CN101440127B - 高纯度盐酸万古霉素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种工业上可行的高纯度盐酸万古霉素的制备方法，所述方法包括下列步骤：(1)具有万古霉素的含量不低于80％的万古霉素粗品在含有NH₄HCO₃流动相的葡聚糖树脂玻璃层析柱中进行柱层析，得到有效层析液；(2)向有效层析液加入NaCl水溶液，搅拌产生沉淀；(4)采用90％的乙醇水溶液进行多次顶洗，干燥得到盐酸万古霉素。通过本发明得到的盐酸万古霉素有效组份大大得到提高，其它杂质大大降低，纯度很高，同时产品外观颜色得到明显改观，适于口服或注射给药。

Description

高纯度盐酸万古霉素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种提纯盐酸万古霉素的新方法。具体地说，该方法首先通过含有盐-水流动相的琼脂糖或葡聚糖凝胶柱中进行柱层析和在盐-水中利用盐进行沉淀，从而得到高纯度的盐酸万古霉素，该盐酸万古霉素能够很好地满足口服和注射给药的需要。

背景技术

盐酸万古霉素是东方诺卡氏菌在控制发酵条件下产生的一种两性糖肽类抗生素，其化学式为C₆₆H₇₅C₁₂N₉O₂₄·HCl，分子量为1.486。通过微生物Amycolatopis orientalis发酵制备万古霉素的方法已经在美国专利3,067,099(1995年申请)和WO91/08,300中更为详细的描述。盐酸万古霉素成品的冻干粉呈现类白色，其水溶液为透明溶液，pH为2.5～4.5。

临床上，盐酸万古霉素从20世纪50年代末开始有商业销售。已知盐酸万古霉素与黏肽的前质末端D-Ala-D-Ala结合，抑制细菌细胞壁的合成。此外，盐酸万古霉素还可以改变细胞膜的渗透性和RNA的合成。

盐酸万古霉素特别用于由抗β-乳胺抗生素的葡萄球菌引起的严重或重症感染的初步治疗，也用于治疗对青霉素过敏或使用青霉素和头孢菌素没有效果的患者。商业销售的盐酸万古霉素有口服(溶液和胶囊/子弹型胶囊)和注射(小瓶的消毒静脉溶液)形式。

盐酸万古霉素单独使用或与其它氨基葡糖苷结合使用可以治疗由葡萄球菌、链球菌、肠球菌或白喉杆菌引起的心内膜炎。

只有在注射盐酸万古霉素对葡萄球菌引起的小肠结肠炎没有效果的情况下，才允许口服盐酸万古霉素。只有注射用盐酸万古霉素适用于其它所有的适应症。

在抗生素的某些利用中，减少抗生素高色谱纯度的可能副作用是非常重要的，迄今其它现存的提纯方法均无法做到这点。而本发明正是为了提供一种高纯度、高产率的盐酸万古霉素的提纯方法，使提纯得到的盐酸万古霉素能够用于口服或注射给药。

发明内容

本发明提供了一种高纯度、高产率的盐酸万古霉素的提纯方法，所述方法包括如下步骤：

(1)具有万古霉素色谱纯度不低于80％的万古霉素粗品在含有NH₄HCO₃流动相的层析柱中进行柱层析，得到色谱纯度不低于95％的有效层析液；

(2)向有效层析液加入NaCl水溶液，产生沉淀；

(3)采用乙醇进行顶洗，干燥得到盐酸万古霉素。

其中，采用的层析介质为葡聚糖凝胶Sephadex CM-25、琼脂糖SP Sepharose或琼脂糖CM Sepharose，流动相为4～6％(w/v)NH₄HCO₃。

其中，流动相以流量为0.5～1.5柱体积/小时进行洗脱。

其中，向浓缩后的有效层析液中加入的NaCl水溶液中的NaCl数量为层析液体积的3％～7％(W/V)进行沉淀。

其中，加入NaCl水溶液后，不断搅拌30～90分钟，混合液温度控制在5～25℃，并静置24～48小时。

其中，采用90％的乙醇水溶液进行多次顶洗，顶洗至电导率≤1000μs/cm时停止加入90％的乙醇水溶液。

根据本发明，优选地，还包括有效层析液经过超滤、纳滤后可得到有效层析液的浓缩液，以通过NaCl水溶液产生沉淀。

其中，所述超滤的回流温度控制在10～20℃，并用纯化水洗涤滤余液，超滤膜选用10000Da～50000Da。

其中，所述纳滤溶液的温度控制在10～20℃，并分步加入纯化水和0.04％～0.06％的乙二胺四乙酸(W/bons)，纳滤膜选用200Da～600Da，最好，纳滤时间控制在5～12小时。

根据本发明，优选地，还包括有效层析液或有效层析液的浓缩液通过0.45μm和0.2μm的滤芯过滤后再进行沉淀。

根据本发明，优选地，所述方法还包括在柱层析前，将万古霉素粗品溶于纯水中，搅拌，用2～6mol/L NaOH溶液调整至pH＝9～10，待完全溶解后过滤，收集滤液，用2～6mol/L HCl溶液调整滤液至pH＝4.5～6.0。

根据本发明，优选地，所述方法还包括在用含有NH₄HCO₃流动相洗脱前，先用纯水和低浓度的NH₄HCO₃溶液进行预洗。

其中，提纯得到的盐酸万古霉素能够用于口服或注射给药。

本发明所提供的工艺流程具体描述如下。

万古霉素发酵液在碱性条件下过滤，得到的澄清滤液通过大孔吸附树脂，万古霉素被吸附在树脂，树脂水洗后用含有溶剂的酸性水溶液洗脱，典型的洗脱液为含乙醇的盐酸水溶液。万古霉素被洗脱下来，含有万古霉素的洗脱液加入活性炭脱色，过滤得到的滤液浓缩得到盐酸万古霉素水溶液，水溶液的浓度大约在100mg/mL。浓缩结束后，接着进行沉淀操作。

在含有盐酸万古霉素的水溶液中加入NH₄HCO₃(数量为浓缩液体积的6％～10％(W/V))，然后用氨水调节万古霉素浓缩液pH至7.5～8.5，搅拌45～60min，使其混合均匀，大量的万古霉素从溶液中沉淀出来。沉淀过程的温度必须控制在10～20℃，静置16±2小时后，把混合液固液分离，使万古霉素沉淀从溶液中分离出来得到固体万古霉素碱，然后用乙醇顶洗，顶去固体中残留液，分离后得到万古霉素粗品。得到的万古霉素碱中万古霉素色谱纯度不低于80％(HPLC)，一般在85％以上。

万古霉素粗品在水溶液里溶解后过滤，上层析柱层析纯化得到万古霉素色谱纯度93％以上的有效层析液。有效层析液经过超滤、纳滤后得到盐酸万古霉素浓缩液。

盐酸万古霉素浓缩液通过0.45μm和0.2μm的滤芯过滤后进行沉淀。向含有盐酸万古霉素的浓缩液中加入NaCl水溶液(注：NaCl溶解成水溶液后加入，水溶液浓度为25～35％，再经0.45μm过滤后加入料液中。)，使浓缩液中NaCl的浓度为3％～7％(W/V)，并持续搅拌60±30分钟，控制混合液温度在5～25℃，静置24～48小时后固液分离。盐酸万古霉素滤饼先用90％的乙醇水溶液进行第一次顶洗，顶洗至电导率≤1000μs/cm时停止加入90％的乙醇水溶液。再用经0.45μm膜过滤后的无水乙醇进行第二次顶洗，顶洗后即得盐酸万古霉素沉淀湿品(乙醇水溶液是由0.45μm膜过滤后的无水乙醇与纯化水配制而成)。沉淀湿品通过干燥去除残留乙醇及水分，获得盐酸万古霉素成品。

通过本发明得到的盐酸万古霉素有效组份大大得到提高，其它杂质大大降低，纯度很高，色谱纯度可达到95％以上，同时产品外观颜色得到明显改观，适于口服或注射给药。

具体实施方式

通过以下实施例来对本发明作进一步具体说明，但并不仅限于以下实施例和实施例中的工艺参数范围。

实施例1：万古霉素粗品的制备

盐酸万古霉素水溶液浓度为120mg/mL，体积20.0L，含万古霉素色谱纯度80.4％(HPLC)溶液pH为3.0，边搅拌边加入NH₄HCO₃共1600g，加盐过程中溶液不断有气泡产生，万古霉素从中析出，形成了浆状物，然后加浓氨水调节pH到8.0，此是万古霉素析出更多，浆状物更浓，继续搅拌50MIN，使其混合均匀，停搅拌静置18小时，过程温度控制在14～16℃。混合物通过过滤分离并用5000mL乙醇顶洗，得到了万古霉素碱的湿品4023g，效价564μg/mg，收率94.5％。万古霉素碱HPLC检测万古霉素色谱纯度为88.6％。

实施例2：万古霉素粗品溶解

在玻璃烧杯中将实施例1中制备的1000g万古霉素粗品溶于10.0L纯水中，搅拌，用2mol/L NaOH溶液调整至pH＝9.0。待完全溶解后过滤，过滤过程中加入少量纯水，当残留物中万古霉素的浓度为7.3mg/ml和体积为1.7L时，停止过滤。在耐酸反应罐中收集滤液，用2mol/L HCl溶液调整滤液至pH＝4.5。最后得到滤液18.5L，浓度为29.0mg/mL，色谱纯度为88.2％。参见表一。

实施例3：万古霉素粗品溶解

在玻璃烧杯中将实施例1中制备的1000g万古霉素粗品溶于3.0L纯水中，搅拌，用6mol/L NaOH溶液调整至pH＝10.0。待完全溶解后过滤，过滤过程中加入少量纯水，当残留物中万古霉素的浓度为9.4mg/ml和体积为1.5L时，停止过滤。在耐酸反应罐中收集滤液，用6mol/L HCl溶液调整滤液至pH＝6.0。最后得到滤液8.5L，浓度为65.0mg/mL，色谱纯度为88.5％。参见表一。

实施例4：万古霉素粗品溶解

在玻璃烧杯中将实施例1中制备的1000g万古霉素粗品溶于6.0L纯水中，搅拌，用4mol/L NaOH溶液调整至pH＝9.5。待完全溶解后过滤，过滤过程中加入少量纯水，当残留物中万古霉素的浓度为8.3mg/ml和体积为1.6L时，停止过滤。在耐酸反应罐中收集滤液，用4mol/L HCl溶液调整滤液至pH＝5.0。最后得到滤液10.5L，浓度为53.2mg/M1，色谱纯度为88.6％。参见表一。

实施例5：柱层析

取例4中的盐酸万古霉素滤液106mL，盐酸万古霉素溶液通过装有葡聚糖Sephadex CM-25的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的3％(bons/L)。吸附阶段为了提高吸附效果，采用以下方法吸附：首先，以流量为0.5倍柱体积/小时，向葡聚糖层析柱中添加0.05倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.3倍柱体积的纯水冲洗；再次加0.05倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为0.5倍柱体积/小时，0.3倍柱体积的纯水冲洗；如此反复直至吸附完全。吸附后，以流量为1.5倍柱体积/小时，5倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为1.5倍柱体积/小时，用12倍柱体积的0.3％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为0.5倍柱体积/小时，用5％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000 IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝2.8。得到有效洗脱液289mL，浓度为13.2mg/mL，色谱纯度95.2％。参见表二。

实施例6：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液177mL，盐酸万古霉素溶液通过装有葡聚糖Sephadex CM-25的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的5％(bons/L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.5倍柱体积/小时，向葡聚糖层析柱中添加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.7倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.5倍柱体积/小时，0.7倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为2.5倍柱体积/小时，7倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用15倍柱体积的0.5％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1倍柱体积/小时，用5％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将盐酸万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中盐酸万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000 IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝3.1。得到有效洗脱液432mL，浓度为15.4mg/mL，色谱纯度94.9％。参见表二。

实施例7：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液142mL，盐酸万古霉素溶液通过装有葡聚糖Sephadex CM-25的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的4％(bons/L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.0倍柱体积/小时，向葡聚糖层析柱中添加0.1倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.5倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.1倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.0倍柱体积/小时，0.5倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为2.0倍柱体积/小时，6倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为3.5倍柱体积/小时，用18倍柱体积的0.7％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1.5倍柱体积/小时，用6％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中盐酸万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝3.5。得到有效洗脱液462mL，浓度为11.5mg/mL，色谱纯度95.0％。参见表二。

实施例8：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液150mL，盐酸万古霉素溶液通过装有葡聚糖Sephadex CM-25的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的4.2％(bons/L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.0倍柱体积/小时，向葡聚糖层析柱中添加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.7倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.0倍柱体积/小时，0.7倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为2.0倍柱体积/小时，6倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用16倍柱体积的0.4％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1倍柱体积/小时，用4％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将盐酸万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中盐酸万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝3.2。得到有效洗脱液512mL，浓度为10.8mg/mL，色谱纯度95.2％。参见表二。

实施例9：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液106mL，盐酸万古霉素溶液通过装有琼脂糖SP Sepharose的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的3％(bons/L)。吸附阶段为了提高吸附效果，采用以下方法吸附：首先，以流量为0.5倍柱体积/小时，向琼脂糖层析柱中添加0.05倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.3倍柱体积的纯水冲洗；再次加0.05倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为0.5倍柱体积/小时，0.3倍柱体积的纯水冲洗；如此反复直至吸附完全。吸附后，以流量为1.5倍柱体积/小时，5倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为1.5倍柱体积/小时，用12倍柱体积的0.3％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为0.5倍柱体积/小时，用5％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝2.8。得到有效洗脱液350mL，浓度为10.6mg/mL，色谱纯度94.3％。参见表三。

实施例10：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液177mL，盐酸万古霉素溶液通过装有琼脂糖SP Sepharose的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的5％(bons/L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.5倍柱体积/小时，向琼脂糖层析柱中添加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.7倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.5倍柱体积/小时，0.7倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为3.5倍柱体积/小时，7倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用15倍柱体积的0.5％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1倍柱体积/小时，用5％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将盐酸万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中盐酸万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝3.1。得到有效洗脱液458mL，浓度为14.2mg/mL，色谱纯度94.8％。参见表三。

实施例11：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液142mL，盐酸万古霉素溶液通过装有琼脂糖SP Sepharose的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的4％(bons/L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.0倍柱体积/小时，向琼脂糖层析柱中添加0.1倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.5倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.1倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.0倍柱体积/小时，0.5倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为2.5倍柱体积/小时，6倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为3.5倍柱体积/小时，用18倍柱体积的0.7％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1.5倍柱体积/小时，用6％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中盐酸万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝3.5。得到有效洗脱液395mL，浓度为12.5mg/mL，色谱纯度94.7％。参见表三。

实施例12：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液106mL，盐酸万古霉素溶液通过装有琼脂糖CM Sepharose的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的3％(bons/L)。吸附阶段为了提高吸附效果，采用以下方法吸附：首先，以流量为0.5倍柱体积/小时，向琼脂糖层析柱中添加0.05倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.3倍柱体积的纯水冲洗；再次加0.05倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为0.5倍柱体积/小时，0.3倍柱体积的纯水冲洗；如此反复直至吸附完全。吸附后，以流量为1.5倍柱体积/小时，5倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为1.5倍柱体积/小时，用12倍柱体积的0.3％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为0.5倍柱体积/小时，用5％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝2.8。得到有效洗脱液420mL，浓度为9.4mg/mL，色谱纯度94.6％。参见表四。

实施例13：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液177mL，盐酸万古霉素溶液通过装有琼脂糖CM Sepharose的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的5％(bons/L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.5倍柱体积/小时，向琼脂糖层析柱中添加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.7倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.15倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.5倍柱体积/小时，0.7倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为3.5倍柱体积/小时，7倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为2.5倍柱体积/小时，用15倍柱体积的0.5％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1倍柱体积/小时，用5％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将盐酸万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中盐酸万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝3.1。得到有效洗脱液605mL，浓度为10.9mg/mL，色谱纯度94.3％。参见表四。

实施例14：柱层析

取实施例4中的盐酸万古霉素滤液142mL，盐酸万古霉素溶液通过装有琼脂糖CM Sepharose的20mm×60cm的玻璃层析柱。每个层析柱盐酸万古霉素的加样量为添加在层析柱中柱体积的4％(bons/L)。吸附阶段用于提高吸附效果。首先，以流量为1.0倍柱体积/小时，向琼脂糖层析柱中添加0.1倍柱体积的万古霉素溶液，然后以相同流量用0.5倍柱体积的纯水冲洗。再次加0.1倍柱体积的万古霉素溶液，并且以流量为1.0倍柱体积/小时，0.5倍柱体积的纯水冲洗。吸附后，以流量为2.5倍柱体积/小时，6倍柱体积的纯水冲洗。

纯水冲洗后，以流量为3.5倍柱体积/小时，用18倍柱体积的0.7％(w/v)的NH₄HCO₃水溶液进行预洗。

预洗后，以流量为1.5倍柱体积/小时，用6％(w/v)NH₄HCO₃水溶液将万古霉素洗脱下来。分阶段用洗脱收集罐收集洗脱部分，并且进行HPLC检测使得在有效洗脱罐收集的洗脱液中盐酸万古霉素的HPLC含量不少于90％，效价不低于2000IU/ml，用4mol/L HCl溶液酸化调整至pH＝3.5。得到有效洗脱液442mL，浓度为11.7mg/mL，色谱纯度94.0％。参见表四。

实施例15

对酸化的万古霉素洗脱液进行超滤。超滤膜采用10000Da，超滤的回流温度控制在10～11℃。用纯化水洗涤滤渣，并且控制滤渣的效价和体积分别不超过2000IU/ml和100L。

超过滤通过纳滤膜进行过滤，除去盐分并浓缩，纳滤膜采用400Da。溶液的温度控制在10～20℃。分步加入纯化水直到浓缩物效价在150,000和250,000IU/ml之间，电导率不超过2000μs/cm。加入0.05％±0.01％的乙二胺四乙酸(W/bons)(制备乙二胺四乙酸并以(5±1)％(w/v)乙二胺四乙酸溶液加入)，并通过0.45μm(PVDF)和0.22μm(PES)的滤膜过滤得到浓缩物。

实施例16

万古霉素发酵液在碱性条件下过滤，得到的澄清滤液通过大孔吸附树脂XAD-1600，万古霉素被吸附在树脂，树脂水洗后用40％乙醇的酸性水溶液洗脱，万古霉素被洗脱下来，含有万古霉素的洗脱液加入活性炭脱色，过滤得到的滤液浓缩得到盐酸万古霉素水溶液，接着加入NH₄HCO₃进行沉淀，得到万古霉素粗品。万古霉素粗品中万古霉素B含量为88.2％，效价为572u/mg。

取此粗品4000g，加纯化水30.0L，加NaOH溶液调节pH到10.0，用0.2M²的0.5μm孔径的陶瓷膜过滤得到15.0L万古霉素滤液，溶液效价为51224IU/ml，万古霉素B含量为87.2％，滤液pH为9.8，滤液上柱层析，层析柱填料为琼脂糖凝胶。上柱结束后层析柱用纯化水洗柱6BV，然后用0.1mol/l的NH₄HCO₃水溶液洗柱10BV，然后用0.6mol/l的NH₄HCO₃水溶液层析，收集其中万古霉素含量在93％以上以及效价在2000IU/ml的部分，得到有效层析液。有效层析液中加入HCl，调节pH到2.8，然后用50000Da的超滤膜超滤得到滤液，然后用200Da孔径的纳滤膜浓缩脱盐，最后获得浓度为180mg/mL的盐酸万古霉素水溶液体积9.2L，含万古霉素色谱纯度为95.2％，溶液pH为3.0。

实施例17盐酸万古霉素的沉淀

取实施例16中的浓缩液1.0L，通过0.45μm和0.2μm的滤芯过滤后边搅拌边加入30％的NaCl水溶液100mL，万古霉素从中析出，形成了浆状物，继续搅拌30MIN，使其混合均匀，停搅拌静置24小时，过程温度控制在24～25℃。混合物通过过滤分离并先用用400mL90％乙醇顶洗，顶洗结束是顶洗液电导率为334μs/cm，然后用400mL无水乙醇顶洗，得到了盐酸万古霉素湿品212.9g，湿品通过干燥去除残留乙醇后得到中间体157.6g，再通过高真空干燥后得到盐酸万古霉素成品126.3g，成品水分为2.6％，万古霉素色谱纯度为96.9％。本步收率为70.1％。参见表五。

实施例18盐酸万古霉素的沉淀

取实施例16中的浓缩液1.0L，通过0.45μm和0.2μm的滤芯过滤后边搅拌边加入30％的NaCl水溶液233mL，万古霉素从中析出，形成了浆状物，继续搅拌60MIN，使其混合均匀，停搅拌静置48小时，过程温度控制在10～11℃。混合物通过过滤分离并先用用400mL90％乙醇顶洗，顶洗结束是顶洗液电导率为345μs/cm，然后用400mL无水乙醇顶洗，得到了盐酸万古霉素湿品222.5g，湿品通过干燥去除残留乙醇后得到粉168.2g，再通过高真空干燥后得到盐酸万古霉素成品133.4g，成品水分为3.1％，万古霉素色谱纯度为96.1％。本步收率为74.1％。参见表五。

实施例19盐酸万古霉素的沉淀

取实施例16中的浓缩液1.0L，通过0.45μm和0.2μm的滤芯过滤后边搅拌边加入30％的NaCl水溶液160mL，万古霉素从中析出，形成了浆状物，继续搅拌45min，使其混合均匀，停搅拌静置36小时，过程温度控制在14.5～15.5℃。混合物通过过滤分离并先用用400mL90％乙醇顶洗，顶洗结束是顶洗液电导率为408μs/cm，然后用400mL无水乙醇顶洗，得到了盐酸万古霉素湿品202.7g，湿品通过干燥去除残留乙醇后得到粉156.3g，再通过高真空干燥后得到盐酸万古霉素成品128.9g，成品水分为2.4％，万古霉素色谱纯度为96.5％。本步收率为71.6％。参见表五。

实施例20盐酸万古霉素的沉淀

取实施例16中的浓缩液1.0L，通过0.2μm的滤芯过滤后边搅拌边加入30％的NaCl水溶液100mL，万古霉素从中析出，形成了浆状物，继续搅拌30MIN，使其混合均匀，停搅拌静置36小时，过程温度控制在19～20℃。混合物通过过滤分离并先用用400mL90％乙醇顶洗，顶洗结束是顶洗液电导率为438μs/cm，然后用400mL无水乙醇顶洗，得到了盐酸万古霉素湿品212.9g，湿品通过干燥去除残留乙醇后得到粉157.6g，再通过高真空干燥后得到盐酸万古霉素成品126.3g，成品水分为2.6％，万古霉素色谱纯度为96.9％。本步收率为70.2％。参见表五。

实施例21：盐酸万古霉素的沉淀

取实施例16中的浓缩液1.0L，通过0.2μm的滤芯过滤后边搅拌边加入30％的NaCl水溶液200mL，万古霉素从中析出，形成了浆状物，继续搅拌40MIN，使其混合均匀，停搅拌静置40小时，过程温度控制在1 4～1 5℃。混合物通过过滤分离并先用用400mL90％乙醇顶洗，顶洗结束是顶洗液电导率为682μs/cm，然后用400mL无水乙醇顶洗，得到了盐酸万古霉素湿品207.5g，湿品通过干燥去除残留乙醇后得到粉144.1g，再通过高真空干燥后得到盐酸万古霉素成品125.4g，成品水分为2.1％，万古霉素色谱纯度为96.5％。本步收率为69.7％。参见表五。

实施例22：盐酸万古霉素的沉淀

取实施例16中的浓缩液1.0L，通过0.2μm的滤芯过滤后边搅拌边加入30％的NaCl水溶液200mL，万古霉素从中析出，形成了浆状物，继续搅拌90MIN，使其混合均匀，停搅拌静置38小时，过程温度控制在5～5.5℃。混合物通过过滤分离并先用用400mL90％乙醇顶洗，顶洗结束是顶洗液电导率为365μs/cm，然后用400mL无水乙醇顶洗，得到了盐酸万古霉素湿品216.8g，湿品通过干燥去除残留乙醇后得到粉152.4g，再通过高真空干燥后得到盐酸万古霉素成品130.7g，成品水分为2.6％，万古霉素色谱纯度为96.8％。本步收率为72.6％。参见表五。

表一

表二

表三

表四

表五

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

Claims (7)

1.一种盐酸万古霉素的提纯方法，所述提纯方法包括下列步骤：

(1)万古霉素发酵液在碱性条件下过滤，得到的澄清滤液通过大孔吸附树脂，万古霉素被吸附在树脂，树脂水洗后用含有乙醇的盐酸水溶液洗脱，万古霉素被洗脱下来，含有万古霉素的洗脱液加入活性炭脱色，过滤得到的滤液，浓缩得到盐酸万古霉素水溶液；

(2)浓缩结束后，在盐酸万古霉素水溶液中加入NH₄HCO₃，然后用氨水调节盐酸万古霉素水溶液pH至7.5～8.5，搅拌50-60min，使其混合均匀，万古霉素从溶液中沉淀出来，沉淀过程的温度控制在10～20℃，静置16±2小时后，把混合液固液分离，使万古霉素沉淀从溶液中分离出来得到固体万古霉素碱，然后用乙醇顶洗，洗去固体中残留液，分离后得到万古霉素粗品；

(3)万古霉素粗品在水溶液里溶解后过滤，上层析柱层析纯化得到万古霉素色谱纯度93％以上的有效层析液，有效层析液经过超滤、纳滤后得到盐酸万古霉素浓缩液，其中，所述层析的介质为葡聚糖凝胶Sephadex CM-25、琼脂糖SP Sepharose或琼脂糖CM Sepharose；

(4)盐酸万古霉素浓缩液通过0.45μm和0.2μm的滤芯过滤后进行沉淀；向含有盐酸万古霉素的浓缩液中加入NaCl水溶液，使浓缩液中NaCl的浓度为3％～7％(W/V)，并持续搅拌，控制混合液温度在5～25℃，静置后固液分离；

(5)滤饼先用90％的乙醇水溶液进行第一次顶洗，顶洗至电导率≤1000μs/cm时停止加入90％的乙醇水溶液，再用经0.45μm膜过滤后的无水乙醇进行第二次顶洗，顶洗后即得盐酸万古霉素沉淀湿品，盐酸万古霉素沉淀湿品通过干燥去除残留乙醇及水分，获得盐酸万古霉素成品。

2.如权利要求1所述的提纯方法，其中，步骤(3)中，层析的流动相为4～6％(w/v)NH₄HCO₃。

3.如权利要求2所述的提纯方法，其中，流动相以流量为0.5～1.5柱体积/小时进行洗脱。

4.如权利要求2所述的提纯方法，其中，在用4～6％(w/v)NH₄HCO₃流动相洗脱前，还包括，先用纯水和低浓度的NH₄HCO₃溶液进行顶洗。

5.如权利要求1所述的提纯方法，其中，步骤(3)中，所述超滤的回流温度控制在10～20℃，并用纯化水洗涤滤渣，超滤膜选用10000Da～50000Da。

6.如权利要求1所述的提纯方法，其中，步骤(3)中，所述纳滤溶液的温度控制在10～20℃，并分步加入纯化水和0.04％～0.06％的乙二胺四乙酸，纳滤膜选用200Da～600Da。

7.如权利要求1所述的提纯方法，其中，步骤(4)中，加入NaCl水溶液后，不断搅拌30～90分钟，并静置24～48小时。