JP5908478B2 - h「Gly2」GLP−2の固相合成 - Google Patents
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Description
His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-Ile31-Thr32-Asp33 (配列番号1)
(a)アミノ酸配列:X-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号2)を含む第一のペプチドフラグメントを用意し、ここでXは第一の保護基であり、第一のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結(conjugate)されており;
(b)アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントを用意し、ここでYは第二の保護基であり;
(c)第一のペプチドフラグメントから第一の保護基を除去し;そして
(d)N-末端が脱保護された、担体に担持された第一のペプチドフラグメントに、第二のペプチドフラグメントをカップリング(coupling)させる、
の各段階を含む上記方法に関する。
(a)アミノ酸配列:X-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号2)を含む第一のペプチドフラグメントをペプチド合成により用意し、ここでXはFmoc保護基であり、第一のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(b)アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントをペプチド合成により用意し、ここでYは、Boc及びベンジルオキシカルボニルからなる群から任意に選択される、酸に不安定な保護基であり、第二のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(c)担体から第二のペプチドフラグメントを切り出し;そして
(d)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーなどにより、切り出した第二のペプチドフラグメントを精製し;
(e)任意にピペリジン、ピペラジン、モルホリン及びジシクロヘキシルアミンからなる群から選択される二級アミンを加えることにより、第一のペプチドフラグメントからFmoc保護基を除去し;
(f)N-末端が脱保護された、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに、精製した第二のペプチドフラグメントを加えることにより、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに第二のペプチドフラグメントをカップリングさせ;
(g)第二のペプチドフラグメントにカップリングした、担体に連結された第一のペプチドフラグメントを担体から切り出し;そして
(h)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーなどによって、第二のペプチドフラグメントにカップリングした、切り出した、第一のペプチドフラグメントを精製する、
の各段階を含む上記方法に関する。
(a)上述のように本発明の方法に従ってペプチドを製造し;そして
(b)段階(a)で製造したペプチドを含む医薬組成物を製造する、
の各段階を含む上記方法に関する。
(a)アミノ酸配列:X-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号2)を含む第一のペプチドフラグメントを用意し、ここでXは第一の保護基であり、第一のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(b)アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントを用意し、ここでYは第二の保護基であり;
(c)第一のペプチドフラグメントから第一の保護基を除去し;そして
(d)N-末端が脱保護された、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに、第二のペプチドフラグメントをカップリングさせる、
の各段階を含む上記方法に関する。
His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-Ile31-Thr32-Asp33 (配列番号1)
を有する、一本鎖の非グリコシル化33アミノ酸ペプチドである、テヅグルチドの製造方法に関する。
を含む第一のペプチドフラグメント(ここでXは第一の保護基である)、およびアミノ酸配列:
Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)
を含む第二のペプチドフラグメント(ここでYは第二の保護基である)を含む。
(a)たとえば固相ペプチド合成により、アミノ酸配列:X-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号2)を含む第一のペプチドフラグメントをペプチド合成により用意し、ここでXはFmoc保護基であり、第一のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(b)たとえば固相ペプチド合成により、アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントをペプチド合成により用意し、ここでYは、Boc及びベンジルオキシカルボニルからなる群から任意に選択される、酸に不安定な保護基であり、第二のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(c)担体から第二のペプチドフラグメントを切り出す;及び
(d)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにより、及び/または結晶化によって、切り出した第二のペプチドフラグメントを精製し;
(e)任意にピペリジン、ピペラジン、モルホリン及びジシクロヘキシルアミンからなる群から選択される二級アミンを加えることによって、第一のペプチドフラグメントからFmoc保護基を除去し;
(f)N-末端が脱保護された、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに精製した第二のペプチドフラグメントを加えることによって、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに第二のペプチドフラグメントをカップリングさせ;
(g)第二のペプチドフラグメントにカップリングした、担体に連結された第一のペプチドフラグメントを担体から切り出し;そして
(h)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー及び/または結晶化によって、第二のペプチドフラグメントにカップリングした切り出した第一のペプチドフラグメントを精製する、
の各段階を含む。
(a)上述のように本発明の方法に従ってペプチドを製造し;そして
(b)段階(a)で製造したペプチドを含む医薬組成物を製造する、の各段階を含む上記方法に関する。
(a)上述の本発明の方法に従って製造した医薬的有用量のテヅグルチド;
(b)製剤のpHを薬学的に許容可能なレベル、特に約6.0〜約9.0、たとえば約6.5〜約8.0または約7.0〜約7.5に調節するのに十分なリン酸塩緩衝液;
(c)安定化量のアミノ酸L-ヒスチジン;及び
(d)ショ糖及びマンニトールから選択される増量剤
を含む。
(a)ペプチド約0.1〜約50mg/ml、たとえば約5〜約40mg/ml、または約7〜約30mg/ml、または約10〜約20mg/ml、または約20mg/mlを含む、上述の本発明の方法に従って製造した医学的有用量のテヅグルチド;
(b)pHを生理学的に許容しうるレベル、たとえば約5.5または6を超え、特に約6.0〜約9.0、例えば約6.5〜約8.0、または約7.0〜約7.5で保持するためのリン酸塩緩衝液;
(c)安定化アミノ酸、特にL-ヒスチジン;及び
(d)増量剤、特にマンニトール
を含むことができる。
(a)再構成された製品を約6.9〜7.9のpHに保持するのに必要な量、たとえばpH約7.3〜約7.4に保持する量のリン酸塩緩衝液;
(b)約0.5〜約1%のL-ヒスチジン;
(c)約2〜約5%のマンニトール、たとえば約2.5〜約3.5%のマンニトール、または約3%のマンニトール;及び
(d)上述の本発明の方法に従って製造したテヅグルチドを約0.1〜約50mg/ml、たとえば約5〜約40mg/ml、または約7〜約30mg/ml、または約10〜約20mg/ml、または約20mg/ml
を含む凍結乾燥製剤であってもよい。
(a)上述の本発明の方法に従って製造したテヅグルチド約7〜約30mg/ml、たとえば約10〜約20mg/ml、または約20mg/ml;
(b)pHを約7.3〜約7.4に保持するのに十分なリン酸塩緩衝液;
(c)約0.5〜約1%L-ヒスチジン;及び
(d)約3%マンニトール
を含む凍結乾燥組成物であってもよい。
(a)本発明の方法に従ってペプチドを製造し;
(b)本発明の方法に従って組成物を製造し;
(c)組成物を約−40℃に凍結し;
(d)第一の乾燥段階を約−20℃で実施し;そして
(e)第二の乾燥段階を+20℃で実施する。
(a)上述の本発明の方法に従って製造したテヅグルチド;
(b)再構築した生成物を約6.9〜約7.9のpH、たとえば約7.3〜約7.4のpHに保持するための35mMリン酸塩緩衝液;
(c)約0.5〜約1%のL-ヒスチジン;及び
(d)約3%のマンニトール
を含む。
H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH(配列番号1)
1.Fmoc-Asp(OBut)-OH(1.235g,3mmol)(Fmoc=9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)及びジイソプロピルカルボジイミド(0.623g,4mmol)(DIC)を、N,N-ジメチルホルムアミド(15cm3)(DMF)中の4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸-ジメチルアクリルアミドポリマー担体(1g,1mmol)に加え、続いて4-ジメチルアミノピリジン(0.012g,0.1mmol)(DMAP)を加えた。このエステル化を1時間進行させた。ポリマー担体をDMF(10×10cm3)で洗浄し、反応を繰り返した。ポリマー担体を再びDMF(10×10cm3)で洗浄した。
二つの完全にアセンブリされたテヅグルチド-ポリマー担体サンプルは、それぞれジクロロメタンで十分に洗浄し、トリイソプロピルシラン(5%v/v)(TIPS)を含むトリフルオロ酢酸(TFA)を加えて切り出しを実施した。
保護化テトラペプチドは、ジクロロメタン中のTFA(1%v/v,6×10cm3)を使用してクロロトリチル-ポリスチレンポリマー担体から切り出した。TFA/ジクロロメタンの各部分は、メタノール中のピリジン(2%v/v,40cm3)に加えて酸を中和した。
Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OBut)-Gly-OHは、以下の条件を使用して、Luna C18逆相カラム(15μm,5cm直径×25cm)で精製した。
緩衝液A=水。
緩衝液B=MeCN。
勾配:20〜40%Bを60分で、続いて40〜90%Bを60分で。
波長:230nm。
精製したBoc-His(Trt)-Gly-Asp(OBut)-Gly-OHは、Fmoc-アミノ酸カップリングに関して上述したTBTUを使用する標準的カップリング手順を適用して、55μmolスケールで、5位で切り取られたペプチド-ポリマー担体にカップリングさせた。
粗ペプチドの三バッチ分を、以下の条件を使用してVydac C18カラム(5μm,4.6mm×250mm)の逆相HPLCにより分析した。
緩衝液A=0.1%v/v TFA/水。
緩衝液B=0.1%v/v TFA/MeCN。
勾配液:1〜99%B、20分で。
波長:230nm。
全テヅグルチド分子は、上述のFmoc-固相プロトコルを使用してアセンブリした。アセンブリした粗ペプチドの純度は、HPLCにより52%であり、24%のβ-Asp類似体を含んでいた(図1を参照)。
(a)アミノ酸配列:X-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号2)を含む第一のペプチドフラグメントを用意し、ここでXは第一の保護基であり、第一のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(b)アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントを用意し、ここでYは第二の保護基であり;
(c)第一のペプチドフラグメントから第一の保護基を除去し;そして
(d)N-末端が脱保護された、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに第二のペプチドフラグメントをカップリングさせる、
の各段階を含む上記方法。
(b)アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントをペプチド合成により用意し、ここでYは、Boc及びベンジルオキシカルボニルからなる群から任意に選択される酸に不安定な保護基であり、第二のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(c)担体から第二のペプチドフラグメントを切り出し;そして
(d)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーにより、切り出した第二のペプチドフラグメントを精製し;
(e)任意にピペリジン、ピペラジン、モルホリン及びジシクロヘキシルアミンからなる群から選択される二級アミンを加えることによって、第一のペプチドフラグメントからFmoc保護基を除去し;
(f)N-末端が脱保護された、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに精製した第二のペプチドフラグメントを加えることによって、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに第二のペプチドフラグメントをカップリングさせ;
(g)第二のペプチドフラグメントにカップリングした担体に連結された第一のペプチドフラグメントを担体から切り出し;そして
(h)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーによって、第二のペプチドフラグメントに結合した、切り出した第一のペプチドフラグメントを精製する、
の各段階を含む、1〜13のいずれかの方法。
(a)1〜17のいずれかに記載の方法に従ってペプチドを製造し;そして
(b)段階(a)で製造したペプチドを含む医薬組成物を製造する、
の各段階を含む上記方法。
Claims (16)
- アミノ酸配列:His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号1)を含むペプチドを製造する方法であって、
(a)アミノ酸配列:X-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号2)を含む第一のペプチドフラグメントを用意し、ここでXは第一の保護基であり、第一のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(b)アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントを用意し、ここでYは第二の保護基であり;
(c)第一のペプチドフラグメントから第一の保護基を除去し;そして
(d)N-末端が脱保護された、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに第二のペプチドフラグメントをカップリングさせる、
の各段階を含む上記方法。 - 第一のペプチドフラグメント及び/または第二のペプチドフラグメントが固相ペプチド合成により製造され、第二のペプチドフラグメントが固相合成により製造される場合、第二のペプチドフラグメントを担体から切り出してから、N-末端が脱保護された第一のペプチドフラグメントに第二のペプチドフラグメントをカップリングさせるか、及び/または、第一のペプチドフラグメントが固相ペプチド合成により製造される場合、第二のペプチドフラグメントにカップリングされた第一のペプチドフラグメントを担体から切り出す、請求項1に記載の方法。
- 第一のペプチドフラグメント及び/または第二のペプチドフラグメントは、C-末端アミノ酸残基を担体に連結し、続いてC-末端が担体と連結された残基(単数または複数)のN-末端に適切に保護されたアミノ酸を加えることにより提供される、請求項2に記載の方法。
- C-末端が担体に連結された残基(単数または複数)のN-末端に続いて加えるべき第一のペプチドフラグメント及び/または第二のペプチドフラグメントのアミノ酸は、Boc及びFmocからなる群から選択される保護基でそれぞれ保護される、請求項3に記載の方法。
- 第一の保護基はFmocである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 第二の保護基は、酸に不安定な保護基である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 酸に不安定な保護基が、Boc及びベンジルオキシカルボニルからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 第二のペプチドフラグメントのヒスチジン残基は、トリチル、Boc、Bom及びBumからなる群から選択される保護基で側鎖において保護される、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 第二のペプチドフラグメントのアスパラギン酸酸残基は、tert-ブチルエステル保護基を用いて側鎖で保護される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- (a)アミノ酸配列:X-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号2)を含む第一のペプチドフラグメントをペプチド合成により固相合成により用意し、ここでXはFmoc保護基であり、第一のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(b)アミノ酸配列:Y-His-Gly-Asp-Gly(配列番号3)を含む第二のペプチドフラグメントをペプチド合成により固相合成により用意し、ここでYは、Boc及びベンジルオキシカルボニルからなる群から任意に選択される酸に不安定な保護基であり、第二のペプチドフラグメントのC-末端残基は担体に連結されており;
(c)担体から第二のペプチドフラグメントを切り出し;そして
(d)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにより、及び/または結晶化などによって、切り出された第二のペプチドフラグメントを精製し;
(e)任意にピペリジン、ピペラジン、モルホリン及びジシクロヘキシルアミンからなる群から選択される二級アミンを加えるることによって、第一のペプチドフラグメントからFmoc保護基を除去し;
(f)N-末端が脱保護された、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに精製した第二のペプチドフラグメントを加えることによって、担体に連結された第一のペプチドフラグメントに第二のペプチドフラグメントをカップリングさせ;
(g)第二のペプチドフラグメントにカップリングした担体に連結された第一のペプチドフラグメントを担体から切り出し;そして
(h)任意に逆相高圧液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーなどによって、第二のペプチドフラグメントに結合した、切り出された第一のペプチドフラグメントを精製し、担体は任意に官能基化ポリマー、たとえばポリスチレン、ポリジメチルアクリルアミド及びポリエチレングリコールからなる群から選択されるポリマーである、
の各段階を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 - 第一のペプチドフラグメント及び/または第二のペプチドフラグメントのC-末端アミノ酸は、リンカー、任意に4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸(HMPA)によって官能基化ポリマーに結合している、請求項10に記載の方法。
- アミノ酸配列:His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp(配列番号1)を含むペプチドを含む医薬組成物を製造する方法であって、
(a)請求項1〜11のいずれかに記載の方法に従ってペプチドを製造し;そして
(b)段階(a)で製造したペプチドを含む医薬組成物を製造する、
の各段階を含む上記方法。 - 医薬組成物は、組成物のpHを生理学的に許容可能なレベルに調整するのに十分な量のリン酸塩緩衝液をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 医薬組成物はさらにL-ヒスチジンを含む、請求項12または13の方法。
- 医薬組成物はさらに、マンニトール及びショ糖からなる群から選択される増量剤をさらに含む、請求項12〜14のいずれかに記載の方法。
- 医薬組成物は注射可能な剤形として提供される、請求項12〜15のいずれかに記載の方法。
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