CN109354608A - 一种基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法 - Google Patents

一种基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法 Download PDF

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CN109354608A CN201811316360.7A CN201811316360A CN109354608A CN 109354608 A CN109354608 A CN 109354608A CN 201811316360 A CN201811316360 A CN 201811316360A CN 109354608 A CN109354608 A CN 109354608A
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徐红岩
解燕娟
杨明
彭瑞涛
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Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
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Shanghai GL peptide Ltd
Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法，主要解决现有合成方法存在合成周期比较长，溶剂用量比较大，粗品纯度和产率低的技术问题。本发明合成步骤：先合成二肽Fmoc‑Leu‑Arg(Pbf)‑OH，Fmoc‑Tyr(tBu)‑D‑Ala‑OH，Fmoc‑Trp(Boc)‑Ser(tBu)‑OH三个片段；以脯氨酸‑2‑氯‑三苯甲基‑氯树脂为起始树脂，采用固相合成方法逐一偶联每个二肽，合成得到侧链全保护的肽链树脂，然后全保护切割，得到全保护多肽。然后对全保护多肽进行C端乙氨化，得到阿林瑞林的全保护片段，再对阿拉瑞林全保护片段切割去除侧链保护基团，得到阿拉瑞林的粗品肽。

Description

一种基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法
技术领域
本发明属于药肽合成的技术领域，特别涉及基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法。
背景技术
阿拉瑞林结构式：
英文名称：Alarelin；CAS号：79561-22-1；分子式：C56H78N16O12；分子量：1167.32
序列：PGLU-HIS-TRP-SER-TYR-D-ALA-LEU-ARG-PRO-NHET ACETATE SALT。
现有阿拉瑞林的合成方法,例如：中国专利201210204261.6公开了一种阿拉瑞林的一种固液结合的合成方法。该发明主要合成步骤：1）以脯氨酸-2氯-三苯甲基-氯树脂为起始树脂采用芴甲氧羰基固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂；2）对侧链全保护的肽链树脂进行切割，得到全保护的肽链片段pGluP-9；3）对全保护的肽链片段pGluP-9进行C端乙胺化，得到阿拉瑞林的全保护片段；4）对阿拉瑞林的全保护片段切割除去侧链保护基，得到阿拉瑞林粗品肽。该专利存在下述问题：合成周期比较长，溶剂用量比较大，粗品纯度和产率低，产品色谱见图1。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于Fmoc二肽的合成阿拉瑞林的方法，主要解决现有合成方法存在合成周期比较长，溶剂用量比较大，粗品纯度和产率低的技术问题。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于Fmoc二肽的合成醋酸阿拉瑞林的方法，包括以下步骤：1）先合成二肽Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH三个片段；2）以H-Pro-2CL-Trt 树脂为起始树脂，采用固相合成方法逐一偶联三个二肽片段，然后在逐一偶联Fmoc-His(Trt)-OH和PyrGlu，合成得到侧链全保护的肽链树脂；3）对侧链全保护的肽链树脂进行切割，得到全保护的肽链片段PGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH；4) 对全保护片段进行C端乙胺化，得到阿拉瑞林的全保护片段； 5）对阿拉瑞林全保护片段进行切割去除侧链保护基团，得到阿拉瑞林粗品肽。
合成阿拉瑞林，具体步骤如下：1)取H-Pro-二氯树脂用二氯甲烷浸泡，使树脂充分膨胀，抽干，以DMF为溶剂，依次加入Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH，NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；H-Pro-2cl-trt 树脂，取代度为：0.3-0.8mmol/g，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH的量为树脂摩尔量的2-3倍；
2）在步骤1的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
3）在步骤2 Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH，NMM,用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
4)在步骤3 Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-His(Trt)-OH，NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
5）在步骤4 Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Pyr(焦谷氨酸），NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
6）在上述步骤中所获得的Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分含量1%TFA/DCM 全保护切割5-6次，每次5分钟。收集的液体浓缩后加水析出固体，然后洗涤5-6次，得到全保护片段多肽Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH；
7）将全保护片段溶于DMF中，加入乙胺盐酸盐，DIEA，用HBTU/HOBT为缩合试剂，搅拌反应过夜，反应结束后，加柠檬酸饱和溶液，析出白色固体，抽干，真空干燥，获得PGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHET；
8）将全保护片段进行切割（TFA:H2O:TIS体积比=95:2:3），反应2-3小时，反应结束后加乙醚沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5-6次，真空干燥，获得阿拉瑞林粗品。粗品收率85%，粗品纯度80%。
本发明的有益技术效果：本发明主要是运用二肽片段合成，能节省合成周期，减少反应步骤，减少溶剂用量，更为重要的是能提高产品的收率及纯度。
附图说明
图1现有合成方法产品的色谱图。
图2为本发明产品的色谱图。
具体实施方式
先合成三个二肽片段
1)Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH
简单步骤：
1.Fmoc-Leu-OH + H-Osu + DCC —→Fmoc-Leu-Osu
2.Fmoc-Leu-Osu + H-Arg(pbf)-OH —→Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH
实际操作：
1.三口瓶中，加入Fmoc-Leu-OH,加入H-Osu，用THF搅拌溶清，2-8℃滴加DCC的THF溶液，反应过夜，抽滤，即Fmoc-Leu-Osu 滤液A；
2.三口瓶中加入水， Na2CO3 搅拌溶清，加入H-Arg(pbf)-OH ,搅拌降温，滴加滤液A，控制温度在2-8℃之间，3h加完，反应过夜。抽滤，浓缩滤液，加入适量水，用乙醚萃取杂质，用乙酯萃取产品，水洗盐水洗干燥。抽滤，浓缩，加石油醚结晶，得Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH ，烘干得产品；
（TLC 85：10：5 Rf=0.4）HPLC:95.1% 得率 66.2%；
结构式，分子式分子量
C40H51N5O8S FW:761.9。
2)Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH
简单步骤：
1.Fmoc-Tyr(tBu)-OH + H-Osu + DCC —→Fmoc-Tyr(tBu)-Osu
2.Fmoc-Tyr(tBu)-Osu + H-D-Ala-OH —→Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH
实际操作：
1.三口瓶中，加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH,加入H-Osu，用THF搅拌溶清，2-8℃滴加DCC的THF溶液，反应过夜，抽滤，即Fmoc-Tyr(tBu)-Osu 滤液A；
2.三口瓶中加入水，Na2CO3 搅拌溶清，加入H-D-Ala-OH ,搅拌降温，滴加滤液A，控制温度在2-8℃之间，3h加完，反应过夜。抽滤，浓缩滤液，加入适量水，用乙醚萃取杂质，用乙酯萃取产品，水洗盐水洗干燥。抽滤，浓缩，加石油醚结晶，得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，烘干得产品；
（TLC 85：10：5 Rf=0.5）HPLC:97.6% 得率 70.8%；
结构式，分子式分子量
C31H34N2O6 FW:530.61。
3) Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH
简单步骤：
3.Fmoc-Trp(Boc)-OH + H-Osu + DCC —→Fmoc-Trp(Boc)-Osu
4.Fmoc-Trp(Boc)-Osu + H-Ser(tBu)-OH —→Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH
实际操作：
1.三口瓶中，加入Fmoc-Trp(Boc)-OH,加入H-Osu，用THF搅拌溶清，2-8℃滴加DCC的THF溶液，反应过夜，抽滤，即Fmoc-Trp(Boc)-Osu 滤液备用A；
2.三口瓶中加入水， Na2CO3搅拌溶清，加入H-Ser(tBu)-OH ,搅拌降温，滴加滤液A，控制温度在2-8℃之间，3h加完，反应过夜。抽滤，浓缩滤液，加入适量水，用乙醚萃取杂质，用乙酯萃取产品，水洗盐水洗干燥。抽滤，浓缩，加石油醚结晶，得Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH，烘干得产品；
（TLC 85：10：5 Rf=0.5）HPLC:96.2% 得率 71.3%；
结构式，分子式分子量
C38H43N3O8 FW:669.7。
实施例1，合成阿拉瑞林具体步骤如下：1)取H-Pro-二氯树脂用二氯甲烷浸泡，使树脂充分膨胀，抽干，以DMF为溶剂，依次加入Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH，NMM，用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应1.4小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；H-Pro-2cl-trt 树脂取代度为：0.5mmol/g，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH的量为树脂摩尔量的2.5倍；
2）在步骤1的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，NMM,用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应1.5小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
3）在步骤2 Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH，NMM，用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应1.5小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
4)在步骤3 Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-His(Trt)-OH，NMM，用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应1.5小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
5）在步骤4 Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Pyr(焦谷氨酸），NMM，用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应1.5小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
6）在上述步骤中所获得的Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分含量1%TFA/DCM 全保护切割5-6次，每次5分钟。收集的液体浓缩后加水析出固体，然后洗涤5-6次，得到全保护片段多肽Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH；
7）将全保护片段溶于DMF中，加入乙胺盐酸盐，DIEA，用HBTU/HOBT为缩合试剂，搅拌反应过夜，反应结束后，加柠檬酸饱和溶液，析出白色固体，抽干，真空干燥，获得PGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHET；
8）将全保护片段进行切割（TFA:H2O:TIS体积比=95:2:3），反应2-3小时，反应结束后加乙醚沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5-6次，真空干燥，获得阿拉瑞林粗品。粗品收率85%，粗品纯度80%；产品色谱见图2。
实施例2，合成阿拉瑞林，具体步骤如下：1)取H-Pro-二氯树脂用二氯甲烷浸泡，使树脂充分膨胀，抽干，以DMF为溶剂，依次加入Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH，NMM，用TBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应40分钟，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；H-Pro-2cl-trt 树脂取代度为：0.8mmol/g，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH的量为树脂摩尔量的3倍；
2）在步骤1的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，NMM，用TBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应40分钟，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
3）在步骤2 Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH，NMM，用TBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应40分钟，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂;
4)在步骤3 Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-His(Trt)
-OH，NMM，用TBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应40分钟，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
5）在步骤4 Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Pyr(焦谷氨酸），NMM，用TBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应40分钟，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
6）在上述步骤中所获得的Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分含量1%TFA/DCM 全保护切割5-6次，每次5分钟。收集的液体浓缩后加水析出固体，然后洗涤5-6次，得到全保护片段多肽Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH；
7）将全保护片段溶于DMF中，加入乙胺盐酸盐，DIEA，用HBTU/HOBT为缩合试剂，搅拌反应过夜，反应结束后，加柠檬酸饱和溶液，析出白色固体，抽干，真空干燥，获得PGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHET；
8）将全保护片段进行切割（TFA:H2O:TIS体积比=95:2:3），反应2小时，反应结束后加乙醚沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5-6次，真空干燥，获得阿拉瑞林粗品，色谱图参照实施例1。
实施例3，合成阿拉瑞林具体步骤如下：1)取H-Pro-二氯树脂用二氯甲烷浸泡，使树脂充分膨胀，抽干，以DMF为溶剂，依次加入Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH，NMM，用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；H-Pro-2cl-trt 树脂取代度为：0.3mmol/g，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH的量为树脂摩尔量的3倍；
2）在步骤1的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，NMM，用TBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
3）在步骤2 Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH，NMM，用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂;
4)在步骤3 Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-His(Trt)-OH，NMM，用TBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
5）在步骤4 Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应20分钟，抽干，DMF洗涤5-6次，抽干，以DMF作为溶剂，加入Pyr(焦谷氨酸），NMM，用HBTU/HOBT混合物为缩合剂，反应2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
6）在上述步骤中所获得的Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分含量1%TFA/DCM 全保护切割5-6次，每次5分钟。收集的液体浓缩后加水析出固体，然后洗涤5-6次，得到全保护片段多肽Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH；
7）将全保护片段溶于DMF中，加入乙胺盐酸盐，DIEA，用HBTU/HOBT为缩合试剂，搅拌反应过夜，反应结束后，加柠檬酸饱和溶液，析出白色固体，抽干，真空干燥，获得PGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHET；
8）将全保护片段进行切割（TFA:H2O:TIS体积比=95:2:3），反应3小时，反应结束后加乙醚沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5-6次，真空干燥，获得阿拉瑞林粗品，色谱图参照实施例1。

Claims (5)

1.一种基于Fmoc二肽的合成醋酸阿拉瑞林的方法，其特征是：包括以下步骤：1）先合成二肽Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH三个片段；2）以H-Pro-2CL-Trt 树脂 为起始树脂，采用固相合成方法逐一偶联三个二肽片段，然后在逐一偶联Fmoc-His(Trt)-OH和PyrGlu，合成得到侧链全保护的肽链树脂；3）对侧链全保护的肽链树脂进行切割，得到全保护的肽链片段PGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH；4) 对全保护片段进行C端乙胺化，得到阿拉瑞林的全保护片段； 5）对阿拉瑞林全保护片段进行切割去除侧链保护基团，得到阿拉瑞林粗品肽。
2.根据权利要求1所述的一种基于Fmoc二肽的合成醋酸阿拉瑞林的方法，其特征是：Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH合成包括以下步骤：第一步，反应容器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH,加入H-Osu，用THF搅拌溶清，2-8℃滴加DCC的THF溶液，反应过夜，抽滤，即Fmoc-Tyr(tBu)-Osu滤液A；第二步，反应容器中加入水，Na2CO3 搅拌溶清， 加入H-D-Ala-OH ,搅拌降温，滴加滤液A，控制温度在2-8℃之间，3h加完，反应过夜；抽滤，浓缩滤液，加入适量水，用乙醚萃取杂质，用乙酯萃取产品，水洗盐水洗干燥；抽滤，浓缩，加石油醚结晶，得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH。
3.根据权利要求1所述的一种基于Fmoc二肽的合成醋酸阿拉瑞林的方法，其特征是：Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH合成包括以下步骤：第一步，反应容器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH,加入H-Osu，用THF搅拌溶清，2-8℃滴加DCC的THF溶液，反应过夜，抽滤，即Fmoc-Tyr(tBu)-Osu 滤液A；第二步，反应容器中加入水，Na2CO3 搅拌溶清， 加入H-D-Ala-OH ,搅拌降温，滴加滤液A，控制温度在2-8℃之间，3h加完，反应过夜；抽滤，浓缩滤液，加入适量水，用乙醚萃取杂质，用乙酯萃取产品，水洗盐水洗干燥；抽滤，浓缩，加石油醚结晶，得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH。
4.根据权利要求1所述的一种基于Fmoc二肽的合成醋酸阿拉瑞林的方法，其特征是：Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH合成包括以下步骤：第一步，反应容器中加入Fmoc-Trp(Boc)-OH,加入H-Osu，用THF搅拌溶清，2-8℃滴加DCC的THF溶液，反应过夜，抽滤，即Fmoc-Trp(Boc)-Osu 滤液备用A；第二步，加入水， Na2CO3搅拌溶清，加入H-Ser(tBu)-OH ,搅拌降温，滴加滤液A，控制温度在2-8℃之间，3h加完，反应过夜；抽滤，浓缩滤液，加入适量水，用乙醚萃取杂质，用乙酯萃取产品，水洗盐水洗干燥；抽滤，浓缩 ，加石油醚结晶，得Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH。
5.根据权利要求1所述的一种基于Fmoc二肽的合成醋酸阿拉瑞林的方法，其特征是：步骤2）到步骤5）具体为：①取H-Pro-二氯树脂用二氯甲烷浸泡，使树脂充分膨胀，抽干，以DMF为溶剂，依次加入Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH，NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤5-6次，抽干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；H-Pro-2cl-trt 树脂 取代度为：0.3-0.8mmol/g，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH的量为树脂摩尔量的2-3倍；
②在步骤①的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应后抽干，DMF洗涤，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-OH，NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
③在步骤②Fmoc-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应后抽干，DMF洗涤，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应后抽干，DMF洗涤，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-OH，NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂；
④在步骤③Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt树脂 中加入质量百分浓度20%哌啶反应后抽干，DMF洗涤，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应后抽干，DMF洗涤，抽干，以DMF作为溶剂，加入Fmoc-His(Trt)-OH，NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂 ；
⑤在步骤④Fmoc-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分浓度20%哌啶反应后抽干，DMF洗涤，抽干，以DMF作为溶剂，加入质量百分浓度20%哌啶反应后抽干，DMF洗涤，抽干，以DMF作为溶剂，加入Pyr(焦谷氨酸），NMM，用HBTU/HOBT或TBTU/HOBT中的一种混合物为缩合剂，反应40分钟-2小时，茚三酮法检测反应中点，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂 ；
⑥在上述步骤中所获得的Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-2cl-trt 树脂中加入质量百分含量1%TFA/DCM 全保护切割5-6次；收集的液体浓缩后加水析出固体，然后洗涤，得到全保护片段多肽Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH；
⑦将全保护片段溶于DMF中，加入乙胺盐酸盐，DIEA，用HBTU/HOBT为缩合试剂，搅拌反应过夜，反应结束后，加柠檬酸饱和溶液，析出白色固体，抽干，真空干燥，获得PGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHET；
⑧将全保护片段进行切割，反应2-3小时，反应结束后加乙醚沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤，真空干燥，获得阿拉瑞林粗品。
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