CN101597325A - 一种纯化亮丙瑞林(Leuprorelin)的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纯化亮丙瑞林的方法，包括如下步骤：1)将固相合成所得粗肽溶解后，用固定相为反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈与甲醇的混合液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；3)将磷酸盐采用阴离子交换转成醋酸盐。本发明提供一条适于产业化纯化亮丙瑞林的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化亮丙瑞林，纯度高且收率好，达到产业化要求。

Description

一种纯化亮丙瑞林(Leuprorelin)的方法

技术领域

本发明属于HPLC技术领域，尤其是涉及一种规模化纯化亮丙瑞林(Leuprorelin)的方法。

背景技术

亮丙瑞林，制剂中文名称为醋酸亮丙瑞林、抑那通或者简称亮丙瑞林，英文名称为Leuprorelin acetate、Enanton，Lucrin等，其结构为：

分子式：C₅₉H₈₄N₁₆O₁₂

分子量：1209.41

CAS登录号：53714-56-0

亮丙瑞林属于GnRH类似物，作用同布舍瑞林。重复给予大剂量的促黄体生成释放激素(LH-RH)或其高活性衍生物醋酸亮丙瑞林，在首次给药后能立即产生一过性的垂体-性腺系统兴奋作用(急性作用)，然后抑制垂体生成和释放促性腺激素。它还进一步抑制卵巢和睾丸对促性腺激素的反应，从而降低雌二醇和睾丸酮的生成(慢性作用)。醋酸亮丙瑞林的促黄体生成激素(LH)释放活性约为LH-RH的100倍，它的抑制垂体-性腺系统功能的作用也强于LH-RH。醋酸亮丙瑞林是高活性的LH-RH衍生物，由于它对蛋白分解酶的抵抗力和对LH-RH受体的亲和力都比LH-RH强，所以能有效地抑制垂体-性腺系统的功能。此外，醋酸亮丙瑞林又是一种缓释制剂，它恒定地向血液中释放醋酸亮丙瑞林，故能有效地降低卵巢和睾丸的反应，产生高度有利的垂体-性腺系统的抑制作用。对子宫内膜异位症、子宫肌瘤或绝经前乳腺癌患者，每4周1次皮下注射醋酸亮丙瑞林，使血清中雌二醇下降到接近绝经期的水平。因此本品有卵巢功能抑制作用，可抑制正常排卵和使月经停止。对前列腺癌患者皮下注射醋酸亮丙瑞林，每4周1次，使血清睾丸酮浓度降至去势水平之下，表明本品有药理学的去势作用。对患有中枢性性早熟的男孩和女孩每4周1次，皮下注射醋酸亮丙瑞林后，血清中促性腺激素的水平降至青春期前的水平，表明对第二性征有进行性抑制作用。

亮丙瑞林的适应症为子宫内膜异位症；伴有月经过多、下腹痛、腰痛及贫血等的子宫肌瘤；绝经前乳腺癌，且雌激素受体阳性患者；前列腺癌；中枢性性早熟症。临床主要用于前列腺癌及子宫内膜异位症。在已发表的文献和专利中，未有大规模生产、并且具有较高收率的纯化工艺报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一条适于产业化纯化亮丙瑞林的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化亮丙瑞林，纯度高且收率好，达到产业化要求，解决现有技术存在的缺陷.

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种纯化亮丙瑞林的方法，包括如下步骤：

1)将固相合成所得粗肽溶解后，用固定相为反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈与甲醇的混合液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；

3)将磷酸盐采用阴离子交换转成醋酸盐。

优选的方案是：所述的步骤1)和步骤3)之间还包括步骤2)将收集目的峰值的肽溶液减压旋蒸浓缩。

更为优选的方案是：所述A相的磷酸盐缓冲溶液pH为2.0～3.0。

更为优选的方案是：所述色谱纯乙腈与甲醇的体积比为4∶1，检测波长为280nm。

更为优选的方案是：所述色谱纯乙腈与甲醇的混合液浓度为12-53％。

更为优选的方案是：所述的反相硅胶柱为八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶。

更为优选的方案是：所述的阴离子交换树脂是Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41。

本发明与现有技术相比，有如下优点和有益效果：

本发明提供一条适于产业化纯化亮丙瑞林的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化亮丙瑞林，纯度高且收率好，达到产业化要求。

具体实施方式

实施例1

1、样品处理：每克粗肽用超纯水、乙腈和醋酸的混合液(V水∶V乙腈∶V醋酸＝85∶10∶5)溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。

2、第一步纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：0.1％-0.3％磷酸水溶液用三乙胺调pH至2.0-3.0；B相：乙腈和甲醇(V乙腈∶V甲醇＝4∶1)混合液。流速：70-80ml/min。检测波长：280nm。梯度：B％：12％～43％(55min)。进样量为1.3-1.5g。

纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量为13-15ml样品溶液。线性梯度洗脱55min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过37℃下减压旋蒸浓缩至约15-20g/ml后备用。

3、第二步转盐：取5.5g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样约1g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.5％的符合欧洲药典标准的亮丙瑞林，收率71.5％。

实施例2

1、样品处理：每克粗肽用超纯水、乙腈和醋酸的混合液(V水∶V乙腈∶V醋酸＝85∶10∶5)溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。

2、第一步纯化：纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×25cm。流动相：A相：0.1％-0.3％磷酸水溶液用三乙胺调pH至2.0-3.0；B相：乙腈和甲醇(V乙腈∶V甲醇＝4∶1)混合液。流速：450-550ml/min。检测波长：280nm。梯度：B％：18％～33％(45min)。进样量为13-15g。

纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量为130-150ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过37℃下减压旋蒸浓缩至约15-20g/ml后备用。

3、第二步转盐：取120g阴离子交换树脂Wofatit AD-41置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样约15-20g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.5％的符合欧洲药典标准的亮丙瑞林，收率69.2％。

实施例3

1、样品处理：每克粗肽用超纯水、乙腈和醋酸的混合液(V水∶V乙腈∶V醋酸＝85∶10∶5)溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。

2、第一步纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：0.1％-0.3％磷酸水溶液用三乙胺调pH至2.0-3.0；B相：乙腈和甲醇(V乙腈∶V甲醇＝4∶1)混合液。流速：1900-2200ml/min。检测波长：280nm。梯度：B％：12％～53％(65min)。进样量为55-75g。

纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量为550-750ml样品溶液。线性梯度洗脱65min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过37℃下减压旋蒸浓缩至约15-20g/ml后备用。

3、第二步转盐：取800g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样约90-120g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.5％的符合欧洲药典标准的亮丙瑞林，收率73.8％。

本发明使用反相高效液相色谱法与阴离子交换法纯化亮丙瑞林，得到符合欧洲药典标准的醋酸亮丙瑞林，纯度高且收率好，提供了一条适于规模化纯化亮丙瑞林的工艺方法，达到产业化要求。对其他类似肽的纯化也有借鉴意义。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1、一种纯化亮丙瑞林的方法，包括如下步骤：

1)将固相合成所得粗肽溶解后，用固定相为反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈与甲醇的混合液为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；

3)将磷酸盐采用阴离子交换转成醋酸盐。

2、如权利要求1所述的纯化亮丙瑞林的方法，其特征是：所述的步骤1)和步骤3)之间还包括步骤2)将收集目的峰值的肽溶液减压旋蒸浓缩。

3、如权利要求1或者2所述纯化亮丙瑞林的方法，其特征在于：所述A相的磷酸盐缓冲溶液pH为2.0～3.0。

4、如权利1或者2所述纯化亮丙瑞林的方法，其特征在于：所述色谱纯乙腈与甲醇的体积比为4∶1，检测波长为280nm。

5、如权利1或者2所述纯化亮丙瑞林的方法，其特征在于：所述色谱纯乙腈与甲醇的混合液浓度为12-53％。

6、如权利要求1或者2所述的纯化亮丙瑞林的方法，其特征在于：所述的反相硅胶柱为八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶。

7、根据权利要求1或者2所述方法，其特征在于：所述的阴离子交换法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现，所述的阴离子交换树脂是Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41。