CN101787071B - 一种伐普肽的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种伐普肽的纯化方法，包括以下步骤：1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为3.0-4.5的醋酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；2)采用反相高效液相色谱法将其转成醋酸盐。本发明的方法纯度高且收率好，达到产业化要求，为大量纯化制备伐普肽原料药提供了一种有效纯化工艺。

Description

一种伐普肽的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及伐普肽的纯化方法。
背景技术
伐普肽(vapreotide)是一种用于治疗前列腺癌、肢端肥大症等病症的多肽药物，其效果较好且副作用小，具有很好的市场前景。在已发表的文献和专利中，未有大规模生产、并且具有较高收率的纯化工艺报道。
发明内容
本发明提出了一条适于产业化纯化伐普肽的工艺方法，纯度高且收率好，达到产业化要求。
为实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：
1)以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为3.0-4.5的醋酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；
所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的伐普肽粗肽或者纯度不能满足药用的伐普肽。A相醋酸盐缓冲溶液的pH值优选3.5；“粗肽溶液”是指粗肽溶于纯净水所得到的溶液，纯净水符合注射用水标准，优选超纯水。优选“乙腈”的纯度级别优选色谱纯，即乙腈为色谱纯乙腈。步骤1)也称第一步纯化。
2)采用反相高效液相色谱法将其转成醋酸盐。
转成醋酸盐的方法优选，“反相高效液相色谱”的固定相为八烷基硅烷键合硅胶，醋酸水溶液为A相，其中A相的醋酸水溶液浓度小于0.2％，优选浓度为0.1％；乙腈为B相：梯度：B％：10％～40％，进行梯度洗脱。优选“乙腈”的纯度级别优选色谱纯，即乙腈为色谱纯乙腈。步骤1)也称转盐。
纯化规模包括以下规格色谱柱：50mm×250mm(柱子直径×长度)、150mm×250mm、300mm×250mm。
采用本发明提供的方法纯化伐普肽操作简单可行、纯度可达98％以上、收率好，达到产业化要求。
具体实施方式
实施例一：
1.样品处理：粗肽为超纯水溶解，溶液用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：0.2％醋酸溶液用氨水调pH至3.0；B相：乙腈，流速：70-80ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：20％～40％(洗脱时间45min)。进样量为1.3-1.5g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.3-1.5g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约70～80mg/ml后备用。
3、转盐：纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：0.1％醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈。流速：70-80ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：10％～40％(洗脱时间30min)。进样量为1.5-2.0g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为150-200ml样品溶液。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液合并旋蒸浓缩至约5-8mg/ml，然后转至合适大小容器进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.0％的伐普肽。纯化收率57％。
实施例二：
1.样品处理：粗肽为超纯水溶解，溶液用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150mm×250mm。流动相：A相：0.2％醋酸溶液用氨水调pH至3.5；B相：乙腈，流速：450-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：20％～40％(洗脱时间45min)。进样量为13-15g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为13-15g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约70-80mg/ml后备用。
3、转盐：纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150mm×250mm。流动相：A相：0.1％醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈。流速：450-550ml/min。检测波长：280nm。梯度：B％：10％～40％(洗脱时间30min)。进样量为15-20g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为1200-1600ml样品溶液。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液合并旋蒸浓缩至约5-8mg/ml，然后转至合适大小容器进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.0％的伐普肽，纯化收率65％。
实施例三：
1.样品处理：粗肽为超纯水溶解，溶液用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：300mm×250mm。流动相：A相：0.2％醋酸溶液用氨水调pH至4.5；B相：乙腈。流速：1900-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：20％～40％(洗脱时间60min)。进样量为55-75g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为55-75g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约70-80mg/ml后备用。
3、转盐：纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：300mm×250mm。流动相：A相：0.1％醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈。流速：1900-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：10％～40％(洗脱时间45min)。进样量为55-75g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为1200-1600ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的伐普肽溶液合并旋蒸浓缩至约5-8ml/g，然后转至合适大小容器进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.0％的符合标准的伐普肽，纯化收率62％。

Claims (5)

1.一种伐普肽的纯化方法，包括以下步骤：1）以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为3.0-4.5的醋酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B%：20%-40%，将粗肽溶液进行梯度洗脱，其中A相的醋酸盐缓冲溶液是通过将0.2%的醋酸溶液用氨水调pH配制而成；
2)采用反相高效液相色谱法转盐：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，用醋酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B%：10%-40%，进行梯度洗脱，其中A相的醋酸水溶液浓度小于0.2%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）A相的醋酸盐缓冲溶液pH应为3.5-4.5。
3.根据权利要求1至2任意一项所述的方法，其特征在于：A相的醋酸水溶液浓度为0.1%。
4.根据权利要求1至2任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中的乙腈为色谱纯乙腈。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述步骤2）中的乙腈为色谱纯乙腈。
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