CN105622424B - 化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物及其制备方法和应用，具体地，提供了一种2‑羟基‑5硝基苯甲醛衍生物，其为式(Ⅰ)所示化合物，其中，R1为H或甲基；R2为H、C1‑6烷基或C6‑10芳基；R3为H、C1‑6烷基或C6‑10芳基。在多肽制备过程中，利用该化合物能够打破肽链氨基酸残基之间的相互作用，进而能够抑制多肽链的二级结构的形成，打破羰基与氨基之间的氢键相互作用，减少了多肽合成过程中聚集现象的发生，使得难溶性多肽片段的合成、分离纯化和表征过程与常规水溶性多肽类似，从而可以高效制备困难序列多肽。

Description

化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于多肽/蛋白合成技术领域，具体地，涉及化合物及其制备方法及利用其制备疏水性膜蛋白/困难序列多肽的方法。
背景技术
膜蛋白基因组包含了所有哺乳动物基因组的20％～30％，在信号传导、物质运输以及生物催化方面具有极其重要的作用，大多数膜蛋白都成为现代制药公司研究药物的重要靶点，在已知药物中约有50％的药物作用靶标是膜蛋白。因此，膜蛋白结构和功能的研究将为药物的合理设计带来广阔的前景。但是，目前对这些数量庞大的重要膜蛋白的结构-功能的认识匮乏。这是由于膜蛋白自身的疏水性，很难得到足够量的且纯度较高的膜蛋白用于晶体和核磁进行结构分析。通过生物重组表达的方法，常常会存在效率差、细胞毒性大等问题，且无法得到精确修饰的蛋白序列。
另一方面，蛋白化学合成技术为获得膜蛋白样品提供了新的途径。蛋白化学合成技术能实现蛋白的原子尺度的精度的精确调控，得到含D-氨基酸、主链骨架的“氧酯”修饰、同位素标记、荧光标记、糖基化翻译后修饰等的功能特异性的膜蛋白。例如，诺贝尔奖获得者MacKinnon和同事通过化学合成得到一个带修饰的钾离子通道KcsAD-Ala77，该修饰将77位甘氨酸替换为D-型丙氨酸。使用这种人工设计合成的膜蛋白工具，获得了钾离子通道的选择性的机理。这显示出化学合成膜蛋白的应用前景巨大。
但是，当前使用化学合成手段得到的膜蛋白例子极少，膜蛋白样品制备是蛋白化学合成领域的重大挑战之一。这是因为膜蛋白跨膜肽片段的强疏水性特征以及肽片段形成的α-螺旋等二级结构之间的分子间相互作用导致沉聚，导致膜肽片段溶解度极差，造成膜蛋白跨膜肽片段分离纯化和膜蛋白肽片段连接困难，所以很难得到足够量的且纯度较高的困难序列多肽和膜蛋白用于结构、功能以及药物的研究。
为实现化学合成策略高效获取膜蛋白样品，Kent等人在主链骨架N-原子上引入N-甲基化修饰，从而破坏膜肽片段的二级结构，从而有效增加膜蛋白的溶解性，但是该修饰基团无法有效脱除，得不到天然膜蛋白，没有实用价值。为解决骨架修饰的脱除困难问题，我们在2014年发展了一种可脱除主链骨架修饰策略合成膜蛋白。该策略使用预先制备的甘氨酸结构单元，通过Fmoc SPPS方法在膜肽片段的主链骨架甘氨酸位点引入可脱除的Arg4-tag修饰基团，该基团与Fmoc-SPPS兼容，在肽片段合成及多肽连接过程中稳定。但该结构最后能在与蛋白兼容的温和三氟乙酸(TFA)条件下定量去除，最终得到天然蛋白。被该骨架修饰基团修饰的疏水性膜蛋白，在合成、纯化、连接以及质谱分析过程中都表现出和水溶性多肽一样的性状，用于高效的合成中等大小的跨膜蛋白。该策略的一个基本元素是骨架修饰基团只能在甘氨酸位点引入。但是，并不是所有的膜蛋白在其含跨膜区的多肽片段中含有Gly。这使得基于Gly位点的RBM策略在实际应用中同样受到了极大的限制。因此，需要发展在其他位点引入可脱除主链骨架修饰策略的更方便和普适的方法，高效合成膜蛋白。此外，在Fmoc固相多肽合成过程中，大多数困难序列多肽的合成过程中易形成二级结构(例如β-sheet的结构)，使得氨基酸缩合和脱Fmoc保护基的效率低下，最终导致产物纯度差、产率低。此外，困难序列多肽易形成二级结构发生强烈相互作用而发生聚集，水溶性差，导致在分离纯化过程中在纯化过程困难。所以困难序列多肽的化学合成是多肽合成领域的一大重要挑战。例如，Amyloid-β(Aβ)属于困难序列多肽的一种，在多肽合成过程易发生聚集现象，制备困难。Aβ在阿兹海默症中起重要作用。阿兹海默症是一种与年龄相关的神经退化性疾病，影响着世界上多数老人的生活。很多研究发现Aβ在神经细胞中的聚集是阿兹海默症的重要特征之一。Aβ在阿紫海默症发病机理的重要作用，使Aβ成为现代的研究热点。翻译后修饰、不同长度的派生物以及不同位点突变等对Aβ聚集影响的研究，有可能为阿尔兹海默症提供新一代的诊断标记和治疗靶点。
因此，目前关于制备疏水性膜蛋白以及困难序列多肽的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速有效地化学合成疏水性膜蛋白和困难序列多肽的手段。
根据本发明的第一方面，本发明一种化合物，其为式(Ⅰ)所示化合物，该化合物为2-羟基-5硝基苯甲醛衍生物：
其中：R1为H或者甲基；R2为H、C1-6烷基或C6-10芳基；R3为H、C1-6烷基或C6-10芳基。发明人经过大量的探索实验和艰苦的劳动，惊奇地发现利用该化合物来制备多肽的方法特别适合制备疏水性膜蛋白和困难序列多肽，具体地，利用该化合物能够在固相多肽合成的过程中通过醛氨缩合在氨基酸的氨基上，再经过NaBH4的还原形成亚胺结构，后一个氨基酸通过该化合物苯环上羟基发生O→N迁移，缩合在氨基上。由于该化合物打破了肽链氨基酸残基之间的相互作用，进而在多肽制备过程中，能够抑制多肽链的二级结构的形成，即打破了羰基与氨基之间的氢键相互作用，减少了多肽合成过程中聚集现象的发生。同时，该化合物的引入使得困难序列多肽合成、分离纯化和表征过程与水溶性蛋白具有类似的处理特性。由此，能够有效地制备困难序列多肽，并且大大地提高合成纯度，能够大大地减少时间、人力、物力的消耗。进一步地，利用该化合物，发展了主链可脱除骨架修饰策略进行疏水性膜蛋白的化学合成。化学合成膜蛋白困难的起因在于膜蛋白中含跨膜区的膜肽片段的溶解度极差，膜肽片段连接、分离纯化等操作过程非常困难。膜蛋白跨膜肽片段的强疏水性特征以及肽片段形成的α-螺旋等二级结构之间的分子间相互作用导致沉聚，导致膜蛋白中含跨膜区的膜肽片段的溶解度极差。发明人提出了在跨膜区的主链骨架氨基酸的N-原子上引入助溶的Arg-Tag的可脱除骨架修饰策略。含该修饰基团的膜肽序列可以通过Fmoc SPPS合成技术得到。该修饰基团在不仅可以破坏膜肽/膜蛋白的二级结构，同时引入Arg-Tag基团，也能有效增加溶解性。该修饰基团在膜肽序列合成、肽片段连接以及分离纯化过程中稳定，从而简化膜蛋白合成操作，实现膜肽/膜蛋白的增溶作用。完成膜蛋白全长序列的组装后，助溶Arg-Tag基团又能在三氟乙酸(TFA)条件下定量脱除，最终有效得到天然膜蛋白序列。最后，在磷脂膜/去垢剂等接近天然的膜蛋白环境中重组复性，得到具有生物功能的膜蛋白。
根据本发明的一些实施例，R2为H、甲基、乙基或苯基；R3为H、甲基、乙基或苯基。由此，利用该化合物能够进一步有效地提高制备困难序列多肽的效率，并且大大地提高合成纯度，能够大大地减少时间、人力、物力的消耗。
根据本发明的一个实施例，所述化合物具有以下结构：
由此，利用该化合物能够进一步有效地提高制备困难序列多肽的效率，并且大大地提高合成纯度，能够大大地减少时间、人力、物力的消耗。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种制备上述化合物的方法，包括：
使式(Ⅱ)所示化合物进行硝基化反应，以便获得所述式(Ⅰ)所示化合物
其中，R1为H或者甲基；R2为H、C1-6烷基或C6-10芳基；R3为H、C1-6烷基或C6-10芳基。由此，能够快速有效地制备所述式(Ⅰ)所示化合物，并且步骤简单、操作方便。
根据本发明的一些实施例，R2为H、甲基、乙基或苯基；R3为H、甲基、乙基或苯基。
根据本发明的一些实施例，所述方法包括：使所述式(Ⅱ)所示化合物与硝基在冰醋酸溶液中接触，以便获得所述式(Ⅰ)所示化合物。由此，能够进一步快速有效地制备所述式(Ⅰ)所示化合物，并且步骤简单、操作方便。
根据本发明的一些实施例，所述方法包括：(1)将冰醋酸和硝酸进行混合，以便获得第一混合物，并且使得所述第一混合物的温度降至0℃；(2)于室温下，将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛加入于步骤(1)所获的所述第一混合物中反应12小时，加入冰水淬灭，过滤，以便获得固体物质；(3)水洗步骤(2)所获得所述固体物质，干燥后，在70℃条件下，于乙醇溶液中，进行重结晶，以便获得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛。由此，有利于2-羟基－4-甲氧基苯甲醛与硝酸的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。
根据本发明的一些实施例，所述方法包括以下步骤：(1)将31ml冰醋酸和31ml硝酸进行混合，以便获得第一混合物，并且使得所述第一混合物的温度降至0℃；(2)于室温下，将8.4g 2-羟基-4-甲氧基苯甲醛加入于步骤(1)所获得的所述第一混合物中反应12小时，加入200ml冰水淬灭，过滤，以便获得固体物质；(3)水洗步骤(2)所获得的所述固体物质，干燥后，在70℃条件下，在50％乙醇溶液中，进行重结晶，以便获得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛。由此，能够高效地制备2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛，且副反应较少，反应效率和产率较高。
根据本发明的第三方面，本发明提出所述化合物或者所述方法制备获得的化合物在制备疏水性膜蛋白或者困难序列多肽中的用途。
根据本发明的一些实施例，所属疏水性膜蛋白为膜蛋白甲流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM，所述困难序列多肽为Amyloid-β。
根据本发明的第四方面，本发明提出一种制备Amyloid-β的方法，包括：
(a-1)使2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(a1)所示固相树脂上的多肽接触，以便获得式(a2)所示固相树脂上的多肽
(a-2)在DMF溶液中，使所述式(a2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，以便获得式(a3)所示固相树脂上的多肽
(a-3)利用Fmoc固相合成法继续延长所述式(a3)所示固相树脂上的多肽，以便获得式(a4)所示固相树脂上的多肽
(a-4)在含有体积比0.1％HCl的DMF溶液中，使所述式(a4)所示固相树脂上的多肽与SnCl2进行还原反应，以便获得式(a5)所示固相树脂上的多肽
发明人采用SnCl2/HCl将所述式(a4)所示固相树脂上的多肽上的硝基还原成氨基可使Gly缩合上去；
(a-5)利用Fmoc固相合成法将式(a5)所示固相树脂上的多肽连接上Gly-Arg4-tag,以便获得式(a6)所示固相树脂上的多肽
(a-6)对所述式(a6)所示固相树脂上的多肽进行乙酰化，以便获得式(a7)所示固相树脂上的多肽
利用乙酸酐处理，将所述式(a6)所示固相树脂上的多肽的羟基用乙酰基封闭起来，以防止多肽上的修饰基团被TFA从多肽上切下来；
(a-7)采用TFA将所述式(a7)所示固相树脂上的多肽从固相树脂上切下来，以便获得式(A1)所示的A1多肽片段
(b)脱去所述A1多肽片段中的乙酰基，以便获得式(A2)所示的A2多肽片段
利用含有0.4M Cys的缓冲溶液(H2O:乙腈＝1:1，v/v，pH为7.0)将所述A1多肽片段中的乙酰基脱去，再纯化，得到A2多肽片段；
(c)使得所述A2多肽片段与式(A3)所示的A3多肽片段进行连接反应，以便获得式(A4)所示的A4多肽片段
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG-SCH2CH2SO3H(A3)
(d)对所述A4多肽片段进行脱硫处理，以便获得式(A5)所示的A5多肽片段
将A4多肽片段溶于含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液，调节pH至7.3后，向反应瓶中加入溶于pH为3.5的含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液中的三(2-羧乙基)膦后，加入偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐。再加入17％～20％(v/v)的叔丁基硫醇，pH调至6.5，于37℃下反应9小时后，反应完全，以便得到A5多肽片段；
(e)采用TFA处理所述A5多肽片段，以便获得式(A6)所示的Amyloid-β
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-OH(A6)。利用上述方法，能够快速有效地制备Amyloid-β。
根据本发明的一些实施例，所述方法中步骤(a-1)中，2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(a1)所示固相树脂上的多肽的摩尔比为1.5：1。
根据本发明的一些实施例，所述方法中步骤(a-2)在DMF溶液中，所述式(a2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4的摩尔比为1:4。
根据本发明的一些实施例，所述方法中步骤(a-6)中利用由乙酸酐、DIEA和DMF所组成的溶液(乙酸酐：DIEA：DMF＝1:1:8)对所述式(a6)所示固相树脂上的多肽进行乙酰化，以便获得式(a7)所示固相树脂上的多肽，由此，有利于困难序列多肽合成的进行，从而能够有效提高反应效率和产率。
根据本发明的第五方面，本发明提出一种制备甲流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM的方法，包括：
(a)使得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(b1)所示固相树脂上的多肽接触，以便获得式(b2)所示固相树脂上的多肽
(b)在DMF溶液中，使所述式(b2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，以便获得式(b3)所示固相树脂上的多肽
(c)利用Fmoc固相合成法继续延长所述式(b3)所示固相树脂上的多肽，以便获得式
(d)在含有体积比0.1％HCl的DMF溶液中，使所述式(b4)所示固相树脂上的多肽与SnCl2进行还原反应，以便获得式(b5)所示固相树脂上的多肽
(e)利用Fmoc固相合成法将式(b5)所示多肽连接上Gly-Arg4-tag，以便获得式(b6)所示固相树脂上的多肽
(f)对所述式(b6)所示多肽进行乙酰化，以便获得式(b7)所示固相树脂上的多肽片段
利用乙酸酐处理，将所述式(b6)所示多肽的羟基用乙酰基封闭起来，以防止多肽上的修饰基团被TFA从多肽上被切下来；
(g)用TFA将固相树脂上的多肽从树脂上切下来，以便获得式(B1)所示的B1多肽片段
(h)脱去所述B1多肽片段中的乙酰基，以便获得式(B2)所示的B2多肽片段
利用含有0.4M Cys的缓冲溶液(H2O:乙腈＝1:1，v/v，pH为7.0)将所述A1多肽片段中的乙酰基脱去，再纯化，得到A2多肽片段；
(i)采用TFA处理所述B2多肽片段，以便获得式(B3)所示的家流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TMH-SSDPLVVAASIIAILHLILWILDRL-OH(B3)。利用上述方法，能够快速有效地制备甲流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM。
需要说明的是，本文中使用的术语“多肽片段”是指通过Fmoc固相合成能一次合成的多肽，即多肽片段的氨基酸个数一般不多于50个。
需要说明的是，所述A1多肽片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：
H-CIIGLMVGRMB-Ac GVVIA-OH(SEQ ID NO：1)；
所述A2多肽片段具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：
H-CIIGLMVGRMB-OH GVVIA-OH(SEQ ID NO：2)；
所述A3多肽片段具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，其中，所述的A3多肽片段的C端为烷基硫酯：
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG-SCH2CH2SO3H(SEQ ID NO：3)；
所述A4多肽片段具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列：
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGCIIGLMVGRMB-OH GVVIA-OH(SEQ ID NO：4)；
所述A5多肽片段具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列：
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGRMB-OH GVVIA-OH(SEQ ID NO：5)；
所述A6多肽片段具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列：
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-OH(SEQ ID NO：6)；
所述B1多肽片段具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
H-SSDPLVVAASIIARMB-Ac ILHLILWILDRL-OH(SEQ ID NO：7)；
所述B2多肽片段具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列：
H-SSDPLVVAASIIARMB-OH ILHLILWILDRL-OH(SEQ ID NO：8)；
所述B3多肽片段具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列：
H-SSDPLVVAASIIAILHLILWILDRL-OH(SEQ ID NO：9)。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点将结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明的实施例1，制备获得的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛的质谱图，其中：
图1Ⅰ为根据本发明的实施例1，制备获得的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛的正电荷质谱图，
图1Ⅱ为根据本发明的实施例1，制备获得的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛的负电荷质谱图；
图2为根据本发明的实施例1，制备获得的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛的核磁谱图，
其中：
图2Ⅰ为根据本发明的实施例1，制备获得的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛的1HNMR谱图，
图2Ⅱ为根据本发明的实施例1，制备获得的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛的13CNMR谱图；
图3为根据本发明的实施例2，制备获得的A1多肽片段的色谱和质谱图；
图4显示了根据本发明的实施例2，制备获得的A2多肽片段的色谱和质谱图；
图5显示了根据本发明的实施例2，制备获得的A3多肽片段的色谱和质谱图；
图6显示了根据本发明的实施例2，制备获得的A4多肽片段的色谱和质谱图；
图7显示了根据本发明的实施例2，制备获得的A5多肽片段的色谱和质谱图；
图8显示了根据本发明的实施例2，制备获得的A6多肽片段的质谱图；
图9显示了根据本发明的实施例3，制备获得的B1多肽片段的色谱和质谱图；
图10显示了根据本发明的实施例3，制备获得的B2多肽片段的色谱和质谱图；
图11显示了根据本发明的实施例3，制备获得的B3多肽片段的色谱和质谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 制备2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛
量取31ml的冰醋酸和31ml的硝酸放在250ml圆底烧瓶中，冰水浴敷浴，圆底烧瓶温度降至0℃后，加入2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(8.4g，50mmol)，得混合物；
将所述混合物在室温下反应12小时，将所得的反应体系倒入装有200ml的冰水混合物的500ml烧杯中。过滤后，用水洗固状物质，干燥固体，在乙醇和水(1:1，v/v)条件下结晶，得到产物8.2g，产率为76％。将获得的产物经核磁(NMR)检测，核磁检测谱图见图2。
图2(I)为1H NMR谱图：1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.01(s,1H),10.11(s,1H)),8.29(s,1H),6.74(s,1H),3.98(s,3H)。
图2(II)为13C NMR谱图：13C-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ188.61,165.77,158.97,131.89,128.15,115.40,101.17,57.11.ESI-MS m/z calcd for C8H7NO5 197.0；found(M+H+)198.5；found(M-H+)196.5。由图2和图1可知，获得的产物结构正确，为2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛。
实施例2 制备人源Aβ1-42
2.1、制备多肽片段
采用Fmoc固相多肽合成法，制备如下多肽片段：
A1多肽片段：
H-CIIGLMVGRMB-Ac GVVIA-OH(其中，GRBM-Ac表示含N-乙酰化助溶基团的修饰基团的甘氨酸)。
A2多肽片段：
H-CIIGLMVG RMB-OH GVVIA-OH(其中，GRBM表示含N-助溶基团修饰基团的甘氨酸)。
A3多肽片段：
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG-SCH2CH2SO3H。
A4多肽片段：
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGCIIGLMVGRMB-OH GVVIA-OH。
A5多肽片段:
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGRMB-OH GVVIA-OH。
A6多肽片段:
H-DAE FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-OH。
具体操作步骤如下：
Fmoc固相多肽合成法：
将酰肼树脂(或2-氯三苯甲基树脂)加入多肽合成管，用二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)(体积比1:1)溶胀30分钟，接着，将3.6当量的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，4当量的羟基苯并三氮唑(HOBt)，8当量的二异丙基乙胺(DIEA)和4当量Fmoc保护的目标肽C端第一个氨基酸溶于DMF中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应4小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，然后用掩蔽试剂(醋酸酐：DIEA：DMF＝1：1：8)浸泡树脂10分钟后，再依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次，接下来，加入20％哌啶的DMF溶液处理树脂5分钟和10分钟后，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次，再将现配制的混合液(3.6当量的HBTU，4当量HOBt，8当量DIEA和4当量Fmoc保护的目标肽C端第二个氨基酸)加入树脂反应60分钟，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次后，用20％哌啶的DMF溶液处理5分钟和10分钟，接下来的氨基酸的缩合重复上面的操作。
其中，酰肼树脂是通过5％水合肼的DMF溶液直接与2-氯三苯甲基树脂发生取代反应制备获得的。
制备A1多肽片段
(1)采用Novel PEG Wang树脂，偶联A1多肽片段的C端的第一个氨基酸采用的操作包括：将4倍当量的Fmoc保护的A1多肽C段第一个氨基酸，4倍当量的DIC以及4倍当量Oxyma溶于DMF溶液中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应8小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次。将4倍当量的Fmoc保护的A1多肽C段第一个氨基酸，4倍当量的DIC，4倍当量Oxyma以及催化量的DMAP溶于DMF溶液中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应2小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次。然后用掩蔽试剂(醋酸酐：DIEA：DMF＝1：1：8)浸泡树脂10分钟后，再依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。接下来，加入20％哌啶的DMF溶液处理树脂5分钟和10分钟后，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次，再将现配制的混合液(4当量的DIC，4当量Oxyma和4当量Fmoc保护的B1多肽片段的C端第二个氨基酸)加入树脂反应两次，每次60分钟，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次后，用20％哌啶的DMF溶液处理5分钟和10分钟，接下来的氨基酸的缩合重复上面的操作，以便获得式(a1)所示固相树脂上的多肽；
(2)：预先将1.5倍的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与被脱了N端Fmoc的式(a1)所示固相树脂上的多肽反应1小时，从而获得式(a2)所示固相树脂上的多肽，再用4倍的NaBH4的DMF溶液还原式(a2)所示固相树脂上的多肽两次，每次5分钟，以便获得式(a3)所示固相树脂上的多肽。式(a3)所示固相树脂上的多肽中被修饰的甘氨酸的后一个氨基酸通过两次DIC/Oxyma缩合，每次4～5小时，通过Fmoc固相合成技术继续延长多肽并在多肽N端连上Boc氨基酸，从而获得式(a4)所示固相树脂上的多肽。将所得式(a4)所示固相树脂上的多肽片段用SnCl2/0.001HCl的DMF溶液还原多肽修饰基团上的硝基，从而获得式(a5)所示固相树脂上的多肽。通过Fmoc固相合成技术在多肽上被还原的修饰基团的氨基上连Gly-Arg4-tag，从而获得式(a6)所示固相树脂上的多肽。最后用乙酸酐：DIEA：DMF＝1:1:8对多肽片段上修饰基团的羟基进行乙酰化，从而获得式(a7)所示固相树脂上的多肽。待目标多肽固相合成结束后，将所得到的树脂分别用大量DMF、DCM洗涤，真空干燥后，外加10ml酸性切割试剂(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，处理2-4小时，以便获得A1多肽片段。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的A1多肽片段，经质谱确定结构正确，制备获得的A1多肽片段的质谱和色谱图如图3所示。
制备A2多肽片段
将A1多肽片段(2.6mg，1μmol，1eq)溶于1ml含有0.4M Cys的H2O:乙腈＝1:1缓冲溶液，调节pH至7.0后，将反应瓶置于37℃下反应1小时后，反应完全将A1多肽片段中修饰基团上的羟基上的乙酰基脱去，即得A2多肽片段，相应的A2多肽片段的色谱及质谱图见图4。
制备A3多肽片段
采用Fmoc固相多肽合成法以及酰肼树脂，待目标多肽固相合成结束后，将所得到的树脂分别用大量DMF、DCM洗涤，真空干燥后，外加10ml酸性切割试剂(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，处理2-4小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥。将干燥的多肽片段(3.3mg，1μmol，1eq)溶于100ul含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液，调节pH至3.0后，将反应瓶置于-15℃冰盐浴(氯化钠+冰)中，待混合溶液冷却后，然后加入1ul 1M的NaNO2溶液；氧化20分钟后，向反应瓶中加入溶于100ul pH为6.5的含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液中的2-巯基乙烷磺酸钠(16.4mg，100μmol，100eq)溶液，将反应体系恢复室温，用2M NaOH溶液调pH至5.5，于37℃下反应30分钟后，反应完全。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的A3多肽片段，其中所述的A3多肽片段的C端为烷基硫酯经质谱确定结构正确，制备获得的A3多肽片段的质谱和色谱图如图5所示。
制备A4多肽片段
将A3多肽片段(3.4mg，1μmol，1eq)以及A2多肽片段(2.6mg，1μmol，1eq)溶于400ul含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液，调节pH至3.0后。向反应瓶中加入溶于100ul pH为6.5的含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液中的4-巯基苯乙酸(MPAA，16.4mg，100μmol，100eq)和三(2-羧乙基)膦(TCEP，28mg，100μmol)后，溶液然后用2M NaOH溶液调pH至7.0，于37℃下反应2小时后，反应完全，即得A4多肽片段，相应的连接产物A4多肽片段的色谱及质谱图见图6。经半制备HPLC分离纯化处理，获得纯化后的A4多肽片段。
制备A5多肽片段
将A4多肽片段(4.4mg，1μmol，1eq)溶于500ul含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液，调节pH至7.3后。向反应瓶中加入溶于500ul pH为3.5的含有6M盐酸胍的磷酸盐缓冲液中的三(2-羧乙基)膦(TCEP，84mg，300μmol)后，加入偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(VA-044,Xmg,10eq)。再加入17％～20％(v/v)的叔丁基硫醇(HStBu)，pH调至6.5，于37℃下反应9小时后，反应完全，即得物A5多肽片段，相应的连接产物A5多肽片段的色谱及质谱图见图7。经半制备HPLC分离纯化处理，获得纯化后的A5多肽片段。
制备Amyloid-β
将A5多肽片段(5.3mg,1μmol，1eq)加1ml酸性切割试剂(95％三氟乙酸，2.5％水，2.5％TIPS)，处理2-4小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的目标多肽片段Amyloid-β，经质谱确定结构正确。制备获得的A6多肽片段的质谱和色谱图分别如图8所示，完成了全长的Aβ1-42的化学全合成。
实施例3制备家流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM
3.1、制备多肽片段
采用Fmoc固相多肽合成法，制备如下多肽片段：
B1多肽片段：
H-SSDPLVVAASIIARMB-Ac IL HLILWILDRL-OH(ARBM-Ac表示含N-乙酰化助溶基团的修饰基团的丙氨酸)。
B2多肽片段：
H-SSDPLVVAASIIARMB-OH ILHLILWILDRL-OH(ARBM-Ac表示含N-助溶基团的修饰基团的丙氨酸)。
B3多肽片段：
H-SSDPLVVAASIIAILHLILWILDRL-OH。
具体操作步骤如下：
制备B1多肽片段
首先，将Novel PEG Wang树脂加入多肽合成管，用二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)(体积比1:1)溶胀30分钟，接着，偶联B1多肽片段的C端的第一个氨基酸采用的操作包括：将4倍当量的Fmoc保护的B1多肽片段的C端的第一个氨基酸，4倍当量的DIC以及4倍当量Oxyma溶于DMF溶液中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应8小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次。将4倍当量的Fmoc保护的B1多肽片段的C端第一个的氨基酸，4倍当量的DIC，4倍当量Oxyma以及催化量的DMAP溶于DMF溶液中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应2小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次。然后用掩蔽试剂(醋酸酐：DIEA：DMF＝1：1：8)浸泡树脂10分钟后，再依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。接下来，加入20％哌啶的DMF溶液处理树脂5分钟和10分钟后，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次，再将现配制的混合液(3.6当量的HBTU，4当量HOBt，8当量DIEA和4当量Fmoc保护的B1多肽片段的C端第二个氨基酸)加入树脂反应两次，每次60分钟，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次后，用20％哌啶的DMF溶液处理5分钟和10分钟，接下来的氨基酸的缩合重复上面的操作，以便获得式(b1)所示固相树脂上的多肽。预先将1.5倍的2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与被脱了N端Fmoc的式(b1)所示固相树脂上的多肽反应1小时。再用4倍的NaBH4的DMF溶液还原两次，每次5分钟，以便获得式(b3)所示固相树脂上的多肽。式(b3)所示固相树脂上的多肽中被修饰的丙氨酸的后一个氨基酸通过两次DIC/Oxyma缩合，每次4～5小时，通过Fmoc固相合成技术继续延长多肽并在多肽N端连上Boc氨基酸，从而获得式(b4)所示固相树脂上的多肽。将所得的(b4)所示固相树脂上的多肽用SnCl2/0.001HCl的DMF溶液还原多肽修饰基团上的硝基，从而获得式(b5)所示固相树脂上的多肽。通过Fmoc固相合成技术在式(b5)所示固相树脂上的多肽中被还原的修饰基团上的氨基上连Gly-Arg4-tag，从而获得式(b6)所示固相树脂上的多肽。最后用乙酸酐：DIEA：DMF＝1:1:8对式(b6)所示固相树脂上的多肽修饰基团上的羟基进行乙酰化，以便获得式(b7)所示固相树脂上的多肽片段。待目标多肽固相合成结束后，将所得到的树脂分别用大量DMF、DCM洗涤，真空干燥后，外加10ml酸性切割试剂(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，处理2-4小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的B1多肽片段，经质谱确定结构正确。制备获得的B1多肽片段的质谱和色谱图分别如图9所示。
制备B2多肽片段
将B1多肽片段(3.7mg，1μmol，1eq)溶于1ml含有0.4M Cys的H2O:乙腈＝1:1缓冲溶液，调节pH至7.0后，将反应瓶置于37℃下反应1小时后，反应完全将B1多肽片段中修饰基团上的羟基上的乙酰基脱去，即得B2多肽片段，相应的B2多肽片段的色谱及质谱图见图10。
制备B3多肽片段
将B2多肽片段(3.6mg,1μmol，1eq)加1ml酸性切割试剂(95％三氟乙酸，2.5％水，2.5％TIPS)，处理2-4小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理，然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的目标多肽片段，经质谱确定结构正确。制备获得的B3多肽片段的质谱和色谱图分别如图11所示。完成了全长的家流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM的化学全合成，多肽总分离产率为24％，纯度大于90％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.化合物在制备疏水性膜蛋白或者困难序列多肽中的用途，所述化合物具有以下结构：
2.根据权利要求1所述的用途，所述疏水性膜蛋白为膜蛋白甲流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM，所述困难序列多肽为Amyloid-β。
3.一种制备Amyloid-β的方法，其特征在于，包括：
(a-1)使2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(a1)所示固相树脂上的多肽接触，以便获得式(a2)所示固相树脂上的多肽
(a-2)在DMF溶液中，使所述式(a2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，以便获得式(a3)所示固相树脂上的多肽
(a-3)利用Fmoc固相合成法继续延长所述式(a3)所示固相树脂上的多肽，以便获得式(a4)所示固相树脂上的多肽
(a-4)在含有体积比0.1％HCl的DMF溶液中，使所述式(a4)所示固相树脂上的多肽与SnCl2进行还原反应，以便获得式(a5)所示固相树脂上的多肽
(a-5)利用Fmoc固相合成法将式(a5)所示固相树脂上的多肽连接上Gly-Arg4-tag,以便获得式(a6)所示固相树脂上的多肽
(a-6)对式(a6)所示固相树脂上的多肽进行乙酰化，以便获得式(a7)所示固相树脂上的多肽
(a-7)采用TFA将所述式(a7)所示固相树脂上的多肽从固相树脂上切下来，以便获得式(A1)所示的A1多肽片段
(b)脱去所述A1多肽片段中的乙酰基，以便获得式(A2)所示的A2多肽片段
(c)使得所述A2多肽片段与式(A3)所示的A3多肽片段进行连接反应，以便获得式(A4)所示的A4片段
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG-SCH2CH2SO3H(A3)
(d)对所述A4多肽片段进行脱硫处理，以便获得式(A5)所示的A5多肽片段
(e)采用TFA处理所述A5多肽片段，以便获得式(A6)所示的Amyloid-β
H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-OH(A6)。
4.一种制备甲流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM的方法，其特征在于，包括：
(a)使得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(b1)所示固相树脂上的多肽接触，以便获得式(b2)所示固相树脂上的多肽
(b)在DMF溶液中，使所述式(b2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，以便获得式(b3)所示固相树脂上的多肽
(c)利用Fmoc固相合成法继续延长所述式(b3)所示固相树脂上的多肽，以便获得式(b4)所示固相树脂上的多肽
(d)在含有体积比0.1％HCl的DMF溶液中，使所述式(b4)所示固相树脂上的多肽与SnCl2进行还原反应，以便获得式(b5)所示固相树脂上的多肽
(e)利用Fmoc固相合成法将式(b5)所示多肽连接上Gly-Arg4-tag，以便获得式(b6)所示固相树脂上的多肽
(f)对所述式(b6)所示多肽进行乙酰化，以便获得式(b7)所示固相树脂上的多肽片段
(g)用TFA将固相树脂上的多肽从树脂上切下来，以便获得式(B1)所示的B1多肽片段
(h)脱去所述B1多肽片段中的乙酰基，以便获得式(B2)所示的B2多肽片段
(i)采用TFA处理所述B2多肽片段，以便获得式(B3)所示的家流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM
H-SSDPLVVAASIIAILHLILWILDRL-OH(B3)。
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