CN105622726A - 一种醋酸亮丙瑞林的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种醋酸亮丙瑞林的制备方法。主要解决现有醋酸亮丙瑞林制备方法存在生产工序复杂、周期长、成本高、收率低、转盐困难等技术问题。本发明的技术方案是：通过固相合成的方法得到亮丙瑞林粗品，对亮丙瑞林粗品进行溶解、过滤、检测后利用反相高相液相色谱系统对其进行粗纯、精纯、浓缩、转盐、再浓缩、过滤，最后进行冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品。本发明所述的纯化制备方法既适合于实验室研发，也适合于大规模的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，具体为一种利用反相高效液相色谱法，对固相合成的亮丙瑞林粗品进行等度和梯度洗脱，并对其进行转盐的制备方法。
背景技术
前列腺癌在全球范围内十分常见，世界卫生组织国际癌症研究机构于2012统计，该年全球新诊断的前列腺癌患者为110万，约占新增癌症病例总数的15%，即成为全球范围内男性第二常见的癌症。美国癌症学会（ACS）发布的《2015年癌症统计》报告预计，2015年美国的新发癌症病例为1658370人，其中26%的男性病例为前列腺癌，是男性好发癌症中的首位。与欧美等发达国家相比，中国的前列腺癌发病率较低，但却在快速上升中。据统计，中国前列腺癌的发病率在近二十年间增长了超过10倍，成为男性恶性肿瘤的第6位。中国抗癌协会泌尿男性生殖系肿瘤专业委员会的数据显示，截止至去年年底，中国前列腺癌每年新发病例达330万人。其中经济发达地区尤为严重，2009年的统计数据显示，城市地区的发病率比农村地区高四倍以上，而北京、上海、广州的发病率分别为19.3/10万、32.23/10万、17.57/10万。
多肽、蛋白质是生命体内一类具有特定生物活性，对机体生命活动发挥重要调节功能的活性物质。随着生物技术和多肽合成技术的发展，这些生物活性分子也大量的可以利用人工的方法获得，并进行鉴定、分离和纯化。醋酸亮丙瑞林是一种常用的激素类抗恶性肿瘤药物，是促性腺素释放激素(LHRH)类似物，含有9个氨基酸的多肽，其促黄体生成激素（LH）释放活性约为LH-RH的15倍，它的抑制垂体-性腺系统功能的作用也强于LH-RH。醋酸亮丙瑞林是高活性的LH-RH类似物，由于它对蛋白分解酶的抵抗力和对LH-RH受体的亲和力都比LH-RH强，所以能有效地抑制垂体-性腺系统的功能。临床上具有很大的应用价值。醋酸亮丙瑞林从1989年批准上市以来，用于治疗子宫内膜异位症、子宫肌瘤、中枢性性早熟症、晚期前列腺癌的效果已经得到公认。其毒副作用小，已经成为治疗晚期前列腺癌的首选药物。
醋酸亮丙瑞林可以通过人工固相合成的方法得到，并利用反相高效液相色谱对其进行分离纯化。高效液相色谱经过30多年的快速发展，已经取得了长足的进步，其中反相高效液相色谱因其良好的选择性，具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点，在多肽的分离纯化中备受青睐，其应用范围不断扩大，具有广阔前景。利用反相高效液相色谱对多肽进行分离纯化时，反向色谱柱填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相，通常使用十八烷基硅烷键合硅胶。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常以水、缓冲液为水相，甲醇、乙腈、异丙醇等为有机相，水相和有机相组成混合试剂进行二元梯度洗脱。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。
传统的转盐方法是利用玻璃柱或者聚乙烯柱里面装填阴阳离子树脂，利用离子交换的原理实现多肽产品的转盐过程。另外利用传统阴阳离子交换原理，对多肽产品进行转盐，步骤1）在调整多肽产品液体的PH后，上样挂柱2）冲洗样品3）利用酸碱调整冲洗液的PH后将多肽产品冲洗下来，在此过程中，每一个环节都要取少许的流出液进行HPLC检测，确认冲洗干净后，方可进行下一步工作。所以此方法，工作流程多，时间消耗大，而且会产生大量的废液，更重要的是最后收集的多肽产品合格液体积大，不利于下面的浓缩和冻干工作。另外需要购置仪器设备和阴阳离子填料，还需另外安排实验场地和人员，耗费了大量的人力物力。
2009年11月上海丽珠制药有限公司获得注射用醋酸亮丙瑞林微球药品批文。2011年8月美国FDA批注了Abbott公司每3个月注射1剂用醋酸亮丙瑞林。2012年2月杭州中肽生化有限公司醋酸亮丙瑞林产品零缺陷通过了美国FDA现场审查，成为国内通过FDA检查的唯一多肽制造商。国内外许多制药公司也在积极研发优化醋酸亮丙瑞林微球工艺，使其缓释周期更长。另外国内外不乏关于亮丙瑞林的文献，但是少有利用反相高效液相色谱法对亮丙瑞林进行粗纯、精纯、转盐方法的相关文献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱系统对醋酸亮丙瑞林进行纯化制备的方法。主要解决现有醋酸亮丙瑞林纯化制备方法存在生产工序复杂、周期长、成本高、收率低转盐困难等技术问题。本发明的技术方案是：通过固相合成的方法得到亮丙瑞林粗品，对亮丙瑞林粗品进行溶解、过滤、检测后利用反相高相液相色谱系统对其进行粗纯、精纯、浓缩、转盐、再浓缩、过滤，最后进行冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品。本发明所述的纯化制备方法，通过改变醋酸亮丙瑞林纯化制备的生产工艺，达到了缩短生产周期，降低纯化制备成本，提高产品收率的目的，既适合于实验室研发，也适合于大规模的工业化生产。
本发明的技术方案如下：一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，包括以下步骤：
1）固相树脂Boc-Pro-（为聚苯乙烯树脂）置于反应瓶中，用无水CH2Cl2搅拌洗涤，抽干；经去保护基、洗涤、中和、洗涤、抽干，然后按照亮丙瑞林多肽序列，依次接二肽、接三肽、直到接完九肽，得到亮丙瑞林九肽树脂pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-，最后经过裂解(将亮丙瑞林从树脂上解离)脱侧链保护，沉淀、过滤、析出固体，洗涤，抽干，真空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品；
2）亮丙瑞林粗品溶解在醋酸、乙腈、水溶液中，超声处理，经过滤膜过滤，取滤液待用；
3）利用高效液相色谱仪，检测亮丙瑞林粗品纯度；利用质谱仪器确认亮丙瑞林粗品分子量；
4）对过滤后的亮丙瑞林粗品进行粗纯，利用反相高效液相色谱系统，制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度100%纯化水，进行等度洗脱分离纯化。采用紫外检测器对样品进行检测，收集目的峰值的肽溶液；
5）对粗纯后的亮丙瑞林粗品进行分离纯化，利用反相高效液相色谱系统，制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸水溶液，进行梯度洗脱分离纯化。采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽溶液；
6）将分离纯化后的高纯度高浓度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；
7）将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱采用离子交换法转成醋酸盐；
8）将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品。
步骤1）所述的CH2Cl2搅拌洗涤为3次，每次10分钟。
步骤1）所述的经去保护基、洗涤、中和、洗涤：去保护基：加入9-10NHCl/iPrOH+CH2Cl2，搅拌60分钟，抽干。洗涤：CH2Cl2洗涤3次，抽干；DMF洗涤1次，抽干。中和：加入三乙胺/CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌5分钟，抽干。洗涤：DMF洗涤1次，抽干；CH2Cl2洗涤5～6次至呈中性。
步骤2）所述的醋酸、乙腈、水溶液配置时，体积比为醋酸∶乙腈∶水=1∶2∶40。
步骤4）5）7）所述的制备动态轴向压缩柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶，KromasilC1810um100A。
步骤4）中的流动相梯度选择0.01min到40minA∶B质量百分浓度为5%:95%等度洗脱。
步骤5）中的流动相梯度选择0.01min到40minA∶B质量百分浓度由22%:78%～28%:72%梯度洗脱。
步骤7）所述的反相动态轴向压缩柱转醋酸盐使用流动相为30～50mmol醋酸胺缓冲盐体系。
本发明的有益效果：本发明提出了一种醋酸亮丙瑞林的制备方法。本发明利用反相高效液相色谱系统对亮丙瑞林进行粗纯具有下述特点：特点1：粗纯过程所使用的流动相为常用的乙腈和水，上样后，进行等度洗脱，因为水的极性很强，可以将目标物中极性强的杂质组分先从制备柱中冲洗出来，目标物仍保留在制备柱中，起到了分离杂质的作用。特点2：在对目标物进行等度冲洗的过程中，水可以将目标物中含有的大量切割试剂TFA（三氟乙酸）及其形成的强酸弱碱盐冲洗出来，大大降低了目标物中TFA根离子的含量，起到脱盐的作用。特点3：传统的纯化过程中，有的不采用粗纯的方法，直接进行纯化分离；有的以阴阳离子树脂载体，运用离子交换法进行粗纯，此方法在粗纯的过程中，使用大量的溶剂试剂，增加了目标物的损耗同时会产生大量的溶剂废液，目标物溶液体积也非常大，增加了浓缩环节的时间和工作量，降低了工作效率和产品收率。采用本发明的粗纯方法，可以大大降低废液排放，减少目标物损耗，提高产品收率。
采用反相高效液相色谱系统对亮丙瑞林进行转盐，与传统的转盐方法相比，本发明具有下述特点：特点1：本发明利用反相高效液相色谱系统对亮丙瑞林进行转盐，使用乙腈和醋酸铵缓冲溶液作为流动相，在整个的转盐过程中，醋酸铵会与目标物中强酸强碱离子反应，形成强酸弱碱盐和强碱弱酸盐，最后用水从制备柱中洗脱出来，在整个转盐的过程中调整醋酸铵缓冲盐浓度和冲洗梯度，在分离纯化的同时即可实现转盐过程，既保证了多肽产品对离子含量的要求也保证了多肽产品的最终纯度，大大提高了工作效率和产品收率。特点2：传统的转盐方法，是将玻璃柱里面装填离子树脂，利用离子交换的方法实现转盐，在整个转盐的过程中，要一边收集目标物溶液，一边进行检测分析，工序复杂，转盐周期长，更重要的是，此方法会产生大量的溶剂废液，增加废弃物的排放，加重环保压力。利用反相高效液相色谱系统对亮丙瑞林进行转盐，可以在一套系统中同时完成分离纯化和转盐两个工序，同时在生产过程中产生溶剂废液数量远远少于传统方法，因此采用此方法，缩短了生产周期，减少了溶剂废液的排放，大大降低了生产成本，提高了产品产量和收率。此方法既适合于实验室级别的生产试验，也适合于大规模工业化生产，既省钱又环保。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
图2为本发明产品质谱图谱。
具体实施方式
实施例1：参照图1
1.合成亮丙瑞林粗品：固相树脂Boc-Pro-（为聚苯乙烯树脂）置于反应瓶中，用无水CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌10分钟，抽干。去保护基：加入9-10NHCl/iPrOH+CH2Cl2，搅拌60分钟，抽干。洗涤：CH2Cl2洗涤3次，抽干；DMF洗涤1次，抽干。中和：加入三乙胺/CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌5分钟，抽干。洗涤：DMF洗涤1次，抽干；CH2Cl2洗涤5～6次至呈中性，抽干。接二肽：Boc-Arg·HClHOBT、DCCI分别用无水DMF溶解倒入树脂中，密塞瓶口，搅拌过夜。次日,抽干溶剂,用CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次，抽干。检测游离氨基：kaiser试剂检测反应完全。重复以上步骤，接三肽、接四肽……接九肽。洗涤：CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次、甲醇洗涤4次，抽干。于烘箱中干燥，再置P2O5干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂（pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-）。裂解(将亮丙瑞林从树脂上解离)：将上述经干燥的亮丙瑞林九肽树脂置于裂解瓶中,加入无水甲醇,通入乙基胺，密闭，振摇24小时,抽去部分乙基胺后过滤，树脂用甲醇洗涤4次,滤洗液减压浓缩至干，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用质量百分浓度50%的醋酸溶解，减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，如此反复5次，至成泡沫状，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚充分洗涤6-8次，抽干，真空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品。
2、亮丙瑞林粗品处理：称取适量的亮丙瑞林粗品溶解于体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶2∶40的醋酸乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全澄清，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
3、粗纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度100%水。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量百分浓度为5%:95%等度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行等度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
4、精纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定
相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：
20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度0.1%醋酸水溶
液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量
百分浓度由20%:80%～26%:74%梯度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
5、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，用30mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%纯化水和占本次体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液把样品从动态轴向压缩柱中冲出。把转好醋酸盐的合格产品进行旋蒸蒸发、过滤、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品，质谱见图2。
实施例2：参照图1
1.合成亮丙瑞林粗品：固相树脂Boc-Pro-（为聚苯乙烯树脂）置于反应瓶中，用无水CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌10分钟，抽干。去保护基：加入9-10NHCl/iPrOH+CH2Cl2，搅拌60分钟，抽干。洗涤：CH2Cl2洗涤3次，抽干；DMF洗涤1次，抽干。中和：加入三乙胺/CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌5分钟，抽干。洗涤：DMF洗涤1次，抽干；CH2Cl2洗涤5～6次至呈中性，抽干。接二肽：Boc-Arg·HClHOBT、DCCI分别用无水DMF溶解倒入树脂中，密塞瓶口，搅拌过夜。次日,抽干溶剂,用CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次，抽干。检测游离氨基：kaiser试剂检测反应完全。重复以上步骤，接三肽、接四肽……接九肽。洗涤：CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次、甲醇洗涤4次，抽干。于烘箱中干燥，再置P2O5干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂（pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-）。裂解(将亮丙瑞林从树脂上解离)：将上述经干燥的亮丙瑞林九肽树脂置于裂解瓶中,加入无水甲醇,通入乙基胺，密闭，振摇24小时,抽去部分乙基胺后过滤，树脂用甲醇洗涤4次,滤洗液减压浓缩至干，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用质量百分浓度50%醋酸溶解，减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，如此反复5次，至成泡沫状，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚充分洗涤6-8次，抽干，真空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品。
2、亮丙瑞林粗品处理：称取适量的亮丙瑞林粗品溶解于体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶2∶40的醋酸乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全澄清，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
3、粗纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度100%水。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量百分浓度为3%:97%等度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行等度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
4、精纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定
相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：
20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度0.2%醋酸水溶
液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量
百分浓度由18%:82%～24%:76%梯度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
5、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，用40mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%纯化水和占本次体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液把样品从动态轴向压缩柱中冲出。把转好醋酸盐的合格产品进行旋蒸蒸发、过滤、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品，质谱见图2。
实施例3：参照图1
1.合成亮丙瑞林粗品：固相树脂Boc-Pro-（为聚苯乙烯树脂）置于反应瓶中，用无水CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌10分钟，抽干。去保护基：加入9-10NHCl/iPrOH+CH2Cl2，搅拌60分钟，抽干。洗涤：CH2Cl2洗涤3次，抽干；DMF洗涤1次，抽干。中和：加入三乙胺/CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌5分钟，抽干。洗涤：DMF洗涤1次，抽干；CH2Cl2洗涤5～6次至呈中性，抽干。接二肽：Boc-Arg·HClHOBT、DCCI分别用无水DMF溶解倒入树脂中，密塞瓶口，搅拌过夜。次日,抽干溶剂,用CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次，抽干。检测游离氨基：kaiser试剂检测反应完全。重复以上步骤，接三肽、接四肽……接九肽。洗涤：CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次、甲醇洗涤4次，抽干。于烘箱中干燥，再置P2O5干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂（pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-）。裂解(将亮丙瑞林从树脂上解离)：将上述经干燥的亮丙瑞林九肽树脂置于裂解瓶中,加入无水甲醇,通入乙基胺，密闭，振摇24小时,抽去部分乙基胺后过滤，树脂用甲醇洗涤4次,滤洗液减压浓缩至干，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用质量百分浓度50%醋酸溶解，减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，如此反复5次，至成泡沫状，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚充分洗涤6-8次，抽干，真空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品。
2、亮丙瑞林粗品处理：称取适量的亮丙瑞林粗品溶解于体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶2∶40的醋酸乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全澄清，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
3、粗纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度100%水。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量百分浓度为5%:95%等度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行等度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
4、精纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定
相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：
20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度0.3%醋酸水溶
液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量
百分浓度由22%:78%～28%:72%梯度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
5、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，用50mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%纯化水和占本次体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液把样品从动态轴向压缩柱中冲出。把转好醋酸盐的合格产品进行旋蒸蒸发、过滤、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品，质谱见图2。
实施例4：参照图1
1.合成亮丙瑞林粗品：固相树脂Boc-Pro-（为聚苯乙烯树脂）置于反应瓶中，用无水CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌10分钟，抽干。去保护基：加入9-10NHCl/iPrOH+CH2Cl2，搅拌60分钟，抽干。洗涤：CH2Cl2洗涤3次，抽干；DMF洗涤1次，抽干。中和：加入三乙胺/CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌5分钟，抽干。洗涤：DMF洗涤1次，抽干；CH2Cl2洗涤5～6次至呈中性，抽干。接二肽：Boc-Arg·HClHOBT、DCCI分别用无水DMF溶解倒入树脂中，密塞瓶口，搅拌过夜。次日,抽干溶剂,用CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次，抽干。检测游离氨基：kaiser试剂检测反应完全。重复以上步骤，接三肽、接四肽……接九肽。洗涤：CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次、甲醇洗涤4次，抽干。于烘箱中干燥，再置P2O5干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂（pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-）。裂解(将亮丙瑞林从树脂上解离)：将上述经干燥的亮丙瑞林九肽树脂置于裂解瓶中,加入无水甲醇,通入乙基胺，密闭，振摇24小时,抽去部分乙基胺后过滤，树脂用甲醇洗涤4次,滤洗液减压浓缩至干，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用质量百分浓度50%醋酸溶解，减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，如此反复5次，至成泡沫状，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚充分洗涤6-8次，抽干，真空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品。
2、亮丙瑞林粗品处理：称取适量的亮丙瑞林粗品溶解于体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶2∶40的醋酸乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全澄清，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
3、粗纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度100%水。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量百分浓度为7%:93%等度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行等度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
4、精纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定
相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：
20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度0.3%醋酸水溶
液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量
百分浓度由20%:80%～26%:74%梯度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
5、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，用50mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%纯化水和占本次体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液把样品从动态轴向压缩柱中冲出。把转好醋酸盐的合格产品进行旋蒸蒸发、过滤、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品，质谱见图2。
实施例5：参照图1
1.合成亮丙瑞林粗品：固相树脂Boc-Pro-（为聚苯乙烯树脂）置于反应瓶中，用无水CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌10分钟，抽干。去保护基：加入9-10NHCl/iPrOH+CH2Cl2，搅拌60分钟，抽干。洗涤：CH2Cl2洗涤3次，抽干；DMF洗涤1次，抽干。中和：加入三乙胺/CH2Cl2洗涤3次，每次搅拌5分钟，抽干。洗涤：DMF洗涤1次，抽干；CH2Cl2洗涤5～6次至呈中性，抽干。接二肽：Boc-Arg·HClHOBT、DCCI分别用无水DMF溶解倒入树脂中，密塞瓶口，搅拌过夜。次日,抽干溶剂,用CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次，抽干。检测游离氨基：kaiser试剂检测反应完全。重复以上步骤，接三肽、接四肽……接九肽。洗涤：CH2Cl2洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH2Cl2洗涤3次、甲醇洗涤4次，抽干。于烘箱中干燥，再置P2O5干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂（pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-）。裂解(将亮丙瑞林从树脂上解离)：将上述经干燥的亮丙瑞林九肽树脂置于裂解瓶中,加入无水甲醇,通入乙基胺，密闭，振摇24小时,抽去部分乙基胺后过滤，树脂用甲醇洗涤4次,滤洗液减压浓缩至干，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用质量百分浓度50%醋酸溶解，减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，如此反复5次，至成泡沫状，用甲醇溶解，丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚充分洗涤6-8次，抽干，真空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品。
2、亮丙瑞林粗品处理：称取适量的亮丙瑞林粗品溶解于体积比：醋酸∶乙腈∶水=1∶2∶40的醋酸乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全澄清，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
3、粗纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度100%水。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量百分浓度为5%:95%等度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行等度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
4、精纯：
纯化条件：色谱柱：DAC-HB200（江苏汉邦科技有限公司-动态轴向压缩柱200）内装固定
相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶KromasilC1810um100A。柱子直径和装填长度为：
20cm×30cm。流动相：A：质量百分浓度100%乙腈溶液；B：质量百分浓度0.2%醋酸水溶
液。流速：1000ml/min。检测波长：230nm。设置洗脱梯度：0.01min到40minA∶B质量
百分浓度由24%:76%～30%:70%梯度洗脱。
纯化过程：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约10分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，进行梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目标物溶液浓缩至约10-50mg/ml后待用。
5、转盐：将动态轴向压缩柱用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗3个柱体积（一个柱体积约8分钟），然后用占本次冲洗体积总量5%质量百分浓度100%乙腈溶液平衡柱子2个柱体积，上样，用30mmol醋酸胺水溶液冲洗柱子3个柱体积；后用占本次冲洗体积总量95%纯化水和占本次体积总量5%的质量百分浓度100%乙腈溶液冲洗2个柱体积；最后用占本次冲洗体积总量80%的质量百分浓度100%乙腈溶液把样品从动态轴向压缩柱中冲出。把转好醋酸盐的合格产品进行旋蒸蒸发、过滤、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品，质谱见图2。
Claims (6)
1.一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1）固相树脂Boc-Pro-聚苯乙烯树脂置于反应瓶中，用无水CH2Cl2搅拌洗涤，抽干；经去保护基、洗涤、中和、洗涤、抽干，然后按照亮丙瑞林多肽序列，依次接二肽、接三肽、直到接完九肽，得到亮丙瑞林九肽树脂pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-聚苯乙烯树脂，最后经过裂解脱侧链保护，沉淀、过滤、析出固体，洗涤，抽干，真空干燥至恒重，得到亮丙瑞林粗品；
2）亮丙瑞林粗品溶解在醋酸、乙腈、水溶液中，超声处理，经过滤膜过滤，取滤液待用；
3）利用高效液相色谱仪检测亮丙瑞林粗品纯度；利用质谱仪器确认亮丙瑞林粗品分子量；
4）对过滤后的亮丙瑞林粗品进行粗纯，利用反相高效液相色谱系统，制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度100%纯化水，进行等度洗脱分离纯化；采用紫外检测器对样品进行检测，收集目的峰值的肽溶液；
5）对粗纯后的亮丙瑞林粗品进行分离纯化，利用反相高效液相色谱系统，制备动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度100%乙腈溶液，流动相B为质量百分浓度0.1%-0.3%醋酸水溶液，进行梯度洗脱分离纯化；采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰值的肽溶液。
6）将分离纯化后的高纯度高浓度目的肽溶液进行减压旋蒸浓缩，浓缩液收集待用；
7）将浓缩液经过反相动态轴向压缩柱采用离子交换法转成醋酸盐；
8）将转好醋酸盐合格产品进行减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品。
2.根据权利要求1所述的一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，其特征是：制备动态轴向压缩柱内装固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶。
3.根据权利要求1所述的一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，其特征是：步骤2）醋酸、乙腈、水溶液配置时，体积比为醋酸∶乙腈∶水=1∶2∶40。
4.根据权利要求1所述的一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，其特征是：步骤4）中的流动相梯度选择0.01min到40minA∶B质量百分浓度为5%:95%等度洗脱。
5.根据权利要求1所述的一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，其特征是：步骤5）中的流动相梯度选择0.01min到40minA∶B质量百分浓度由22%:78%～28%:72%梯度洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种醋酸亮丙瑞林的制备方法，其特征是：步骤7）将浓缩液经过制备动态轴向压缩柱完成离子交换转成醋酸盐，所用到的流动相为30～50mmol醋酸铵缓冲盐体系。
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