CN106565818A - 一种盐酸万古霉素杂质高纯度样品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐酸万古霉素相关杂质4、杂质6和杂质9高纯度样品的制备方法，取盐酸万古霉素结晶粉末，配制成浓度为10～15g/L的水溶液；水浴保温30～33℃，加入乙二醇，搅拌120-122小时；然后降温到20-21℃，并缓慢滴加无水乙醇结晶；分离晶体，用高压液相色谱制备柱分离得到盐酸万古霉素中杂质4、杂质6和杂质9的高纯度样品。该方法工艺简单，大大降低了制备成本。

Description

一种盐酸万古霉素杂质高纯度样品的制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵制药领域，涉及一种抗生素产品中的相关杂质的制备方法，尤其涉及盐酸万古霉素相关杂质4、杂质6、杂质9的高纯度样品的制备方法。

背景技术

盐酸万古霉素是三环糖苷化非核糖体肽的一种分支产物，由放线菌属的东方拟无枝酸菌(以前被命名为东方诺卡菌)通过发酵产生。盐酸万古霉素为窄谱抗生素，仅对革兰阳性菌有效，如溶血性链球菌、肺炎球菌及肠球菌等均属敏感，对耐药金葡菌本品尤为敏感。其作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，它主要和细菌细胞壁结合，而使某些氨基酸不能进入细胞壁的糖肽中。临床主要用于耐青霉素金葡菌所引起的严重感染，如肺炎、心内膜炎及败血症等，对溶血性链球菌引起的感染及败血症等也有较好的疗效。

盐酸万古霉素相关杂质是盐酸万古霉素质量控制的重点，高纯度的杂质样品对其药理毒理研究有重要作用。

盐酸万古霉素的检测方式根据2010版中国药典规定，采用的高压液相色谱检测条件如下：

液相色谱仪：岛津LC-2010C HT

色谱柱：C₁₈250×4.6mm 品牌：Thermo(赛默飞世尔)

流动相A：三乙胺缓冲液(取三乙胺4mL加水至2000mL，用磷酸调节pH值至3.2)∶乙腈∶四氢呋喃＝92∶7∶1

流动相B：三乙胺缓冲液∶乙腈∶四氢呋喃＝70∶29∶1

梯度设置：

检测波长：λ＝280 流速:1.0mL/min 进样体积:20μL

根据上述的检测方法，对盐酸万古霉素样品进行高压液相色谱检测，检测图谱如图1所示。分别对图1中的杂质进行编号命名，如下表1所示：

表1

保留时间(Min)	相对保留值	杂质编号
			3.80	0.43	1
4.653	0.52	2
			5.434	0.61	3
5.969	0.67	4
			6.499	0.73	5
7.07	0.8	6
			8.368	0.94	7
8.874	1	万古霉素
			13.532	1.52	8
15.737	1.77	9
			17.415	1.96	10
19.123	2.15	11
			19.562	2.2	12
20.35	2.29	13
			22.312	2.51	14
23.717	2.67	15

为了方便对杂质进行一个定量的计算，用盐酸万古霉素作为标准品，通过面积归一法计算得到的一个方便我们衡量上柱量的相对的数值。

其中杂质4、杂质6、杂质9(参见图1)在盐酸万古霉素成品中含量比较低，C18填料制备柱分离制备此杂质需要消耗大量的盐酸万古霉素成品及大量的流动相，制备成本非常高昂。

发明内容

本发明的目的是提供一种盐酸万古霉素相关杂质4、杂质6和杂质9的高纯度样品的制备方法，可以快速且较方便地将盐酸万古霉素样品中的杂质4、杂质6、杂质9富集到较高的纯度，且组份相对单一，再通过制备分离得到高纯度的杂质样品。

一种盐酸万古霉素杂质4、杂质6和杂质9高纯度样品的制备方法，其步骤包括：

1)取盐酸万古霉素结晶粉末，配制成浓度为10～15g/L的盐酸万古霉素水溶液；

2)将步骤1)得到的盐酸万古霉素水溶液水浴加热到30～33℃，然后加入乙二醇，搅拌并保温120-122小时；

3)将步骤2)的溶液降温到20-21℃，并缓慢滴加无水乙醇结晶，并分离晶体；

4)将晶体用高压液相色谱制备柱分离得到盐酸万古霉素中杂质4、杂质6和杂质9的高纯度样品。

优选的，上述步骤2)中所加入的乙二醇体积为盐酸万古霉素水溶液体积的7％～8％。

优选的，上述步骤3)滴加无水乙醇的量为步骤2)保温后溶液体积的4～6倍；晶体采用常规分离方法进行分离，例如离心分离。

优选的，上述步骤4)中制备柱使用的分离条件为：

制备填料：C18HCE

流动相A：乙腈

流动相B：0.1％(V/V)TFA水溶液

梯度设置：

表2

时间(min)	流动相B	流动相A	流速(mL/min)
				0	92	8	70
30	85	15	70
				31	10	90	70
35	10	90	70
				35.1	92	8	100
45	92	8	100

检测波长：280nm

通过本发明方法可以快速制备盐酸万古霉素样品中的杂质4、杂质6、杂质9高纯度样品，工艺简单，相比于现有技术中制备这几项杂质的方法节约了大量成本。

附图说明

图1是盐酸万古霉素样品的高压液相色谱检测图谱。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1.

1.取6g盐酸万古霉素结晶粉末，加入纯化水配制成10g/L的水溶液，溶液体积约600mL；

2.将步骤1配制的溶液水浴保温，温度为30℃；加入42mL的乙二醇，搅拌均匀保温122小时；

3.降温到20℃，并缓慢滴加3852mL无水乙醇结晶，离心分离晶体；

4.高压液相色谱检测晶体，杂质4含量为17.68％(质量百分含量，下同)，杂质6含量21.4％，杂质9含量6.97％；

5.使用高压制备液相色谱进行制备分离，分离杂质冻干检测，结果如表3所示。

表3

杂质名称	色谱纯度	冻干重量
			杂质4	98.5％	246μg
杂质6	97.4％	321μg
			杂质9	99.5％	103μg

实施例2.

1.取8g盐酸万古霉素结晶粉末，加入纯化水配置成1.5g/L的水溶液，溶液体积约533mL；

2.将步骤1配制的溶液水浴保温，温度为33℃；加入42.6mL的乙二醇，搅拌均匀保温120小时；

3.降温到21℃，并缓慢滴加2302mL无水乙醇结晶，离心分离晶体；

4.高压液相色谱检测晶体，杂质4含量为15.32％，杂质6含量19.36％，杂质9含量10.67％；

5.使用高压制备液相色谱进行制备分离，分离杂质冻干检测，结果如表4所示。

表4

杂质名称	色谱纯度	冻干重量
			杂质4	98.6％	186μg
杂质6	98.1％	211μg
			杂质9	99.0％	168μg

实施例3.

1.取5g盐酸万古霉素结晶粉末，加入纯化水配置成1g/L的水溶液，溶液体积约500mL；

2.将步骤1配制的溶液水浴保温，温度为33℃；加入35mL的乙二醇，搅拌均匀保温120小时；

3.降温到21℃，并缓慢滴加2675mL无水乙醇结晶，离心分离晶体；

4.高压液相色谱检测晶体，杂质4含量为16.73％，杂质6含量22.34％，杂质9含量11.65％；

5.使用高压制备液相色谱进行制备分离，分离杂质冻干检测，结果如表5所示。

表5

杂质名称	色谱纯度	冻干重量
			杂质4	97.8％	173μg
杂质6	98.3％	194μg
			杂质9	99.2％	112μg

Claims (5)

1.一种盐酸万古霉素相关杂质4、杂质6和杂质9高纯度样品的制备方法，其步骤包括：

1)取盐酸万古霉素结晶粉末，配制成浓度为10～15g/L的盐酸万古霉素水溶液；

2)将步骤1)得到的盐酸万古霉素水溶液水浴加热到30～33℃，然后加入乙二醇，搅拌并保温120-122小时；

3)将步骤2)的溶液降温到20-21℃，并缓慢滴加无水乙醇结晶，并分离晶体；

4)将晶体用高压液相色谱制备柱分离得到盐酸万古霉素中杂质4、杂质6和杂质9的高纯度样品。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所加入的乙二醇体积为盐酸万古霉素水溶液体积的7％～8％。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)滴加无水乙醇的量为步骤2)保温后溶液体积的4～6倍。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)离心分离晶体。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中制备柱使用的分离条件为：制备填料为C18HCE；流动相A为乙腈；流动相B为0.1％(V/V)的三氟乙酸水溶液；梯度设置为表2所示：

表2

时间(min) 流动相B 流动相A 流速(mL/min) 0 92 8 70 30 85 15 70 31 10 90 70 35 10 90 70 35.1 92 8 100 45 92 8 100

检测波长为280nm。