CN106543279A

CN106543279A - 一种胸腺法新合成工艺

Info

Publication number: CN106543279A
Application number: CN201610935946.6A
Authority: CN
Inventors: 刘宇
Original assignee: YUEYANG XINHUADA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: YUEYANG XINHUADA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明提供一种胸腺法新的合成工艺，属多肽固相合成领域，其特征在于：首先将AM树脂进行改造，在AM树脂上偶联2‑6个侧链保护亲水氨基酸残基，亲水性氨基酸为Lys，Arg、Glu、Asp氨基酸，然后将Rink amide Linker偶联至树脂，制备Fmoc‑ AA_n···AA₂ – AA₁‑AM树脂，延长合成多肽与树脂线性距离，增加树脂亲水性；将改造的树脂用于胸腺法新的合成，胸腺法新固相合成采用从C端至N端线性连续合成，通过控制氨基酸过量倍数和偶联时间达到最佳合成效率，肽链合成完成后最后脱Fmoc保护，乙酸酐乙酰化多肽N端，用裂解试剂裂解，乙醚沉淀获得胸腺法新。本发明方法制备的树脂在进行胸腺法新合成时表现高效，能很好的消除胸腺法新在固相合成过程中β折叠的发生。

Description

一种胸腺法新合成工艺

技术领域

本发明涉及固相多肽合成，尤其涉及一种胸腺法新的固相合成工艺。

背景技术

胸腺法新(thymalfasin)是从胸腺中分离的一个28个氨基酸残基的多肽，该多肽N端乙酰化，C端为游离羧基，分子量3108Da。胸腺法新促进骨髓干细胞分化，诱导T淋巴细胞分化成熟，研究表明，胸腺法新是胸腺肽中生物活性最强组分，是一种理想的免疫调节剂。目前胸腺法新已用于治疗慢性病毒性肝炎、肝癌以及免疫力低下等疾病治疗。

目前胸腺法新的合成方法主要采用Fmoc固相合成，其中采用羟基树脂进行合成的方法较多，如中国专利CN102199205A，采用该方法存在一定比例DKP的发生，导致产量下降，同时由于胸腺法新是困难多肽，在合成过程中形成β折叠，导致合成困难，纯度和产量均较低；中国专利CN201410105039通过在王树脂上增加0-8个氨基酸，然后连接HMPA Linker，能较好的抑制DKP的发生，提高收率。另外一种方法则采用酰氨树脂，如中国专利CN101104638A，通过偶联Fmoc-Asp-OtBu，其余氨基酸的合成和羟基树脂一致，该方法能够有效消除DKP的发生，使产率和纯度均有所提高，但由于困难序列的存在，导致合成成本高，杂质难分离等问题。

因此，本领域迫切需要提供一种简便有效的胸腺法新合成工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胸腺法新的固相合成工艺。

本发明的技术方案是：一种胸腺法新合成工艺，其特征在于：首先将AM树脂进行改造，在AM树脂上偶联2-6个侧链保护亲水氨基酸残基，亲水性氨基酸为Lys，Arg、Glu、Asp氨基酸，然后将Rink amide Linker偶联至树脂，制备Fmoc- AA_n···AA₂ – AA₁-AM树脂，延长合成多肽与树脂线性距离，增加树脂亲水性；将改造的树脂用于胸腺法新的合成，胸腺法新固相合成采用从C端至N端线性连续合成，通过控制氨基酸过量倍数和偶联时间达到最佳合成效率，肽链合成完成后最后脱Fmoc保护，乙酸酐乙酰化多肽N端，用裂解试剂裂解，乙醚沉淀获得胸腺法新。

本发明首先将AM树脂进行改造，包括如下步骤：

A）在活化剂存在下，由AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc- AA₁-AM树脂；

B）乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；

C）哌啶/DMF溶液脱保护；

D）在活化剂存在下，由Fmoc-AA₁-AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc- AA – AA₁-AM树脂；

E）重复B)C)D)步骤获得Fmoc- AA_n···AA₂ – AA₁-AM树脂；

F）乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；

G）哌啶/DMF溶液脱保护；

H）在活化剂存在下，Rink amide Linker和步骤F)所得树脂偶联获得树脂；

I）乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭，测定替代值。

本发明利用改造后的树脂进行新腺法新合成，包括如下步骤：

①改造后的树脂膨化后，20%哌啶/80%DMF溶液去保护；

②在活化剂存在下，Fmoc-Asp-OtBu与树脂偶联得到Fmoc-Asp-(树脂)-OtBu；

③其余氨基酸按照常规方法依次偶联；

④20%哌啶/80%DMF溶液去保护；

⑤乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液乙酰化；

⑥裂解采用TFA/DMB/水溶液进行裂解；

冷乙醚沉淀获得胸腺法新粗品。

作为本发明的进一步改进，所述步骤A）中，所用Rink Amide树脂替代度为0.8-1.1mmol/g。

作为本发明的进一步改进，所述步骤A）和D）中，依次偶联采用的偶联剂为DIEA/HCTU/HOBt。

作为本发明的进一步改进，所述步骤C）和G）中，每步的去Fmoc基团试剂为50%哌啶/DMF溶液。

作为本发明的进一步改进，所述步骤I）中，树脂替代度为0.05-0.5 mmol/g。

作为本发明的进一步改进，所述步骤②中，所用的Fmoc-Asp-OtBu为树脂的10倍量，偶联时间为2小时。

作为本发明的进一步改进，所述步骤③中，第8位Ser，第10位、第18位和第21位Glu，第16位Leu、第17位和第19位Lys氨基酸为树脂6倍量，偶联时间为1.5小时。

作为本发明的进一步改进，所述步骤⑥中，裂解液TFA含量90-95%，DMB含量2.5-5%，水含量2.5-5%。

采用上述技术方案，具有操作简单，成本低廉等优点，适合大规模生产。本发明方法制备的树脂在进行胸腺法新合成时表现高效，能很好的消除胸腺法新在固相合成过程中β折叠的发生。

附图说明

图1为树脂改造流程图。

图2为胸腺法新合成路线图。

图3为胸腺法新HPLC纯化图。

图4为胸腺法新合成粗品质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

AM树脂、链接剂、各种保护氨基酸以及偶联剂均购自上海吉尔生化有限公司，说明书和权利要求书中所用英文缩写的含义见下表。

实施例一 Fmoc-Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)-AM树脂的合成

称取替代值1.1 mmol/g AM树脂10克，DMF膨化30分钟，抽干，称取44 mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH，44 mmol HCTU和44 mmol HOBt，量取88 mmol DIEA，用60毫升DMF将氨基酸和HCTU以及HOBt溶解，滴加DIEA，混匀后冰浴冷却，活化15分钟后加入膨化好的树脂，反应12小时，茚三酮检测阴性后终止反应；配置60毫升封闭液（20 mmol乙酸酐，200mmol三乙胺溶于DMF中，定容至60毫升），加入树脂中，室温反应1小时。封闭好的树脂用50%哌啶DMF溶液去保护15分钟，DMF清洗8次，进行第二个Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联，重复偶联完成4个Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联后测定替代值，替代值为0.2 mmol/g。

实施例二 Rink amide-Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)-AM树脂的合成

实施例一制备的树脂加入20%哌啶DMF溶液去保护，去保护时间15分钟，去保护完成后DMF洗涤8次至完全干净；称取4mmol Rink amide Linker，4 mmol HCTU，量取8 mmol DIEA，用10毫升DMF将Rink amide Linker和HCTU溶解，滴加DIEA，混匀后冰浴冷却，活化15分钟后加入去保护的树脂，增加DMF至树脂完全覆盖，反应3小时，10毫升封闭液封闭30分钟，洗涤后冻干，测定替代值，替代值为0.12 mmol/g。

实施例三 Fmoc-Asp(Rink amide-Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)-AM)-OtBu的合成

称取实施例二制备的Rink amide-Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)-AM树脂8.3 g，加入20%哌啶DMF溶液去保护，去保护时间15分钟，去保护完成后DMF洗涤8次至完全干净；称取Fmoc-Asp-OtBu 4.115 g， HCTU 4.137 g，HOBt 1.35 g，加入15 ml DMF溶解，滴加3.3 ml DIEA，冰浴活化15分钟，加入准备好的树脂中偶联2小时，茚三酮试剂检测树脂为无色透明，说明反应完成，洗涤树脂。

实施例四全保护肽树脂的合成

实施例三制备的Fmoc-Asp(Rink amide-Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)- Lys(Boc)-AM)-OtBu树脂加入20%哌啶DMF溶液去保护，去保护时间15分钟，去保护完成后DMF洗涤8次至完全干净；按照胸腺法新氨基酸序列从C端向N端合成，物料比例为：树脂/氨基酸/HCTU/HOBt/DIEA=1/4/4/4/8，偶联时间为1小时。其中第8位Ser，第10位、第18位和第21位Glu，第16位Leu、第17位和第19位Lys氨基酸为树脂6倍量，偶联时间为1.5小时。

实施例五全保护肽树脂N端乙酰化

实施例四制备的全保护肽树脂加入20%哌啶DMF溶液去保护，去保护时间15分钟，去保护完成后DMF洗涤8次至完全干净；加入乙酰化溶液（5 mmol 乙酸酐，50 mmol DIEA，20 mlDMF），反应15分钟，依次用DMF洗涤，二氯甲烷洗涤，甲醇洗涤，冷冻干燥机干燥。

实施例六肽树脂裂解

配置50 ml裂解液（92.5% TFA，5% DMB，2.5%水），加入实施例五制备的树脂中，裂解反应3小时，过滤收集滤液，加入TFA洗涤树脂，收集合并，加入500 ml无水冷乙醚沉淀多肽，离心收集沉淀，乙醚洗涤，干燥，加入1%乙酸溶液溶解后进行冷冻干燥，称重获得3.01g胸腺法新粗品，粗品收率96.8%。

实施例七 HPLC

称取1 mg胸腺法新粗品，加入10 ml 含有0.1%的TFA的90%水和10%乙腈溶解，进行反相HPLC分析，色谱柱为C18柱，A液为含0.1%的TFA的水，B液为含0.1%的TFA的乙腈，进行梯度洗脱，0至30分钟B液从10%至40%，结果如图所示，胸腺法新纯度为68.1%。

实施例八 MALDI-TOF质谱分析

实施例七制备的胸腺法新进行MALDI-TOF质谱分析，基质为α-氰基,4-羟基肉桂酸，分析合成胸腺法新分子量为3108Da，与理论分子量一致，说明合成正确。

以上内容是结合优选的实施方式进行的具体说明，对于本发明所属技术领域的技术人员，在本发明的技术思路上还可以做出若干推演，都应当视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种胸腺法新合成工艺，其特征在于：首先将AM树脂进行改造，在AM树脂上偶联2-6个侧链保护亲水氨基酸残基，亲水性氨基酸为Lys，Arg、Glu、Asp氨基酸，然后将Rink amideLinker偶联至树脂，制备Fmoc- AA_n···AA₂ – AA₁-AM树脂，延长合成多肽与树脂线性距离，增加树脂亲水性；将改造的树脂用于胸腺法新的合成，胸腺法新固相合成采用从C端至N端线性连续合成，通过控制氨基酸过量倍数和偶联时间达到最佳合成效率，肽链合成完成后最后脱Fmoc保护，乙酸酐乙酰化多肽N端，用裂解试剂裂解，乙醚沉淀获得胸腺法新。

2.根据权利要求1所述的胸腺法新合成工艺，其特征在于：将AM树脂进行改造，包括如下步骤：

A)在活化剂存在下，由AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc- AA₁-AM树脂；

B)乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；

C)哌啶/DMF溶液脱保护；

D)在活化剂存在下，由Fmoc- AA₁-AM树脂和Fmoc保护氨基酸偶联得到Fmoc-AA₂ –AA₁-AM树脂；

E)重复B)C)D)步骤获得Fmoc- AA_n···AA₂ – AA₁-AM树脂；

F)乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭；

G)哌啶/DMF溶液脱保护；

H)在活化剂存在下，Rink amide Linker和步骤F)所得树脂偶联获得树脂；

I) 乙酸酐/三乙胺/二氯甲烷溶液封闭，测定替代值。

3.根据权利要求1或2所述的胸腺法新合成工艺，其特征在于：利用改造后的树脂进行胸腺法新合成，包括如下步骤：

改造后的树脂膨化后，20%哌啶/80%DMF溶液去保护；

在活化剂存在下，Fmoc-Asp-OtBu与树脂偶联得到Fmoc-Asp-(树脂)-OtBu；

其余氨基酸按照常规方法依次偶联；

20%哌啶/80%DMF溶液去保护；

乙酸酐/DIEA/DMF溶液乙酰化；

裂解采用TFA/DMB/水溶液进行裂解；

冷乙醚沉淀获得胸腺法新粗品。

4.根据权利要求2所述的胸腺法新制备方法，其特征在于：所述步骤A）中，所用AM树脂替代度为0.8-1.1 mmol/g。

5.根据权利要求2所述的胸腺法新制备方法，其特征在于：所述步骤A）和D）中，依次偶联采用的偶联剂为DIEA/HCTU/HOBt。

6.根据权利要求2所述的胸腺法新制备方法，其特征在于：所述步骤C）和G）中，每步的去Fmoc基团试剂为50%哌啶/DMF溶液。

7.根据权利要求2所述的胸腺法新制备方法，其特征在于：所述步骤I）中，树脂替代度为0.05-0.5 mmol/g。

8.根据权利要求3所述的胸腺法新制备方法，其特征在于：所述步骤②中，所用的Fmoc-Asp-OtBu为树脂的10倍量，偶联时间为2小时。

9.根据权利要求3所述的胸腺法新合成工艺，其特征在于：步骤③中，第8位Ser，第10位、第18位和第21位Glu，第16位Leu、第17位和第19位Lys氨基酸为树脂6倍量，偶联时间为1.5小时。

10.根据权利要求3所述的胸腺法新合成工艺，其特征在于：所述步骤⑥中，裂解液TFA含量90-95%，DMB含量2.5-5%，水含量2.5-5%。