；或者，例如在步骤(1)中进行偶联反应时，通常可以是每摩尔树脂使用5-25L溶剂，例如可以是每摩尔树脂使用10-20L溶剂。在其它偶联反应步骤中亦可使用此比率范围。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述树脂与所述Fmoc-Gly-OH的投料比为1：2.5～5(摩尔比)，优选1：3～5。进一步地，在后续的各个肽偶联反应中，添加的该步骤的氨基酸(Fmoc保护的或未保护的)的量为步骤(1)中树脂量的2～7倍(摩尔倍)，优选3～6倍。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所述Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱四者的投料比为1：1-3：1-3：2-6(摩尔比)，例如四者的投料比为1：1-2：1-2：2-4。需要说明的是，当某类物料(例如酰胺键形成促进剂)以两种或两种以上组合使用时，其在上述投料比中的用量是以投入的全部该类物料计的，例如使用两种酰胺键形成促进剂时，它们的总摩尔数是Fmoc-Gly-OH摩尔数的1-3倍，优选1-2倍；其它物料种表示它们的量时，亦有同样含义，除非另有说明。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，还包括在偶联反应期间或者反应后采用茚三酮检测法检测偶联反应进行程度。如果发现偶联反应不够完全，可以重复进行偶联反应。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，还包括在完成偶联反应后对获得的Fmoc-Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1～3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽试剂选自哌啶(亦称为六氢吡啶，PIP)、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在选自下列的溶剂中进行的：二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，优选二甲基甲酰胺。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在15～25%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的，优选是在20%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在10～30℃温度下进行的，反应时间为10～200min，例如30～90min，例如约60min。在一个实施方案中，所述脱帽反应是在室温下进行的。在一个实施方案中，所述脱帽反应是在室温下进行的反应时间为10～200min，例如30～90min，例如约60min。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，还包括在完成脱帽反应后对获得的Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理1～3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，还包括在脱帽反应期间或者脱帽反应后采用茚三酮检测法检测脱帽反应进行程度。如果发现脱帽反应不够完全，可以重复进行脱帽反应。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述偶联反应是参照步骤(1)中的偶联反应进行的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸，得到H-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第二循环操作使用Fmoc-L-Leu-OH作为保护氨基酸，得到H-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第三循环操作使用Fmoc-D-trp(boc)-OH作为保护氨基酸，得到H-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第四循环操作使用Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到H-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第五循环操作使用Fmoc-L-Ser(tBu)-OH作为保护氨基酸，得到H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第六循环操作使用Fmoc-L-trp(boc)-OH作为保护氨基酸，得到H-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第七循环操作使用Fmoc-L-His(trt)-OH作为保护氨基酸，得到H-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第八循环操作使用H-Pyr-OH作为保护氨基酸，得到H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中进行偶联反应时，酰胺键形成促进剂是HOAT和HOBT两者组合使用。在一个实施方案中，HOAT和HOBT二者的用量比为1：1-4(摩尔比)，优选1：2-3(摩尔比)。发明人已经出人意料地发现，组合使用酰胺键形成促进剂对于提高第一步骤偶联率进而提高产品品质是非常有益的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)和步骤(3)中进行偶联反应时，使用的酰胺键形成促进剂是HOAT。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，在第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-L-Arg(pbf)-OH一起加入适量乳酸进行反应。在一个实施方案中，所述Fmoc-L-Arg(pbf)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.1-0.5，优选1：0.2-0.3。所述的乳酸例如是符合2010年版二部480页收载的“乳酸”的标准的产品。发明人已经出人意料地发现，在该步骤中加入适量乳酸时，所得曲普瑞林氨基酸光学纯检测时D-Arg的含量低于约0.10%，这对于提高产品品质是非常有益的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)、步骤(2)、和步骤(3)中的所述偶联反应是在10～30℃温度下进行的，反应时间为10～200min，例如30～90min，例如约60min。在一个实施方案中，所述偶联反应是在室温下进行的。在一个实施方案中，所述偶联反应是在室温下进行的反应时间为10～200min，例如30～90min，例如约60min。

根据本发明第一方面的方法，其中在各步骤中进行脱帽反应和/或偶联反应时，是在室温进行的，优选是在20±5℃下进行的，虽然本发明描述了一些优选的反应时间，然而反应时间可根据茚三酮检测结果而随时作适当调整，例如如果经检测发现反应尚不完全的情况下可适当延长反应，这些操作是本领域技术人员容易控制的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H₂O。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H₂O=50-98:1-10:1-10:0.1-5。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H₂O=90-98:1-5:1-5:0.5-2。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H₂O=95:2:2:1。在一个实施方案中，所述切割液是预先冷却到-20℃至10℃，优选预先冷却至0℃至10℃，优选预先冷却至约5℃。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述切肽反应是在室温进行的，优选是在20±5℃下进行的。反应时间为1-10小时，优选1-5小时，优选2-3小时。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述切肽反应是将氨基酸的侧链保护基及十肽从树脂上同时切割下来从而获得十肽曲普瑞林。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，在完成切肽反应后，除去切割液(例如通过减压的方式)，然后加入乙醚进行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤数次，真空干燥，获得曲普瑞林。

根据本发明第一方面的方法，在经步骤(4)切肽反应获得曲普瑞林干燥品后，还进一步包括对该曲普瑞林干燥品进行纯化的步骤。该纯化步骤在本发明中亦可称为步骤(5)，纯化前的曲普瑞林干燥品可以称为曲普瑞林粗品。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的纯化步骤是照如下子步骤进行的：

(a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；

(b)将步骤(a)所得滤液加载到离子交换柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；

(c)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(a)中，所述待纯化的曲普瑞林可以是如本发明合成的曲普瑞林，亦可以是其它固相合成法合成得到的曲普瑞林(例如可以是CN101357936A说明书第8页至第10页第1行所得曲普瑞林或者进一步地是说明书第10页第6行所得曲普瑞林；例如可以是US4010125实施例1和2所得曲普瑞林)，还可以是液相法合成得到的曲普瑞林(例如可以是孙永强文献(孙永强、钱明霞、严益民、冯晓晖、蒋伟，曲普瑞林的液相合成，中国医药工业杂志，2012，43(7)：532)中步骤2.2或者步骤2.3所得曲普瑞林)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(a)中，所述溶剂为醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为2-20%(v/v)的醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为5%的醋酸水溶液。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(a)中，溶解曲普瑞林所得溶液中曲普瑞林的浓度为0.1-10%(w/v)，例如浓度为1-5%(w/v)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，所述的离子交换柱为阳离子交换柱(例如但不限于Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IECSP-420N、Shodex Asahipak ES-502C7C、SP Sepharose HP、SP Sepharose FF、SSepharose FF和DEAE Sepharose FF、D001(或D301)大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D113大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、001×7(732)凝胶强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、7320阳离子交换树脂、001×7MB阳离子交换树脂)或阴离子交换柱(例如国产D201、D231、DK251、731、或290型阴离子交换树脂，美国Amberlite IRA-900型阴离子交换树脂，德国Lewatit MP-500型阴离子交换树脂，日本Diaion PA308型阴离子交换树脂，TOSOH TSK–GEL DEAE-5PW、Chrompack IonoSpher A)或其组合使用；优选的离子交换柱为阴离子交换柱。优选的离子交换柱是基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交换柱，例如Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，它们可以容易地从商业途径获得，例如得自北京谱朋科技有限公司。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，先用酸性溶液平衡柱子，再将样品加载到柱子上，然后再依次用碱性溶液、酸性溶液和盐溶液洗脱柱子，收集盐溶液洗脱所得的主峰流出液(其中含有初步纯化的曲普瑞林)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，所述的离子交换柱预先用酸性溶液(其可称为流动相A)洗脱并使柱子平衡(由此可以活化柱子)；在一个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是醋酸溶液；在一个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为0.1%-1%的醋酸溶液；在一个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为约0.5%的醋酸溶液。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，曲普瑞林加载到离子交换树脂中的加载量可以是根据经验确定的，特别是曲普瑞林与离子交换树脂的比率为10～200：1(mg:ml)；特别是50～100：1(mg:ml)；在下文实例中如未特别注明，是50mg：1ml。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，将曲普瑞林加载到离子交换柱上后，用碱性溶液(其可称为流动相B)洗脱(至直使流出液的pH恒定)。在一个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在一个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为5-50mmol/L的氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在一个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为约20mmol/L的氢氧化钠溶液。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，用碱性溶液(其可称为流动相B)洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用酸性溶液(流动相A)洗脱至直使流出液的pH恒定。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，用酸性溶液(流动相A)洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用盐溶液(其可称为流动相C)洗脱，收集主峰流出液(其中含有转化成盐型的曲普瑞林)。在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是氯化钠、碳酸钠、醋酸钠、醋酸铵、或磷酸二氢钾的水溶液；在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)的浓度是50-1000mmol/L；在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是0.7mol/L氯化钠溶液。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(c)中，将子步骤(b)中所得收集转化成盐型的曲普瑞林主峰流出液用乙腈稀释(例如可以稀释至乙腈浓度达1%-10%，例如约5%)；将该稀释液加载到硅胶柱上，用流动相X(其为乙腈溶液，例如浓度为1%-10%的乙腈水溶液，例如浓度约5%的乙腈水溶液)洗脱(例如5-180min，例如约30min)；接着用用流动相Y(其为乙腈溶液，例如浓度为10%-50%的乙腈水溶液，例如浓度约20%的乙腈水溶液)洗脱，收集主峰流出液(其中含有纯化的曲普瑞林)；接着通过冷冻干燥除去溶剂使水分含量低于7%(下文各实施例中终产物均控制水分含量在3-5%之间)。任选地，可以用流动相Z(其为乙腈溶液，例如浓度为60%-95%的乙腈水溶液，例如浓度约80%的乙腈水溶液)对柱子平衡(例如5-50min)以使柱子活化，以用于下一批次纯化工艺。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(c)中，所述硅胶是十八烷基硅烷键合硅胶。在一个实施方案中，所述硅胶柱是制备型的硅胶柱；在一个实施方案中，所述硅胶柱规格可以为10*250mm、20*250mm、30*250mm、50*250mm、100*250mm、150*250mm、300*250mm、或450*250mm。在一个实施方案中，所述硅胶粒径为：5～15微米，例如10微米。硅胶柱的规格是本领域技术人员根据具体操作需求而可以容易地选择地，在下文中，如未特别说明，所用的硅胶柱为50*250mm，粒径10微米的Lichrospher RP-18色谱柱(德国产)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，进行最终的色谱洗脱纯化时，由于最终纯化步骤中使用到乙腈，因此本发明终产物中可能残余有微量的乙腈，控制乙腈的量是有必要的，通过减压干燥或真空干燥或者冷冻干燥是可以容易地除去乙腈的，或者可以容易地除去乙腈以使乙腈量降低到0.04%以下(可照气相色谱法测定)。本发明后文各实施例所得精制醋酸曲普瑞林中中，乙腈含量均低于0.03%。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种曲普瑞林，其中乙腈含量低于0.03%。

进一步地，本发明第二方面提供了一种曲普瑞林的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：

(a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；

(b)将步骤(a)所得滤液加载到离子交换柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；

(c)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(a)中，所述待纯化的曲普瑞林可以是如本发明合成的曲普瑞林，亦可以是其它固相合成法合成得到的曲普瑞林(例如可以是CN101357936A说明书第8页至第10页第1行所得曲普瑞林或者进一步地是说明书第10页第6行所得曲普瑞林；例如可以是US4010125实施例1和2所得曲普瑞林)，还可以是液相法合成得到的曲普瑞林(例如可以是孙永强文献(孙永强、钱明霞、严益民、冯晓晖、蒋伟，曲普瑞林的液相合成，中国医药工业杂志，2012，43(7)：532)中步骤2.2或者步骤2.3所得曲普瑞林)，此外该曲普瑞林可以是十肽本身，亦可以是其盐例如醋酸盐。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(a)中，所述溶剂为醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为2-20%(v/v)的醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为5%的醋酸水溶液。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(a)中，溶解曲普瑞林所得溶液中曲普瑞林的浓度为0.1-10%(w/v)，例如浓度为1-5%(w/v)。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，所述的离子交换柱为阳离子交换柱(例如但不限于Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N、Shodex Asahipak ES-502C7C、SP Sepharose HP、SP Sepharose FF、S Sepharose FF和DEAE Sepharose FF、D001(或D301)大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D113大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、001×7(732)凝胶强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、7320阳离子交换树脂、001×7MB阳离子交换树脂)或阴离子交换柱(例如国产D201、D231、DK251、731、或290型阴离子交换树脂，美国Amberlite IRA-900型阴离子交换树脂，德国Lewatit MP-500型阴离子交换树脂，日本Diaion PA308型阴离子交换树脂，TOSOH TSK–GEL DEAE-5PW、Chrompack IonoSpher A)或其组合使用；优选的离子交换柱为阴离子交换柱。优选的离子交换柱是基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交换柱，例如Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，它们可以容易地从商业途径获得，例如得自北京谱朋科技有限公司。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，先用酸性溶液平衡柱子，再将样品加载到柱子上，然后再依次用碱性溶液、酸性溶液和盐溶液洗脱柱子，收集盐溶液洗脱所得的主峰流出液(其中含有初步纯化的曲普瑞林)。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，所述的离子交换柱预先用酸性溶液(其可称为流动相A)洗脱并使柱子平衡(由此可以活化柱子)；在一个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是醋酸溶液；在一个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为0.1%-1%的醋酸溶液；在一个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为约0.5%的醋酸溶液。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，曲普瑞林加载到离子交换树脂中的加载量可以是根据经验确定的，特别是曲普瑞林与离子交换树脂的比率为10～200：1(mg:ml)；特别是50～100：1(mg:ml)；在下文实例中如未特别注明，是50mg：1ml。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，将曲普瑞林加载到离子交换柱上后，用碱性溶液(其可称为流动相B)洗脱(至直使流出液的pH恒定)。在一个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在一个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为5-50mmol/L的氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在一个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为约20mmol/L的氢氧化钠溶液。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，用碱性溶液(其可称为流动相B)洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用酸性溶液(流动相A)洗脱至直使流出液的pH恒定。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，用酸性溶液(流动相A)洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用盐溶液(其可称为流动相C)洗脱，收集主峰流出液(其中含有转化成盐型的曲普瑞林)。在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是氯化钠、碳酸钠、醋酸钠、醋酸铵、或磷酸二氢钾的水溶液；在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)的浓度是50-1000mmol/L；在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是0.7mol/L氯化钠溶液。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(c)中，将步骤(b)中所得收集转化成盐型的曲普瑞林主峰流出液用乙腈稀释(例如可以稀释至乙腈浓度达1%-10%，例如约5%)；将该稀释液加载到硅胶柱上，用流动相X(其为乙腈溶液，例如浓度为1%-10%的乙腈水溶液，例如浓度约5%的乙腈水溶液)洗脱(例如5-180min，例如约30min)；接着用流动相Y(其为乙腈溶液，例如浓度为10%-50%的乙腈水溶液，例如浓度约20%的乙腈水溶液)洗脱，收集主峰流出液(其中含有纯化的曲普瑞林)；接着通过冷冻干燥除去溶剂使水分含量低于7%(下文各实施例中终产物均控制水分含量在3-5%之间)。任选地，可以用流动相Z(其为乙腈溶液，例如浓度为60%-95%的乙腈水溶液，例如浓度约80%的乙腈水溶液)对柱子平衡(例如5-50min)以使柱子活化，以用于下一批次纯化工艺。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(c)中，所述硅胶是十八烷基硅烷键合硅胶。在一个实施方案中，所述硅胶柱是制备型的硅胶柱；在一个实施方案中，所述硅胶柱规格可以为10*250mm、20*250mm、30*250mm、50*250mm、100*250mm、150*250mm、300*250mm、或450*250mm。在一个实施方案中，所述硅胶粒径为：5～15微米，例如10微米。硅胶柱的规格是本领域技术人员根据具体操作需求而可以容易地选择地，在下文中，如未特别说明，所用的硅胶柱为50*250mm，粒径10微米的Lichrospher RP-18色谱柱(德国产)。

根据本发明第二方面的纯化方法，其中进行最终的色谱洗脱纯化时，由于最终纯化步骤中使用到乙腈，因此本发明终产物中可能残余有微量的乙腈，控制乙腈的量是有必要的，通过减压干燥或真空干燥或者冷冻干燥是可以容易地除去乙腈的，或者可以容易地除去乙腈以使乙腈量降低到0.04%以下(可照气相色谱法测定)。本发明后文各实施例所得精制醋酸曲普瑞林中中，乙腈含量均低于0.03%。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种曲普瑞林，其中乙腈含量低于0.03%。

进一步地，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一项所述方法获得的曲普瑞林；或者本发明第三方面提供了本发明第二方面任一项所述方法获得的曲普瑞林。本发明的曲普瑞林具有纯度高的特点。

在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.2%。在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%。在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，其中D-Arg相对于全部精氨酸而言均小于0.2%，优选小于0.15。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种曲普瑞林，其中乙腈含量低于0.03%。

在本发明中，可以对获得的曲普瑞林进行氨基酸组成检测，检测方法如下：取曲普瑞林5mg，置硬质安瓿瓶中，加6mol/L盐酸溶液5ml，充氮后封口，于110℃下反应24小时，冷却，启封，水浴蒸发至近干，加水溶解至适当浓度，作为供试品溶液；另取甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丝氨酸各对照品，制成与供试品中各氨基酸浓度相当的溶液，作为对照品溶液；用氨基酸分析方法，以各氨基酸总摩尔数的八分之一作为1，计算各氨基酸的相对比值。通常而言，曲普瑞林的上述8种氨基酸的相对比值均应为1.0左右，并且通常在0.8～1.2之间，常规药用要求的曲普瑞林原料药的上述8种氨基酸的相对比值均应在0.85～1.15之间。本发明人出人意料地发现，在纯化工艺中使用特定的离子交换柱等纯化条件，终产物中甘氨酸的相对比值趋近于1，在0.9～1.1之间。由此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种曲普瑞林，其中甘氨酸的相对比值在0.9～1.1之间。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中，使用的氨基酸如未特别标示其构型时，均指-L型氨基酸。

在本发明中，使用到如下的一些Fmoc保护或未保护的氨基酸作为起始原料：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp(boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-trp(boc)-OH、Fmoc-L-His(trt)-OH、H-Pyr-OH。在本发明中还使用到Rink-amide MBHA树脂作为载体，其取代量为0.84mmol/g，在标示树脂投料量时均有类似含义；如果直接以摩尔量标示树脂投料量，表示所加入的树脂的取代量，以摩尔(mol)或者毫摩尔(mmol)计。

固相多肽合成中一般需要将α-氨基以及侧链活性基团保护起来。目前使用比较多的α-氨基保护基为：叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)两种。Boc基团需要反复采用50%的三氟乙酸(TFA)来脱除，肽树脂切割一般采用氢氟酸(HF)，对环境以及实验设备都有较高的要求，而Fmoc基团可以使用哌啶轻易地脱除，切割采用TFA，与Boc法相比，具有反应条件温和、合成效率高以及切割条件温和等优点，逐渐取代了Boc基团而成为目前固相多肽合成的首选α-氨基保护基。在本发明中使用经Fmoc保护的氨基酸。

酰胺键形成促进剂例如但不限于：HOAT(CAS No.39968-33-7)、HOBT(1-Hydroxybenzotriazole)、6-Cl-HOBt(6-Chloro-1-Hydroxy-1H-Benzotriazole)、或其组合。

有机碱例如但不限于：NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其组合。

本发明需要解决的技术问题是公开一种固相合成曲普瑞林的合成方法以及纯化工艺，解决目前现有的技术存在的上述缺陷。

本发明固相合成曲普瑞林的方法大体上包括如下步骤：

(1)以rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂或knorr树脂(这些树脂是容易从商业途径购得的)为起始原料，用固相合成的方法按照曲普瑞林氨基酸序列依次连接保护氨基酸，最后得到氨基酸侧链被保护的多肽；

(2)用切割液将氨基酸的侧链保护基及多肽从树脂上同时切割下来，用乙醚沉淀洗涤后，获得粗品；

(3)将粗品用醋酸水溶液溶解，依次经过离子交换柱和C18反相柱，冻干后，得到曲普瑞林(其为符合国家药典标准的曲普瑞林原料药产品)。

在本发明的上下文中，对脱帽反应或者肽偶联反应进行反应程度检测时，如未另外说明，均是采用如下方式的茚三酮检测法进行：

1、脱帽反应程度检测法：每次用小试管取大约0.5-1mg树脂，用乙醇洗涤后，往试管中依次加入4滴缓冲液(20mg苯酚溶于50m1乙醇+25ml吡啶)，1滴Vc-乙醇溶液(4×10^-5mol/L)，2滴茚三酮溶液(500mg茚三酮溶于10m1乙醇，50g/L)，用超声波进行脱氨处理。然后在沸水浴中加热5min，观察树脂及试管中溶液的颜色，进而判断反应的进行程度；若显蓝色则反应完全，若不显蓝色则反应不完全需重新进行此步。

2、肽偶联反应程度检测试剂：(1)1g茚三酮，溶于10-50ml无水乙醇；(2)3.2g苯酚，溶于1-20ml无水乙醇；(3)0.4ml KCN储液(0.01M KCN)，溶于19.6ml吡啶。

3、肽偶联反应程度检测方法：在待检测的经肽偶联反应的树脂中，将上述三种试剂按1：1：1比例依次各滴加2滴，通过颜色观察来判断反应是否完全，此法灵敏度达到99%以上。若溶液及树脂为黄色，则表明树脂上无残留－NH₂；若溶液及树脂为紫色、淡蓝色或蓝色，则表明树脂上仍有残留的－NH₂，颜色越深，表明残留的-NH₂越多，肽的耦联反应越不完全，需延长反应时间。

按照本发明，所说的依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法，包括如下步骤：Fmoc-Gly-树脂的制备、Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Tyr(Tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Gly-树脂的制备包括以下步骤：称取一定量树脂(0.3-1.2mmol/g)于反应柱中，然后加入二氯甲烷，振荡并浸泡20-90分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。加入脱帽试剂室温下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Gly-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。上述DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU表示一种或者多种组合使用作为肽偶联剂；HOBT/HOAT表示一种或者两种作为酰胺键形成促进剂，即其中“/”如未另外特别说明，表示“和或者或”的关系。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Pro-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Leu-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-D-Trp(Boc)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Tyr(Tbu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Tyr(Tbu)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Ser(Tbu)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Trp(Boc)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-His(Trt)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤：向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取H-Pyr-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、HOBT/HOAT适量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5～5：1，优选3～5：1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1：1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5)；上述反应温度可以为：5-70℃；上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为：保护氨基酸：DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU：HOBT/HOAT：DIEA/NMM=1：1-3：1-3：2-6。

在本发明方法的一个实施方案中，用切割液将氨基酸的侧链保护基及十肽从树脂上同时切割下来包括如下步骤：将上述步骤中获得的H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂加入预冷的切割液(零下20℃至零上10℃)，在一定温度下反应1-10小时(例如1-5小时，例如约3小时)。减压除去切割液，加入大量乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗涤数次(例如4-10次)，真空干燥，获得曲普瑞林粗品。所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H₂O。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H₂O=50-98:1-10:1-10:0.1-5。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H₂O=90-98:1-5:1-5:0.5-2。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为：TFA:TIS:EDT:H₂O=95:2:2:1。

在本发明方法的一个实施方案中，对获得的曲普瑞林粗品进行纯化的过程包括如下步骤：将切肽步骤中得到的干燥的曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，过滤，滤液经过离子交换柱，收集流出主峰，然后再经过C18(例如5μm)反相柱纯化，收集主峰，合并合格溶液，冻干。获得曲普瑞林精制品，可作为曲普瑞林的原料药。纯化的工艺细节如本发明上、下文所述。

在本发明中，测定氨基酸与树脂之间的偶联率可以采用重量法和比色法两种方法测定。特别是，如未另外说明，本发明上下文中测定氨基酸(特别是第一个氨基酸甘氨酸)与树脂之间的偶联率采用如下步骤所示比色法进行：

采用比色法的根据是脱保护的氨基酸暴露出来的氨基基团可以和专门的检测试剂发生颜色反应，这个反应是定量的，颜色的深浅和氨基基团的数量成正比。颜色的深浅可以用分光光度计测量，据此可以计算出来偶联率的数值。

准确称取2-4毫克的连接了第一个氨基酸的树脂，放入EP管中，加入2-3滴冰乙酸和1毫升甲醇，洗涤后用1毫升甲醇洗涤3次。然后冻干，准确称重。加入偶联率检验专用试剂250微升，同时制空白。沸水浴反应5min，其间振荡2-3次。取出来后立即加入2.8毫升乙醇至总体积为3毫升。充分摇匀，然后用乙醇扫基线，在570nm处测定样品和空白的吸光度。按照下列公式计算：

(-NH₂ mmol/g)=[(样品—空白)×体积(ml)×10⁶]/(15000×样品重量)

偶联率=1-[(-NH₂mmol/g)/(l000×理论交换当量)]

在本发明中，可以通过测定曲普瑞林的氨基酸光学纯来考察产品的品质。曲普瑞林肽链中的十个肽中，有两个Trp氨基酸，其中一个是D-构型，而另一个Trp以及其它8个氨基酸均为L-型。在本发明中，如未另外说明，曲普瑞林氨基酸光学纯检测方法如下：对经纯化的曲普瑞林水解后，经CAT GmbH&Co.Chromatographie Und Analysentechnik KG光学纯检测各手性氨基酸的光学纯。测定本发明实施例1所得曲普瑞林精制品，结果显示除Trp外，其它8个L-氨基酸光学纯度均大于99.5%，这8个氨基酸的D-型对映体的比例均小于0.2%(D-Pro和D-His在0.14～0.18%之间，其它6个氨基酸的D-型对映体的比例均小于0.13%)%；并且对于精氨酸而言，其中D-型对映体的比例小于0.1%。

本发明设计的技术路线具有以下特点：操作简单化，适合大规模生产，原料得到方便，收率高，成本低，生产周期短，质量稳定，所得样品符合国家药典中规定的曲普瑞林原料药的各项检测标准。极具有市场竞争力。

在本发明中，使用到的一些试剂或原材料，它们的名称、来源等信息列举如下：

实施例与前述过程中所采用的原料列表如下：

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。在下面的例子中。下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明主张的保护范围。

实施例1：制备曲普瑞林

步骤1：Fmoc-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

10g的Rink AmidMBHA树脂(0.84mmol/g)，9.51g的Fmoc-Gly-OH；

氨基酸(在本步骤中为Fmoc-Gly-OH)：肽偶联剂HBTU：酰胺键形成促进剂(HOAT和HOBT以摩尔比1：2混合使用)：有机碱DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。溶剂用量根据经验和具体操作掌握，例如10g树脂中清洗、脱帽反应、偶联反应中溶剂用量为50～150ml，特别是在清洗时每次尽量用尽量少的溶剂，后面的步骤亦可参考本步骤1的溶剂用量进行。

(2)操作：准确称取10g Rink AmidMBHA树脂(0.84mmol/g)于反应器中，然后加入二氯甲烷100ml，振荡并浸泡60分钟，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液(100ml)室温下振荡进行脱帽反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂(1～3mg)利用茚三酮反应检测，显蓝色；若不显蓝色，则需重新进行此步。

称取9.51g的Fmoc-Gly-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应1小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

本步骤1所得Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.89。该Fmoc-Gly-树脂用于后续的反应步骤。

在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：3混合使用，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.92。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：1混合使用，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.77。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：4混合使用，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.79。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOAT，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.71。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤1，不同的是使用酰胺键形成促进剂为HOBT，得到的Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.74。在一个补充的试验步骤中，参照CN101357936A说明书第8页第1-7行记载的方法制备Fmoc-Gly-树脂，经检测，偶联率达0.78。可见，在本步骤1中，使用酰胺键形成促进剂为HOAT和HOBT以摩尔比1：2-3混合使用时，产物的偶联率明显高于单独用一种偶联剂。

步骤2：Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

在本实施例的本步骤2以及后续的各步骤中，上一步骤所得树脂全部投料到下一步骤；并且使用的肽偶联剂为HBTU，酰胺键形成促进剂为HOBT：有机碱为DIEA。

本步骤中，氨基酸(Fmoc-Pro-OH)：HBTU：HOBT：DIEA =1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测(在本发明中亦称为KT检测)，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取10.8g的Fmoc-Pro-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应2小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

步骤3：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA =1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取20.76g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、乳酸(相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.2倍)、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应2小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。本操作步骤获得的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续的步骤。本实施例1最终所得精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%，特别是结果显示D-Arg相对于全部精氨酸的量而言的含量为0.07%。

在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是加入相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.3倍的乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.09%。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是加入相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.5倍的乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.23%。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是加入相当于Fmoc-Arg(Pbf)-OH摩尔量的0.1倍的乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.21%。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤3，不同的是不加乳酸，所得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂继续用于后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.34%。在一个补充的试验步骤中，参照CN101357936A说明书第8页第15-21行记载的方法制备Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂，其继续用于本实施例后续步骤而获得的精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，结果显示D-Arg的含量为0.31%。可见，在本步骤3中，在肽偶联反应中添加适量乳酸有助于更好品质的曲普瑞林。

步骤4：Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(Fmoc-Leu-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取11.31g的Fmoc-Leu-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应2.5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

步骤5：Fmoc-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(Fmoc-D-Trp(Boc)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取16.85g的Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应3小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

步骤6：Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取17.4g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应3小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

步骤7：Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取12.27g的Fmoc-Ser(tBu)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应4小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

步骤8：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂 的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(Fmoc-Trp(Boc)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取16.85g的Fmoc-Trp(Boc)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

步骤9：Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro- Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(Fmoc-His(Trt)-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取19.83g的Fmoc-His(Trt)-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应5小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。

步骤10：H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pr o-Gly-树脂的制备

(1)原辅料配比

本步骤中，氨基酸(H-Pyr-OH)：HBTU：HOBT：DIEA=1：1：1：4(摩尔比)。

(2)操作：加入20%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温下振荡反应60分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮反应检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取4.14g的H-Pyr-OH、HBTU、HOBT，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入DIEA，搅拌混匀后，倒入反应器中，室温振荡反应6小时。抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。KT检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间，接肽反应结束后，放入真空干燥器内干燥过夜，称重，得保护的十肽树脂。

步骤11：、肽链的裂解

将上一步骤所得树脂转移到500ml圆底烧瓶中，加入100ml预冷切割液(95%三氟乙酸/2%TIS/2%EDT/1%水)，室温搅拌反应3小时。抽滤以将树脂与滤液分离，用20ml三氟乙酸洗涤树脂2次，然后将滤液与洗涤液合并。然后加入冰冻乙醚1000ml，离心将沉淀与乙醚分离，将沉淀用5%醋酸溶解冷冻干燥后得醋酸曲普瑞林粗品。

步骤12：精制纯化

(i)样品处理：将上一步骤所得冻干的醋酸曲普瑞林粗品溶于5%醋酸(可缩写为HAc)，超声处理使样品完全溶解，得到醋酸曲普瑞林浓度为30mg/ml的溶液，溶解后用0.45微米滤膜过滤，收集滤液，4℃放置备用。

(ii)预处理并转盐：用流动相A(0.5%醋酸溶液)活化离子交换色谱柱(Shodex IEC SP-420N，北京谱朋公司)，至pH检测恒定。将溶解后的曲普瑞林粗品溶液经过离子交换柱，直至样品全部上完，粗品质量(mg)与离子交换树脂体积(ml)比为50:1。用流动相B(20mmol/L氢氧化钠溶液)洗涤树脂，直至pH由酸性变为碱性并维持pH恒定。然后用流动相A洗涤树脂，直至pH由碱性变为酸性并维持pH恒定。用流动相C(0.7mol/L氯化钠溶液)洗涤树脂，收集主峰。即为粗品溶液预处理并转盐后的溶液。

(iii)硅胶柱纯化：将上步骤中所得溶液加入乙腈调至乙腈浓度达5%；将该稀释液加载到硅胶柱(Lichrospher RP-18色谱柱，其预先用80%乙腈溶液活化)上，用流动相X(其为5%的乙腈水溶液)洗脱(30min)；接着用流动相Y(其为20%的乙腈水溶液)洗脱(流速10ml/min)，收集主峰流出液(其中含有纯化的曲普瑞林；使用280nm紫外检测监控，在离子交换柱洗脱中亦可使用UV280nm监控)。

(iv)冷冻干燥：将收集所得主峰流动相浓缩后，用冷冻干燥机冻干，冷冻干燥后得醋酸曲普瑞林精制品。以上12个步骤经计算总收率达27.6%(以步骤1中10g树脂投料量计)。

本实施例获得的醋酸曲普瑞林精制品，其经现行上市醋酸曲普瑞林原料药的药品标准测定，完全符合该标准的规定。例如其按无水、无醋酸物计，含C64H82N18O13为99.92%；按无水、无醋酸物计，比旋度为-69.2°；测定甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸八种氨基酸组成，以各氨基酸总摩尔数的八分之一作为1，计算各氨基酸的相对比值，甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸均在0.95～1.05之间，甘氨酸为0.98。步骤(i)至(iv)精制纯化过程收率87.7%(在本发明中可简称为“纯化收率”)。

杂质色谱含量：单杂0.07%，总杂0.23%。色谱杂质测定方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.01mol/L磷酸溶液-乙腈(30:70)为流动相，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，理论板数按曲普瑞林峰计算不低于3000；取本品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成份峰保留时间的2.5倍；计算最大的单一杂质的峰面积占总峰面积的百分数(简称单杂，以%表示)和各杂质峰面积的总和占总峰面积的百分数(简称总杂，以%表示)。单杂和总杂越低则产品品质越好。

【纯化操作的增补试验例部分】

基本上参考以上“步骤12：精制纯化”中步骤(i)至(iv)进行，操作的不同之处在以下增补试验例中描述。

【增补试验例1】

照以上“步骤12：精制纯化”进行，不同的是换用下列离子交换填料的柱子，得到相应批次(Z1-01至Z1-11)的曲普瑞林纯品：No-01：Shodex IEC CM-825、No-02：Shodex IEC SP-825、No-03：Shodex Asahipak ES-502C7C、No-04：SP Sepharose HP、No-05：SP Sepharose FF、No-06：DEAE Sepharose FF、No-07：D001、No-08：D113、No-09：001×7、No-10：Amberlite IRA-900、No-11：Chrompack IonoSpherA。

使用不同填料的离子交换柱进行纯化，产品收率以及产品的一些性质测定结果如下表1。

表1

结果显示，使用基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交换柱时收率高，色谱纯度在99.6%以上，杂质含量低。

【增补试验例2】

照以上“步骤12：精制纯化”进行，不同的是在步骤(ii)中用氢氧化钠溶液洗脱时，将氢氧化钠溶液替换为2、5、10、30、50、100、或250mmol/L，得到7个批次的产品。纯化收率方面，5～50mmol/L氢氧化钠溶液批次的收率在85～90%之间，而2、100、或250mmol/L氢氧化钠溶液批次的收率低于76%。单杂方面，5～50mmol/L氢氧化钠溶液批次的单杂均小于0.25%，而100～250mmol/L氢氧化钠溶液批次的单杂分别为0.63%和0.91%。总杂方面，5～50mmol/L氢氧化钠溶液批次的总杂均小于0.6%，而100～250mmol/L氢氧化钠溶液批次的总杂分别为1.47%和1.89%。5～50mmol/L氢氧化钠溶液批次的甘氨酸相对比值均在0.95～1.05之间，而100～250mmol/L氢氧化钠溶液批次的甘氨酸相对比值分别为1.19和1.28。

【增补试验例3】

用上文“步骤11：、肽链的裂解”所得曲普瑞林粗品，分别照以下方法纯化：纯化法1：照孙永强文献(中国医药工业杂志，2012，43(7)：532)中的“2.3分离纯化、冻干。”纯化法2：照CN101357936A说明书第8页至第10页第2-6行方法。纯化法3：照US4010125实施例2第2-3段方法。结果显示，三种纯化法的收率在71-76%之间，单杂在0.26～0.61%之间，总杂在0.87～1.26%之间，甘氨酸相对比值均在0.83～0.92之间。

【增补试验例4】

照文献方法制备三种曲普瑞林粗品。粗品1：使用孙永强文献(中国医药工业杂志，2012，43(7)：532)中的“2.1液相合成步骤”至“2.2粗品的制备”得到。粗品2：照CN101357936A说明书第8页至第10页第1行方法。粗品3：照US4010125实施例1和实施例2第1段方法。

将以上三种粗品照本发明上文“步骤12：精制纯化”中步骤(i)至(iv)进行，结果显示三种样品经纯化的收率在86-89%之间，单杂在0.09～0.18%之间，总杂在0.26～0.35%之间，8种氨基酸相对比值均在0.95～1.05之间。表明本发明纯化方法适用于不同来源的曲普瑞林粗品。

实施例2：制备曲普瑞林

照实施例1的方法进行，不同的仅是使用rink amide am树脂。

结果显示，在步骤1中偶联率为0.89；12个步骤总收率达26.9%；按无水、无醋酸物计，含C64H82N18O13为99.87%；按无水、无醋酸物计，比旋度为-70.1°；测定甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸八种氨基酸组成，以各氨基酸总摩尔数的八分之一作为1，计算各氨基酸的相对比值，甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸均在0.95～1.05之间，丝氨酸为0.97。

精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%。

实施例3：制备曲普瑞林

照实施例1的方法进行，不同的仅是将其中的HBTU替换为HATU，将其中的DIEA替换为NMM。

结果显示，在步骤1中偶联率为0.90；12个步骤总收率达27.5%；精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.13%；各项检测项目符合质量标准规定。

发明人在补充的试验中，参照CN101357936A说明书第8页第1行至说明书第10页第6行详细记载的方法制备曲普瑞林。结果显示，在第一步骤进行偶联反应制备Fmoc-Gly-树脂中，所得Fmoc-Gly-树脂偶联率仅0.78；总收率达25.3%；精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try和Arg以外，其它6个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均在0.13%～0.22%之间，而D-Arg相对于全部Arg而言的含量达0.34%。

实施例4：制备曲普瑞林

照实施例1的方法进行，不同的仅是将其中的HBTU替换为HCTU。

结果显示，在步骤1中偶联率为0.91；12个步骤总收率达26.6%；

精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.14%；

各项检测项目符合质量标准规定。

实施例5：制备曲普瑞林

照实施例1的方法进行，不同的仅是在各肽偶联反应步骤中，氨基酸：肽偶联剂：酰胺键形成促进剂：有机碱=1：2：2：2(摩尔比)。

结果显示，在步骤1中偶联率为0.89；12个步骤总收率达26.5%；

精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%；

各项检测项目符合质量标准规定。

实施例6：制备曲普瑞林

照实施例1的方法进行，不同的仅是在步骤1中改变Fmoc-Gly-OH的投料，使树脂与Fmoc-Gly-OH二者的摩尔比为1：2.5或者1：5，得到两批试样。

结果显示，在步骤1中偶联率为0.89或0.92；12个步骤总收率达27.6%或27.2%；

精制曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0.15%；

对于以上实施例1-6制备得到的本发明高纯度的曲普瑞林，它们在“步骤12：精制纯化”中步骤(i)至(iv)纯化收率均在86-90%之间，单杂在0.07～0.25%之间，总杂在0.25～0.4%之间，8种氨基酸相对比值均在0.94～1.06之间；各样品色谱纯度和含量均大于99.65%。并且各项检测项目符合质量标准规定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当至出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和修饰也应该视为本发明的保护范围。

Claims (16)

1.曲普瑞林的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：

(a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；

(b)将步骤(a)所得滤液加载到选自下列的离子交换柱上：Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，依次用碱性溶液、酸性溶液和盐溶液洗脱柱子，收集盐溶液洗脱所得的主峰流出液，其中所述碱性溶液是5-50mmol/L氢氧化钠溶液；

(c)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。

2.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，其中步骤(a)中：

所述溶剂为2-20%(v/v)的醋酸水溶液；和/或

溶解曲普瑞林所得溶液中曲普瑞林的浓度为0.1-10%(w/v)。

3.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，其中步骤(b)中，洗脱过程中，先用酸性溶液平衡柱子，再将样品加载到柱子上。

4.根据权利要求3的纯化方法，其中，所述酸性溶液是2-20%醋酸溶液。

5.根据权利要求1的纯化方法，其中步骤(b)中，曲普瑞林加载到离子交换树脂中的加载量是曲普瑞林与离子交换树脂的比率为10～200：1(mg:ml)。

6.根据权利要求1的纯化方法，其中步骤(b)中，用碱性溶液洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用2-20%醋酸溶液洗脱至直使流出液的pH恒定。

7.根据权利要求1的纯化方法，其中步骤(b)中，用酸性溶液洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用氯化钠溶液洗脱，收集主峰流出液。

8.根据权利要求1的纯化方法，其中步骤(c)中，将步骤(b)中所得收集转化成盐型的曲普瑞林主峰流出液用乙腈稀释；将该稀释液加载到硅胶柱上，用流动相X即浓度为1%-10%的乙腈水溶液洗脱；接着用流动相Y即浓度为10%-50%的乙腈水溶液洗脱，收集主峰流出液；接着通过冷冻干燥除去溶剂使水分含量低于7%，得到纯化的曲普瑞林。

9.根据权利要求8的纯化方法，其特征在于，其中步骤(c)中，所述硅胶是十八烷基硅烷键合硅胶。

10.固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步骤：

(1)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Gly-树脂；

(2)向上一步骤所得的肽偶合树脂中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；

(3)循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸Fmoc-Pro-OH：Fmoc-L-Arg(pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp(boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-trp(boc)-OH、Fmoc-L-His(trt)-OH和H-Pyr-OH，以最终形成十肽树脂：H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂；

(4)向步骤(3)所得十肽树脂中加入切割液进行切肽反应，以使十肽从树脂上切割下来，得到曲普瑞林；

以及，根据权利要求1-9任一项的纯化方法进行纯化以得到精制曲普瑞林。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于，步骤(1)中进行偶联反应时，酰胺键形成促进剂是HOAT和HOBT两者组合使用。

12.根据权利要求11的方法，其中HOAT和HOBT二者的用量比为1：1-4(摩尔比)。

13.根据权利要求11的方法，其中HOAT和HOBT二者的用量比为1：2-3(摩尔比)。

14.根据权利要求10的方法，其中步骤(2)和步骤(3)中进行偶联反应时，使用的酰胺键形成促进剂是HOAT。

15.根据权利要求10的方法，其中步骤(3)中，在第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-L-Arg(pbf)-OH一起加入乳酸进行反应；所述Fmoc-L-Arg(pbf)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.1-0.5。

16.根据权利要求15的方法，其中所述Fmoc-L-Arg(pbf)-OH与乳酸的摩尔比为1：0.2-0.3。