CN102863519B - 一种盐酸万古霉素的精制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐酸万古霉素的精制方法，将纯度在90%以上的盐酸万古霉素溶液精制为纯度在95%以上的盐酸万古霉素，精制过程实现固液分离，不使用有机溶媒，收率在80%以上。固液分离所得到母液中的万古霉素可返回前道分离工序回收。本发明操作简便，收得率高，是一种切实可行的工业化精制工艺。

Description

一种盐酸万古霉素的精制方法

技术领域

本发明属于提纯技术领域，具体涉及一种盐酸万古霉素的精制方法。

背景技术

盐酸万古霉素是美国礼来公司于1958年开发的，放线菌属东方拟无枝菌酸菌在适宜的条件下发酵产生的糖肽类抗生素。由于盐酸万古霉素与其它抗生素无交叉耐药，对耐药的金黄色葡萄球菌等有较强的杀灭作用，始终为临床医生所关注。但过去文献报道认为，万古霉素有严重的肾、耳毒性，故在临床未被广泛使用。

近年来由于抗生素的大量使用，导致临床上耐甲氧西林金葡菌（MASA）感染病例日益增多，这种感染对手术后患者，及低免疫力患者是致命的。盐酸万古霉素因其所具有的独特的对革兰氏阳性菌的抑制机理，被公认为是为数不多的、可用于治疗复杂的耐甲氧西林金葡菌（MASA）感染化学疗剂。同时由于近年来新科学技术的不断发展和运用，使得药用盐酸万古霉素纯度在不断提高。相应的，过去认为盐酸万古霉素所具有的严重的肾、耳毒性在不断减少。基于上述这些原因，盐酸万古霉素在临床治疗方面起着越来越重要的作用。这样，建立一个简便可行、低污染、适用于工业化生产的精制工艺，制造出高纯度的、符合药用标准的盐酸万古霉素有着重要的意义。

万古霉素由其分子化学结构（图1）上来看，为糖肽类化合物，有很好的水溶性；同时以肽链中的酚羟基与二糖成甙键，这样的结构决定了它对酸，碱尤其是热的不稳定性，一旦过酸、过碱，尤其是受热容易造成甙键断裂，失去二糖。结构还带有多个游离酚羟基，导致其易氧化成醌式——这可能与终产品常常带有浅粉红色有关。同时糖结构上带有一游离氨基，具有弱碱性，可与盐酸形成盐，而所带的多个游离酚羟基具有弱酸性，因此是一两性化合物，有报道称其等电点是pH 8.1。正是由于万古霉素化学结构的这些特点，给制造高纯度盐酸万古霉素造成一定的困难。

盐酸万古霉素已开发多年，早期的精制方法多采用结晶或沉淀技术，经过滤、热真空干燥，得到成品。即往已处理到一定纯度的盐酸万古霉素溶液中加入能与水互溶的有机溶媒如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈等使之产生结晶或沉淀，离心或过滤实现固液分离，固体部分经加热真空干燥，去除水分及有机溶媒得到产品。采用这种方法所制造的产品纯度往往在85 - 93%之间，达不到中国药典2010版及欧洲药典6.0版纯度在93%以上的要求。

近年来各种介质的色谱分离技术在盐酸万古霉素纯化方面得到广泛应用，使得纯化液中盐酸万古霉素纯度都能在95%以上。中国专利200710187300.5采用葡聚糖Sephadex CM-25 及 琼脂糖SP Sepharose  或 CM Sepharose 色谱分离技术，使纯度为88%的万古霉素粗品液纯化成纯度为95%纯化液，纯化回收率约为70%。 EP1824874采用反向硅胶（Octadecyl silica gel）分离万古霉素粗品，可得到纯度为97%纯化液。WO2006/004238使用疏水性吸附树脂 AmberchromCG-161分离，可使纯化液纯度达到95%以上。尽管采用色谱分离技术截获的纯化液（水溶液）盐酸万古霉素纯度都能在95%以上，药品制造规范往往要求制造过程后期有一道结晶或沉淀工序，实现固液分离以去除母液中可能存在的潜在杂质，而不宜直接冷冻干燥或喷雾干燥制成产品。因此上述几个专利均采用加入有机溶媒结晶或沉淀的方法，实现固液分离。所得固体经加热、真空干燥制得成品。事实上盐酸万古霉素由于化学结构上的特点，要得到各项标准均能达到药典要求的产品，对结晶条件如溶媒、温度、搅拌速度等有一定限制，这样就造成结晶晶体细而粘不易过滤。更困难的是所得到的固体需要加热、真空干燥才能达到水分含量小于5%及残留溶媒小于0.5%的药典要求。而加热往往会造成盐酸万古霉素纯度的显著的下降和澄清度不合格——这可能与盐酸盐受热分解有关。

WO2010/082726为应对上述困难，披露了一种新的解决方案。他们的研究表明，采用结晶法得到盐酸万古霉素在温度40℃以下真空干燥，很难达到欧洲药典6.0项下水分含量应小于5%，残留溶媒（三类溶媒）应小于0.5%的要求。在40℃以上温度真空干燥，将导致盐酸万古霉素破坏，纯度由干燥前的96%在数小时内跌至93%以下。为解决这些困扰，他们经加入有机溶媒结晶并经固液分离得到的湿粉，此湿粉盐酸万古霉素纯度达96%以上，水分及溶媒30-50%，将此湿粉用纯化水溶解，用反渗透膜浓缩到一定体积，再加入等体积纯化水，继续用反渗透膜浓缩到一定体积，如此反复多次，相当于用水洗涤盐酸万古霉素溶液多次，以去除湿粉所带的无机盐及溶媒，然后用反渗透膜浓缩到约120克-170克/升，调pH 2.5，经活性炭脱色及无菌过滤，最后进行冷冻干燥，得到盐酸万古霉素粉，产品符合欧洲药典6.0版标准。这种解决方法实现了固液分离的精制要求，同时也避免了热真空干燥，不失为实际工业化生产可行的一种工艺。但是该精制工艺采用加入近2倍量（V/V）的乙醇结晶方法，这类结晶方法有几点缺陷：1）采用加入能与水互溶的有机溶媒结晶方法，受限于结晶过程不能加热及pH2.5-3.0 之间，所得到的晶体细而粘，很难过滤。2）母液中的有机溶媒需加热回收，造成母液中带有的总量10-20%的盐酸万古霉素受热降解而无法回收利用。3）母液中未回收完全的有机溶媒及盐酸万古霉素受热降解物对环保处理造成的压力。

综上所述，为生产出高纯度、高收率、符合现行各国药典标准的盐酸万古霉素，有必要建立一个更优化的，环境友好的盐酸万古霉素精制工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种盐酸万古霉素的精制方法，本发明操作简便，收得率高，是一种切实可行的工业化精制工艺。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种盐酸万古霉素的精制方法，将纯度在90%以上的盐酸万古霉素溶液精制为纯度在95%以上的盐酸万古霉素，精制过程实现固液分离，不使用有机溶媒，收率在80%以上。

所述的精制方法包括以下步骤：

（1）将待精制的纯度在90%以上的盐酸万古霉素溶液冷却至15℃以下，用氯化铵-氨水缓冲对配制成pH为8.0-8.1的悬浮液；

待精制的纯度在90%以上的盐酸万古霉素溶液浓度控制在50-150克/升之间，最佳浓度为60-120克/升。

将氯化铵固体投入待精制的盐酸万古霉素溶液，搅拌使之溶解，质量体积浓度控制在1.0-2.5%之间。在已投入氯化铵的溶液中边搅拌边用6N氨水调pH至8.0-8.1之间；继续搅拌1-2小时使之沉淀完全，静置8-12小时；全部操作均在溶液温度15℃以下进行。

（2）充分搅拌步骤（1）的悬浮液使之沉淀完全，经离心或其他过滤方式进行固液分离；固体置高真空、30℃以下干燥24小时；

万古霉素是一种两性化合物，在等电点pH=8.0-8.1附近所析出的晶体颗粒大，极易过滤。与用溶媒法或盐析法所得晶体相比有显著的差异。固液分离所得到的母液，可直接加入前道色谱分离工序，回收盐酸万古霉素。所得固体置0℃下保存数周，纯度几乎没有变化，因此可作为稳定的中间体进行储存。

（3）用纯化水和4M 盐酸溶液将步骤（2）的固体溶解成浓度为20-25克/升、pH为2.5-3.5的盐酸万古霉素溶液；用150Da纳滤膜浓缩至浓度为30-50克/升；加入与溶液等体积注射用水进行透析洗涤并重复透析洗涤5次；然后将溶液继续纳滤浓缩至浓度为120-150克/升；整个过程溶液温度始终控制在15℃以下；用注射用水反复透析洗涤是为去除溶液中可能带有的无机盐， 主要是氯化铵。

（4）将步骤（3）的浓度为120-150克/升的盐酸万古霉素浓缩液用4M HCl 调pH至2.5-3.5，加入占盐酸万古霉素固体质量5-10%的活性碳脱色、除热源，再经过精滤，进行冷冻干燥；所得盐酸万古霉素纯度在95.0%以上，精制收率在80%以上，产品质量符合中国药典，及欧洲、美国药典要求。

本发明操作简便，收得率高。以往工艺在精制前都要求盐酸万古霉素溶液的纯度在95%以上，这样才能保证最后成品纯度在药典要求的93%以上。本发明仅要求盐酸万古霉素溶液的纯度在90%以上，经过结晶，固体粉纯度可提高到95%以上，最后成品纯度可确保在93%以上。做过色谱分离的人都知道，在相同的柱效条件下，要获得纯度高的分离液，截获的部位往往比较窄，收得率比较低。如果分离液纯度要求低些，截获的部位可以比较宽，收得率比较高。

本发明所提及的盐酸万古霉素的纯度是采用中国药典2010版所规定的HPLC法所测定的，该方法与欧洲药典7.0版规定的方法是一致的。

附图说明

图1是盐酸万古霉素分子结构式。

图2是盐酸万古霉素液（分离液）纯度HPLC图谱。

图3是万古霉素粉纯度HPLC图谱。

图4是盐酸万古霉素成品纯度HPLC图谱。

具体实施方式

以下实例对本发明作一些具体说明， 但并不表示本发明仅局限于以下实例及实例所提及的工艺参数范围内。

实施例1： 盐酸万古霉素溶液的制备

将浓度为87克/升，纯度82%盐酸万古霉素提取液3.62升，通过装有4升 PS/DVB反向色谱填料的层析柱。随后用5%正丁醇水溶液梯度顶洗，顶洗后期正丁醇水溶液浓度升至10%。用自动收集器分段收集洗出流分，并用HPLC法检测流分纯度。合并纯度在90%以上的流分，纳滤浓缩，得到盐酸万古霉素溶液3.45升。浓度：68.98克/升，收率：85.0%，纯度：91.82%，见图2。

实施例2： 万古霉素制备

将实例1所制得的盐酸万古霉素液3升，置15℃的冷水浴中。搅拌下加入30克氯化铵固体，充分搅拌使之完全溶解，搅拌下用4N的氨水调pH=8.08，搅拌3小时，其间有大量固体析出，静置过夜。抽滤滤集固体。所得固体经高真空、30℃干燥4小时后，磨粉，再置高真空、30℃干燥20小时。得万古霉素固体 197.4克。效价：868μg/mg，收率：90.18%，纯度：95.68%，见图3。

实施例3： 盐酸万古霉素制备

将实例2所制得的万古霉素固体 180克悬浮于8升纯化水中，冷却至5℃，搅拌下用4M 盐酸调pH2.8，充分搅拌使之完全溶解。将此溶液置纳滤系统，浓缩至4升体积。加入4升纯化水，继续浓缩至4升体积。重复如此洗涤操作5次。最后将此溶液浓缩至1.3升体积。

上述浓缩液中加入活性碳10克，室温下搅拌30分钟，过滤，滤液再经0.22μm 膜过滤，装盘，置冷冻干燥机，-45℃冷冻4小时。开启真空至15Pa以下进行升华，并升温至-10℃，在此温度保持真空10小时。随后继续升温到0℃并保持真空5小时，最后升温至30 ℃保持真空3小时。收粉，得产品盐酸万古霉素 142.5克, 收率：91.20%。样品经测定符合中国药典2010版及欧洲药典7.0版的标准，其中，水分含量：4.3%，纯度：95.12%，见图3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种盐酸万古霉素的精制方法，所述的精制方法包括以下步骤： 

（1）将浓度为50-150克/升的纯度在90%以上的待精制的盐酸万古霉素溶液冷却至15℃，将氯化铵固体投入待精制的盐酸万古霉素溶液，搅拌使之溶解，质量体积浓度控制在1.0-2.5%之间，在已投入氯化铵的溶液中边搅拌边用6N氨水调pH至8.0-8.1之间；继续搅拌1-2小时使之沉淀完全，静置8-12小时；全部操作均在溶液温度为15℃进行；

（2）经离心进行固液分离；固体置高真空，30℃干燥24小时；

（3）用纯化水和4M 盐酸溶液将步骤（2）的固体溶解成浓度为20-25克/升、pH为2.5-3.5的盐酸万古霉素溶液；用150Da纳滤膜浓缩至浓度为30-50克/升；加入与溶液等体积注射用水进行透析洗涤并重复透析洗涤5次；然后将溶液继续纳滤浓缩至浓度为120-150克/升；整个过程溶液温度始终控制在15℃；

（4）将步骤（3）的浓度为120-150克/升的盐酸万古霉素浓缩液用4M HCl调pH至2.5-3.5，活性碳脱色，精滤，冷冻干燥，即得到盐酸万古霉素，其纯度在95.0%以上，收率在80%以上。