CN113264979B - 可脱除骨架修饰快速脱除的新方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可脱除骨架修饰(RBM)快速脱除的新方法及应用，该可脱除骨架修饰快速脱除的新方法包括以下步骤：将多肽中引入的RBM中的硝基‑NO2首先还原为氨基‑NH2，然后在酸性有机溶剂中利用氧化剂将氨基‑NH2转化为重氮盐‑N≡N，最后利用还原剂脱除重氮盐‑N≡N，从而实现将RBM转化为2‑羟基‑4‑甲氧基苄基(HMB)，从而通过多肽切割试剂将RBM从多肽上快速脱除，另外本发明操作简单、收率高，可将其应用于多肽或蛋白的制备中，能够有效提高多肽的合成产率、辅助蛋白化学连接等，获得天然多肽或蛋白。

Description

可脱除骨架修饰快速脱除的新方法及应用
技术领域
本发明属于多肽或蛋白合成技术领域，具体涉及一种将多肽序列上可脱除骨架修饰RBM转化为HMB的转化方法，以及采用该转化方法将多肽上可脱除骨架修饰快速脱除的新方法，以及该可脱除骨架修饰快速脱除的新方法在制备多肽或蛋白中的应用。
背景技术
化学蛋白质合成可以获得具有翻译后修饰或位点特异性标记的蛋白质，虽然这项技术在水溶性球状蛋白的研究中发现了越来越多的应用，但困难序列多肽的化学合成仍然是一项巨大的挑战。具体的说，困难序列多肽难以合成主要是因为它们形成容易聚集的二级结构(α螺旋或β折叠)。为了实现化学合成策略高效获取困难序列蛋白样品，Kent等人在主链骨架N-原子上引入N-甲基化修饰，从而破坏多肽片段的二级结构，有效增加困难序列多肽溶解性，但是该基团无法有效脱除，得不到天然蛋白，没有实用价值。除了引入N-甲基化修饰，在二级结构区域中引入骨架修饰基团，也可以有效地破坏二级结构的形成。1993年Sheppard等研究报道了一种基于骨架酰胺保护的策略，即N-(2-羟基-4-甲氧基苄(Hmb))结构。在标准SPPS条件下，待多肽组装完成后，向树脂中加入三氟乙酸，HMB和其他酸不稳定的保护基都会从多肽序列中脱除，可以获得天然的目标多肽。但HMB只能接入到Gly上，且并不是所有的困难序列多肽在其易形成二级结构的区域都含有Gly，这使得基于Gly位点引入HMB策略在实际应用中受到了极大地限制。
随后2016年新的研究发现可在任意氨基酸位点引入可脱除骨架修饰(RemovableBackbone Modification,RBM)策略。该策略采用活化的O-N酰基转移辅助装置，在Fmoc固相肽合成过程中安装一个对三氟乙酸具有可切换反应性的RBM(可移除的骨架修饰)基团，即2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛，该基团与Fmoc SPPS兼容，在肽片段合成及多肽连接中稳定。RBM显著的优点是可以安装在任意氨基酸上，从而可以不受限制的用于模型肽或困难序列多肽合成，并且困难序列多肽及其片段表现得几乎像是水溶性肽，在连接、纯化和质量表征的过程中可以很容易地处理。此外，RBM基团可以被三氟乙酸定量去除，得到天然蛋白质。
虽然RBM基团可以被多肽切割试剂定量去除，但RBM脱除速率与安装位点有关，比如安装在丙氨酸后的RBM可以较快去除，但对于另外一些氨基酸位点多肽切割试剂(如三氟乙酸)切除可脱除骨架修饰RBM通常需要5h左右，时间较长，长时间的脱除过程可能会使多肽蛋白发生一些副反应，比如三氟乙酸化或带上三氟乙酸盐，因此需要开发将RBM快速脱除的方法。
经研究发现，多肽序列上的RBM在TFA等多肽切割试剂中脱除缓慢，主要是由于RBM的苯环上存在硝基这样的吸电子基团，若将RBM上的硝基脱除即将其转化为对TFA异常敏感Hmb结构，则多肽序列上的RBM能够轻松脱除，但在化学合成蛋白中直接脱除RBM上的硝基是非常困难的。
发明内容
有鉴于此，本发明有必要提供一种可脱除骨架修饰快速脱除的新方法及应用，通过将RBM上的硝基脱除，将其转化为对三氟乙酸异常敏感的HMB(2-羟基-4-甲氧基苄基)结构，从而进一步的使得多肽序列上的RBM能够轻松快速脱除，该可脱除骨架修饰快速脱除的新方法的操作简单且收率高，可将其应用于多肽或蛋白的制备中，有效提高困难多肽的合成产率、辅助蛋白化学连接等，获得天然多肽或蛋白。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了一种转化方法，包括以下步骤：
Figure BDA0003062500940000021
提供化合物(Ⅰ)，其中，R1为任意一种氨基酸的侧链基团，R2为任意一种不含二级胺结构的氨基酸侧链基团，R3为任意烷基或任意官能团；
将所述化合物(Ⅰ)中的硝基-NO2还原为氨基-NH2，获得化合物(Ⅱ)；
在酸性有机溶剂中利用氧化剂将所述化合物(Ⅱ)中的氨基-NH2转化为重氮盐-N≡N，获得化合物(Ⅲ)；
利用还原剂脱除所述化合物(Ⅲ)中的重氮盐-N≡N，获得化合物(Ⅳ)。
进一步的，所述化合物(Ⅰ)通过FMOC固相法合成多肽的过程中引入RBM获得。
进一步的，所述获得化合物(Ⅲ)的步骤，具体为：在第一有机溶剂中加入酸、氧化剂和所述化合物(Ⅱ)进行反应，其中，所述第一有机溶剂选自DCM、DMF或四氢呋喃。
进一步的，所述酸选自水杨酸、醋酸或氟硼酸；
所述氧化剂选自亚硝酸钠、亚硝酸叔丁酯或亚硝酸异戊酯。
进一步的，所述获得化合物(IV)的步骤，具体为：在第二有机溶剂中加入还原剂和所述化合物(Ⅲ)进行反应，其中，所述第二有机溶剂选自DMF。
进一步的，所述还原剂选自EtSH、NaBH4或NaBH3CN。
本发明还提供了一种可脱除骨架修饰快速脱除的新方法，包括以下步骤：
采用如权利要求1-6任一项所述的转化方法，将多肽序列上的RBM转化为HMB，获得所述化合物(IV)；
脱除所述化合物(IV)中的酰基官能团，获得化合物(V)
Figure BDA0003062500940000031
采用多肽切割试剂将所述化合物(Ⅴ)中的HMB脱除，获得多肽，所述多肽切割试剂包括三氟乙酸。
本发明进一步提供了如前述所述的可脱除骨架修饰快速脱除的新方法在制备多肽或蛋白中的应用。
本发明更进一步提供了一种多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛与固相树脂上的多肽N-端的氨基反应生成碳氮双键结构，获得第一多肽化合物；
S2、在有机溶液中，将所述第一多肽化合物与还原剂进行还原反应将所述碳氮双键结构还原为碳氮单键结构，获得第二多肽化合物，其中，所述有机溶液选自DMF溶液，所述还原剂选自NaBH4、三乙酰氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠；
S3、利用FMOC固相合成法延长所述第二多肽化合物，获得第三多肽化合物；
S4、对所述第三多肽化合物进行酰基化反应，获得第四多肽化合物，所述第四多肽化合物中连接有RBM；
S5、采用如权利要求7所述的可脱除骨架修饰快速脱除的新方法，获得多肽。
进一步的，所述多肽包括模型肽、糖肽、抗病毒环肽或一次性全合成泛素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的转化方法通过氧化、还原过程将多肽上的RBM转化为HMB，由于HMB对多肽切割试剂非常敏感，从而能够快速从多肽序列中脱除获得天然多肽或蛋白。
该转化方法快速将RBM从多肽序列上脱除，大大提高了多肽合成产率和纯度，能够减少时间、人力、物力的消耗。
此外，由于RBM的引入打破了肽链氨基酸残基之间的相互作用，进而在多肽制备过程中，能够抑制多肽链二级结构的形成，即打破了羰基和氨基之间的氢键相互作用，减少了多肽合成过程聚集现象的产生，提高多肽合成效率；同时，RBM若放在DG、DL、DE等易发生天冬酰亚胺副反应的序列之间，由于Asp-Xaa之间的的骨架酰胺键N-原子上修饰了RBM基团，无法与Asp侧链保护的酯键发生亲核取代反应，有效消除了多肽多次重复的缩合/脱保护过程中可能的脱水现象的发生，配合本发明中的快速脱除的新方法可以获得产率高、纯度好的天然多肽。
附图说明
图1为本发明实施例1中，步骤S52获得的重氮盐色谱图；
图2为本发明实施例1中，步骤S53重氮盐脱除后的色谱图；
图3为本发明实施例6中，步骤S52获得的重氮盐色谱图；
图4为本发明实施例8中，步骤S52获得的重氮盐色谱图；
图5为本发明实施例10中，步骤S52获得的重氮盐色谱图；
图6为本发明实施例11中，步骤S53重氮盐脱除后的色谱图；
图7为本发明实施例13中，步骤S53重氮盐脱除后的色谱图；
图8为本发明实施例15中，步骤S53重氮盐脱除后的色谱图；
图9为本发明实施例16中，步骤S53重氮盐脱除后的色谱图；
图10为本发明实施例19中，泛素合成过程中RBM引入前色谱图；
图11为本发明实施例19中，泛素合成过程中RBM引入后并将其乙酰化色谱图；
图12为本发明实施例19中，泛素合成过程脱除RBM得到天然泛素序列色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体的实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明第一方面提供了一种转化方法，包括以下步骤：
Figure BDA0003062500940000051
提供化合物(Ⅰ)，其中，R1为任意一种氨基酸的侧链基团，R2为任意一种不含二级胺结构的氨基酸侧链基团，R3为任意烷基或任意官能团。本文中所述的“氨基酸的侧链基团”指的是天然或非天然氨基酸侧链基团，这里不再具体阐述；“不含二级胺结构的氨基酸侧链基团”指的是天然或非天然氨基酸侧链基团中不含有二级胺结构(-NH-)，其中，不含二级胺结构的天然氨基酸侧链基团是指天然存在于蛋白质中的氨基酸中除脯氨酸以外任一种氨基酸的侧链基团，比如非极性或疏水性氨基酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，又例如酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸(当带电荷时也称为天冬氨酸盐)、谷氨酸(当带电荷时也称为谷氨酸盐)、天冬酰胺和谷氨酰胺等，不含二级胺结构的非天然氨基酸侧链基团是指不包括于上文所述天然存在于蛋白质中的氨基酸列表中的氨基酸的侧链基团，具体包括天然存在氨基酸中(除脯氨酸以外)任一者的D-同分异构体，此外，还包括高丝氨酸、正亮氨酸和甲状腺素等，可以理解的是，本领域所公知的氨基酸侧链基团均可用于本发明中。本文中所述的“任意烷基”是指饱和烃基，即烷烃分子中少掉一个氢原子而成的烃基，具体实例可以是但不限于甲基、乙基等，所述的“任意官能团”指的是-X、-OH、-CHO、-COOH、-NO2、-SO3H、-NH2、RCO-等本领域中常规的决定有机化合物的化学性质的原子或原子团。
将所述化合物(Ⅰ)中的硝基-NO2还原为氨基-NH2，获得化合物(Ⅱ)；
在酸性有机溶剂中利用氧化剂将所述化合物(Ⅱ)中的氨基-NH2转化为重氮盐-N≡N，获得化合物(Ⅲ)；
利用还原剂脱除所述化合物(Ⅲ)中的重氮盐-N≡N，获得化合物(Ⅳ)。
本发明创新性的提出了一种转化方法，具体的说，本发明将连接有RBM的多肽中的硝基在还原条件下转化为氨基，然后在酸性有机溶剂中利用氧化剂将RBM上的氨基转化为重氮盐，最后利用还原剂脱除重氮盐，从而将RBM转化为HMB，由于HMB对三氟乙酸等多肽切割试剂非常敏感，因此后续容易脱除，从而可实现RBM基团的快速脱除。
进一步的，本发明中所述化合物(Ⅰ)的获得是通过FMOC固相法合成多肽的过程中引入RBM获得，主要过程包括采用FMOC固相合成法，固相树脂溶胀后，将氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，然后在最后一个氨基酸上接入RBM
Figure BDA0003062500940000061
其中，固相树脂为Fmoc固相合成法中常规采用的固相载体，包括但不限于Wang，Rink-Amide，Trt树脂等，氨基酸的缩合可以采用本领域中的常规手段，采用缩合剂例如2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、碱例如N,N二异丙基乙胺(DIEA)对氨基酸的羧基进行活化；
然后还原RBM引入产生的碳氮双键后(可以采用本领域中常规采用的硼氢化钠等进行还原)，继续采用FMOC固相合成法，缩合FMOC保护的氨基酸，而最后一个氨基酸为BOC保护的氨基酸，将RBM上的酚羟基乙酰化。由于FMOC固相合成法合成多肽及引入RBM属于现有技术，因此，本文中不再具体阐述。
进一步的，本发明中将所述化合物(Ⅰ)中的硝基-NO2还原为氨基-NH2的方式可以采用本领域中常规手段，比如通过无水SnCl2或氯化铬(CrCl2)进行还原，可以理解的是，其他能够将所述化合物(Ⅰ)中的硝基-NO2还原为氨基-NH2的还原剂均可用于本发明中，在本发明的一些具体的实施方式中，优选的，在2mM HCl的DMF溶液中，将化合物(Ⅰ)与SnCl2进行反应，其具体的反应比例可根据实际情况自行调整，因此这里不再赘述，
进一步的，所述获得化合物(Ⅲ)的步骤，具体为：在第一有机溶剂中加入酸、氧化剂和所述化合物(Ⅱ)进行反应，其中，所述第一有机溶剂的选择没有特别的限定，可采用本领域中常采用的有机溶剂，具体实例包括但不限于DCM(优选为体积比水/DCM＝1:1)、DMF或四氢呋喃，更优选的，采用本领域中较常采用的DMF。进一步的，在氨基转化为重氮盐的过程中，由于重氮盐一般容易分解，只有在酸液中比较稳定，因此，需要在酸性条件下进行反应，在酸性介质中利用亚硝酸的作用实现氨基到重氮盐的转化，具体反应机理如下，其中，酸或氧化剂的选择没有特别的限定，所述氧化剂可以是本领域中常规选择的可提供亚硝酸根的氧化剂，具体实例包括但不限于亚硝酸钠、亚硝酸叔丁酯或亚硝酸异戊酯，所述酸可以是本领域中任意常规的无机酸或有机酸，具体实例包括但不限于水杨酸、醋酸或氟硼酸。
氨基转化为重氮盐的反应机理：
Figure BDA0003062500940000071
举例来说，在本发明的一些具体的实施方式中，可以采用以下方式中的任意一种将化合物(Ⅱ)转化为化合物(Ⅲ)：
①在含有AcOH的水和DCM混合溶液中加入NaNO2，在0℃-10℃使NaNO2与化合物(Ⅱ)进行反应；
②在四氢呋喃溶液中加入亚硝酸叔丁酯(tBuNO2)和水杨酸，在25℃-40℃亚硝酸叔丁酯与化合物(Ⅱ)反应；
③在DMF溶液中加入亚硝酸叔丁酯(tBuNO2)和水杨酸，在25℃-40℃亚硝酸叔丁酯与化合物(Ⅱ)反应；
④在DMF溶液中加入亚硝酸异戊酯(Isoamyl nitrite)和HBF4，在25℃-40℃范围内亚硝酸异戊酯与化合物(Ⅱ)反应；
需要说明的是，以上仅仅是示例，其反应温度、添加量以及反应时间等没有特别的限定，可根据氧化剂和酸选择的不同体系进行调整，并且通过调整采用不同的氧化剂和酸体系、各组分的添加比例以及反应时间等可调整化合物(Ⅲ)的产率和纯度。
进一步的，所述获得化合物(IV)的步骤，具体为：在第二有机溶剂中加入还原剂和所述化合物(Ⅲ)进行反应，具体的说，RBM上的苯二氮盐接受来自合适供体的电子，导致苯环上碳氮单键断裂，释放N2，重氮盐脱除。其中，所述第二有机溶剂的选择同样没有特别的限定，可以采用本领域中常规的有机溶剂，在本发明的一些实施方式中，采用本领域中常用的DMF。
优选的，所述还原剂选自能够提供H-的还原剂，具体实例包括但不限于EtSH、NaBH4或NaBH3CN。
举例来说，在本发明的一些具体的实施方式中，可以采用以下方式中的任意一种将化合物(Ⅲ)转化为化合物(Ⅳ)：
①在含有乙硫醇(EtSH)的DMF溶液中，使化合物(Ⅲ)与Et-SH反应；
②在DMF溶液中，使化合物(Ⅲ)与NaBH4反应；
③在DMF溶液中，使化合物(Ⅲ)与NaBH3CN反应；
可以理解的是，以上几种反应过程仅仅是示例，此外，以上过程中，其反应温度、添加量以及反应时间等没有特别的限定，可根据还原体系进行调整，并且通过调整采用不同的还原体系、各组分的添加比例以及反应时间等可调整化合物(Ⅳ)的产率和纯度。
本发明第二方面提供了一种可脱除骨架修饰快速脱除的新方法，包括以下步骤：
采用如本发明第一方面所述的转化方法，将多肽序列上的RBM转化为HMB，获得所述化合物(IV)；
脱除所述化合物(IV)中的酰基官能团，获得化合物(V)
Figure BDA0003062500940000081
其中，本文中所述的“酰基官能团”指的是有机或无机含氧酸(如无机酸、有机羧酸或磺酸等)去掉一个羟基后剩余的基团，具体实例包括但不限于乙酰基、丙酰基、丁酰基等。将酰基官能团脱除的方式可以采用本领域中常规的方式，比如利用含有哌啶的DMF溶液进行处理，将酚羟基上的酰基官能团脱除，这里不再具体阐述；
采用多肽切割试剂将所述化合物(Ⅴ)中的HMB脱除，获得多肽，所述多肽切割试剂是三氟乙酸系切割试剂，可以采用本领域中常规的三氟乙酸多肽切割试剂，这里不再具体限定。
通过将多肽序列上的RBM转化为HMB后，可利用多肽切割试剂将RBM快速脱除，减少时间、人力和物力的消耗。需要说明的是，在上述过程中，脱除重氮盐后，部分反应条件可能存在反应体系残留有氨基未转化的化合物(Ⅱ)，因此，此时可再次用亚硝酸系氧化剂进行处理，从而消除副产物；进一步的，由于部分残留化合物(Ⅱ)在未转化重氮盐前酰基官能团已经掉落，也存在一些化合物(Ⅲ)在未脱除重氮盐前，酰基官能团掉落并且酰基官能团掉落后重氮盐很难脱除，因此，在亚硝酸系氧化剂处理后，对树脂进行酰基化处理以防止酚羟基上的酰基官能团掉落，进一步去除副产物。然后再次采用本发明中的新方法脱除重氮盐，从而消除副产物，提高反应产率。
举例来说，亚硝酸异戊酯、HBF4与多肽上RBM的氨基反应，将RBM上氨基转化为的叠氮化物的过程中，会产生副产物(①)即酚羟基的保护基酰基脱除，酰基一旦脱除，叠氮化物则很难去除。此外，将多肽上RBM上的叠氮化物脱除过程中也会产生副产物(①)同时产生副产物(②)，解决此副产物的方法为再次用亚硝酸氧化条件将氨基转化为重氮盐，然后将副产物(①)中裸露的酚羟基酰基化，最后再次用转化方法中的还原条件脱除重氮盐。
Figure BDA0003062500940000091
本发明第三方面提供了如本发明第四方面所述的可脱除骨架修饰快速脱除的新方法在制备多肽或蛋白中的应用。目前在制备多肽或蛋白的过程中存在诸多问题，比如现有的采用RBM策略的困难序列多肽的合成中RBM脱除时间较长，容易使多肽蛋白发生副反应；再比如泛素是一种存在于所有真核生物中的小蛋白，其由76个氨基酸组成，它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，蛋白质被泛素标记的过程称为泛素化过程。泛素化是真核生物体内普遍存在的翻译后修饰形式，参与蛋白质降解、信号转导、DNA损伤修饰等许多重要的生命活动过程，泛素修饰系统的紊乱与癌症、神经退行性疾病等许多重大疾病密切相关。因此泛素的合成及获得结构性质均一的泛素化蛋白对研究泛素修饰系统紊乱的疾病至关重要。早期，泛素的化学合成是将泛素分为三段然后依次化学连接，此过程操作步骤多，且需要分离纯化，耗时费力。随后研究人员开发固相一次性合成泛素，但几乎无法得到正确泛素产物，此后研究人员在一次性合成泛素中引入假二肽或异二肽，但假二肽异二肽成本太高。此外，若多肽序列中含有DG序列、DE序列，一般通过直接合成很难得到获得正确产物，因为DG序列(DE序列)会产生严重的脱水现象。而通过本发明第二方面所述的快速脱除的新方法制备多肽则解决了上述问题，一是由于RBM的引入打破了肽链氨基酸残基之间的相互作用，进而在多肽制备过程中，能够抑制多肽链二级结构的形成，即打破了羰基和氨基之间的氢键相互作用，减少了多肽合成过程聚集现象的产生，同时，RBM若放在DG、DL、DE序列之间，能够有效消除脱水现象的发生；二是将RBM转化为HMB后进行快速脱除，可获得天然多肽，极大的避免了副产物的产生，提高了多肽合成产率和纯度，极大的减少了时间、人力、物力的消耗。
本发明第四方面提供了一种多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛与固相树脂上的多肽N-端的氨基反应生成碳氮双键结构，获得第一多肽化合物，由于为现有技术，不再具体阐述；
S2、在有机溶液中，将所述第一多肽化合物与还原剂进行还原反应将所述碳氮双键结构还原为碳氮单键结构，获得第二多肽化合物，其目的是还原RBM引入的碳氮双键，该步骤中，所述有机溶液可以为常规选择，比如DMF溶液，这里的还原剂没有特别的限定，可以是本领域中的常规选择，具体实例包括但不限于NaBH4、三乙酰氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠；
S3、利用FMOC固相合成法延长所述第二多肽化合物，获得第三多肽化合物；
S4、对所述第三多肽化合物进行酰基化反应，获得第四多肽化合物，所述第四多肽化合物中连接有RBM，若酚羟基裸露，则RBM上叠氮化物脱除缓慢，因此，该步骤中通过酰基化处理将酚羟基封闭起来，以便随后的步骤中RBM上的叠氮化合物能够很快的脱除，其中，本文中所述的“酰基化反应”是指将多肽化合物中的酚羟基转化为酰基官能团的过程，由于酰基化反应为本领域中的常规反应过程，本发明中可以采用本领域中常规的酰化试剂，例如乙酸酐等；
S5、采用如权利要求7所述的快速脱除方法，获得多肽。
进一步的，该多肽制备方法中所述多肽没有特别的限定，可以是本领域中的常规选择，具体实例包括模型肽、糖肽、抗病毒环肽或一次性全合成泛素等多肽或蛋白，能够有效提高多肽的合成产率、辅助蛋白化学连接等，获得天然多肽或蛋白。
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更加清楚完整的说明。
实施例1
本实施例中公开了一种模型肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛与式(a1)所示固相树脂上的多肽接触，获得式(a2)所示固相树脂上的多肽，
Figure BDA0003062500940000101
其中，式(a1)所示的固相树脂采用Fmoc固相合成法获得，具体步骤为：将Rink AM树脂加入多肽合成管，用N,N二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)(体积比1：1)溶胀30min，接着加入20％哌啶的DMF溶液处理树脂5min和10min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。然后3.8eq的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，8eq的N,N二异丙基乙胺(DIEA)和4eq的Fmoc保护的目标肽C端第一个氨基酸溶于DMF中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应45min,再依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。然后将现配的混合溶液(3.8eq的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，8eq的N,N二异丙基乙胺(DIEA)和4eq的Fmoc保护的目标肽C端第二个氨基酸)加入树脂反应45min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。再加入20％哌啶的DMF溶液处理树脂5min和10min,依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。接下来的氨基酸的缩合重复上面的操作，获得式(a1)所示的固相树脂；
式(a2)所示的固相树脂上的多肽获得，具体步骤为：用DMF溶解5eq的2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛，然后加入到多肽合成管中，与被脱了N端Fmoc的式(a1)所示固相树脂上的多肽反应30min，从而获得式(a2)所示固相树脂上的多肽；
S2、在有机溶液中，使所述式(a2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，获得式(a3)所示固相树脂上的多肽，
Figure BDA0003062500940000111
具体操作为：用5eq的NaBH4的DMF溶液还原式(a2)所示固相树脂上的树脂多肽两次，每次5min，从而获得式(a3)所示固相树脂上的树脂的多肽；
S3、利用FMOC固相合成法继续延长所述式(a3)所示固相树脂上的多肽，获得式(a4)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000112
具体操作为：式(a3)所示固相树脂上的树脂多肽中被修饰的甘氨酸的后一个氨基酸通过2次HATU/DIEA缩合，每次2h，通过Fmoc固相合成技术继续延长多肽并在多肽N端连上BoC氨基酸，从而获得式(a4)所示固相树脂上的树脂的多肽；
S4、对式(a4)所示固相树脂上的多肽进行乙酰化，以便获得式(a5)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000121
具体操作为：将所得式(a4)所示固相树脂上的树脂的多肽用乙酸酐：DIEA：DMF＝1：1：8(体积比)处理2次，每次30min，对多肽修饰基团上的酚羟基进行乙酰化，从而获得式(a5)所示固相树脂上的树脂的多肽；
S5、采用本发明中所述的快速脱除方法，具体步骤为：
S51、将式(a5)所示固相树脂上的树脂的多肽片段用6M SnCl2/2Mm HCl的DMF溶液还原多肽修饰基团上的硝基，从而获得式(a6)所示固相树脂上的树脂的多肽
Figure BDA0003062500940000122
S52、在含有体积比为10％AcOH的水和DCM混合溶液(水：DCM＝1/1)中加入5eqNaNO2，在4°条件下NaNO2与所述式(a6)所示固相树脂上的多肽反应2次每次时间为10min，获得式(a7)所示固相树脂上的多肽,色谱表征结果图1，本实施例中此步骤的产率为80％
Figure BDA0003062500940000123
S53、在含有体积比为50％乙硫醇(EtSH)的DMF溶液中，使所述式(a7)所示固相树脂上的多肽与Et-SH反应12h，获得式(a8)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果见图2，本实施例中此步骤的产率为75％
Figure BDA0003062500940000131
S6、由于反应体系中可能残留部分式(a6)所述固相树脂上的多肽，因此，采用在DMF溶液中加入5eq亚硝酸异戊酯(Isoamyl nitrite)和5eq HBF4，在室温条件下与步骤S53获得的反应体系反应15min；然后对树脂上的肽进行乙酰化，并再次在50％Et-SH的DMF溶液中，使固相树脂上的多肽与Et-SH反应1.5h；
S7、脱除式(a8)所示固相树脂上的多肽上的乙酰基，获得式(a9)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000132
具体操作为：用含有20％哌啶的DMF溶液处理式(a8)所示固相树脂上的多肽，脱除酚羟基上的乙酰基，从而获得式(a9)所示固相树脂上的多肽；
S8、采用多肽切割试剂将所述式(a9)所示固相树脂上的多肽从固相树脂上切下来，获得式(a10)所示多肽
H-GVKDGAQKFNG-OH (a10)，
具体操作为将所得的树脂分别用大量DMF、DCM洗涤，真空干燥后，外加10mL酸性切割试剂(88％三氟乙酸、5％苯酚、5％水、2％茴香硫醚)处理2h，以便获得式(a10)所示多肽，即为目标多肽片段。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽，利用分析型高效液相色谱对粗肽进行分析处理，经质谱确定结构正确。
实施例2
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，不同之处在于：步骤S52中反应温度为0℃。
实施例3
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，不同之处在于：步骤S52中反应温度为10℃。
实施例4
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S52、在四氢呋喃溶液中加入5eq亚硝酸叔丁酯(tBuNO2)和1eq水杨酸，在37°条件下亚硝酸叔丁酯与所述式(a6)所示固相树脂上的多肽反应1h，获得式(a7)所示固相树脂上的多肽，此步骤产率25％”。
实施例5
本实施采用与实施例4相同的实施方式，不同之处在于：步骤S52中反应温度为25℃。
实施例6
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S52、在DMF溶液中加入10eq亚硝酸叔丁酯(tBuNO2)和5eq水杨酸，在37°条件下亚硝酸叔丁酯与所述式(a6)所示固相树脂上的多肽反应15min，获得式(a7)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果如图3所示，此步骤产率75％”。
实施例7
本实施例采用与实施例6相同的实施方式，不同之处在于：步骤S52中反应温度为40℃。
实施例8
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S52、在DMF溶液中加入10eq亚硝酸异戊酯(Isoamyl nitrite)和5eq HBF4，在37°条件下亚硝酸异戊酯与所述式(a6)所示固相树脂上的多肽反应15min，获得式(a7)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果见图4所示的，此步骤产率90％”。
实施例9
本实施例与实施例8采用相同的实施方式，不同之处在于，“步骤S52中在DMF溶液中加入7eq亚硝酸异戊酯和5eq HBF4”。
实施例10
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S52、在DMF溶液中加入5eq亚硝酸异戊酯(Isoamyl nitrite)和5eq HBF4，在室温条件下亚硝酸异戊酯与所述式(a6)所示固相树脂上的多肽反应15min，获得式(a7)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果见图5所示的，此步骤产率98％”。
实施例11
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S53、在含有体积比为50％乙硫醇Et-SH的DMF溶液中，使所述式(a7)所示固相树脂上的多肽与Et-SH在60℃反应1.5h，获得式(a8)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果见图6所示的，此步骤产率95％”。
实施例12
本实施例采用与实施例11相同的实施方式，不同之处在于：步骤S53中反应温度为50℃。
实施例13
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S53、在DMF溶液中，使所述式(a7)所示固相树脂上的多肽与5eqNaBH4在37°下反应15min，获得式(a8)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果见图7所示的，此步骤产率50％”。
实施例14
本实施例采用与实施例13相同的实施方式，不同之处在于，“步骤S53、在DMF溶液中，使所述式(a7)所示固相树脂上的多肽与3eqNaBH4在37°下反应15min，获得式(a8)所示固相树脂上的多肽”。
实施例15
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S53、在DMF溶液中，使所述式(a7)所示固相树脂上的多肽与5eq NaBH3CN在37°下反应1h，获得式(a8)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果见图8所示的，此步骤产率60％”。
实施例16
本实施例采用与实施例1相同的实施方式，区别之处仅在于：本实施例中，“步骤S53、在DMF溶液中，使所述式(a7)所示固相树脂上的多肽与5eqNaBH3CN在60℃下反应25min，获得式(a8)所示固相树脂上的多肽，色谱表征结果见图9所示的，此步骤产率92％”。
实施例17
本实施例采用与实施例16相同的实施方式，不同之处在于，“步骤S53中，在DMF溶液中，使所述式(a7)所示固相树脂上的多肽与8eqNaBH3CN在50℃下反应，获得式(a8)所示固相树脂上的多肽”。
实施例18
本实施例采用与实施例16相同的实施方式，不同之处在于，步骤S53中采用10eqNaBH3CN与式(a7)所示固相树脂上的多肽进行反应。
实施例19
本实施例中公开了一种一次性全合成泛素的制备方法，包括以下步骤：
S1、使2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(b1)所示固相树脂上的多肽(表征见图10)接触，获得式(b2)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000161
其中，式(b1)所示固相树脂上的多肽采用Fmoc固相多肽合成法获得，具体步骤为：将Rink AM树脂加入多肽合成管，用N,N二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)(体积比1：1)溶胀30min，接着加入20％哌啶的DMF溶液处理树脂5min和10min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。然后3.8eq的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，8eq的N,N二异丙基乙胺(DIEA)和4eq的Fmoc保护的目标肽C端第一个氨基酸溶于DMF中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应45min,再依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。然后将现配的混合溶液(3.8eq的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，8eq的N,N二异丙基乙胺(DIEA)和4eq的Fmoc保护的目标肽C端第二个氨基酸)加入树脂反应45min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。再加入20％哌啶的DMF溶液处理树脂5min和10min,依次用DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次。接下来的氨基酸的缩合重复上面的操作，以便获得式(b1)所示固相树脂上的多肽。
式(b2)所示固相树脂上的多肽的获得，具体操作为：用DMF溶解5eq的2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛，然后加入到多肽合成管中，与被脱了N端Fmoc的式(b1)所示固相树脂上的多肽反应30min，从而获得式(b2)所示固相树脂上的多肽，其中，2-羟基-4甲氧基-5硝基苯甲醛与式(b1)所示固相树脂上的多肽的摩尔比为5：1；
S2、在有机溶液中，使所述式(b2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，获得式(b3)所示固相树脂上的多肽，其中，所述有机溶液选自DMF溶液
Figure BDA0003062500940000171
具体操作为：采用NaBH4的DMF溶液还原式(b2)所示固相树脂上的树脂多肽两次，每次5min，从而获得式(b3)所示固相树脂上的树脂的多肽，其中，式(b2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4的摩尔比为1：5；
S3、利用FMOC固相合成法继续延长所述式(b3)所示固相树脂上的多肽，获得式(b4)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000172
具体操作为：式(b3)所示固相树脂上的树脂多肽中被修饰的甘氨酸的后一个氨基酸通过2次HATU/DIEA缩合，每次2h，通过Fmoc固相合成技术继续延长多肽并在多肽N端连上BoC氨基酸，从而获得式(b4)所示固相树脂上的树脂的多肽；
S4、对式(b4)所示固相树脂上的多肽进行乙酰化，获得式(b5)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000181
具体操作为：将式(b4)所示固相树脂上的树脂的多肽用乙酸酐：DIEA：DMF＝1：1：8处理2次，每次30min，对多肽修饰基团上的酚羟基进行乙酰化，从而获得式(b5)所示固相树脂上的树脂的多肽(表征见图11)；
S5、采用快速脱除方法，具体步骤为：
S51、将式(b5)所示固相树脂上的树脂的多肽片段用6M SnCl2/2mM HCl的DMF溶液还原多肽修饰基团上的硝基，从而获得式(b6)所示固相树脂上的树脂的多肽
Figure BDA0003062500940000182
S52、将式(b6)所示固相树脂上的树脂的多肽片段，用亚硝酸异戊酯(Isoamylnitrite)、HBF4的DMF溶液在室温条件下处理15min，获得式(b7)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000183
S53、在含有体积比50％Et-SH的DMF溶液中，使所述式(b7)所示固相树脂上的多肽与Et-SH反应1.5h，获得式(b8)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000191
具体操作为：在DMF溶液中，使所述式(b7)所示固相树脂上的多肽与NaBH3CN在60°下反应25min，获得式(b8)所示固相树脂上的多肽，其中，式(b7)所示固相树脂上的多肽与NaBH3CN的摩尔比为1∶5；
S6、因NaBH3CN提供的H-会使酚羟基上的保护基乙酰基部分脱除产生副产物，以及在此过程有少量叠氮化物重新变回氨基，因此，为了提高产物纯度，重复步骤S52、采用在DMF溶液中加入5eq亚硝酸异戊酯(Isoamyl nitrite)和5eq HBF4，在室温条件下与步骤S53的反应体系反应15min；然后对树脂上的肽进行乙酰化，重复步骤S53；
S7、脱除式(b8)所示固相树脂上的多肽的乙酰基，获得式(b9)所示固相树脂上的多肽
Figure BDA0003062500940000192
具体操作为：用含有20％哌啶的DMF溶液脱除酚羟基上的乙酰基，从而获得式(b9)所示固相树脂上的多肽；
S8、采用多肽切割试剂将所述式(b9)所示固相树脂上的多肽从固相树脂上切下来，获得式(b10)所示多肽(表针结果见图12)，所述多肽切割试剂选自三氟乙酸，
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG (b10)
具体操作为：将所得的树脂分别用大量DMF、DCM洗涤，真空干燥后，外加10mL酸性切割试剂(88％三氟乙酸、5％苯酚、5％水、2％茴香硫醚)处理2h，以便获得目标多肽片段。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离心获得粉末状粗肽，利用分析型高效液相色谱对粗肽进行分析处理，经质谱确定结构正确，获得的目标多肽片段的色谱和质谱图如图10-图12中所示的。
实施例20
本实施例采用与实施例19相同的实施方式，区别仅在于：步骤S53、使所述式(b7)所示固相树脂上的多肽与EtSH反应1.5h获得式(b8)所示固相树脂上的多肽。
实施例21
本实施例采用与实施例19相同的实施方式，不同之处在于，步骤S2中采用三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂。
实施例22
本实施例采用与实施例19相同的实施方式，不同之处在于，步骤S2中采用氰基硼氢化钠作为还原剂。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种可脱除骨架修饰快速脱除的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用转化方法，将多肽序列上的RBM转化为HMB，获得化合物（IV）；
脱除化合物（IV）中的酰基官能团，获得化合物（V）
Figure QLYQS_1
；
采用多肽切割试剂将化合物（Ⅴ）中的HMB脱除，获得多肽，所述多肽切割试剂为三氟乙酸；
其中，所述转化方法包括以下步骤：
Figure QLYQS_2
提供化合物（Ⅰ），其中，R1为氨基酸的侧链基团，R2为不含二级胺结构的氨基酸侧链基团，R3为-CH3；所述化合物（Ⅰ）通过FMOC固相法合成多肽的过程中引入RBM获得，所述多肽为模型肽或一次性全合成泛素；
将所述化合物（Ⅰ）中的硝基-NO2还原为氨基-NH2，获得化合物（Ⅱ）；
在第一有机溶剂中加入酸、氧化剂和所述化合物（Ⅱ），将所述化合物（Ⅱ）中的氨基-NH2转化为重氮盐-N≡N，获得化合物（Ⅲ）；所述第一有机溶剂选自DCM、DMF或四氢呋喃；所述酸选自醋酸或氟硼酸；所述氧化剂选自亚硝酸钠或亚硝酸异戊酯；
利用还原剂脱除所述化合物（Ⅲ）中的重氮盐-N≡N，获得化合物（Ⅳ），所述还原剂选自EtSH或NaBH3CN。
2.如权利要求1所述的可脱除骨架修饰快速脱除的方法，其特征在于，获得所述化合物（IV）的步骤，具体为：在第二有机溶剂中加入还原剂和所述化合物（Ⅲ）进行反应，其中，所述第二有机溶剂选自DMF。
3.如权利要求1或2所述的可脱除骨架修饰快速脱除的方法在制备多肽或蛋白中的应用。
4.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将2-羟基-4-甲氧基-5硝基苯甲醛与固相树脂上的多肽N-端的氨基反应生成碳氮双键结构，获得第一多肽化合物；
S2、在有机溶液中，将所述第一多肽化合物与还原剂进行还原反应将所述碳氮双键结构还原为碳氮单键结构，获得第二多肽化合物，其中，所述有机溶液选自DMF溶液，所述还原剂选自NaBH4、三乙酰氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠；
S3、利用FMOC固相合成法延长所述第二多肽化合物，获得第三多肽化合物；
S4、对所述第三多肽化合物进行酰基化反应，获得第四多肽化合物，所述第四多肽化合物中连接有RBM；
S5、采用如权利要求1或2所述的可脱除骨架修饰快速脱除的方法，获得多肽。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述多肽包括模型肽或一次性全合成泛素。
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