CN102247396A - 左旋可利霉素、其药物组合物、制备方法及应用 - Google Patents

左旋可利霉素、其药物组合物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种左旋可利霉素、其药物组合物、制备方法及应用。左旋可利霉素是以异戊酰螺旋霉素III、II、I三个组分为主的混合物，含有一定量的异丁酰螺旋霉素III、II，丁酰螺旋霉素III、II，丙酰螺旋霉素III、II和乙酰螺旋霉素III、II，其中异戊酰螺旋霉素III的含量不低于30wt％，异戊酰螺旋霉素III、II、I的总含量不低于60wt％，酰化螺旋霉素的含量为80～98wt％，该左旋可利霉素在温度25℃、0.02g/ml氯仿溶液中的比旋度为[α]D＝-52°～-57°。还涉及异戊酰螺旋霉素III、II或I为晶体化合物的左旋可利霉素和含所述左旋可利霉素的药物组合物。本发明的左旋可利霉素或其药物组合物中活性成分有旋光性，抗感染效果优良。

Description

左旋可利霉素、其药物组合物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于可利霉素原料药及其药物制剂领域，具体地说，涉及一种大环内酯类基因工程抗生素，尤其涉及一种左旋可利霉素药物、其制备方法及其在制备治疗和预防感染性疾病药物中的应用。
背景技术
可利霉素是利用基因工程技术研制的新型螺旋霉素衍生物，原命名为必特螺旋霉素，曾用名为生技霉素[专利号：ZL97104440.6]。根据“中国药品通用名称命名原则”，经国家药典委员会技术审核及研究确定，必特螺旋霉素的中文通用名称更改为可利霉素，英文名称为Carrimycin。
可利霉素为基因工程菌发酵产物，其化学结构是以4”-异戊酰螺旋霉素为主成分，包括4”-异戊酰螺旋霉素I、II、III，其次还含有约6种4”-位羟基酰基化的螺旋霉素，故其化学名统称为4”酰化螺旋霉素。
可利霉素主成分的化学结构如式(1)所示：
Figure BDA0000063571980000011
其中：
Figure BDA0000063571980000012
可利霉素为16元环大环内酯类抗生素，其作用机制是通过与细菌核糖体结合而抑制其蛋白质合成。
体外试验结果表明，可利霉素对革兰氏阳性菌、尤其对某些耐药菌(如耐β-内酰胺金葡菌、耐红霉素金葡菌等)有效，与同类药无明显的交叉耐药性。同时它对支原体、衣原体有很好的抗菌活性，对部分革兰氏阴性菌也有抗菌活性，且对弓形体、军团菌等有良好抗菌活性和组织渗透性，还有潜在的免疫调节作用。其体内抗菌活性明显优于体外[ZL200310122420.9]。临床研究表明，每日服用可利霉素片剂0.2-0.4mg5-7天，可适用于治疗化脓性链球菌引起的急性细菌性咽炎、急性化脓性扁桃体炎；敏感细菌引起的细菌性鼻窦炎、急性支气管炎；肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及肺炎支原体所致的轻症肺炎；支原体、衣原体引起的非淋球菌性尿道炎；敏感细菌引起的皮肤软组织感染、牙周炎、中耳炎等感染性疾病。其总有效率为92.68％，可利霉素安全有效。
药代动力学研究结果表明，可利霉素中具活性的有效组分主要为异戊酰螺旋霉素I、II、III。可利霉素进入体内后很快代谢为螺旋霉素，以母体药物异戊酰螺旋霉素I、II、III和活性代谢物螺旋霉素I、II、III的AUC0-t总和计算，其口服绝对生物利用度平均为91.6％。文献报道，螺旋霉素人体口服绝对生物利用度为30-40％[Frydman AM et al J AntimicrobChemother.1988，22(suppl B)：93-103]。说明异戊酰螺旋霉素的结构明显改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。单次服药可利霉素消除较慢，T1/2β在23-27小时之间。
通过对可利霉素有效组分的研究发现，可利霉素中具活性的有效组分异戊酰螺旋霉素I、II、III的分子结构中存在多个手性碳原子。而手性(Chirality)是三维物体的基本属性，是自然界的本质属性之一。作为生命活动重要基础的生物大分子，如蛋白质、多糖、核酸和酶等，几乎全是手性的，这些大分子在体内往往具有重要的生理功能。手性药物(chiral drug)是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差别，分别被命名为R-型(右旋)或S-型(左旋)、外消旋。而近20年以来随着药学研究工作的深入，已表明药物对映体立体选择性(stereoselectivity)的不同，使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用的极大差异。人们将手性药物中活性高的对映体称为优对映体(Eutomer)；而活性低的或无活性的对映体称为劣对映体(Distomer)。在许多情况下，劣对映体不仅没有药效，而且还会部分抵消优对映体的药效，有时甚至还会产生严重的毒副反应，表现出药效差异的复杂性，也决定了单一对映体的治疗指数与其消旋体有着相当的差异，如熟知的DL-(+-)合霉素的疗效仅为D(-)氯霉素的一半；普萘洛尔(propranolol)L-异构体的药物活性比D-异构体大100倍；(-)美沙酮是强止痛剂，而(+)无效。而且毒性也存在差别，如沙立度胺(thalidomide)的两个对映体对小鼠的镇静作用相近，但只有S(-)异构体及其代谢物才有胚胎毒及致畸作用；氯胺酮为一有特点的广泛应用的麻醉和镇痛药，但存在产生幻觉等副作用，研究发现，S(+)体药效比R(-)体强3～4倍，而毒副作用明显与后者有关。手性药物疗效的极大差异促进了手性药物的研究开发以及分离分析的发展。利用“手性”技术，人们可以有效地将药物中不起作用或有毒副作用的对映体剔除，生产出具有单一定向结构的纯手性药物，从而让药物成分更纯，在治疗疾病时疗效更快、疗程更短。因此，手性药物的研究目前已成为国际新药研究的新方向之一，各国政府和各大医药公司纷纷投入巨资，在手性药物制剂、手性原材料和手性中间体等领域进行研究开发，抢占世界手性制药市场。此外，随着手性技术的不断改进，尤其是液相色谱法的迅速广泛应用，积极地推动了手性药物对映体的分离分析和测定。单一对映体手性药物已得到了广泛的应用。
可利霉素是否也具有光学活性，本发明人对此进行了大量的研究，很惊喜地发现，通过对培养、发酵条件的调整和优化，意外的得到了一种具有旋光活性的可利霉素，该具有旋光活性的可利霉素具有更加优良的抗感染活性，为此，本发明提供一种左旋可利霉素、其制备方法及其在制备预防和治疗感染性疾病药物中的应用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种左旋可利霉素，该左旋可利霉素具有旋光性，同时具有更加优良的抗感染活性。
本发明的第二目的在于提供一种左旋可利霉素药物组合物，该左旋可利霉素药物组合物含有本发明所提供的具有旋光性的左旋可利霉素和药学上可接受的载体。
本发明的第三目的在于提供一种左旋可利霉素的制备方法，该方法生产工艺简化，质量标准易控，所制备的左旋可利霉素效果优良，具有旋光性，同时抗感染活性更加优良。
本发明的第四目的在于提供本发明所述的左旋可利霉素或左旋可利霉素药物组合物在制备治疗和预防感染性疾病药物中的应用，尤其是在抗细菌、抗衣原体及支原体方面有较好的疗效，可以作为感染性疾病的药物。
为实现本发明的第一目的，本发明采用如下技术方案：
一种左旋可利霉素，其特征在于，所述的左旋可利霉素是以异戊酰螺旋霉素III、II、I三个组分为主的混合物，含有一定量的异丁酰螺旋霉素III、II，丁酰螺旋霉素III、II，丙酰螺旋霉素III、II和乙酰螺旋霉素III、II，其中异戊酰螺旋霉素III的含量不低于30wt％，异戊酰螺旋霉素III、II、I的总含量不低于60wt％，酰化螺旋霉素的含量为80～98wt％，优选85～98wt％，更优选90～98wt％，最优选95～98wt％；所述的左旋可利霉素在温度25℃、0.02g/ml氯仿溶液中的比旋度为[α]D＝-52°～-57°，优选-54°～-56°，更优选-55°。
本发明人对可利霉素进行了大量的研究，通过对培养发酵条件的调整和优化，尤其是通过pH调节剂严格控制发酵过程中的pH值，使发酵过程中pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，并且每个阶段各满足一定的方程式，从而得到了具有光学活性的左旋可利霉素，这可能是由于在此培养发酵条件下导致了具有光学活性的组分的含量发生了改变，也可能是由于在此培养发酵条件下导致其光学构型发生变化。
本发明的左旋可利霉素比旋度测定方法为：取本发明制得的左旋可利霉素，精密称定，加氯仿溶解并稀释成每1ml中约含20mg的溶液，采用钠光谱的D线(589.3nm)测定旋光度，测定长度为1dm，测定温度为25℃，使用读数至0.0001°，并经过检定的旋光计。
本发明的左旋可利霉素的熔程为112～122℃，优选114～120℃，更优选116～118℃。
其测定方法为：取经干燥的本品适量，置熔点测定用毛细管中，进行熔点测定，重复测定三次，取平均值。
本发明的可利霉素具有旋光性，而根据现代药理学研究，由于药物对映体的立体选择性的不同，使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用发生很大差异。而本发明通过体内药效和体外药效证明本发明的左旋可利霉素具有优良的抗感染效果，同时具有很强的药理活性，从而为感染性疾病的治疗提供了一种新的药物，也为研发可利霉素的手性药物制剂奠定了基础。
经体内外试验证明，本发明的左旋可利霉素敏感度高，耐药性小，除对耐药的金黄色葡萄球菌有效外，尚能对由于滥用抗生素引起的细菌感染具有不可估量的价值。如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染；超光谱β-内酰胺酶(ESBL)生成的大肠杆菌感染；艰难梭菌(C-diff)引起的传染病均因滥用抗生素所致，由于左旋可利霉素的问世，可望得到控制。
本发明所述的左旋可利霉素还含有螺旋霉素III和其它组分，其中螺旋霉素III的含量不大于1.0％，其它组分的含量总和为2.0～19wt％，优选2.0～14.0wt％，更优选2.0～9.0wt％，最优选2.0～4.0wt％。
本发明中，所述的其它组分中至少含有3种改进的螺旋霉素的同系物。
本发明的左旋可利霉素是以异戊酰螺旋霉素III、II、I三个组分为主的混合物，所述的异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物，或者所述的异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物，或者所述的异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物；
当异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物时，该晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为8.0°、10.0°、11.2°、11.7°、16.4°、19.1°、19.6°、20.0°、21.4°、22.9°、23.6°和29.4°显示有特征峰；
当异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物时，该晶体使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为10.0°、11.6°、16.4°、17.3°、19.1°、21.2°、22.1°、22.7°、26.4°、26.9°、27.5°和31.5显示有特征峰；
当异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物时，该晶体使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为7.6°、8.0°、10.0°、11.4°、16.4°、17.0°、17.5°、17.9°、19.5°、22.7°、23.7°和24.4°显示有特征峰。
本发明人经过进一步的研究发现，当将所得到的左旋可利霉素进行纯化分离得到异戊酰螺旋霉素III、II或I的单组分后，再将其中一种组分进行重结晶得到异戊酰螺旋霉素III、II、I的晶体后再与左旋可利霉素混合得到了异戊酰螺旋霉素III、II、或I为左旋异戊酰螺旋霉素III、II、或I晶体化合物的左旋可利霉素，经体内药效发现异戊酰螺旋霉素III、II、或I为左旋异戊酰螺旋霉素III、II、或I晶体化合物的左旋可利霉素的药效明显由于单纯的左旋可利霉素。
为实现本发明的第二目的，本发明采用如下技术方案：
一种左旋可利霉素药物组合物，其中，所述的左旋可利霉素药物组合物含有上述的左旋可利霉素和药学上可接受的载体。
本发明所述的药物组合物中，左旋可利霉素的含量为安全及治疗有效量的左旋可利霉素，优选左旋可利霉素的含量为药物组合物的10～90wt％，更优选25～75wt％，再优选40～60wt％。
本发明所用术语“安全及治疗有效量”，是指能减轻或逆转或治疗人体或其它哺乳动物的疾病而且所服用的药物或药剂对哺乳动物的组织并无严重伤害的药物、化合物、组合物、产品或药剂的足够用量。
本发明所用术语“药学上可接受的载体”，是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。此外，还可以在组合物中添加其它辅料如香味剂、甜味剂等。
本发明的组合物可任选使用安全及有效量的稀释剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、吸收促进剂、表面活性剂、赋形剂或任何其它安全及有效量的本领域常用的药物载体。
本发明所述的左旋可利霉素药物组合物以适合药用的制剂形式存在，该制剂形式为液体制剂、固体制剂、半固体制剂或气体制剂。
所述的液体制剂为注射剂、输液剂、溶液剂、合剂、糖浆剂、酊剂、溶胶剂、芳香水剂、甘油剂、胶体溶液剂、胶浆剂、混悬剂或乳剂；
所述的固体制剂为粉针、冻干粉针、片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、丹剂或膜剂；
所述的半固体制剂为软膏剂、硬膏剂、栓剂、浸膏剂或凝胶剂；
所述的气体制剂为气雾剂或喷雾剂。
本发明所述的左旋可利霉素药物组合物，其中，所述的左旋可利霉素的用量为每单位剂型为10～1500mg，优选100～1000mg，更优选200～500mg。
为实现本发明的第三目的，本发明采用如下技术方案：
一种左旋可利霉素的制备方法，该方法包括培养发酵和提取，其中，所述的培养发酵为：将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSJ-195，在斜面培养基上培养后，将其接种于种子培养基，培养后，再将其接种于发酵培养基，通过pH调节剂控制发酵过程，在pH值6.0～9.0，优选6.0～8.0，更优选6.0～7.5的条件下进行发酵，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝k1x1+6.0，其中0.0227≤k1≤0.1364，0＜x1≤22；第二阶段满足方程式y2＝k2x2+b2，其中-0.0735≤k2＜0，6.5＜b2≤10.62，22≤x2≤56；第三阶段满足方程式y3＝k3x3+b3，其中0＜k3≤0.0078，6.06≤b3＜6.5，56≤x3≤120。
本发明中，通过对培养发酵条件的调整和优化，尤其是通过pH调节剂严格控制发酵过程中的pH值，使发酵过程中pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，并且每个阶段各满足一定的方程式，从而得到了具有光学活性的左旋可利霉素。
本发明中，发酵过程是关键，整个发酵过程中需要不定时的检测pH值，而pH值是通过添加pH调节剂进行控制的，其中，所述的pH调节剂为葡萄糖、枸橼酸、醋酸、盐酸、氨水、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或其组合，优选葡萄糖、枸橼酸、醋酸、氨水或其组合；更优选葡萄糖、氨水或其组合。
本发明所述的制备方法，其中，所述的提取为：将培养发酵后的发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.5-9.0，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.0-2.5水提取，得水相提取液，调pH至4.5-5.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.5-9.0，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
本发明所述的制备方法，其中，所述斜面培养基中含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO30.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％。
本发明所述的制备方法，其中，所述种子培养基中含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl0.4％、CaCO3 0.5％、蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％。
本发明所述的制备方法，其中，所述发酵培养基中含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO4 0.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％。
本发明所述的制备方法，其中，所述在斜面培养基上的培养为在温度28～38℃的条件下培养8～15天。
本发明所述的制备方法，其中，所述在种子培养基上的培养为在温度25～30℃的条件下培养40～80小时。
本发明所述的制备方法，其中，所述在发酵培养基上的发酵为在26～30℃的条件下培养72～120小时。
当左旋可利霉素含有异戊酰螺旋霉素I、II或III的晶体时，所述的制备方法还包括如下步骤：
a)对左旋可利霉素进行分离纯化得到左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III；
b)将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III进行重结晶得到左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物；
c)将步骤a)分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋可利霉素；
d)将步骤b)得到的左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物与步骤c)得到的左旋可利霉素混合得到异戊酰螺旋霉素I、II或III为左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物的左旋可利霉素。
本发明所述的制备方法，其中，步骤a)中所述的分离纯化为：
采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的左旋可利霉素进行纯化，采用ODS制备色谱柱，用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，通过紫外检测，记录分离的紫外谱图，对左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III组分目标峰进行收集：
色谱柱：ODS制备色谱柱；
流动相：乙腈(A)，100mM醋酸氨水溶液(B)；
梯度条件：采用线性梯度0～60分钟，A为25％～65％；61～90分钟，A为65％～90％；
流速：260mL/min；
进样量：10mL；
进样浓度：0.5g/mL；
检测波长：231nm；
收集方式：紫外触发收集；
按照左旋异戊酰螺旋霉素I的保留时间RT 44.759min，收集左旋异戊酰螺旋霉素I样品；或者按照左旋异戊酰螺旋霉素II的保留时间RT 43.34min，收集左旋异戊酰螺旋霉素II样品；或者按照左旋异戊酰螺旋霉素III的保留时间RT 48.009min，收集左旋异戊酰螺旋霉素III样品；然后采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III的白色粉末状固体。
本发明所述的制备方法，其中，
当异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物时，该晶体采用如下重结晶方法得到：先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素I的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素I晶体，其中所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1；
其中，所述左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的重结晶方法的第一优选技术方案为，所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2～9倍，优选2.5～7.5倍；加入纯水的速度为4～10ml/分钟，优选6～8ml/分钟。
所述左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的重结晶方法的第二优选技术方案为，所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1。
所述左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的重结晶方法的第三优选技术方案为，所加入纯水的搅拌速度为30～60转/分钟，优选45～60转/分钟；纯水加完后，搅拌速度为10～30转/分钟，优选10～20转/分钟。
所述左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的重结晶方法的第四优选技术方案为，纯水加完后降温的速度为每小时1～3℃，优选每小时1～1.5℃。
当异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物时，该晶体采用如下重结晶方法得到：先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素II的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素II晶体，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1；
其中，所述左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的重结晶方法的第一优选技术方案为，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2～9倍，优选2.5～7.5倍；加入纯水的速度为4～10ml/分钟，优选6～8ml/分钟。
所述左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的重结晶方法的第二优选技术方案为，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1。
所述左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的重结晶方法的第三优选技术方案为，所加入纯水的搅拌速度为30～60转/分钟，优选45～60转/分钟；纯水加完后，搅拌速度为10～30转/分钟，优选10～20转/分钟。
所述左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的重结晶方法的第四优选技术方案为，纯水加完后降温的速度为每小时1～3℃，优选每小时1～1.5℃。
当异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物时，该晶体采用如下重结晶方法得到：先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素III的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1。
其中，所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的重结晶方法的第一优选技术方案为，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2～9倍，优选2.5～7.5倍；加入纯水的速度为4～10ml/分钟，优选6～8ml/分钟。
所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的重结晶方法的第二优选技术方案为，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1。
所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的重结晶方法的第三优选技术方案为，所加入纯水的搅拌速度为30～60转/分钟，优选45～60转/分钟；纯水加完后，搅拌速度为10～30转/分钟，优选10～20转/分钟。
所述左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的重结晶方法的第四优选技术方案为，纯水加完后降温的速度为每小时1～3℃，优选每小时1～1.5℃。
本发明还提供所述的左旋可利霉素或左旋可利霉素药物组合物在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
本发明中，所述的感染性疾病为革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、解脲支原体、沙眼衣原体、化脓性链球菌、卡他球菌、淋球菌、流感杆菌、军团菌或厌氧菌感染引起的疾病。
本发明还进一步提供所述的左旋可利霉素或所述的左旋可利霉素药物组合物在制备抗菌药物中的应用，所述的菌为肺炎链球菌、甲类链球菌、化脓性链球菌、肠球菌、金葡菌、表葡菌、卡他球菌、淋球菌、流感杆菌、大肠杆菌、产毒大肠杆菌、致病性大肠杆菌、侵龚性大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、伤寒杆菌、不动杆菌、枸橼酸杆菌枸橼酸杆菌、粘质沙雷氏菌、宋内氏痢疾杆菌、福氏痢疾杆菌、白色念球菌；军团菌如嗜肺军团菌、高曼军团菌、博茨曼军团菌、杜莫夫军团菌、佐丹军团菌、米克戴德军团菌；厌氧菌如脆弱类杆菌、多形类菌、普通类杆菌、吉氏类杆菌、吉氏类杆菌、栖瘤胃类杆菌、不解糖普氏杆菌、口腔普氏杆菌、具核酸杆菌、拉式梭杆菌、双岐杆菌、乳杆菌、消化链球菌、疮疱丙酸杆菌、产气荚膜梭菌、酵母样真菌。
本领域技术人员通常知道用于治疗所需的活性成分的量将随各种因素而变化，包括所治疗疾病的性质及患者的年龄和病情，最终由主治医生来判断。本发明所说的左旋可利霉素药物组合物以单位剂型给药时，所述的左旋可利霉素的用量为每单位剂型为10～1500mg，优选100～1000mg，更优选200～500mg。将每日所需要的剂量以单一剂量或分剂量的形式给药。
体内外药效学试验证明，本发明提供的左旋可利霉素或左旋可利霉素药物组合物中其活性成分具有光学活性，具有较好的抗感染效果，不仅对革兰氏阳性菌，尤其是耐红霉素、耐β-内酰胺酶的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌有较好的抗菌活性，而且对部分阴性菌如卡他球菌、淋球菌、流感杆菌和部分军团菌及厌氧菌也有效，特别对肺炎支原体、肺炎衣原体的活性显著。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明的左旋可利霉素具有旋光性，而根据现代药理学研究，由于药物对映体的立体选择性的不同，使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用发生很大差异。而本发明通过体内药效和体外药效证明本发明的左旋可利霉素具有优良的抗感染效果，同时具有很强的药理活性，从而为感染性疾病的治疗提供了一种新的药物，也为研发可利霉素的手性药物制剂奠定了基础；而通过体内药效发现，异戊酰螺旋霉素I、II或III为左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物的左旋可利霉素对小鼠感染12株细菌的疗效显示出更加优良的保护作用；
2)本发明所提供的左旋可利霉素的制备方法，通过对培养发酵条件的调整和优化，尤其是通过pH调节剂严格控制发酵过程中的pH值，使发酵过程中pH值随时间的变化呈三个连续的阶段，并且每个阶段各满足一定的方程式，从而得到了具有光学活性的左旋可利霉素；
3)本发明所提供的左旋可利霉素的制备方法生产工艺简化，适用于大工业规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中发酵过程的pH值随时间的变化曲线图；
图2为本发明实施例2中发酵过程的pH值随时间的变化曲线图；
图3为本发明实施例3中发酵过程的pH值随时间的变化曲线图；
图4为可利霉素标准品组分液相色谱图，其中，
1——螺旋霉素III
2——单乙酰螺旋霉素II
3——单乙酰螺旋霉素III
4——丙酰螺旋霉素II
5——丙酰螺旋霉素III
6——(异)丁酰螺旋霉素II
7——异戊酰螺旋霉素I
8——(异)丁酰螺旋霉素III
9——异戊酰螺旋霉素II
10——异戊酰螺旋霉素III
图5为本发明的实施例4所提供的左旋可利霉素的液相色谱图。
图6为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的X射线粉末衍射图谱；
图7为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的X射线粉末衍射图谱；
图8为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的X射线粉末衍射图谱。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明而不是限制本发明。
【实施例1】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSJ-195，在斜面培养基上培养后，将其接种于种子培养基，培养后，再将其接种于发酵培养基，通过葡萄糖和氨水控制发酵过程，在pH值6.0～9.0的条件下进行发酵，发酵时间为120h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.1364x1+6.0，其中0＜x1≤22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0735x2+10.64，其中22≤x2≤56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56≤x3≤120，曲线变化如图1所示，获得发酵液。
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至9.0，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.5水提取，得水相提取液，调pH至4.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.5，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例2】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSJ-195，在斜面培养基上培养后，将其接种于种子培养基，培养后，再将其接种于发酵培养基，通过葡萄糖和氢氧化钠控制发酵过程，在pH值6.0～8.0的条件下进行发酵，发酵时间为110h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.0909x1+6.4，其中0＜x1＜22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0441x2+7.8，其中22＜x2＜56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56≤x3≤110，曲线变化如图2所示，获得发酵液。
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.9，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.2水提取，得水相提取液，调pH至4.2，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.6，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例3】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSJ-195，在斜面培养基上培养后，将其接种于种子培养基，培养后，再将其接种于发酵培养基，通过葡萄糖和枸橼酸控制发酵过程，在pH值6.0～7.5的条件下进行发酵，发酵时间为115h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.0682x1+6.0，其中0＜x1＜22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0294x2+8.147，其中22＜x2＜56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56＜x3＜115，变化曲线如图3，获得发酵液。
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.6，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.3水提取，得水相提取液，调pH至5.2，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.7，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例4】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO30.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，在温度28℃培养15天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO3 0.5％、蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％的种子培养基，在温度25℃培养80小时，以0.1％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO40.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，通过葡萄糖和氨水控制发酵过程，在pH值6.0～9.0的条件下进行发酵，发酵时间为120h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.1364x1+6.0，其中0＜x1≤22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0735x2+10.64，其中22≤x2≤56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56≤x3≤120，获得发酵液；
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.5，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.0水提取，得水相提取液，调pH至4.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.5，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例5】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO30.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，在温度38℃培养8天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO3 0.5％、蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％的种子培养基，在温度30℃培养40小时，以20％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO40.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，通过葡萄糖和氨水控制发酵过程，在pH值6.0～7.5、温度30℃的条件下进行发酵，发酵时间为115h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.0682x1+6.0，其中0＜x1＜22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0294x2+8.147，其中22＜x2＜56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56＜x3＜115，变化曲线如图3，获得发酵液。
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至9.0，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.5水提取，得水相提取液，调pH至4.5-5.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH9.0，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例6】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO30.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，在温度30℃培养12天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO3 0.5％、蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％的种子培养基，在温度28℃培养60小时，以10％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO40.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，通过葡萄糖和氨水控制发酵过程，在pH值6.0～7.5、温度28℃的条件下进行发酵，发酵时间为90h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.0682x1+6.0，其中0＜x1＜22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0294x2+8.147，其中22＜x2＜56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56＜x3＜90，变化曲线如图3，获得发酵液。
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.7，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.2水提取，得水相提取液，调pH至5.0，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.7，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例7】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO30.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，在温度35℃培养10天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO3 0.5％、蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％的种子培养基，在温度26℃培养55小时，以15％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO40.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，通过葡萄糖和氨水控制发酵过程，在pH值6.0～7.5、温度27℃的条件下进行发酵，发酵时间为115h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.0682x1+6.0，其中0＜x1＜22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0294x2+8.147，其中22＜x2＜56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56＜x3＜110，变化曲线如图3，获得发酵液。
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.6，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.3水提取，得水相提取液，调pH至4.8，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.8，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例8】左旋可利霉素的制备
1)培养发酵
将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆菌株WSJ-195，在含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO30.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％的斜面培养基上，在温度36℃培养13天，接种于含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO3 0.5％、蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％的种子培养基，在温度27℃培养75小时，以0.5％接种量种入含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO40.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％的发酵培养基，通过葡萄糖和氨水控制发酵过程，在pH值6.0～8.0、温度29℃的条件下进行发酵，发酵时间为98h，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝0.0909x1+6.4，其中0＜x1＜22；第二阶段满足方程式y2＝-0.0441x2+7.8，其中22＜x2＜56；第三阶段满足方程式y3＝0.0078x3+6.06，其中56≤x3≤110，曲线变化如图2所示，获得发酵液。
2)提取
将发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.9，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液用无盐水及1％NaH2PO4洗涤，再用pH2.4水提取，得水相提取液，调pH至4.6，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.6，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
【实施例9】左旋可利霉素的HPLC定量测定方法
照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)测定。
采用Venusil XBP C18(L)(200mm×4.6mm，5um)色谱柱(AGELATECHNOLOGIES)；流动相A为乙睛，流动相B为0.01mol·L-1醋酸铵溶液(用氨水调节pH值至7.0)，按下表梯度洗脱；波长232nm；流速为1.0mL·min-1，柱温25℃；进样量20μl。
Figure BDA0000063571980000132
色谱条件和系统适用性试验，参照可利霉素标准品组分液相色谱图(图4)，调节色谱条件，必要时可改变流动相的梯度洗脱条件，使进样的左旋可利霉素组分与可利霉素标准品组分图谱(图4)一致。
标准品溶液：精密称取标准品适量，以0.01mol/L醋酸铵溶液(用氨水调节pH至7.0)-乙腈(65∶35)混合液稀释至0.4mg/ml-0.6mg/ml作为标准品溶液，摇匀，备用。
供试品溶液：精称本品50mg，以0.01mol/L醋酸铵溶液(用氨水调节pH至7.0)-乙腈(65∶35)混合液稀释至50ml作为供试品溶液，摇匀，备用。
按外标法以异戊酰螺旋霉素III的峰面积计算。异戊酰螺旋霉素III应不低于30％；异戊酰螺旋霉素(I+II+III)应不低于60％；酰化螺旋霉素9个组分总含量应不少于80％，螺旋霉素III的量应不大于1.0％，其他未知组分的总和应不大于5.0％。计算公式如下：
异戊酰螺旋霉素III％＝A异戊酰III×WS×P/(AS×WT)×100％
异戊酰螺旋霉素(I+II+III)％＝(A异戊酰I+A异戊酰II+A异戊酰III)×WS×P/(AS×WT)×100％
酰化螺旋霉素总含量％＝(A乙酰II+A乙酰III+A丙酰II+A丙酰III+A异丁酰II+A异戊酰I+A异丁酰III+A异戊酰II+A异戊 酰III)×WS×P/(AS×WT)×100％
螺旋霉素III％＝A螺旋III×WS×P/(AS×WT)×100％
未知组分％＝AW×WS×P/(AS×WT)×100％
式中：WS-标准品的重量，g；
AS-标准品中异戊酰螺旋霉素III的峰面积；
WT-供试品的重量，g；
AW-供试品中未知组分的峰面积之和；
P-标准品中异戊酰螺旋霉素III的纯度。
【实施例10】左旋可利霉素成品组分的HPLC检测
按实施例4提供的左旋可利霉素提取流程及实施例9提供的HPLC定量检测方法，对左旋可利霉素发酵8批次发酵液进行提取，所获产品各组分的HPLC检测情况如表1所示，液相色谱图如图5所示。
表1、8批次左旋可利霉素成品组分的HPLC检测情况
对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素也进行了上述检测，其获得的液相色谱图如5所示。
【实施例11】左旋可利霉素比旋度的测定
取本发明实施例所制备的左旋可利霉素，精密称定，加氯仿溶解并稀释成每1ml中约含20mg的溶液，采用钠光谱的D线(589.3nm)测定旋光度，测定长度为1dm，测定温度为25℃，使用读数至0.0001°并经过检定的旋光计。
表2、比旋度考察结果
Figure BDA0000063571980000142
【实施例12】左旋可利霉素素片(按10000片计算)
处方：
Figure BDA0000063571980000143
Figure BDA0000063571980000151
制备工艺：称取适量淀粉，稀释至15％浓度，加热至糊状，制成粘合剂；主料可利霉素、辅料淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁分别过100目筛，按处方量，称取所需主料和辅料；可利霉素、淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后，用15％淀粉浓度的淀粉糊制成软材，14目筛制粒，50-60℃干燥，水份控制在3-5％，14目筛整粒，加羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁混合，测定颗粒含量；根据颗粒含量，计算片重，压片(Φ9mm浅凹冲头)，检测片重差异；经检验合格后进行包装。
【实施例13】左旋可利霉素胶囊剂(按10000粒计算)
处方：
Figure BDA0000063571980000152
制备工艺：将主料可利霉素、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后，装入混合器充分混合后1.5-2小时；取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致(每粒胶囊所装重量约为0.105g)，将经检验合格的药用3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机操作要求，分别填入装料器进行填充，将填充好的胶囊进行差异检验(±10％以内，＜0.3g)，溶出度符合要求，将检验后符合要求的胶囊，放入打光机内加入液体石蜡进行15-20分钟的打光，然后取出进行成品包装盒检验。
【实施例14】左旋可利霉素糖衣片(按10000片计算)
处方：同实施例12。
制备工艺：按照实施例12的方法操作，将检验合格后的片芯放入糖衣锅中，将配好的糖浆(浓度为65-70％)慢慢放入锅中，然后将温度升至40℃左右，加入适量滑石粉，鼓风干燥25-30分钟反复几次粉衣层包平后，再进行糖衣层15-20分钟进行糖衣层包衣，待糖衣层包平后进行所需色调的包衣层包衣，将色浆调好后放入糖浆中搅匀倒入锅内，每次约15-20分钟，搅拌均匀。
【实施例15】左旋可利霉素干糖浆(按10000袋计算)
处方：
制备工艺：可利霉素原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒85％通过300目，15％通过180目，然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合1-1.5小时，测其含量，计算装量(理论装量为每袋500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔纸，按分装机操作要求分装，装量差异在±5％以内，装好后进行检验合格后外包装。
【实施例16】左旋可利霉素肠溶片(按10000片计算)
处方：参照实施例12。
制备工艺：片芯制备按实施例12操作，将符合要求的片芯放入糖衣锅中，用60-70％浓度的糖浆和滑石粉进行底衣层包衣三层，然后进行隔离层包衣，加入10％玉米朊酒精溶液，滚转法10-15分钟吹干，再用苯二甲酸二乙酯、丙酮、邻苯二甲酸醋酸纤维、酒精溶液，即肠溶液滴入锅内，滚转法10-15分钟吹干2-3次。检验合格后，按实施例7进行糖衣包衣。
【实施例17】左旋可利霉素胃溶片(按10000片计算)
处方：参照实施例12。
制备工艺：片芯制备按实施例12操作，将符合要求的片芯放入高效包衣机中，然后将符合标准的包衣粉(包括脂溶性和水溶性)按要求配制成包衣液，再将包衣液放入胶体磨粉碎、过滤待用。将装好片芯的高效包衣锅预热，转速控制在5-10转/分，温度控制在45-60℃，用气雾喷头(＞300目)将包衣孔液喷入锅内，然后干燥25-35分钟，反复进行8-12次，直至包匀，晾干检验合格后包装。
【实施例18】左旋可利霉素颗粒剂(按10000袋计算)
处方：
Figure BDA0000063571980000161
制备工艺：可利霉素原粉、糖粉、糊精过120目筛，按处方量称取可利霉素、糖粉、糊精混合均匀，将混合均匀的上述物料用5％PVP-K30胶浆制成软材，摇摆式颗粒剂制粒70℃干燥、整粒，送检合格后分装。
【实施例19】左旋可利霉素冻干粉针剂
称取实施例6的左旋可利霉素原粉500mg与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，可得到淡黄色澄明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。
【实施例20】左旋可利霉素冻干粉针剂
称取实施例4的左旋可利霉素原粉500mg与等摩尔的枸橼酸混合均匀后溶解于5ml水中，可得到淡黄色澄明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。
【实施例21】左旋可利霉素冻干粉针剂
称取实施例5的左旋可利霉素原粉500mg与等摩尔的马来酸混合均匀后溶解于5ml水中，可得到淡黄色澄明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。
【实施例22】异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素的制备
将实施例1所得到的左旋可利霉素进行分离纯化。
左旋异戊酰螺旋霉素I纯化：采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的样品进行纯化，采用ODS制备色谱柱，用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，通过紫外检测，记录分离的紫外谱图，对左旋异戊酰螺旋霉素I组分目标峰进行收集：
色谱柱：ODS制备色谱柱；
流动相：乙腈(A)，100mM醋酸氨水溶液(B)；
梯度条件：采用线性梯度0～60分钟，A为25％～65％；61～90分钟，A为65％～90％；
流速：260mL/min；
进样量：10mL；
进样浓度：0.5g/mL；
检测波长：231nm；
收集方式：紫外触发收集；
按照左旋异戊酰螺旋霉素I的保留时间RT 44.759min，收集左旋异戊酰螺旋霉素I样品，采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋异戊酰螺旋霉素I白色粉末状固体。
将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素I白色粉末状固体进一步重结晶制备成晶体，其重结晶的方法如下：
(1)先将实施例1中得到的左旋异戊酰螺旋霉素I化合物固体溶解于乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶10∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2.5倍；加入纯水的速度为4ml/分钟；加入纯水时的搅拌速度为30转/分钟；
(3)纯水加完后降温至5℃，降温的速度为每小时1℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物。
将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为7.6°、8.0°、10.0°、11.4°、16.4°、17.0°、17.5°、17.9°、19.5°、22.7°、23.7°和24.4°显示有特征峰，其X-射线粉末衍射图谱如图6所示。
将上述分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素I组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋可利霉素；再将所得到的左旋可利霉素与上述得到的左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物混合得到异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素。
【实施例23】异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例22，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素I化合物固体溶解于乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶10∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮体积之和的9倍；加入纯水的速度为10ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；
(3)纯水加完后降温至15℃，降温的速度为每小时3℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图6相似。
【实施例24】异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例22，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素I化合物固体溶解于乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶5∶0.8；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为6ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为40转/分钟；
(3)纯水加完后降温至10℃，降温的速度为每小时2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图6相似。
【实施例25】异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例22，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素I化合物固体溶解于乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶2∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为8ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为45转/分钟；
(3)纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时2.5℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为20转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图6相似。
【实施例26】异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例22，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素I化合物固体溶解于乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶5∶0.8；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮体积之和的5倍；加入纯水的速度为7ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；
(3)纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时1.2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图6相似。
【实施例27】异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素的制备
将实施例2所得到的左旋可利霉素进行纯化，具体操作步骤同实施例22，所不同的是按照左旋异戊酰螺旋霉素II的保留时间RT 43.34，收集左旋异戊酰螺旋霉素II样品。
将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素II白色粉末状固体进一步制备成晶体，其制备方法如下：
(1)先将实施例2中得到的左旋异戊酰螺旋霉素II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶10∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2.5倍；加入纯水的速度为4ml/分钟；加入纯水时的搅拌速度为30转/分钟；
(3)纯水加完后降温至5℃，降温的速度为每小时1℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物。
将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为10.0°、11.6°、16.4°、17.3°、19.1°、21.2°、22.1°、22.7°、26.4°、26.9°、27.5°和31.5显示有特征峰，其X-射线粉末衍射图谱如图7所示。
将上述分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素II组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋可利霉素；再将所得到的左旋可利霉素与上述得到的左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物混合得到异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素。
【实施例28】异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例27，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶10∶0.8；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的9倍；加入纯水的速度为10ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；
(3)纯水加完后降温至15℃，降温的速度为每小时3℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图7相似。
【实施例29】异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例27，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶5∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为6ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为40转/分钟；
(3)纯水加完后降温至10℃，降温的速度为每小时2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图7相似。
【实施例30】异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例27，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶3∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为8ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为45转/分钟；
(3)纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时2.5℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为20转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图7相似。
【实施例31】异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例27，所不同的是重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶6∶0.8；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的5倍；加入纯水的速度为7ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；
(3)纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时1.2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图7相似。
【实施例32】异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的左旋可利霉素的制备
将实施例3所得到的左旋可利霉素进行纯化，具体操作步骤同实施例22，按照左旋异戊酰螺旋霉素III的保留时间RT 48.009，收集左旋异戊酰螺旋霉素III样品。
将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素III白色粉末状固体进一步制备成晶体，其制备方法如下：
(1)先将实施例3中得到的左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶10∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的2.5倍；加入纯水的速度为4ml/分钟；加入纯水时的搅拌速度为30转/分钟；
(3)纯水加完后降温至5℃，降温的速度为每小时1℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。
将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在8.0°、10.0°、11.2°、11.7°、16.4°、19.1°、19.6°、20.0°、21.4°、22.9°、23.6°和29.4°显示有特征峰，其X-射线粉末衍射图谱如图8所示。
将上述分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素III组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋可利霉素；再将所得到的左旋可利霉素与上述得到的左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物混合得到异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的左旋可利霉素。
【实施例33】异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例32，所不同的重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶10∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的9倍；加入纯水的速度为10ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；
(3)纯水加完后降温至15℃，降温的速度为每小时3℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为10转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图8相似。
【实施例34】异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例32，所不同的重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶5∶0.8；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为6ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为40转/分钟；
(3)纯水加完后降温至10℃，降温的速度为每小时2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图8相似。
【实施例35】异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例32，所不同的重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶2∶1；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的7.5倍；加入纯水的速度为8ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为45转/分钟；
(3)纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时2.5℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为20转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图8相似。
【实施例36】异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的左旋可利霉素的制备
其它操作步骤同实施例32，所不同的重结晶的方法如下：
(1)先将左旋异戊酰螺旋霉素III化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶5∶0.8；
(2)然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之和的5倍；加入纯水的速度为7ml/分钟；所加入纯水的搅拌速度为60转/分钟；
(3)纯水加完后降温至12℃，降温的速度为每小时1.2℃，降温的同时继续搅拌，搅拌速度为15转/分钟；得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物。
该左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射图谱与图8相似。
【实施例37】含有左旋异戊酰螺旋霉素I晶体的左旋可利霉素素片
处方及制备工艺同实施例12，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例22得到的异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素原粉。
【实施例38】含有左旋异戊酰螺旋霉素II晶体的左旋可利霉素素片
处方及制备工艺同实施例12，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例27得到的异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素原粉。
【实施例39】含有左旋异戊酰螺旋霉素III晶体的左旋可利霉素素片
处方及制备工艺同实施例12，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例32得到的异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物的左旋可利霉素原粉。
【实施例40】含有左旋异戊酰螺旋霉素I晶体的左旋可利霉素胶囊剂
处方及制备工艺同实施例13，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例23得到的异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物的左旋可利霉素原粉。
【实施例41】含有左旋异戊酰螺旋霉素II晶体的左旋可利霉素胶囊剂
处方及制备工艺同实施例13，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例28得到的异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物的左旋可利霉素原粉。
【实施例42】左旋异戊酰螺旋霉素III为晶体的左旋可利霉素胶囊剂
处方及制备工艺同实施例13，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例33得到的异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III为晶体化合物的左旋可利霉素原粉。
异戊酰螺旋霉素I、II或III为左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物的左旋可利霉素的其它制剂所用的辅料和制备方法同前。
【试验例1】体内药效
试验方法：感染菌液制备：将-80℃冰箱保存的试验菌液取出放在室温1h左右，然后将肺炎链球菌、化脓性链球菌、肠球菌吸取0.1ml菌液分别接种于2ml MH汤中(加10％灭活马血清)，金葡菌也按上述方法接种0.1ml菌液于2ml MH汤中，置37℃孵箱中培养18h后为原菌液，用5％胃膜素稀释原菌液，使动物感染100％致死菌数作为感染菌液。
左旋可利霉素的临床用药途径拟为口服，因此左旋可利霉素试验选择灌胃给药。将小鼠腹腔注射0.5ml致死菌量后动物出现活动明显减少、静卧、毛松等症状。感染后分别在0.5-6h每一只小鼠灌胃一次0.2ml，无任何不良反应。观察七日动物死亡数，用Bliss程序，分别计算各药对小鼠感染后的半数保护剂量(ED50)，与各药物比较保护效果。
体内试验结果见表3和表4：
表3、4种抗生素对小鼠腹腔感染6株链球菌的疗效比较
Figure BDA0000063571980000231
Figure BDA0000063571980000241
表4、4种抗生素对小鼠腹腔感染肠球菌和金葡菌的疗效比较
Figure BDA0000063571980000242
Figure BDA0000063571980000251
体内试验结果表明：左旋可利霉素对小鼠感染12株细菌的疗效见表3和表4，显示都有良好的保护效果；而异戊酰螺旋霉素I、II或III为左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物的左旋可利霉素则显示出更加优良的保护效果。
对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或左旋可利霉素制剂也进行了相同的试验，其获得的结果相似。
【试验例2】体外药效
临床分离菌的测定：
试验方法：采用平皿二倍稀释法：将熔化琼脂培养基定量倒入含系列药物浓度的平皿内与药液混匀(链球菌和肠球菌加入5％去纤维羊血做成血培基、流感杆菌加入7％、淋球菌用淋球菌培养基加入7％去纤维羊血做成巧克力培基)，待凝固后，再将新鲜培养菌液稀释成106CFU/mL，用多点接种仪接种于含本发明实施例4的左旋可利霉素和对照用阿奇霉素、乙酰螺旋霉素和红霉素的平皿琼脂上，经37℃培养18h；淋球菌置5％CO2培养箱中孵育24h；军团菌置5％CO2培养箱中培养48h；厌氧菌置厌氧箱内，37℃厌氧培养48h。观察抗菌药抑制细菌生长的最低浓度即为最低抑菌浓度(MIC)，并计算药物MIC50和MIC90与对照药比较。
附注：
MIC50抑制50％细菌生长最低的抑菌浓度；
MIC90抑制90％细菌生长最低的抑菌浓度。
试验结果见表：
表5、可利霉素对临床分离菌敏感分布
Figure BDA0000063571980000261
对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或左旋可利霉素制剂也进行了相同的试验，其获得的结果相似。
【试验例3】体外抗沙眼衣原体和肺炎衣原体的测定
试验方法：
1.将HEp-2和McCoy细胞系分别种植在96孔细胞培养板(Costar公司)内，37℃，5％CO2培养48小时成为单层细胞。
2.将待接种菌种稀释为10000～20000ifu(包涵体形成单位)/ml，0.1ml/孔接种。沙眼衣原体血清型B/TW-5/OT、D/UW-3/Cx接种McCoy细胞培养板，肺炎衣原体CWL-029接种HEp-2细胞培养板。首先吸去96孔培养板内的细胞培养液，然后按0.1ml/孔进行接种。其中A11～D11的4个孔，C12和D12的2个孔不接种菌种。
3.菌种接种完毕离心96孔细胞培养板，使用Beckman-Coulter公司的J-6MC离心机，离心力×1500g，离心温度35℃，离心时间60分钟。
4.离心完毕后，吸取接种的沙眼衣原体或肺炎衣原体，分别加入系列稀释的4种抗生素药物(即本发明实施例4所制备的左旋可利霉素、对照用乙酰螺旋霉素、红霉素和阿奇霉素)，0.1ml/孔。
5.37℃，5％CO2培养，沙眼衣原体药敏试验板培养48小时，肺炎衣原体药敏试验板培养72小时。培养完毕，吸取抗生素药物溶液，PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤2次，100％甲醇室温固定15分钟。
6.间接免疫荧光染色鉴定：沙眼及肺炎衣原体药敏试验板分别加入纯化的抗沙眼衣原体单克隆抗体(N54克隆)和肺炎衣原体单克隆抗体(P33克隆)，50μl/孔，37℃湿盒内温育30分钟，然后洗板机洗板4次，再加入兔抗鼠荧光抗体(Sigma公司)，50μl/孔，同样方法及条件温育及洗板。加入封片甘油，100μl/孔，在Nikon倒置荧光显微镜(Diaphot-200)下观察结果。
7.MIC的定义：96孔试验板中沙眼衣原体或肺炎衣原体包涵体生长完全被抑制孔(全孔未发现荧光染色的包涵体)的最小抗生素稀释浓度。
试验结果如下：
表6、四种大环内脂类抗生素对沙眼及肺炎衣原体体外作用的最小抑菌浓度(MIC)
1、对于沙眼血清型B/TW-5/OT，可利霉素MIC为0.25μg/ml、红霉素、阿奇霉素(0.5μg/ml)次之，乙酰螺旋霉素(MIC为4μg/ml)较差。
2、对于沙眼血清型D/UW-3/Cx，可利霉素、阿奇霉素体外作用相同，MIC为0.25μg/ml，属敏感；、红霉素(0.5μg/ml)次之，乙酰螺旋霉素(MIC为2μg/ml)较差。
3、对于肺炎衣原体CWL-029，可利霉素和红霉素体外作用最敏感，MIC≤0.016μg/ml，阿奇霉素(MIC为0.032μg/ml)较敏感；乙酰螺旋霉素(MIC为0.5μg/ml)较差。
4、总体来看本发明所制备的左旋可利霉素对衣原体的效果优于其他试验药物。
对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或左旋可利霉素制剂也进行了相同的试验，其获得的结果相似。
【试验例4】体外抗解脲支原体和肺炎衣原体
1、试验方法：在无菌12孔细胞培养板各孔加入U-PPLO 0.8ml(菌液对照孔加入0.9ml，培养基对照孔加入1.0ml)。
2、在各实验孔中加入104CCU/ml的Uu菌液0.1ml，孔中的最终菌量为103CCU/ml(培养基对照孔不加菌液)。
3、分三组(100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml抗生素原液)按照二倍递降浓度梯度用无菌Tip向各实验孔加入实验用抗生素(本发明实施例6的左旋可利霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素和阿奇霉素)：100μl，50μl，25μl，12.5μl。(菌液对照孔、培养基对照孔不加抗生素，同时设抗生素对照孔)
4、上述各孔混匀，培养版用胶带封口，放37℃温箱培养。
5、于实验后17-24h观察记录Uu生长情况。当Uu菌液对照孔呈现阳性生长时，此时能抑制Uu生长的最低抗生素浓度为该药样的最低MIC，实验结束时的MIC为最终MIC(24h)。
对抗解脲支原体菌株进行MIC测定，进行4次测定，结果显示如下：
可利霉素0.025-0.125μg/ml，
乙酰螺旋霉素0.5μg/ml，
红霉素5μg/ml，
阿奇霉素0.025-0.125μg/ml。
上述结果表明，可利霉素有良好的抗Uu作用，与阿奇霉素作用相似，优于乙酰螺旋霉素，红霉素在本组试验中抗Uu作用效果最差。
对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或可利霉素制剂也进行了相同的试验，其获得的结果相似。

Claims (21)

1.一种左旋可利霉素，其特征在于，所述的左旋可利霉素是以异戊酰螺旋霉素III、II、I三个组分为主的混合物，含有一定量的异丁酰螺旋霉素III、II，丁酰螺旋霉素III、II，丙酰螺旋霉素III、II和乙酰螺旋霉素III、II，其中异戊酰螺旋霉素III的含量不低于30wt％，异戊酰螺旋霉素III、II、I的总含量不低于60wt％，酰化螺旋霉素的含量为80～98wt％，优选85～98wt％，更优选90～98wt％，最优选95～98wt％；所述的左旋可利霉素在温度25℃、0.02g/ml氯仿溶液中的比旋度为[α]D＝-52°～-57°，优选-54°～-56°，更优选-55°。
2.根据权利要求1所述的左旋可利霉素，其特征在于，所述的左旋可利霉素还含有螺旋霉素III和其它组分，其中螺旋霉素III的含量不大于1.0％，其它组分的含量总和为2.0～19wt％，优选2.0～14.0wt％，更优选2.0～9.0wt％，最优选2.0～4.0wt％。
3.根据权利要求2所述的左旋可利霉素，其特征在于，所述的左旋可利霉素的熔点为112～122℃，优选114～120℃，更优选116～118℃。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的左旋可利霉素，其特征在于，所述的异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物，或者所述的异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物，或者所述的异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物；
当异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物时，该晶体使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为8.0°、10.0°、11.2°、11.7°、16.4°、19.1°、19.6°、20.0°、21.4°、22.9°、23.6°和29.4°显示有特征峰；
当异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物时，该晶体使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为10.0°、11.6°、16.4°、17.3°、19.1°、21.2°、22.1°、22.7°、26.4°、26.9°、27.5°和31.5显示有特征峰；
当异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物时，该晶体使用Cu-Kα射线测量得到的X-射线粉末衍射在2θ为7.6°、8.0°、10.0°、11.4°、16.4°、17.0°、17.5°、17.9°、19.5°、22.7°、23.7°和24.4°显示有特征峰。
5.一种左旋可利霉素药物组合物，其特征在于，所述的左旋可利霉素药物组合物含有权利要求1-4任意一项所述的左旋可利霉素和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的左旋可利霉素药物组合物，其特征在于，所述左旋可利霉素的含量为药物组合物的10～90wt％，优选25～75wt％，更优选40～60wt％。
7.根据权利要求6所述的左旋可利霉素药物组合物，其特征在于，所述的左旋可利霉素药物组合物以适合药用的制剂形式存在，该制剂形式为液体制剂、固体制剂、半固体制剂或气体制剂，所述的液体制剂为注射剂、输液剂、溶液剂、合剂、糖浆剂、酊剂、溶胶剂、芳香水剂、甘油剂、胶体溶液剂、胶浆剂、混悬剂或乳剂；所述的固体制剂为粉针、冻干粉针、片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、丹剂或膜剂；所述的半固体制剂为软膏剂、硬膏剂、栓剂、浸膏剂或凝胶剂；所述的气体制剂为气雾剂或喷雾剂。
8.根据权利要求5或6或7所述的左旋可利霉素药物组合物，其特征在于，所述的左旋可利霉素的用量为每单位剂型为10～1500mg，优选100～1000mg，更优选200～500mg。
9.一种权利要求1-3任意一项所述的左旋可利霉素的制备方法，该方法包括培养发酵和提取，其特征在于，所述的培养发酵为：将含有4″-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆菌株WSJ-195，在斜面培养基上培养后，将其接种于种子培养基，培养后，再将其接种于发酵培养基，通过pH调节剂控制发酵过程，在pH值6.0～9.0，优选6.0～8.0，更优选6.0～7.5的条件下进行发酵，且pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段，第一阶段满足方程式y1＝k1x1+6.0，其中0.0227≤k1≤0.1364，0＜x1≤22；第二阶段满足方程式y2＝k2x2+b2，其中-0.0735≤k2＜0，6.5＜b2≤10.62，22≤x2≤56；第三阶段满足方程式y3＝k3x3+b3，其中0＜k3≤0.0078，6.06≤b3＜6.5，56≤x3≤120。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的pH调节剂为葡萄糖、枸橼酸、醋酸、盐酸、氨水、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或其组合，优选葡萄糖、枸橼酸、醋酸、氨水或其组合；更优选葡萄糖、氨水或其组合。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的提取为：将培养发酵后的发酵液用硫酸铝处理得滤液，调pH至8.5-9.0，用乙酸丁酯提取，乙酸丁酯提取液分别用无盐水及1％NaH2PO4进行洗涤，再用pH2.0-2.5水提取，得水相提取液，调pH至4.5-5.5，挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液，过滤，滤液调pH8.5-9.0，得沉淀，用纯化水对沉淀物进行淋洗，得湿品，干燥，得左旋可利霉素。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基中含有黄豆饼粉2％、葡萄糖1％、淀粉3％、CaCO30.5％、NaCl 0.4％和琼脂2％。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基中含有黄豆饼粉1.5％、淀粉3.0％、NaCl 0.4％、CaCO3 0.5％、蛋白胨0.3％和KH2PO4 0.05％。
14.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有葡萄糖0.5％、淀粉6.0％、酵母粉0.5％、鱼粉2.0％、NH4NO3 0.6％、NaCl 1.0％、CaCO3 0.5％、KH2PO4 0.05％、MgSO4 0.1％、豆油0.5％和消沫剂0.02％。
15.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在斜面培养基上的培养为在温度28～38℃的条件下培养8～15天；在种子培养基上的培养为在温度25～30℃的条件下培养40～80小时；在发酵培养基上的发酵为在26～30℃的条件下培养72～120小时。
16.根据权利要求9-15任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括如下步骤：
a)对左旋可利霉素进行分离纯化得到左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III；
b)将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III进行重结晶得到左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物；
c)将步骤a)分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋可利霉素；
d)将步骤b)得到的左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物与步骤c)得到的左旋可利霉素混合得到异戊酰螺旋霉素I、II或III为左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III晶体化合物的左旋可利霉素。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述的分离纯化为：
采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的左旋可利霉素进行纯化，采用ODS制备色谱柱，用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱，通过紫外检测，记录分离的紫外谱图，对左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III组分目标峰进行收集：
色谱柱：ODS制备色谱柱；
流动相：乙腈(A)，100mM醋酸氨水溶液(B)；
梯度条件：采用线性梯度0～60分钟，A为25％～65％；61～90分钟，A为65％～90％；
流速：260mL/min；
进样量：10mL；
进样浓度：0.5g/mL；
检测波长：231nm；
收集方式：紫外触发收集；
按照左旋异戊酰螺旋霉素I的保留时间RT 44.759min，收集左旋异戊酰螺旋霉素I样品；或者按照异戊酰螺旋霉素II的保留时间RT 43.34min，收集异戊酰螺旋霉素II样品；或者按照左旋异戊酰螺旋霉素III的保留时间RT 48.009min，收集的左旋异戊酰螺旋霉素III样品；然后采用旋转蒸发除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯，得膏状样品；用石油醚重溶所得样品，再用旋转蒸发除去石油醚，获得左旋异戊酰螺旋霉素I、II或III的白色粉末状固体。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，
当异戊酰螺旋霉素I为左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物时，该晶体采用如下重结晶方法得到：先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素I的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素I晶体化合物，其中所用混合溶剂中乙酸乙酯、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1；
当异戊酰螺旋霉素II为左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物时，该晶体采用如下重结晶方法得到：先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素II的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素II晶体化合物，所用混合溶剂中无水甲醇、无水丙酮和无水乙醇的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1；
当异戊酰螺旋霉素III为左旋异戊酰螺旋霉素III晶体化合物时，其左旋异戊酰螺旋霉素III晶体的重结晶方法为：先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素III的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降温至5℃～15℃，降温的同时继续搅拌，得到左旋异戊酰螺旋霉素III晶体，所用混合溶剂中无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的体积比为1∶0.1～10∶0.5～1，优选1∶2～8∶0.8～1。
19.权利要求1-4任意一项所述的左旋可利霉素或权利要求5-8任意一项所述的左旋可利霉素药物组合物在制备治疗和预防感染性疾病药物中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的感染性疾病为革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、解脲支原体、沙眼衣原体、化脓性链球菌、卡他球菌、淋球菌、流感杆菌、军团菌或厌氧菌感染引起的疾病。
21.权利要求1-4任意一项所述的左旋可利霉素或权利要求5-8任意一项所述的左旋可利霉素药物组合物在制备抗菌药物中的应用，所述的菌为肺炎链球菌、甲类链球菌、化脓性链球菌、肠球菌、金葡菌、表葡菌、卡    他球菌、淋球菌、流感杆菌、大肠杆菌、产毒大肠杆菌、致病性大肠杆菌、侵龚性大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、伤寒杆菌、不动杆菌、枸橼酸杆菌枸橼酸杆菌、粘质沙雷氏菌、宋内氏痢疾杆菌、福氏痢疾杆菌、白色念球菌；军团菌如嗜肺军团菌、高曼军团菌、博茨曼军团菌、杜莫夫军团菌、佐丹军团菌、米克戴德军团菌；厌氧菌如脆弱类杆菌、多形类菌、普通类杆菌、吉氏类杆菌、吉氏类杆菌、栖瘤胃类杆菌、不解糖普氏杆菌、口腔普氏杆菌、具核酸杆菌、拉式梭杆菌、双岐杆菌、乳杆菌、消化链球菌、疮疱丙酸杆菌、产气荚膜梭菌、酵母样真菌。
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Denomination of invention: Levogyration kelimycin, medicament composite thereof, preparation method and application of levogyration kelimycin

Effective date of registration: 20150901

Granted publication date: 20140528

Pledgee: Shengjing bank Yingkou branch of Limited by Share Ltd

Pledgor: Tonglian Group Co., Ltd., Shenyang

Registration number: 2015210000009

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