BR112012029905A2 - levocarrimicina, composições farmacêuticas, métodos de preparação e usos desta - Google Patents
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Abstract
levocarrimicina, composições farmacêuricas, métodos de preparação e usos desta. a presente invenção se refere à levocarrimicina, suas composições farmacêuticas, métodos de preparação e aplicação. levocarrimicina é uma mistura de isovalerilespiramicina iii, ii e i como componentes principais e contém algumas de isoburilerilespiramicina iii e ii, sutirilespiramicina iii e ii, propionilespiramicina iii e ii, bem como acetilespiramicina iii e ii, dentro as quais o teor da isovalerilespiramicina iii, ii e i não e´menor que 30% em peso, o teor total de acilespiramicina é de 80 a 98% em peso. a rotação óptica da dita levocarrimicina é [<244>]~ d~ = - 52<198> ~ -57<198> na solução de 0,02 g/ml de clorofórmio à temperatura de 25<198>c. a presente invenção também se refere ao composto cristalino de isovalerilespiramicina iii,ii ou i em levocarrimicina, e as composições farmacêuticas contendo a dita levocarrimicina ou suas composições farmacêuticas têm atividade óptica e efeito anti-infeccioso excelente.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para LEVOCARRIMICINA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICA, MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E USO DOS MESMOS.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao composto do medicamento bruto de carrimicina e suas preparações farmacêuticas, especificamente a um antibiótico geneticamente engenheirado de macrolídeo, em particular à levocarrimicina, seus métodos de preparação e usos na preparação de fármacos para o tratamento e prevenção de doenças infecciosas.
Antecedentes da Invenção
Carrimicina é um novo derivado de espiramicina desenvolvido adotando-se a engenharia genética tecnológica, que é originalmente denominado biotecespiramicina e anteriormente denominado biotecmicina [Patente ZL97104440.6]. De acordo com “Rules for Chinese Approved Drug Na15 mes”, e sobre a revisão técnica e confirmação da Comissão da Farmacopéia Chinesa, o nome genérico chinês de biotecespiramicina foi trocado para carrimicina.
A carrimicina é um produto de fermentação de bactérias geneticamente engenheiradas. A estrutura química de carrimicina compreende 20 principalmente 4”-isovalerilespiramicina, incluindo 4”-isovalerilespiramicina I, II, II e cerca de 6 tipos de espiramicina 4”-hidróxi acilada, assim o nome químico é 4”-acilespiramicina. A forma estrutural química do componente principal de carrimicina é conforme mostrada na forma (I):
na qual:
2/58
R R’
Isovalerilespiramicina I H COCH2CH(CH3)2
Isovalerilespiramicina II COCH3 COCH2CH(CH3)2
Isovalerilespiramicina III COCH2CH3 COCH2CH(CH3)2
Carrimicina é um antibiótico macrolideo com anel de 16 membros, que inibe a síntese da proteína por combinação com o ribossomo da bactéria.
Os resultados de testes in vitro mostram que a carrimicina é eficaz contra bactérias Gram-positivas, especialmente algumas bactérias resistentes a fármacos, tais como Staphylococcus aureus resistente à β-lactama e Staphylococcus aureus, e não tem resistência a fármacos cruzados, Com fármacos similares. Enquanto isso, a carramicina tem atividade antibacteriana para micoplasma e clamídia, bem como algumas bactérias Gramnegativas e permeabilidade a tecidos para toxoplasma epidêmico e legionela, e tem ainda a função de imunorregulação potencial. A atividade antibacteriana in vivo é muito melhor que àquela in vitro (ZL200310122420.9). A pesquisa clínica mostra que ao se tomar comprimidos de carramicina de 0,2 a 0,4 mg por 5~7 dias, é adequado para se tratar faringite bacteriana aguda e amidalite supurativa aguda causada por estreptococo piogênico; nasossinusite bacteriana e bronquite aguda causada por bactérias sensibilizadas; pneumonia moderada causada por Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza e Mycoplasma pneumonia; uretrite não gonogócicas causada por micoplasma e clamídia; doenças infecciosas tais como infecção da pele e do tecido liso, periodontite e otite média causadas por bactérias sensibilizadas. A taxa efetiva total é de 93,68%. A carrimicina é segura e eficaz.
O estudo da farmacocinética mostra que os componentes ativos da carrimicina são principalmente isovalerilespiramicina I, II e III. A carrimicina metaboliza rapidamente à espiramicina in vivo. De acordo com a AUC0-4 do fármaco parente de isovalerilespiramicina I, II e II e o metabólito ativo de espiramicina I, II e III, a biodisponibilidade absoluta por administração oral é de 91,6% em média. É reportado que a biodisponibilidade absoluta de espiramicina por administração oral é de 30~40% (Frydman AM et al. J Antimi3/58 crob Chemother.1988, 22 (supl. B):93-103). Ele mostra que a isovalerilespiramicina aperfeiçoa significantemente a biodisponibilidade do componente ativo da espiramicina. Uma dose única de carrimicina é eliminada lentamente. T1/2 fica entre 23-27 horas.
Pesquisas sobre os componentes ativos de carrimicina mostram que uma pluralidade de átomos de carbono quirais existe na estrutura molecular dos componentes ativo da carrimicina; isovalerilespiramicina I, II e III. Quiralidade é um atributo básico do corpo tridimensional e é um dos atributos essenciais da natureza. Macromoléculas biológicas, que incluem proteína, polissacarídeo, ácido nucléico e enzima, como base importante do movimento vital, têm frequentemente funções biológicas importantes. O fármaco quiral é um par de enantiômeros do objeto material e imagem espelhada obtido depois que a estrutura molecular do fármaco é introduzida no centro quiral. Esses enantiômeros são basicamente os mesmos com respeito às propriedades físico-químicas, mas diferentes em rotação óptica. Os enantiômeros são respectivamente designados tipo R (dextrorrotatório) ou tipo S (sinistro), e racêmicos. Nos 20 anos recentes, conforme pesquisa farmacêutica se tornou mais intensa, foi provado que a diferença de afinidades de enantiômeros de fármacos com o receptor causada pela indiferença de estereosseletividade do enantiômero do fármaco leva a uma grande diferença na ação farmacológica. O enantiômero com alta atividade dentre os fármacos quirais é chamado de eutômero; enquanto aquele com baixa ou nenhuma atividade é chamado distômero. Em muitos casos, o distômero não somente não exibe qualquer ação farmacológica, mas também desvia daquele do eutômero. Algumas vezes, várias reações secundárias tóxicas graves ocorrem, mostrando a complexidade da diferença em função farmacológica e determinar a grande diferença no índice terapêutico do único enantiômero e o seu racemato. Por exemplo, o efeito curativo da bem conhecida DL-(+-) sintomicina é metade de D (-) de D-isômero; (-) adanona é um forte anestésico enquanto o (+) não é eficaz. Há também diferença na toxicidade. Por exemplo, os dois enantiômeros de talidomida têm sedação similar para camundongos, mas somente o S (-) isômero e sua metabolina têm embriotoxina e teratogê4/58 nese; quetamina é um anestésico e analgésico amplamente usado, mas tem efeitos colaterais tal como alucinação. Estudos mostram que S(+) é 3~4 vezes mais eficaz que R(-) e os efeitos colaterais tóxicos têm algo a ver com o último. A grande diferença do efeito curativo do fármaco tem promovido a pesquisa e o desenvolvimento de fármacos quirais e desenvolvimento de análise de separação. Ao se usar tecnologia “quiral”, podemos remover aqueles sem qualquer efeito ou efeitos colaterais tóxicos eficazmente dos fármacos e produzir fármacos quirais puros com estrutura simples e orientada, fazendo assim ingredientes farmacêuticos mais puros, subsequentemente acelerando o efeito curativo e encurtando o curso de tratamento. Portando, pesquisa em fármacos quirais tem se tornado um dos novos métodos para a pesquisa de novos medicamentos no mundo inteiro. Governos nacionais e empresas farmacêuticas têm investido pesadamente em campos tais como preparações de fármaco quiral, materiais quirais e intermediários quirais para pesquisa e desenvolvimento com a final de se obter domínio no mercado farmacêutico quiral. Além disso, com o aperfeiçoamento contínuo da tecnologia quiral, especialmente uso rápido e difundido da cromatografia líquida, a análise de separação e determinação de enantiômeros de fármacos quirais são promovidos. Fármacos quirais de enantiômero simples têm sido usados amplamente.
Através de muitas pesquisas sobre se a carrimicina tem atividade óptica também, o inventor agradavelmente surpreso de constatar que ao ajustar e otimizar as condições de cultivo e fermentação, o inventor chegou acidentalmente a uma levocarrimicina com rotação óptica, com melhor atividade anti-infecção. Portanto, a presente invenção proporciona levocarrimicina, métodos de preparação da mesma e usos na preparação de fármacos para prevenir e tratar doenças infecciosas.
Sumário de Invenção
O primeiro objetivo da presente invenção é proporcionar levocarrimicina, que tem rotação óptica e maior atividade anti-infecção ao mesmo tempo.
O segundo objetivo da presente invenção é proporcionar uma
5/58 composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica contém levocarrimicina com rotação óptica proporcionada pela presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
O terceiro objetivo da presente invenção é proporcionar um método de preparação de levocarrimicina, em que o método é caracterizado por um processo de produção simplificado e com padrão de qualidade fácil de ser controlado, e a levocarrimicina preparada efeito bom, rotação óptica e maior atividade anti-infecção.
O quarto objetivo da presente invenção é proporcionar usos da dita levocarrimicina ou da dita composição farmacêutica de levocarrimicina na fabricação de um medicamento para o tratamento e prevenção de doenças infecciosas. Especialmente, a levocarrimicina ou composição farmacêutica da levocarrimicina tem bom efeito na resistência às bactérias, clamídia e micoplasma, e pode ser usada como fármacos para doenças infecciosas.
Para realizar o primeiro objetivo da presente invenção, as seguintes soluções técnicas são adotadas:
A levocarrimicina - a levocarrimicina é uma mistura de isovalerilespiramicina III, II e I como principais componentes e têm certo teor de isobutirilespiramicina III e II, butirilespiramicina III e II, propionilespiramicina III e II, bem como acetilespiramicina III e II, dentre elas o teor da isovalerilespiramicina III não é maior que 30% em peso, o teor total da isovalerilespiramicina III, II e I não é menor que 60% em peso, e o teor da acilespiramicina é de 80-98% em peso, preferivelmente 85-98% em peso, ainda preferivelmente 90-98% em peso e mais preferivelmente 95~98% em peso; a rotação óptica específica da dita levocarrimicina é [a}D = -52°~-56° e ainda preferivelmente -55°.
O inventor tem feito várias pesquisas sobre carrimicina. Ao ajustar e otimizar as condições de cultura e fermentação, especialmente por controlo estrito do pH durante a fermentação com regulador de pH, as curvas de variação de pH com tempo mostram três fases contínuas e cada fase satisfaz certa fórmula, respectivamente, assim é obtida a levocarrimicina com atividade óptica. A razão possível é que o teor dos componentes com ativi6/58 dade ótica se alterou sob as condições de fermentação ou a configuração óptica se alterou sob as condições de fermentação.
O método de determinação da rotação específica ótima da levocarrimicina na presente invenção é: pesar a levocarrimicina preparada da presente invenção e adicionar precisamente solução de clorofórmio e diluir em solução de cerca de 10 mg/mL; medir a rotação ótica usando a linha D do espectro de sódio (589,3 nm) com um comprimento de medição de 1 dm e medir a temperatura de 25°C e usar um polarímetro checado com acuidade de 0,0001°.
A faixa de fusão da levocarrimicina da presente invenção é 112~122°C, preferivelmente, 114~120°C, ainda preferivelmente, 116~118°C.
O método de determinação da faixa de fusão é: colocar uma quantidade adequada de produto seco em um tubo capilar para determinação do ponto de fusão; repetir a determinação por três vezes e calcular a média.
A levocarrimicina da presente invenção tem rotação óptica. De acordo com a pesquisa farmacológica moderna, a diferença de afinidade do enantiômero do fármaco com receptor causada pela diferença da estereosseletividade do enantiômero do fármaco leva a uma grande diferença na ação farmacológica. Testes farmacodinâmicos in vivo e in vitro provam que a levocarrimicina da presente invenção tem bom efeito anti-infecção e boa atividade farmacológica ao mesmo tempo, proporcionando, assim, um novo fármaco para o tratamento de doenças infecciosas e produzindo base para pesquisar a preparação farmacêutica quiral de carrimicina.
Testes in vivo e in vitro provam que a levocarrimicina da presente invenção tem alta sensibilidade e baixa resistência a fármacos. A levocarrimicina não somente é eficaz contra Staphylococcus aureus resistente a fármacos como tem também um valor inestimável para infecção bacteriana causada por abuso de antibióticos. Por exemplo, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), infecção por Escherichia coli causada por βlactamase de espectro estendido (ESBL), e doenças infecciosas causadas por Clostridium difficile (C-diff) são todas devido ao abuso de antibióticos e
7/58 espera-se que sejam controladas com o advento da levocarrimicina.
A levo carrimicina contém também espiramicina III e outros componentes, dentre os quais o teor de espiramicina III não é maior que 1,0%, e o teor total de outros componentes é de 2,0~19% em peso, preferivelmente de 2,0~14,0% em peso, ainda preferivelmente 2,0~9,0% em peso e, mais preferivelmente, 2,0-4,0% em peso.
Na presente invenção, as ditas outras composições contêm pelo menos 3 homólogos aperfeiçoados de espiramicina.
A levocarrimicina da presente invenção é uma mistura de isovalerilespiramicina III, II e I como principais componentes, dentre as quais a dita isovalerilespiramicina III é um composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III, a dita isovalerilespiramicina II é um composto de cristal da levoisovalerilespiramicina II, ou a dita isovalerilespiramicina I é um composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I.
Quando a isovalerilespiramicina III é um composto de cristal com III de levoisovalerilespiramicina, o dito composto de cristal medido por difração de pó de raios X com raios Cu-Κα tem os seguintes picos característicos de 2Θ a 8,0°, 10,0°, 11,2°, 11,7°, 16,4°, 19,1°, 19,6°, 20,0°, 21,4°, 22,9°, 23,6° e 29,4°; quando a isovalerilespiramicina II é um composto de cristal com II de levoisovalerilespiramicina, em que o dito composto de cristal medido por difração de pó de raios C com Cu-Κα tem picos característicos de 2Θ a 10,0°, 11,6°, 16,4°, 17,3°, 19,1°, 21,2°, 22,1°, 22,7°, 26,4°, 26,9°, 27,5° e 31,5°; quando a isovalerilespiramicina I é um composto de cristal com I de levoisovalerilespiramicina, em que o dito composto de cristal medido pelo método de difração de pó de raios X com Cu-Κα tem picos característicos de 2Θ a 7,6°, 8,0°, 10,0°, 11,4°, 16,4°, 17,0o, 17,9°, 19,5°, 22,7°, 23,7° e 24,4°.
Em subsequente pesquisa, o inventor descobre que depois de purificar e separar a levocarrimicina, composições simples de isovalerilespiramicina III, II ou II são obtidas; recristalizar uma das composições, e o composto de cristal de isovalerilespiramicina III, II ou I é obtido; misturar um dos compostos de cristal com levocarrimicina para obter a levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina III, II ou I é o composto de cristal de levoisovale8/58 rilespiramicina III, II ou I. Teste farmacodinâmico in vivo prova que o efeito farmacológico da levocarrimicina, na qual a isovalerilespiramicina III, II ou I é um cristal de levoisovalerilespiramicina III, II, ou I é muito melhor que o da levocarrimicina pura.
Para realizar o segundo objetivo da presente invenção, as seguintes soluções técnicas são adotadas: Uma composição farmacêutica de levocarrimicina, na qual a composição farmacêutica de levocarrimicina contém a dita levocarrimicina e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Nas ditas composições farmacêuticas da presente invenção, o teor da levocarrimicina é de quantidade terapeuticamente segura e eficaz e é de 10-90% daquela da composição farmacêutica, preferivelmente, 25-75% em peso, e ainda preferivelmente 40-60% em peso.
“Quantidade terapeuticamente segura e eficaz”, como dito na presente invenção, significa uma quantidade suficiente de fármacos, compostos, composições, produtos ou medicamentos que poderiam aliviar, reverter ou tratar doenças de humanos ou de outros mamíferos e sem efeitos prejudiciais aos tecidos dos mamíferos.
A expressão “Veículo farmaceuticamente aceitável” da presente invenção se refere a veículos de fármacos convencionais no campo farmacêutico, por exemplo, diluentes, excipientes tal como água, cargas tais como amido e açúcar da cana-de-açúcar, adesivos tais como derivados de celulose, alginato, gelatinas e polivinilpirrolidona; agente umectante tai como glicerol; desintegradores tais como ágar, carbonato de cálcio e bicarbonato de sódio; intensificador de absorção tal como composto de amônio quaternário; agentes tensoativos tal como hexadecanol; veículos de adsorção tais como caulim e bentonita; lubrificantes tais como pó de talco, estearato de cálcio, Mg e polietileno glicol. Além disso, outros adjuvantes, condimentos e adoçantes podem ser usados também na composição farmacêutica.
As composições da presente invenção podem conter quaisquer diluentes, desintegrador, lubrificantes, carga, adesivo, umectantes, intensificador de absorção, agente tensoativo, excipiente de quantidade terapeuticamente segura e eficaz, ou veículo comumente usado em fármaco em
9/58 quantidade terapeuticamente segura e eficaz neste campo.
A composição farmacêutica de levocarrimicina na presente invenção existe em preparações aplicáveis para fins farmacêuticos, e as preparações são líquidas, sólidas, semi-sólidas, ou gasosas.
As preparações líquidas compreendem injeção, solução para infusão, solução, mistura, xarope, tintura ou coloide.
As preparações sólidas compreendem pó para injeção, pó liofilizado para injeção, comprimido, cápsula, pó, grânulos, pílula, preparação sublimada ou película.
As preparações semi-sólidas compreendem unguento, emplastro, supositório, extrato ou gel.
As preparações gasosas compreendem aerossol ou spray.
A composição farmacêutica de levocarrimicina na presente invenção compreende, entre elas, o teor de dita levocarrimicina de 1—1.500 mg por formulação unitária, preferivelmente, 100-1.000 mg por formulação unitária e ainda, preferivelmente, 200-500 mg por formulação unitária.
Para realizar o terceiro objetivo da presente invenção, as seguintes soluções são adotadas:
Um método de preparação da levocarrimicina, que inclui um processo de cultivar, fermentar e extrair, dentre os quais a cultura e a fermentação incluem: cultivar as cepas fúngicas clonadas WSP-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de cultura inclinado, inoculá-lo em um meio de semente, então inoculá-lo em meio de fermentação depois da cultura, e controlar o processo de fermentação com regulador de pH. A fermentação prossegue sob pH de 6,0-9,0, preferivelmente 6,0-8,0, e ainda preferivelmente 6,0-7,5. As curvas de variação para pH com o tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a fórmula γι=^Χι=6,0, onde 0,0227<ki<0,1364, 0<Xi<22; a segunda fase satisfaz y2=k2X2+t>2, onde -0,0735<k2<0, 6,5<10,62, 22<X2^56; e a terceira fase satisfaz a fórmula y3=k3x3+ b3, onde 0<k3<0,0078, 6,06<b3<6,5, 56<x3<120.
Na presente invenção, ajustar e otimizar as condições de cultura
10/58 e fermentação, especialmente controlando o pH durante a fermentação com o regulador de pH, as curvas de variação de pH com o tempo mostram três fases contínuas e cada fase satisfaz certa fórmula, respectivamente, assim a levocarrimicina com atividade ótica é obtida.
Na presente invenção, o processo de fermentação é chave, o pH precisa ser detectado regularmente durante o inteiro processo de fermentação e é controlado por adição de regulador de pH, em que o regulador de pH é um de uma combinação de glicose, ácido cítrico, ácido acético, ácido clorídrico, água amoniacal, hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, preferivelmente, glicose, ácido cítrico, ácido acético, água amoniacal ou uma combinação destes.
O método de preparação da presente invenção, no qual o processo de extração é: processar o licor de fermentação com sulfato de alumínio para obter o filtrado, ajustar o pH para 8,9-9,0, extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1% de NaH2PO4, respectivamente, então extrair com água de pH 2,0-2,5 para obter extrato aquoso, ajustar o pH para 4,5-5,5, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter extrato hidratado, filtrar e ajustar o pH para 8,5-9,0, obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secá-lo para obter a levocarrimicina.
Na dita preparação, o método da presente invenção, o dito meio de cultura inclinado contém 2% de farinha de soja, 1% de glicose, 3% de amido, 0,5% de CaCOs, 0,4% de NaCI e 2% de ágar.
No dito método de preparação da presente invenção, o dito meio de semente contém 1,5% de farinha de soja, 3,0% de amido, 0,5% de CaCO3, 0,3% de peptona e 0,05% de KH2PO4.
No dito método de preparação da presente invenção, 0 dito meio de fermentação contém 0,5% de glicose, 6,0% de pó de levedura, 2,0% de farinha de peixe, 0,6% de NH4NO3, 1,0% de NaCI, 0,5% de CaCOs, 0,05% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4, 0,5% de óleo de soja e 0,02% de agente antiespumante.
No dito método de preparação da presente invenção, a cultura
11/58 no meio de cultura inclinado dura de 8~15 dias, na temperatura de 28~38°C.
No dito método de preparação da presente invenção, a cultura no dito meio de cultura dura de 40~80 horas, na temperatura de 25~30°C.
No dito método de preparação da presente invenção, a fermentação no meio de fermentação dura de 72~120 horas, na temperatura de 26~30°C.
Quando a levocarrimicina contém o cristal de isovalerilespiramicina I, II ou II, o dito método de preparação compreende as seguintes etapas:
a) separar e purificar a levocarrimicina para obter levoisovalerilespiramicina I, II ou III;
b) recristalizar a levoisovalerilespiramicina I, II ou III para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III;
c) eliminar a acetonitrila na levocarrimicina residual depois de separar e purificar a levoisovalerilespiramicina I, II ou III na etapa a) através de rotoevaporação, então extrair com 1 vez a quantidade de acetato de etila, e eliminar o acetato de etila no extrato através de rotoevaporação para obter uma amostra de pasta; re-dissolver a amostra obtida com éter de petróleo, e eliminar o éter de petróleo através da rotoevaporação para obter a levocarrimicina; re-dissolver a amostra obtida com éter de petróleo, e eliminar o éter de petróleo através de rotoevaporação para obter a levocarrimcina;
d) misturar o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III obtido na etapa b) com a levocarrimicina obtida na etapa c) para obter a levocarrimicina, dentre as quais, a isovalerilespiramicina I, II ou III é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III.
No método de preparação da presente, o dito processo de separação e purificação na etapa a) compreende:
purificar a levocarrimicina obtida na separação preliminar com cromatografia líquida preparativa de alta performance, preparar a coluna cromatográfica com ODS, usar acetonitrila e solução tampão de acetato de amônio como a fase móvel em eluição de gradiente; registrar o espectrograma de UV separado através de detecção de UV, e coletar os picos alvo
12/58 dos componentes de levoisovalerilespiramicina I, II ou III:
coluna cromatográfica: coluna cromatográfica preparativa ODS;
fase móvel: acetonitrila (A), solução de acetato de amônio
100mM (B);
condição de gradiente: adotar o gradiente linear para 0 ~60 minutos, A é 25% -65%; e 61 -90 minutos, A é 65% -90%;
vazão: 260 mL/min;
volume de injeção: 10 mL;
concentração da amostragem: 0,5 g/mL; medição do comprimento de onda: 231 nm; meio de coleta: coleta via desencadeador de UV;
coletar a amostra de levoisovalerilespiramicina I de acordo com o tempo de retenção de 44,759 minutos de levoisovalerilespiramicina I; ou coletar a amostra de isovalerilespiramicina II de acordo com o tempo de retenção de 43,34 minutos de isovalerilespiramicina II; ou coletar a amostra de isovalerilespiramicina II de acordo com o tempo de retenção de 43,34 minutos de isovalerilespiramicina II; ou coletar a amostra de levoisovalerilespiramicina III de acordo com o tempo de retenção de 48,009 de levoisovalerilespiramicina III; então eliminar a acetonitrila através de rotoevaporação, extrair com 1 quantidade de tempo de acetato de etila, e eliminar o acetato de etila no extrato através da rotoevaporação para obter a amostra de pasta; redissolver a amostra obtida com éter de petróleo, e eliminar o éter de petróleo através de rotoevaporação para obter o pó sólido branco de levoisovalerilespiramicina I, II ou III.
No método de preparação da presente invenção, quando a isovalerilespiramicina I é um cristal de levoisovalerilespiramicina I, o cristal é obtido através do seguinte processo de recristalização: dissolver o pó sólido branco de levoisovalerilespiramicina I no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, e então adicionar água pura com agitação, depois do que, reduzir a temperatura para 5°C ~15°C com agitação contínua, para obter o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I, dentro os quais a razão em volume de acetato de etila para acetona anidra
13/58 no solvente misto é 1:0,1 -10:0,5 - preferivelmente, 1:2 -8:0,8 -1.
Dentre essas, a primeira solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina I é: o volume de água pura adicionada é 2-9 vezes a soma de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra, preferivelmente 2,5-7,5 vezes; a velocidade de adição da água pura é de 4-10 mL/minuto, preferivelmente, 6-8 mL/minuto.
A segunda solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina I é: razão em volume de acetato de etila para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto é 1:0,1-10:0,5-1, preferivelmente 1:2-8:0,8-1.
A terceira solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina I é: a velocidade de agitação quando da adição de água pura é de 30-60 rpm, preferivelmente, 45-60 rpm; depois que a água pura é adicionada, a velocidade de agitação é de 10-30 rpm; preferivelmente 10-20 rpm.
A quarta solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina I é: depois de a água pura ser adicionada, a velocidade de resfriamento é de 1 ~3°C por hora, preferivelmente de 1 ~1,5°C por hora.
Quando a isovalerilespiramicina II é um cristal de levoisovalerilespiramicina II, o composto de cristal é obtido através do seguinte processo de recristalização: dissolver o pó sólido branco de levoisovalerilespiramicina II no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, então adicionar água pura com agitação, depois do que, reduzir a temperatura para 5°C - 15°C com agitação contínua, para obter o cristal da levoisovalerilespiramicina II, em que a razão em volume de metanol absoluto para acetona anidra para álcool etílico absoluto no solvente misto é de 1:01 -10:0,5 -1, preferivelmente, 1:2 -8:0,8 - 1.
Dentre essas, a primeira solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina II é: o volume de água pura adicionada é 2-9 vezes a soma de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, preferivelmente 2,5-7,5 vezes; a velocidade de adição da
14/58 água pura é de 4~10 mL/minuto, preferivelmente, 6~8 mL/minuto.
A segunda solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina II é: a razão em volume de metanol absoluto para acetona anidra para álcool etílico absoluto no solvente misto é
1:0,1-10:0,5-1, preferivelmente 1:2-8:0,8-1.
A terceira solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina II é: a velocidade de agitação quando da adição de água pura é de 30-60 rpm, preferivelmente, 45-60 rpm; depois que a água pura é adicionada, a velocidade de agitação é de 10-30 rpm, preferivelmente, 10-20 rpm.
A quarta solução técnica preferida para a recristalização do cristal de levoisovalerilespiramicina II é: depois que a água pura é adicionada, a velocidade de resfriamento é de 1 ~3°C por hora, preferivelmente de 1 ~1,5°C por hora.
Quando a isovalerilespiramicina III é um de cristal de levoisovalerilespiramicina III, o composto de cristal é obtido através do seguinte processo de recristalização: dissolver o pó sólido branco de levoisovalerilespiramicina III no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, então adicionar água pura com agitação, depois do que, reduzir a temperatura para 5°C -15°C com agitação contínua, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III, em que a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto é de 1:0,1 -10:0,5 - 1, preferivelmente, 1:2 -8:0,8 -1.
Dentre essas, a primeira solução técnica preferida para a recristalização do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III é: o volume de água pura adicionada é 2-9 vezes a soma de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, preferivelmente 2,5-7,5 vezes; a velocidade de adição da água pura é de 4-10 mL/minuto, preferivelmente, 6-8 mL/minuto.
A segunda solução técnica preferida para a recristalização do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III é: a razão em volume de metanol absoluto para acetona anidra para álcool etílico absoluto no solven15/58 te misto é 1:0,1-10:0,5-1, preferivelmente 1:2-8:0,8-1.
A terceira solução técnica preferida para a recristalização do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III é: a velocidade de agitação quando da adição de água pura é de 30-60 rpm, preferivelmente, 45-60 rpm; depois que a água pura é adicionada, a velocidade de agitação é de 10-30 rpm, preferivelmente, 10-20 rpm.
A quarta solução técnica preferida para a recristalização do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III é: depois que a água pura é adicionada, a velocidade de resfriamento é de 1 ~3°C por hora, preferivelmente de 1 -1,5°C por hora.
A presente invenção proporciona também usos da dita levocarrimicina ou das ditas composições farmacêuticas na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças infecciosas.
Na presente invenção, as ditas doenças infecciosas são doenças causada por infecção com bactéria Gram-positiva, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, Chlamydia trachomatis, estreptococos piogênicos, Micrococcus catarrhalis, gonocos, bacilos da influenza, Legionella ou anaeróbicos.
A presente invenção proporciona ainda usos da dita levocarrimicina e da dita composição farmacêutica na fabricação de medicamento antibacteriano, em que as bactérias incluem Streptococcus pneumoniae, estreptococos do Grupo A, estreptococos piogênics, enterococos, Staphylococcus aureus, S. epidermids, Catarrhal coccus, gonococos, bacilos da influenza, Escherichia coli, Escherichia coli enterotoxigênica, Escherichia coli enteropatogênica, Escherichia coli enteroinvasiva, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, bacilo Proteus vulgaris, bacilo tifoide, acinetobactéria, citrobactéria, Serratia marcescens, S.Sonnei, Sh.flexnen, Tritirachium album; legionella como Legionella pneumophila, Legionella gormanii, Legionella bozemanii, Legionella dumoffii, Legionella jordanis, e Legionella micdadei; anaeróbicas como Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Bacteroides bacteroides, Bacteroides prevotella, Prevotella
16/58 asaccharolyticus, Prevotella oralis, Fusobacteriumnu cleatum, Fusobacterium russll, bifidobacteria, lactobacilos, peptoestreptococos, Propionibacterium acnes, Clostridium perfringens, e fungos como levedura
Aquele versado na técnica usualmente sabe que a quantidade de componentes ativos necessários para o tratamento se altera com vários fatores, que incluem a natureza da doença e a idade e condição do paciente, e é finalmente determinada pelo médico. Se as composições farmacêuticas da levocarrimicina na presente invenção são administradas na forma de dosagem unitária, o teor da levocarrimicina é de 10 -1.500 mg por forma de dosagem unitária, 100 -1.000 mg por forma de dosagem unitária e ainda, preferivelmente, 200 -500 mg por forma de dosagem unitária. A dose diária necessária pode ser administrada em dose única ou dose dividida.
O teste farmacodinâmico in vitro prova que os componentes ativos na levocarrimicina ou suas composições farmacêuticas proporcionados pela presente invenção têm atividade óptica e efeito anti-infecção eficaz. Os componentes ativos não somente têm boa atividade antibacteriana contra bactéria Gram-positiva, especialmente Staphylococcus aureus como também são eficazes contra algumas bactérias negativas tais como Catarrhal coccus, gonococos, bacilos da influenza, alguns Legionella e anaeróbicos, especialmente Micoplasma pneumonia e Chlamydia pneumonia.
Em comparação com a técnica anterior, a presente invenção tem as seguintes vantagens:
1) A levocarrimicina da presente invenção tem rotação óptica, contudo, de acordo com a pesquisa farmacológica moderna, a diferença de afinidade do enantiômero do fármaco com receptor causada pela diferença da estereosseletividade do enantiômero do fármaco leva à grande diferença na ação farmacológica. Testes farmacodinâmicos in vitro e in vivo provam que a levocarrimicina da presente invenção tem efeito anti-infecção excelente e boa atividade farmacológica ao mesmo tempo, proporcionando, assim, um fármaco novo para curar doenças infecciosas e estabelecer uma base para pesquisa e desenvolvimento de fármacos virais de carrimicina; teste farmacodinâmico in vivo mostra que a levocarrimicina, na qual a isovaleriles17/58 piramicina I, II ou II é o compostos de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III tem melhor função protetora para o efeito curativo de camundongos infectados com 12 cepas de bactérias;
2) O método de preparação para a levocarrimicina proporcionado pela presente invenção, por ajuste e otimização das condições de cultura e fermentação, especialmente por controle do pH durante a fermentação com regulador de pH, as curvas de variação de pH com tempo mostra três fases contínuas e cada fase satisfaz certa fórmula, respectivamente, assim a levocarrimicina com atividade óptica é obtida;
3) O método de preparação para levocarrimicina proporcionado pela presente invenção, é caracterizado por processo de produção simplificado, é adequado para produção industrial em larga escala.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é a curva de variação de valor de pH-tempo durante a fermentação no Exemplo da presente invenção.
A Figura 2 é a curva de variação de pH-tempo durante a fermentação do Exemplo 2 da presente invenção;
A Figura 3 é a curva de variação do valor de pH-tempo durante a fermentação do Exemplo 3 da presente invenção;
A Figura 4 é o cromatograma líquido dos componentes da carrimicina padrão, dentre as quais:
1— espiramicina III
2— monoacetil espiramicina II
3— monoacetil espiramicina III
4— propionilespiramicina II
5— propionil espiramicina III
6— (iso-) butirilespiramicina II
7— isovalerilespiramicina I
8— (iso-) butirilespiramicina III
9— isovalerilespiramicina II
10— isovalerilespiramicina III
A Figura 5 é o cromatograma líquido da levocarrimicina propor18/58 cionada no Exemplo 4 da presente invenção;
A Figura 6 é o padrão de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I da presente invenção;
A Figura 7 é o padrão de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II da presente invenção;
A Figura 8 é o padrão de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III da presente invenção;
Descrição Detalhada dos Exemplos Preferidos
Os seguintes são Exemplos da presente invenção e esses exemplos almejam detalhar mais que limitar a presente invenção.
Exemplo 1 - Preparação da levocarrimicina
1) Cultura e fermentação
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSJ-195 produzidas por espiramicina contendo gene de 4”-isovaleril transferase em meio de cultura inclinado, inocular no meio de semente, então inoculá-lo no meio de fermentação após cultura, e controlar o processo de fermentação por glicose e água amoniacal. A fermentação dura 120 horas em valor de pH de 6,0-9,0. As curvas de variação de pH com o tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a fórmula y1=k1Xi=6,0, onde 0,0227<ki<0,1364, 0<Xi<22; a segunda fase satisfaz y2=k2X2+b2, onde -0,0735<k2<0, 6,5<10,62, 22<x2<56; e a terceira fase satisfaz a fórmula y3=k3X3+ bs, onde 0<ks<0,0078, 6,06<b3<6,5, 56<X3<120, vide a Figura 1 para a curva de variação, e obter o caldo de fermentação.
2) Extração
Processar o caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter filtrado, ajustar o pH para 9,0 extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1% de NaF^PCU, respectivamente, então extrair com água em pH 2,5 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 4,5, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter o extrato aquoso, filtrar e ajustar o o pH para 8,5, obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secar o mesmo para obter a levocarrimicina.
19/58
Exemplo 2 - Preparação da levocarrimicina
1) Cultura e fermentação
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSJ-195 produzidas por espiramicina contendo gene de 4”-isovaleril transferase em meio de cultura inclinado, inocular no meio de semente, então inoculá-lo no meio de fermentação após cultura, e controlar o processo de fermentação por glicose e hidróxido de sódio. A fermentação dura 110 horas em valor de pH de 6,0 ~ 8,0. As curvas de variação para pH com o tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a fórmula yi=0,0909xi+6,4,onde 0<x-i<22; a segunda fase satisfaz a fórmula y2= 0,0441x2+7,8, onde 22<X2^56; e a terceira fase satisfaz a fórmula y3=0,0078x3+6,06, onde 56<X3<110, vide a Figura 2 para a curva de variação, e obter o caldo de fermentação.
2) Extração
Processar o caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter o filtrado, ajustar o pH para 8,9 extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1% de NaH2PO4, respectivamente, então extrair com água em pH 2,2 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 4,2, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter o extrato aquoso, filtrar e ajustar o pH para 8,5, obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secar o mesmo para obter a levocarrimicina.
Exemplo 3 - Preparação de levocarrimicina
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSP-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de cultura inclinado, inoculá-lo em um meio de semente, então inocular em meio de fermentação depois da cultura, e controlar o processo de fermentação com glicose e ácido cítrico. A fermentação dura 115 horas sob condição de valor de pH de 6,0 ~7,5. As curvas de variação para pH com o tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a formula y1=0,0682xi+6,0, onde 0<Xi<22; a segunda faze satisfaz a fórmula y2=0,0294χ2+8,147, onde 22<x2<56; a terceira fase satisfaz y3=0,0078x3+6,06, onde 56<x3<115, vide Figura 3 para a curva de variação, e obter o caldo de
20/58 fermentação.
2) Extração
Processar o caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter o filtrado, ajustar o pH para 8,9 extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1% de NaFfePO^ respectivamente, então extrair com água em pH 2,3 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 5,2, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter o extrato aquoso, filtrar e ajustar o pH para 8,7, obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secar o mesmo para obter a levocarrimicina.
Exemplo 4 - Preparação de levocarrimicina
1) Cultura e fermentação
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSJ-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de cultura inclinado que contém 2% de farinha de soja, 1% de glicose, 3% amido, 0,5% de CaCOs, 0,4% de NaCI e 2% de ágar por 15 dias a 28°C, inocular este em meio de semente que contém 1,5% de farinha de soja, 3,0% de amido, 0,4% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,3% de peptona e 0,05% de KH2PO4i por 80 horas a 25°C, então inocular a 25°C, então inocular no meio de fermentação que contém 0,5% de glicose, 6,0% de amido, 0,5% de pó de levedura, 2,0% de farinha de peixe, 0,6% de NH4NO3, 1,0% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,05% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4, 0,5% de óleo de soja e 0,02% de antiespumante com um teor de inoculação de 0,1%, e controlar 0 processo de fermentação por glicose e água amoniacal. A fermentação dura 120 horas sob o valor de pH de 6,0 ~9,0. As curvas de variação para pH com tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a formula y1=0,1364x1+6,0, onde 0<Xi<22; a segunda fase satisfaz a fórmula y2=0,0735x2 +10,64, onde 22<x2<56; a terceira fase satisfaz a fórmula y3=0,0078x3+6,06, onde56<x3<120, e o caldo de fermentação é obtido.
2) Extração
Processar o caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter o filtrado, ajustar o pH para 8,5 extrair com acetato de butila, lavar o
21/58 extrato de acetato de butila com água não salina e 1% de NaH2PO4, respectivamente, então extrair com água em pH 2,0 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 4,5, volatilizar e eliminar o acetato de butila para obter extrato hidratado, filtrar e ajustar o pH para 8,5 para obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secar para obter a levocarrimicina.
Exemplo 5 - Preparação de levocarrimicina
1) Cultura e fermentação
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSJ-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de cultura inclinado que contém 2% de farinha de soja, 1% de glicose, 3% amido, 0,5% de CaCO3, 0,4% de NaCI e 2% de ágar por 8 dias a 38°C, inocular este em meio de semente que contém 1,5% de farinha de soja, 3,0% de amido, 0,4% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,3% de peptona e 0,05% de KH2PO4, por 40 horas a 30°C, então inocular em meio de fermentação, que contém 0,5% de glicose, 6,0% de amido, 0,5% de pó de levedura, 2,0% de farinha de peixe, 0,6% de NH4NO3, 1,0% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,05% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4, 0,5% de óleo de soja e 0,02% de antiespumante com um teor de inoculação de 20%, e controlar o processo de fermentação por glicose e água amoniacal. A fermentação dura 115 horas sob o valor de pH de 6,0 - 7,5, a 30°C. As curvas de variação para pH com tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a formula yi=0,0682xi+6,0, onde 0<Xi<22; a segunda fase satisfaz a fórmula y2=-0,0294x2 +8,147, onde 22<x2<56; a terceira fase satisfaz a fórmula y3=0,0078x3+6,06, onde 56<x3<115, vide a Figura 3 para a curva de variação, para obter o caldo de fermentação.
2) Extração
Processar 0 caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter filtrado, ajustar o pH para 9,0, extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1% de NaH2PC>4, respectivamente, então extrair com água em pH 2,5 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 4,5-5,5, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter 0 extrato aquoso, filtrar e ajustar 0 pH para 9,0, obter um precipi22/58 tado, lavar o precipitado com água purificada e secar o mesmo para obter a levocarrimicina.
Exemplo 6 - Preparação de levocarrimicina
1) Cultura e fermentação
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSJ-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de cultura inclinado que contém 2% de farinha de soja, 1% de glicose, 3% amido, 0,5% de CaCOs, 0,4% de NaCI e 2% de ágar por 12 dias a 30°C, inocular este em meio de semente que contém 1,5% de farinha de soja, 3,0% de amido, 0,4% de NaCI, 0,5% de CaCOs, 0,3% de peptona e 0,05% de KH2PO4, por 60 horas a 30°C, então inocular em meio de fermentação, que contém 0,5% de glicose, 6,0% de amido, 0,5% de pó de levedura, 2,0% de farinha de peixe, 0,6% de NH4NO3, 1,0% de NaCI, 0,5% de CaCOs, 0,05% de KH2PO4i 0,1% de MgSO4, 0,5% de óleo de soja e 0,02% de antiespumante com um teor de inoculação de 10%, e controlar 0 processo de fermentação por glicose e água amoniacal. A fermentação dura 115 horas sob o valor de pH de 6,0 ~ 7,5, a 28°C. As curvas de variação para pH com tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a formula yi=0,0682xi+6,0, onde 0<xi<22; a segunda fase satisfaz a fórmula y2=0,0294x2 +8,147, onde 22<X2^56; a terceira fase satisfaz a fórmula y3=0,0078x3+6,06, onde 56<x3<90, vide a Figura 3 para a curva de variação, para obter o caldo de fermentação.
2) Extração
Processar 0 caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter filtrado, ajustar o pH para 8,7, extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1 % de NahhPCXi, respectivamente, então extrair com água em pH 2,2 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 5,0, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter o extrato aquoso, filtrar e ajustar 0 pH para 8,7, obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secar o mesmo para obter a levocarrimicina.
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Exemplo 7 - Preparação de levocarrimicina
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSJ-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de cultura inclinado que contém 2% de farinha de soja, 1% de glicose, 3% amido, 0,5% de CaCO3, 0,4% de NaCI e 2% de ágar por 12 dias a 35°C, inocular este em meio de semente que contém 1,5% de farinha de soja, 3,0% de amido, 0,4% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,3% de peptona e 0,05% de KH2PO41 por 55 horas a 26°C, então inocular em meio de fermentação, que contém 0,5% de glicose, 6,0% de amido, 0,5% de pó de levedura, 2,0% de farinha de peixe, 0,6% de NH4NO3, 1,0% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,05% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4, 0,5% de óleo de soja e 0,02% de antiespumante com um teor de inoculação de 15%, e controlar o processo de fermentação por glicose e água amoniacal. A fermentação dura 115 horas sob o valor de pH de 6,0 ~ 7,5, a 27°C. As curvas de variação para pH com tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a formula y1=0,0682xi+6,0, onde 0<xi<22; a segunda fase satisfaz a fórmula y2=0,0294x2 +8,147, onde 22<x2<56; a terceira fase satisfaz a fórmula y3=0,0078x3+6,06, onde 56<x3^110, vide a Figura 3 para a curva de variação, para obter o caldo de fermentação.
2) Extração
Processar o caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter filtrado, ajustar o pH para 8,6, extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1 % de NaH2PO4, respectivamente, então extrair com água em pH 2,3 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 4,8, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter o extrato aquoso, filtrar e ajustar o pH para 8,8, obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secar o mesmo para obter a levocarrimicina.
Exemplo 8 - Preparação de levocarrimicina
1) Cultura e fermentação
Cultivar as cepas fúngicas clonadas WSJ-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de
24/58 cultura inclinado que contém 2% de farinha de soja, 1 % de glicose, 3% amido, 0,5% de CaCO3, 0,4% de NaCI e 2% de ágar por 13 dias a 36°C, inocular este em meio de semente que contém 1,5% de farinha de soja, 3,0% de amido, 0,4% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,3% de peptona e 0,05% de KH2PO4, por 75 horas a 27°C, então inocular em meio de fermentação, que contém 0,5% de glicose, 6,0% de amido, 0,5% de pó de levedura, 2,0% de farinha de peixe, 0,6% de NH4NO3, 1,0% de NaCI, 0,5% de CaCO3, 0,05% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4, 0,5% de óleo de soja e 0,02% de antiespumante com um teor de inoculação de 0,5%, e controlar o processo de fermentação por glicose e água amoniacal. A fermentação dura 98 horas sob o valor de pH de 6,0 ~ 8,0, a 29°C. As curvas de variação para pH com tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a formula yi=0,0909xi+6,4, onde 0<Xi<22; a segunda fase satisfaz a fórmula y2=0,0441x2 +7,8, onde 22<x2^56; a terceira fase satisfaz a fórmula y3=0,0078x3+6,06, onde 56<x3<110, vide a Figura 3 para a curva de variação, para obter o caldo de fermentação.
2) Extração
Processar o caldo de fermentação com sulfato de alumínio para obter filtrado, ajustar o pH para 8,9, extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de butila com água não salina e 1% de NaH2PO4, respectivamente, então extrair com água em pH 2,3 para obter um extrato aquoso, ajustar o pH para 4,6, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter o extrato aquoso, filtrar e ajustar 0 pH para 8,6, obter um precipitado, lavar o precipitado com água purificada e secar o mesmo para obter a levocarrimicina.
Exemplo 9 - Método de Determinação quantitativa da levocarrimicina por HPLC
Determinar por cromatografia líquida de alta performance (Apêndices V D da Farmacopéia Chinesa 2005 (2))
Usar a coluna cromatográfica Venusil XBP C18 (L), 150 A (200 mmx4,6 mm, 5 pm) (AGELA TECHNOLOGIES), a fase móvel A é acetonitrila, a fase móvel B é 0,01 mol.L'1 de solução de acetato de amônio (ajustar o
25/58 valor de pH para 7,0 com água amoniacal), eluição de gradiente de acordo com tabela abaixo; o comprimento de onde é 232 nm, a vazão é 1,0 mL.min 1, a temperatura de controle é 25°C e o volume de injeção é 20 μΙ_.
Tempo (min) Fase Móvel A Fase Móvel B (%)(%)
3565
5050
6535
35 65
3565
A condição cromatográfica e o teste de adequação do sistema se referem ao cromatograma líquido de componente de carrimicina padrão (Figura 4). Ajustar a condição cromatográfica e, se necessário, alterar a condição de eluição do gradiente da fase móvel para tornar o componente de levocarrimicina da amostra consistente com os espectros do componente de carrimicina padrão (Figura 4).
Solução da amostra padrão: pesar com acuidade a quantidade própria do produto padrão, diluir o mesmo com o licor misto de 0,01 mol/L de solução de acetato misto (ajustar o valor de pH para 7,0 com água amoniacal) e acetonitrila em uma proporção de 65:35 para uma concentração de 0,4 mg/mL como a solução de amostra padrão e agitar bem para uso futuro.
Solução da amostra de teste: pesar 50 mg da amostra de teste, diluir a mesma com o licor misto de 0,01 mol/L de solução de acetato de amônio (ajustar o valor de pH para 7,0 com água amoniacal) e acetonitrila (proporção de 65 para 35) para 50 mL como a solução de produto da amostra e agitar bem para uso futuro.
Calcular com base na área de pico de isovalerilespiramicina III por método de padrão externo. A isovalerilespiramicina III não deve ser menor que 30%, a isovalerilespiramicina (l+ll+lll) não dever ser menos que
60%; o teor total dos 9 componentes da acil espiramicina não deve ser menor que 80%, a quantidade de espiramicina III não deve ser menor que
5,0%. A fórmula para cálculos é mostrada abaixo:
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Isovalerilespiramicina III (%) = ..............xWsxP /(AsxWt)x100%
Isovalerilespiramicina (l+ll+lll)= (AiS0vaierii i +AjSovaierii ii +Asovaierii iii) xWs xP/(AsxWT)x100%
Teor total da acil espiramicina (%)=(A acet» ιι +A Acetii ιιι +A propionii ii *A propionii III ~*~Aisobutiril III +A jsovaleril I ·*Ά isobutiril III *Ajsovaleril II +AiSOvaleryi II,) xWsxP/(AsxWT)x100%
Espiramicina III (%)=A espirai mxWsxP /(AsxWT)x100%
Componentes desconhecidos (%)=AwxWsxP /(AsxWt)x100% em que:
Ws - peso da amostra padrão, g;
As - área de pico de isovalerilespiramicina III na amostra padrão;
Wt - peso da amostra de teste, g;
Aw - área de pico total dos componentes desconhecidos na amostra de teste;
P - pureza da isovalerilespiramicina III na amostra de teste.
Exemplo 10 - Detecção por HPLC dos componentes de levocarrimicina
Extrair oito bateladas do caldo de fermentação da levocarrimicina fermentada pelo processo de extração de levocarrimicina proporcionado no Exemplo 4 e o método de detecção quantitativa por HPLC proporcionado no Exemplo 9, em que as condições de detecção de HPLC de cada componente obtido são mostradas na Tabela 1 e a o cromatograma líquido é conforme mostrado na Figura 5.
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Tabela 1 - Condição de detecção por HPLC de oito bateladas dos componentes de levocarrimicina
| Valor Médio | 34,96 | 23,80 | 3,16 | 3,61 | 1 | 0,99 | 1 | χΟΙ CO | 4,02 | CN | 2,94 | 61,91 | 82,94 |
| CO | 35,44 | 23,76 | 3,00 | o o | t | 1,20 | 1 | O IO co | 5,36 | 1,29 | 3,09 | 62,20 | 85,64 |
| 35,59 | 23,87 | 3,40 | O | 1 | 1,30 | 1 | O co | LO | 1,68 | 3,18 | 62,86 | 86,93 | |
| CO | 35,80 | 23,91 | 2,90 | 3,90 | 1 | 1,20 | 1 | O co | 5,40 | 1,36 | 1,89 | 62,61 | 84,76 |
| 35,71 | 20,02 | 3,46 | 3,50 | 1 | O | 1 | cxi co | 3,90 | 1,14 | co | 59,19 | 80,51 | |
| 32,19 | 24,85 | 3,18 | 3,50 | 1 | LO T T” | 1 | σ> T— oo | CXI co | 0,96 | 3,08 | 60,22 | CXI 00 o 00 | |
| CO | 34,80 | 24,36 | o | 3,54 | 1 | 1 | m cq | 3,07 | O X- | 3,05 | 63,23 | 81,61 | |
| CXI | 34,40 | 24,93 | 2,94 | 2,75 | 1 | 1,00 | 1 | o co | 2,65 | σ> v— V— | 2,92 | 62,27 | 00 o co |
| V- | 35,71 | 24,67 | 2,30 | 3,56 | 1 | 66‘0 | 1 | Vσ> | 2,91 | o tn T— | 2,84 | 62,68 | 82,39 |
| Teor em percentagem % | isv-lll | isv-ll | isv-l | bu-lll | ibu-lll | bu-ll | lbu-ll | Σ CL | 1 CL | ac-lll | ac-ll | Total isv | Acilação total |
A detecção acima é também conduzida para a levocarrimicina preparada em outros exemplos na presente invenção e o cromatograma líquido obtido é conforme mostrado na Figura 5.
Exemplo 11 - Determinação da rotação específica da levocarrimicina
Pesar, com acuidade, uma quantidade apropriada de levocarrimicina preparada nos exemplos da presente invenção, adicionar clorofórmio para dissolver e diluir em solução de 0,02 g/mL de clorofórmio, e determinar a rotação específica com a Lina D (589,3 nm) do espectro de nátrio com comprimento de determinação de 1 dm, temperatura de determinação de 25°C, polarímetro com leitura para 0,0001° depois da calibragem.
Tabela 2 - Resultado de investigação de rotação específica
Formatar tabela confor
| Exemplo N° | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| _ | -52° | -55,2° | -57° | -56° | -54° | -55,3° | 55,1° | 55,4° |
Exemplo 12 - Comprimidos de levocarrimicina (calculados em
10.000 comprimidos)
Formulação: Pó bruto de levocarrimicina proporcionado pelo Exemplo4 1.000 g
Hidróxi propil celulose com baixo teor de substituição (5%) 92,5 g
Carboximetil amida sódica (3%) 55,5 g
Estearato de magnésio (1%) 18,5 g
Amido peso total em peso de outros materiais adjuvantes brutos Peso total 1850 g
Processo de preparação: Pesar uma quantidade apropriada de amido, diluir este para uma concentração de 15%, aquecer até formar uma pasta, e transformar em adesivo; fazer o material principal de carrimicina, materiais adjuvantes de amido, hidróxi propil celulose de baixo teor de substituição, carboximetil amido sódico e estearato de magnésio passam através de uma peneira de 100 malhas, respectivamente, e pesar os materiais principais e adjuvantes necessários, de acordo com a formulação; depois misturar, uniformemente, a carrimicina, amido, hidróxi propil celulose de baixo teor de substituição, adicionar pasta de amido de 15% de concentração de amido para fazer um material macio, granulação com peneira de 14 malhas, secar a 50-60°C, controlar a umidade a 3-5%, corrigir o grânulos com peneira de 14 malhas, adicional carboximetil amido sódico, estearato de magnésio e misturar, então determinar o teor de grânulos; calcular o peso de cada comprimido de acordo com o teor de grânulos, comprimido (punch retuso Φ9 mm), detectar diferenças nos pesos dos comprimidos; embalar os comprimidos qualificados após inspeção.
Exemplo 13 - Cápsulas de Levocarrimicina (calculadas em 10.000 cápsulas) Formulação: Pó bruto de levocarrimicina do Exemplo 4 1.000 g
Amido (para fins farmacêuticos) 1080-peso de pó bruto de carrimicina Cápsulas farmacêuticas N° 3 1.000 cápsulas
Parafina líquida 50 ml
Processo de Preparação: Pesar, respectivamente, o material principal de carrimicina e o material adjuvante de amido farmacêutico de acordo com a formulação do processo, adicionar em um misturador para misturamento total por 1,5-2 horas, os dados obtidos do teor da amostra testada será basicamente de acordo com os dados teóricos (pese de cada cápsula é de cerca de 0,105 g), colocar, respectivamente, cápsulas N° 3 farmaceuticamente qualificadas e os materiais brutos bem misturados em uma máquina de preenchimento de acordo com as exigências operacionais das máquina de preenchimento de cápsulas automática, conduzir inspeção de diferença para as cápsulas preenchidas (dentro de ±10%, < 0,3 g), e a dissolução satisfará as exigências; colocar as cápsulas qualificadas em uma máquina de polimento e adicionar parafina líquida para conduzir o polimento por 15 a 20 minutos, e então retirar as cápsulas e inspecionar as caixas de empacotar o produto acabado.
Exemplo 14 - Comprimidos de levocarrimicina revestidos com açúcar (calculados em 10.000 comprimidos)
Fórmula: A mesma que a do Exemplo 12
Processo de preparação: Operar conforme o método no Exemplo 2, colocar os comprimidos com núcleo em um recipiente para revestimento com açúcar, colocar lentamente o xarope (concentração de 65 a 70%) no recipiente, e então elevar a temperatura para cerca de 40°C, adicionar uma quantidade apropriada de talco, e injetar ar para secagem durante 20 a 30 minutos; depois que os comprimidos receberem um sub-revestimento por repetição das etapas acima várias vezes, efetuar revestimento com açúcar por 15 a 20 minutos; depois os comprimidos recebem um revestimento de açúcar colocando a pasta corante preparada no xarope e misturando, e então verter este no recipiente e misturar por 15 a 20 minutos de cada vez para obter o comprimido revestido com açúcar.
Exemplo 15 - Xarope Seco de Levocarrimicina (calculado em 10.000 sacos)
Formulação: Pó bruto de levocarrimicina no Exemplo 4 1.250 g
Ácido cítrico (0,5%) (citrato) 15 g
Sacarose Peso por peso total de outros materiais adjuvantes
Peso total 500 g
Pigmento (curcumina) cerca de 1 g
Processo de preparação: Esmagar respectivamente o pó bruto de carrimicina, ácido cítrico, sacarose com um esmagador com fluxo de ar em alta velocidade para formar grânulos de tal modo que 85% dos quais possam passar através de uma peneira de 300 malhas, e 15% passem através de uma peneira de 180 malhas, pesar, respectivamente, uma quantidade apropriada do pó fino esmagado de acordo com a formulação e então misture-los adequadamente por 1 a 1,5 h; determinar seu conteúdo, calcular o volume de embalagem (teor de embalagem teórico é de 500 mg em cada saco), e então colocar a mistura em uma máquina de formaçãopreenchimento-vedação, e embalar esse em com papel de alumínio. Embalar o produto de acordo com as exigências operacionais da máquina de embalagem, com a diferença do teor de embalagem limitada em ±5%, inspecionar depois de embalar, e então efetuar a embalagem para o qualificado.
Exemplo 16 - Comprimidos revestidos entéricos de levocarrimicina (calculados em 10.000 comprimidos)
Formulação: Àquela do Exemplo 12
Processo de preparação: preparar os núcleos de comprimido de acordo com o Exemplo 12; colocar os núcleos dos comprimidos qualificados em um recipiente de revestimento de açúcar, usar xarope a 60-70% e pó de talco para revestir três camadas de revestimento base e então revestir a camada de isolamento, adicionar uma solução a 10% de álcool de zeína, secar por 10 a 15 minutos com método de rollover, e então gotejar ftalato de dietila, cetona, ftalato de acetato de celulose e solução de álcool, ou seja, a solução revestida entérica no recipiente e secar por 2 a 3 vezes e 10 a 15 minutos de uma vez com o método rollover, depois de efetuar a qualificação em exame, conduzir o revestimento com açúcar de acordo com o Exemplo 7.
Exemplo 17 - Comprimidos de Levocarrimicina com revestimento gástrico (calculados em 10.000 comprimidos)
Formulação: Àquela do Exemplo 12.
Processo de preparação: preparar os núcleos dos comprimidos de acordo com o Exemplo 12; colocar os núcleos dos comprimidos qualificador em uma máquina de revestimento de eficácia alta e então preparar o pó de revestimento qualificado (incluindo lipossolúvel e hidrossolúvel) em solução de revestimento de acordo com as exigências e então colocar a solução de revestimento no coloide para esmagar e filtrar para uso. Pré-aquecer o recipiente de eficácia alta preenchidos com os núcleos dos comprimidos, com velocidade de rotação controlada entre 5 e 10 rpm e temperatura de 45~60°C, pulverizar a solução de revestimento sobre o recipiente com pulverizado de aerossol (> 300 malhas) e secar por 25-35 minutos, conduzir o processo repetidamente por 8 a 12 minutos, até o revestimento ficar uniforme, e finalmente embalar os comprimidos qualificados depois da secagem.
Exemplo 18 - Grânulos de levocarrimicina (calculados em 10.000 sacos)
Formulação: Pó bruto de levocarrimicina do Exemplo 5 1.250 g
Pó açucarado 20.000 g
Dextrina 9.000 g
5% de PVP-K30 Quantidade apropriada
Processo de preparação: peneirar o pó bruto de carrimicina, açúcar em pó e dextrina com uma peneira de 120 malhas, pesar o pó bruto de carrimicina, o açúcar em pó e a dextrina de acordo com a formulação e misturá-los uniformemente; transformar o material uniforme acima misturado em um material macio com mucilagem de 5% de PVP-K30; preparar o material em grânulos com granulador oscilador, secar a 70°C, acertar os grânulos, e então empacotá-los depois de serem inspecionados para qualificação.
Exemplo 19 - Injeção de pó liofilizado de levocarrimicina
Pesar 500 mg de pó bruto de levocarrimicina preparado de acordo com o Exemplo 6, misturar este com ácido adípico de igual molaridade e então dissolver em 5 mL de água para obter uma solução transparente de cor amarela clara, com pH de 4,6 -5,6. Adicionar 40 mg de manitol como propante liofilizado, congelar rapidamente por 9 h, em temperatura baixa, e liofilizar para obter um grumo solto, amarelo claro. Dissolvê-lo com 10 mL de água estéril antes do uso.
Exemplo 20 - Injeção de pó liofilizado de levocarrimicina
Pesar 500 mg de pó bruto de levocarrimicina preparada de acordo com o Exemplo 4, misturá-lo com ácido cítrico de igual molaridade, e então dissolver em 5 mL de água para obter uma solução transparente amarela clara, com valor de pH de 4,6-5,6. Adicionar 40 mg de manitol como propante liofilizado, congelar rapidamente por 9H em temperatura baixa, e liofilizar para obter um grumo solto de cor amarela clara. Dissolver o mesmo com 10 mL de água estéril antes do uso.
Exemplo 21 - Injeção de pó liofilizado de levocarrimicina
Pesar 500 mg de pó bruto de levocarrimicina preparada de acordo com o Exemplo 5, misturá-lo com ácido maléico de igual molaridade, e então dissolver em 5 mL de água para obter uma solução transparente amarela clara, com valor de pH de 4,6-5,6. Adicionar 40 mg de manitol como propante liofilizado, congelar rapidamente por 9H em temperatura baixa, e liofilizar para obter um grumo solto de cor amarela clara. Dissolver o mesmo com 10 mL de água estéril antes do uso.
Exemplo 22 - Preparação de levocarrimicina em que a isovalerilespiramicina I é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I
Separar e purificar a levocarrimicina obtida no Exemplo 1.
Purificação da levoisovalerilespiramicina I: Purificar a amostra obtida na separação preliminar com HPLC preparativa, preparar a coluna cromatográfica com ODS, usar acetonitrila e solução tampão de acetato de amônio como a fase móvel em gradiente eluído; registrar o espectrograma de UV separado através de detecção de UV, e coletar os picos alvo dos componentes de levoisovalerilespiramicina I:
coluna cromatográfica: coluna cromatográfica preparativa ODS;
fase móvel: acetonitrila (A), solução de acetato de amônio 100mM (B);
condição de gradiente: adotar o gradiente linear para 0 ~ 60 minutos, A é 25% ~ 65%; e 61 ~ 90 minutos, A é 65% ~90%;
vazão: 260 mL/min;
volume de injeção: 10 mL;
concentração da amostragem: 0,5 g/mL; medição do comprimento de onda: 231 nm; meio de coleta: coleta via desencadeador de UV;
coletar a amostra de levoisovalerilespiramicina I de acordo com o tempo de retenção (TR) de 44,759 minutos de levoisovalerilespiramicina I, então eliminar a acetonitrila através de rotoevaporação, extrair com 1 vez uma quantidade de acetato de etila, e eliminar o acetato de etila no extrato através de rotoevaporação para obter uma amostra de pasta; re-dissolver a amostra de pasta com éter de petróleo através de rotoevaporação para obter o pó branco sólido de levoisovalerilespiramicina.
Depois disso, recristalizar o pó branco sólido de levoisovalerilespiramicina I para obter o composto de cristal. O método de recristalização é como abaixo:
(1) dissolver o composto sólido de levoisovalerilespiramicina I obtido de acordo com o Exemplo 1 no solvente misto de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de acetato de etila para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:10:1;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente, e o volume de água pura adicionado é 2,5 vezes o volume total de aceta- to de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 4 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 30 rpm;
(3) resfriar para 5°C em uma velocidade de 1°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 10 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I.
A difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, medida por raios X de Cu-Κα tem picos característicos de 20 de 7,6°, 8,0°, 10,0°, 11,4°, 16,4°, 17,0°, 17,5°, 17,9°, 19,5°, 22,7°, 23,7° e 15 24,4°, e o espectro de difração de pó de raios X é conforme mostrado na Figura 6.
Eliminar a acetonitrila na levocarrimicina residual depois de separar e purificar os componentes da levoisovalerilespiramicina I através de rotoevaporação, então extrair com 1 vez uma quantidade de acetato de etila, 20 e eliminar o acetato de etila no extrato através de rotoevaporação para obter uma amostra de pasta; re-dissolver a amostra de pasta com éter de petróleo, e eliminar o éter de petróleo através de rotoevaporação para obter a levocarrimicina; então misturar a levocarrimicina com o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, acima, para obter a levocarrimicina, em que a iso25 valerilespiramicina I é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I.
Exemplo 23 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina I é composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I
Além das etapas que são as mesmas que àquelas do Exemplo,
22, a diferença no método de recristalização é conforme abaixo:
(1) dissolver o composto sólido de levoisovalerilespiramicina I no solvente misto de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de acetato de etila para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:10:1;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente, e o volume de água pura adicionado é 9 vezes o volume total de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 10 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 60 rpm;
(3) resfriar para 5°C em uma velocidade de 3°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 10 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I.
A difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, medida por raios X de Cu-Κα é similar àquela da Figura 6.
Exemplo 24 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina I é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I
Outras etapas operacionais são as mesmas que aquelas do Exemplo 22. O que é diferente é a recristalização, conforme abaixo:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina I no solvente misto de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de acetato de etila para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:5:0,8;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente, e o volume de água pura adicionado é 7,5 vezes o volume total de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 6 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 40 rpm;
(3) resfriar para 10°C em uma velocidade de 2°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 15 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I.
Medido através de raios X de Cu-Κα, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I é similar ao da Figura 6.
Exemplo 25 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina I é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I
Outras etapas operacionais são as mesmas que aquelas do Exemplo 22. O que é diferente é a recristalização, conforme abaixo:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina I no solvente misto de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de acetato de etila para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:2:1;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente, e o volume de água pura adicionado é 7,5 vezes o volume total de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 8 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 45 rpm;
(3) resfriar para 12°C em uma velocidade de 2,5°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 20 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I.
Medido através de raios X de Cu-Κα, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I é similar ao da Figura 6.
Exemplo 26 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina I é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I
Outras etapas operacionais são as mesmas que aquelas do Exemplo 22. O que é diferente é a recristalização, conforme abaixo:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina I no solvente misto de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de acetato de etila para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:5:0,8;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente, e o volume de água pura adicionado é 5 vezes o volume total de acetato de etila, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 7 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 60 revoluções/minuto;
(3) resfriar para 12°C em uma velocidade de 1,2°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 15 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I.
Medido através de raios X de Cu-Koc, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I é similar ao da Figura 6.
Exemplo 27 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina II é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina
Purificar a levocarrimicina obtida no Exemplo 2. As etapas operacionais detalhadas são as mesmas que as do Exemplo 22. O que é diferente é que a amostra de levoisovalerilespiramicina II é coletada de acordo com o tempo de retenção (TR) de 43,34 de levoisovalerilespiramicina II.
Subsequentemente, recristalizar a levoisovalerilespiramicina de pó branco sólido para obter o composto de cristal. O método de recristalização é como a seguir:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina II obtido de acordo com o Exemplo 2 no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:10:1;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente, e o volume de água pura adicionado é 2,5 vezes o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 4 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 30 rpm;
(3) resfriar para 5°C em uma velocidade de 1°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 10 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II.
A difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II, medida por raios X de Cu-Κα tem picos característicos de
2Θ de 10,0°, 11,6°, 16,4°, 17,3°, 19,1°, 21,2°, 22,1°, 22,7°, 26,4°, 26,9°, 27,5°, e 31,5°, e o espectro de difração de pó de raios X é conforme mostrado na
Figura 7.
Eliminar a acetonitrila da levocarrimicina residual que é purificada e separada das composições de levoisovalerilespiramicina III através de rotoevaporação, então extrair com 1 vez de acetato de etila, e eliminar o acetato de etila do extrato através de rotoevaporação para obter uma amostra de pasta; re-dissolver as amostras de pasta em éter de petróleo, e eliminar o éter de petróleo através de rotoevaporação para obter a levocarrimicina; então misturar a levocarrimicina com o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II, acima, para obter a levocarrimicina, na qual a isovalerilespiramicina II é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina II.
Exemplo 28 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina II é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina II
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo 27. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina II no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:10:0,8;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente. O volume de água pura adicionado é 9 vezes o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 10 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 60 rpm;
(3) resfriar para 15°C em uma velocidade de 3°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 10 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II.
Medido através de raios X de Cu-Κα, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II é similar ao da Figura 7.
Exemplo 29 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina II é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina II
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo
27. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina II no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:5:1;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente. O volume de água pura adicionado é 7,5 vezes o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 6 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 40 rpm;
(3) resfriar para 10°C em uma velocidade de 2°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 15 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II.
Medido através de raios X de Cu-Κα, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II é similar ao da Figura 7.
Exemplo 30 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina II é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina II
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo 27. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina II no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:3:1;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente. O volume de água pura adicionado é 7,5 vezes o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 8 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 45 rpm;
(3) resfriar para 12°C em uma velocidade de 2,5°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 20 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II.
Medido através de raios X de Cu-Κα, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II é similar ao da Figura 7.
Exemplo 31 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina II é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina II
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo 27. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina II no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:6:0,8;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente. O volume de água pura adicionado é 5 vezes o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 7 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 60 rpm;
(3) resfriar para 12°C em uma velocidade de 1,2°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 15 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II.
Medido através de raios X de Cu-Κα, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II é similar ao da Figura 7.
Exemplo 32 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina III é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina III
Purificar a levocarrimicina preparada no Exemplo 3. As etapas operacionais detalhadas são as mesmas que as do Exemplo 22. Coletar as amostras de levoisovalerilespiramicina III de acordo com o tempo de retenção 48,009 minutos de levoisovalerilespiramicina III.
Depois disso, recristalizar o pé branco sólido de levoisovalerilespiramicina III para obter o composto de cristal. O método de recristalização é como abaixo:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina III feito no Exemplo 3 no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:10:1;
(2) então adicionar água pura e agitar a mistura simultaneamente, e o volume de água pura adicionado é 2,5 vezes o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 4 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 30 rpm;
(3) resfriar para 5°C em uma velocidade de 1°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 10 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III.
A difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III medida por raios X de Cu-Κα tem picos características de 8,0°, 10,0°, 11,2°, 11,7°, 16,4o, 19,1o, 19,6°, 20,0°, 21,4°, 22,9o, 23,6°, e 29,4°, e o espectro de difração de pó de raios C é conforme mostrado na Figura 8. Evaporar a acetonitrila da levocarrimicina purificada e separadas das composições de levoisovalerilespiramicina III através de rotoevaporação, então extrair a levocarrimicina com 1 vez de acetato de etila, e evaporar o acetato de etila através de rotoevaporação para obter as amostras de pasta; re-dissolver as amostras de pasta em éter de petróleo, e então evaporar o éter de petróleo através de rotoevaporação para obter a levocarrimicina; então misturar a levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina III é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina III.
Exemplo 33 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina III é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina III
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo
32. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina III no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:10:1;
(2) então adicionar água pura com agitação. O volume de água pura adicionado é 9 vezes o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a velocidade de adição de água é de 10 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de 60 rpm;
(3) resfriar para 15°C em uma velocidade de 3°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação em uma velocidade de 10 rpm durante o resfriamento, para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III.
Medido através de raios X de Cu-Κα, o espectro de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III é similar ao da Figura 8.
Exemplo 34 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina III é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina III
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo 32. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver, inicialmente, o composto sólido de levoisovalerilespiramicina III no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:5:0,8;
(2) adicionar água pura com agitação, e o volume de água pura adicionado é 7,5 vezes tanto quanto o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a água pura será adicionada na taxa de 6 mL/minuto; e a taxa de agitação quando da adição da água pura é de rpm;
(3) resfriar para 10°C em uma taxa de 2°C/h depois da adição de água pura, continuar com a agitação, durante o resfriamento, na taxa de 15 rpm durante o resfriamento, sendo daí obtido o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III.
Os padrões de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III medidos por raios X de Cu-Κα são similares aos da Figura 8.
Exemplo 35 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina III é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina III
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo 32. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver o composto em estado sólido de levoisovalerilespiramicina III no solvente misto composto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:2:1;
(2) então adicionar água pura com agitação, e o volume de água pura adicionado é 7,5 vezes tanto quanto o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a água pura será adicionada na taxa de 8 mL/minuto; e a taxa de agitação para adição da água pura é de 45 rpm;
(3) resfriar para 12°C em uma taxa de 2,5°C/h depois da adição de água pura, com agitação na taxa de 20 rpm para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III.
Os padrões de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III medidos por raios X de Cu-Κα são similares aos da Figura 8.
Exemplo 36 - Preparação da levocarrimicina na qual a isovalerilespiramicina III é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina III
Outras etapas operacionais são as mesmas que as do Exemplo
32. O que é diferente é a recristalização, como a seguir:
(1) dissolver o composto em estado sólido de levoisovalerilespiramicina III no solvente misto composto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, com a razão em volume de metanol absoluto para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto sendo de 1:2:1;
(2) então adicionar água pura com agitação, e o volume de água pura adicionado é 7,5 vezes tanto quanto o volume total de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra; a água pura será adicionada na taxa de 8 mL/minuto; e a taxa de agitação para adição da água pura é de 45 rpm;
(3) resfriar para 12°C em uma taxa de 2,5°C/h depois da adição de água pura, com agitação na taxa de 20 rpm para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III.
Os padrões de difração de pó de raios X do composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III medidos por raios X de Cu-Κα são similares aos da Figura 8.
Exemplo 37 - Comprimido de levocarrimicina contendo o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I
A formulação e o método de preparação são os mesmos do Exemplo 12. A diferença é que o pó de levocarrimicina é o pó de levocarrimicina obtido no Exemplo 22, no qual a isovalerilespiramicina I é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I.
Exemplo 38 - Comprimido de levocarrimicina contendo o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II
A formulação e o método de preparação são os mesmos do Exemplo 12. A diferença é que o pó de levocarrimicina é o pó de levocarrimicina obtido no Exemplo 27, no qual a isovalerilespiramicina I lé o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II.
Exemplo 39 - Comprimido de levocarrimicina contendo o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III
A formulação e o método de preparação são os mesmos do Exemplo 12. A diferença é que o pó de levocarrimicina é o pó de levocarrimicina obtido no Exemplo 32, no qual a isovalerilespiramicina III é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III.
Exemplo 40 - Cápsula de levocarrimicina contendo o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I
A formulação e o método de preparação são os mesmos do Exemplo 13. A diferença é que ο ρό de levocarrimicina é o pó de levocarrimicina obtido no Exemplo 23, no qual a isovalerilespiramicina I é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I.
Exemplo 41 - Cápsula de levocarrimicina contendo o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II
A formulação e o método de preparação são os mesmos do Exemplo 13. A diferença é que o pó de levocarrimicina é o pó de levocarrimicina obtido no Exemplo 28, no qual a isovalerilespiramicina II é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II.
Exemplo 42 - Cápsula de levocarrimicina contendo o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III
A formulação e o método de preparação são os mesmos do Exemplo 13. A diferença é que o pó de levocarrimicina é o pó de levocarrimicina obtido no Exemplo 33, no qual a isovalerilespiramicina I é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III.
Adjuvante e métodos de preparação usados para outras preparações de levocarrimicina, onde a isovalerilespiramicina I, II ou III é o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I, II ou III, são os mesmos que acima.
Exemplo de teste 1 - Farmacodinâmica in vivo
Método de teste: preparação líquida de bactérias infecciosas: colocar as bactérias líquidas armazenadas no refrigerados a -80°C na sala por cerca de 1 hora, à temperatura ambiente, e, respectivamente, retirar 0,1 mL de bactérias líquidas de Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes e enterococos em 2 mL de caldo MH (adicionar soro de cavalo inativado a 10%), inocular o 2 mL de caldo MH com o,1 mL de bactérias líquidas de Staphylococcus aureus de acordo com o método acima, colocar o líquido em uma incubadora a 37°C, por 18 horas, para obter o líquido de bactérias original, diluir o líquido de bactérias original com mucina gástrica a 5%, tirar uma quantidade de 100% das bactérias letais se o animar se infectar com as bactérias líquidas infecciosas.
A administração oral é planejada para medicação clínica de levocarrimicina, assim administração gástrica é selecionada para teste de levocarrimicina. Após injeção intraperitoneal de 0,5 mL de quantidade de bactérias letais na cavidade abdominal dos camundongos, os camundongos apareceram com os seguintes sintomas, por exemplo, atividade reduzida, 10 tranquilidade, o cabelo ficou frouxo, e assim por diante. Clister com 0,2 mL de cada camundongo depois 0,5-6 h de infecção, não mostrou reação adversa. Observar a fatalidade entre os animais dentro de sete dias e calcular a meai dose protetora (ED5o) dos fármacos para camundongos infectados e comparar o efeito protetor dos fármacos através da ordem de Bliss.
Os resultados dos testes in vivo são calculados conforme mostrados nas Tabelas 3 e 4.
47/58
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| Fármacos | Carrimicina Isovaleril 1 é um composto de cristal Isovaleril II é um composto de cristal Isovaleril III é um composto de cristal Azitromicina Acetil espiramicina Eritrocina |
| Dose de desafio (CFU/0,5 mL/camundongo) | Έο v~ US' |
| Organismo de teste | Enterococos 32 |
51/58
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| Dose de desafio (CFU/0,5 mL/camundongo) | co O X CM io' | Έ) TX CO io' |
| Organismo de teste | Staphylococcus aureus i6 | Staphylococcus aureus 76 |
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| Dose de desafio (CFU/0,5 mL/camundongo) | Td X CO | Td T“ X CN_ |
| Organismo de teste | Staphylococcus aureus 12 | Staphylococcus aureus 21 |
53/58
Os resultados de teste in vivo indicaram que: o efeito curativo da levocarrimicina em camundongos infectados com 12 cepas de bactérias conforme mostrados nas Tabelas 3 e 4; os resultados mostram que tem bom efeito protetor; e a levocarrimicina na qual as isovalerilespiramicina I, II ou II é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III mostra melhor efeito protetor.
O mesmo teste é também conduzido sobre a levocarrimicina ou preparações de levocarrimicina preparadas em outros exemplos da presente invenção e os resultados são similares.
Exemplo de teste 2 - Farmacodinâmica in vitro
Determinação de isolados clínicos:
Método de teste: adotar métodos de duas vezes de diluição em placa: verter o meio de cultura de ágar fundido quantitativo na placa que contém concentração de fármacos em séries para misturar com o líquido (adicionar 5% de sangue de cabra isento de fibras em estreptococos e enterococos para obter o meio basal de sangue e adicionar 7% de sangue de cabra isento de fibra em meio de bacilos de influenza e gonococos para obter o meio basal de chocolate), diluir o bactérias cultivadas frescas em 106 CFU/mL depois da solidificação, inocular o ágar na cubeta da levocarrimicina obtidas do Exemplo $ e controlar o grupo azitromicina, acetil espiramicina e eritrocina através do dispositivo inoculador multiponto, cultivar esses a 37°C, por 18 horas; colocar o gonococos em uma incubadora de 5% de CO2 por 24 horas; colocar Legionella em uma incubadora de 5% de CO2 por 48 horas; colocar anaeróbicos em uma caixa anaeróbica de 37°CO2, por 24 horas. Observar que a concentração mínima de fármaco antibacteriano que inibe 0 crescimento de bactéria é a concentração inibitória mínima (MIC) e calcular as MIC50 e MIC90 dos fármacos a serem comparadas com os fármacos de controle.
Notas:
MIC50 inibe 50% de concentração inibitória para o crescimento de bactérias;
MIC90 inibe 90% de concentração inibitória para o crescimento
54/58 de bactérias.
Os resultados de teste são conforme mostrados na tabela a seguir:
| Tabela 5 Distribuição sensitiva de isolados | por carrimicina | |||
| Cepa e número da cepa | Fármacos | Faixa da MIC (pg/mL) | mic50 (pg/mL) | MIC90 (pg/mL) |
| Carrimicina | 0,005->64 | 0,12 | 4 | |
| Streptococcus | Azitromicina | 0,005->64 | 0,25 | 8 |
| pneumonia | Acetil espirami- | 0,005->64 | 0,12 | >64 |
| (112) | cina Eritrocina | 0,005->64 | 0,25 | 64 |
| Carrimicina | 0,06->64 | 0,25 | 64 | |
| Streptococcus | Azitromicina | 0,25->64 | 0,5 | >64 |
| pyogenes | Acetil espirami- | 0,005->64 | 0,25 | >64 |
| (93) | cina Eritrocina | 0,06->64 | 0,5 | >64 |
| Carrimicina | 0,5->64 | 2 | 64 | |
| Enterococos (106) | Azitromicina | 0,25->64 | 8 | >64 |
| Acetil espiramicina | 0,12->64 0,5->64 | 4 4 | >64 >64 | |
| Eritrocina | ||||
| Carrimicina | 0,06->64 | 2 | 64 | |
| Staphylococcus | Azitromicina | 0,5->64 | 2 | >64 |
| aureus | Acetil espirami- | 0,12->64 | 64 | >64 |
| (155) | cina Eritrocina | 0,12->64 | 1 | >64 |
| Carrimicina | 0,12->64 | 2 | >64 | |
| Staphylococcus | Azitromicina | 0,12->64 | 8 | >64 |
| epidermidis | Acetil espirami- | 0,03->64 | 64 | >64 |
| (115) | cina Eritrocina | 0,06->64 | 8 | >64 |
| Carrimicina | 0,03-32 | 0,12 | 1 | |
| Bacilos da influ- | Azitromicina | 0,03->64 | 0,25 | 2 |
| enzae | Acetil espiramicina | 0,03->64 | 0,12 | 4 |
| (ÓÍ) | 0,03->64 | 0,06 | 32 | |
| Eritrocina | ||||
| Carrimicina | 0,12-16 | 2 | 8 | |
| Gonococoss | Azitromicina | 0,12-64 | 2 | 8 |
| (10) | Acetil espiramicina | 0,12-64 | 4 | 8 |
| 0,12-64 | 1 | 8 | ||
| Eritrocina |
55/58
O mesmo teste foi também conduzido com a levocarrimicina ou com as preparações de levocarrimicina preparadas em outros exemplos da presente invenção e os resultados são similares.
Exemplo de teste 3 - Determinação, in vitro, de anti-Chlamydia trachomatis e Chlamydia pneumoniae
Métodos de teste:
1. Cultivar HEp-2 e linhagem de células McCoy em uma placa de cultura de células de 96 poços (Costar Company) respectivamente, 37°C e 5% de CO2, por 48 horas para fazer as células de monocamadas.
2. Diluir as bactérias para 10.000-20.000 ufi (unidades formadoras de inclusão)/mL, adotar 0,1 mL/inoculação dos poços. Inocular a placa de cultura de células de McCoy com sorotipo de Chlamydia trachomatis B/TW-5/OT e D/UW-3/Cx e inocular a placa de cultura de células HEp-2 com Chlamydia pneumoniae CWL-029. Primeiramente, sugar o líquido de cultura de células na placa de cultura de 96 poços, e então inoculara placa por 0,1 mL/poço. Dentre esses, não inocular 4 poços de A11-D11 e 2 poços de C12 e D12 com bactérias.
3. Depois da inoculação, centrifugar a placa de cultura de células de 96 poços com uma máquina de centrifugação de Beckman-Coulter Company, força centrífuga x 1.500 g, temperatura na centrifugação 35°C e tempo de centrifugação de 60 minutos.
4. Depois da centrifugação, sugar a Chlamydia trachomatis ou Chlamydia pneumoniae, inoculada, e adicionar 4 fármacos de antibióticos aí, respectivamente a levocarrimicina preparada no Exemplo 4 da presente invenção; a acetilespiramicina, eritrocina e azitromicina para controle, 0,1 ml/poço.
5. Cultivar na placa de teste sensitivo o fármaco de Chlamydia trachomatis, a 37°C e 5% de CO2 por 48 horas e o fármaco de Chlamydia pneumoniae na placa de teste sensitivo, por 72 horas. Depois da cultura, sugar a solução de fármaco de antibiótico e lavar o mesmo duas vezes com PBS (0,01 M, pH 7,4), e colocá-lo em 100% de metanol, à temperatura ambiente, por 15 minutos.
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6. Identificação de coloração imunofluorescente indireto: adicionar anticorpo clone N54) resistente à Chlamydia trachomatis purificada e anticorpo monoclonal (clone P33) resistente à Chlamydia pneumoniae, na placa de teste sensitivo de fármaco de Chlamydia trachomatis e Chlamydia pneumoniae, respectivamente, e incubar em 50 pL/poço e caixa úmida a 37°C, por 30 minutos. Lavar a placa, 4 vezes, com um lavador de placa, e então adicionar em anticorpo fluorescente anti-rato, anti-coelho (Sigma Company), 50 pL/poço. Incubar e lavar a placa usando-se o mesmo método e sob as mesmas condições. Adicionar glicerol, 100 pL/poço, e observar os resultados em microscópio de fluorescência invertida da Nikon (Daiphot200).
7. Definição da MIC: Esta se refere à concentração mínima diluída do antibiótico sobre a qual se faz o crescimento de corpos de incursão de Chlamydia trachomatis ou Chlamydia pneumoniae em placas de teste de 96 poços completamente suprimidos (nenhuma incursão de coloração de fluorescência é encontrada nos poços).
Os resultados de teste são como a seguir:
Tabela 6 - Inibição in vitro da Concentração Inibitória mínima (MIC) de quatro antibióticos macrolídeos contra Chlamydia trachomatis e Chlamydia pneumoniae
| Carrimicina pg/mL | Acetil espiramicina (AT-SPM) pg/mL | Eritrocina (EM) pg/mL | Azitromicina (AM) pg/ml | |
| Chlamydia trachomatis B/TW-5/OT | 0,25 | 4 | 0,5 | 0,5 |
| Chlamydia trachomatis D/UW-3/Cx | 0,25 | 2 | 0,5 | 0,25 |
| Chlamydia pneumoniae CWL-029 | 0,016 | 0,5 | <0,016 | 0,032 |
1. Para o sorotipo de Chlamydia trachomatis B/TW-5/OT, a MIC de carrimicina é de 0,25 pg/mL, a eritrocina e azitromicina vêm (0,5 pg/mL) vêm em segundo, e acetil espiramicina (MIC é de 4 pg/mL) vem por último.
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2. Para o sorotipo de Chlamydia trachomatis D/UW-3/Cx, o efeito in vitro da carrimicina e azitromicina é o mesmo, a MIC é de 0,25 pg/mL, sendo sensitivo; a eritrocina (0,5 pg/mL) vem em segundo e a acetil espiramicina (MIC é de 2 pg/mL) vem por último.
3. Para a Chlamydia pneumoniae CWL-029, o efeito in vitro da carrimicina e eritrocina é o mais sensível, MIC <0,01 pg/mL, azitromicina (MIC é 0,032 pg/mL) é mais sensível; acetil espiramicina (MIC é 0,5 pg/mL) é fraco.
4. Em geral, o efeito da levocarrimicina da presente invenção contra clamídia é melhor que os de outros fármacos experimentais.
O mesmo teste é também conduzido na levocarrimicina ou nas preparações de levocarrimicina preparadas em outros exemplos da presente invenção, e os resultados são similares.
Exemplo de Teste 4-0 plasma anti-ureia in vitro de Urealyticum e Chlamydia pneumoniae
1. Método de teste: adicionar U-PPLO 0,8mL em uma placa de cultura de 12 poços estéril (adicionar 0,9 mL em poço de controle de líquido de bactérias e 1,0 mL de poções de controle de meio de cultra).
2. Adicionar 104 CCU/mL de Uu de líquido de bactérias em cada poço experimental e a quantidade final de bactérias nos poços é de 10 CCU/mL (não adicionar líquido de bactérias no poço de controle de meio de cultura).
3. Dividir em 3 grupos (100 pg/mL, 10 pg/mL e 1 pg/mL de solução de estoque de antibiótico). Adicionar antibióticos experimentais (levocarrimicina no Exemplo 6 da presente invenção, acetil espiramicina, eritrocina e azitromicina) em cada um dos poços experimentais com Tip estéril de acordo com gradiente de concentração de degradação dupla: 100 pL, 50 pL, 25 pL e 12,5 pL. (Não adicionar antibióticos no poço de controle de líquido e bactéria e no poço de controle de meio de bactéria. Nesse ínterim, o poço de controle de antibiótico é preparado).
4. Misturar os poços acima de modo uniforme, vedar a placa de cultura com fita adesiva e então cultivar em uma incubadora a 37°C.
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5. Observar e registrar o crescimento de Uu na 17 a 24 horas depois do teste. Quando o poço de controle de líquido de bactérias UU mostrar crescimento positivo, a concentração antibiótica mínima que pode inibir o crescimento de Uu é a MIC da amostra. A MIC depois do teste é a MIC final (24 horas).
Determinar a MIC das cepas de urealticum de plasma anti-ureia por 4 vezes e os resultados são como a seguir:
Carrimicina.......0,025 - 0,125 pg/mL,
Acetil espiramicina 0,5 pg/mL,
Eritrocina 5 pg/mL,
Azitromicina 0025 -0,125 pg/mL.
Os resultados acima mostram que a carrimicina tem boa função anti-Uu, que é similar à função da azitromicina e melhor que aquela da acetil espiramicina. A função anti-Uu da eritrocina neste teste é a pior.
O mesmo teste é também conduzido para a levocarrimicina e nas preparações de levocarrimicina preparadas em outros exemplos da presente invenção e os resultados são similares.
Claims (15)
1. Levocarrimicina, em que a dita levocarrimicina é uma mistura de isovalerilespiramicina III, II e I, como componentes principais e contém algumas de isobutirilespiramicina III e II, butirilespiramicina III e II, propionilespiramicina III e II, bem como acetilespiramicina III e II, dentre as quais o teor da isovalerilespiramicina III não é menor que 30% em peso, o teor total de isovalerilespiramicina III, II e I não é menor que 60% em peso, e o teor de acilespiramicina é de 80 a 98% em peso, preferivelmente 85 ~ 98% em peso, ainda preferivelmente 90 ~98% em peso, e, mais preferivelmente, 95 ~98% em peso; em que a rotação óptica da dita levocarrimicina é [a]o = -52° ~ -57° na solução de 0,02 g/mL de clorofórmio à temperatura de 25°C, preferivelmente, -54° ~-56°, e ainda preferivelmente -55°.
2. Levocarrimicina, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita levocarrimicina contém também espiramicina II e outros componentes, entre eles o teor de espiramicina III é não mais que 1,0%, e o teor total de outros componentes é 2,0 ~19% em peso, preferivelmente 2,0 ~14,0% em peso, ainda preferivelmente 2,0~9,0% em peso, e mais preferivelmente 2,0 ~4,0 % em peso.
3. Levocarrimicina, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito ponto de fusão da dita levocarrimicina é 112 ~ 122°C, preferivelmente 114 ~120°C, e ainda preferivelmente 116 ~118°C.
4. Levocarrimicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a dita isovalerilespiramicina III é um composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III, a isovalerilespiramicina II é um composto de cristal com levoisovalerilespiramicina II, ou a isovalerilespiramicina I é um composto de cristal com levoisovalerilespiramicina I, ou a isovalerilespiramicina I é um composto de cristal com levoisovalerilespiramicina I;
quando a isovalerilespiramicina III é um composto de cristal com
III de levoisovalerilespiramicina, o dito composto de cristal medido por difração de pó de raios X com raio de Cu-Ka tem picos característicos de 2Θ em
8,0°, 10,0°, 11,2°, 11,7°, 16,4°, 19,1°, 19,6°, 20,0°, 21,4°, 22,9°, 23,6° e 29,4°;
quando a isovalerilespiramicina II é um composto de cristal com II de levoi2/6 sovalerilespiramicina, o dito composto de cristal medido pela difração de pó de raios X com raio de Cu-Ka tem picos característicos de 2Θ em 10,0°, 11,6o, 16,4°, 17,3°, 19,1°, 21,2°, 22,1°, 22,7°, 26,4°, 26,9°, 27,5° e 31,5°; em que a isovalerilespiramicina I é um composto de cristal com I de levoisovalerilespiramicina, o dito composto de cristal medido pela difração de pó de raios C com raio de Cu-Ka tem picos característicos de 2Θ em 7,6°, 8,0°, 10,0°, 11,4°, 16,4°, 17,0°, 17,5°, 17,9°, 19,5°, 22,7°, 23,7° e 24,4°.
5. Composição farmacêutica de levocarrimicina, em que a dita composição farmacêutica de levocarrimicina contém a levocarrimicina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Composição farmacêutica de levocarrimicina, como definida na reivindicação 5, em que o teor da dita levocarrimicina é de 10 - 90% em peso da composição farmacêutica, preferivelmente, 25 -75% em peso, e ainda preferivelmente, 40 -60% em peso.
7. Método de preparação da levocarrimicina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que inclui processo de cultura, fermentação e extração, em que a dita cultura e a fermentação é: cultura das cepas fúngicas WSP-195 produzidas por espiramicina contendo o gene de 4”-isovaleril transferase em um meio de cultura slant, inoculá-lo em meio de sementes, então inocular o mesmo no meio de fermentação depois cultivar, e controlar processo de fermentação pelo regulador de pH; controlar o pH a 6,0 -9,0, preferivelmente, 6,0 -8,0, e ainda preferivelmente 6,0 -7,5; as curvas de variação de pH com o tempo mostram três fases contínuas, a primeira fase satisfaz a fórmula yi=k-iXi+6,0, em que 0,0227<ki^0,1364, 0<Xi^22; a segunda fase satisfaz ya=k2X2+ b2, em que -0,0735^k2<0, 6,5 <b3^10,62, 22^X2^56; e a terceira fase satisfaz a fórmula y3=k3x3+ ba, em que 0 <k3<0,0078, 6,06<b3 < 6,5, 56<x3<120.
8. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 7, em que o método de extração é: processar o licor de fermentação com sulfato de alumínio para obter o filtrado, ajustar o pH para 8,5 -9,0, extrair com acetato de butila, lavar o extrato de acetato de burila com água não salina e
3/6
NaH2PO4 a 1%, respectivamente, então extrair com água de pH 2,0 ~2,5 para obter extrato aquoso, ajustar o pH para 4,5 -5,5, volatilizar e eliminar o acetato de butila residual para obter o extrato, filtrar e ajustar o pH para 8,5
-9,0, obter o precipitado com água purificada e secar este para obter levocarrimicina.
9. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 7, em que a cultura no meio de cultura slant dura de 8 -15 dias, à temperatura de 28 ~38°C; a cultura no meio de semente dura de 40 -80 horas, à temperatura de 25 ~30°C; e a fermentação no meio de fermentação dura de 72 -120 horas, à temperatura de 26 ~30°C.
10. Método de preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o dito método de preparação compreende também as seguintes etapas:
a) separar e purificar a levocarrimicina para obter levoisovalerilespiramicina I, II ou III;
b) recristalizar a levoisovalerilespiramicina I, II ou III para obter o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III;
c) eliminar a acetonitrila na levocarrimicina residual depois de separar e purificar a levoisovalerilespiramicina I, II ou III na etapa a) através de rotoevaporação, então extrair com 1 vez a quantidade de acetato de etila, e eliminar o acetato de etila no extrato através de rotoevaporação para obter uma amostra de pasta; re-dissolver a amostra obtida com éter de petróleo, e eliminar o éter de petróleo através da rotoevaporação para obter a levocarrimicina;
d) misturar o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III obtido na etapa b) com a levocarrimicina obtida na etapa c) para obter a levocarrimicina, dentre as quais, a isovalerilespiramicina I, II ou III é o composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, II ou III.
11. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 10, em que as ditas separação e purificação na etapa a) compreendem:
purificar a levocarrimicina obtida na separação preliminar com cromatografia líquida preparativa de alta performance, preparar a coluna
4/6 cromatográfica com ODS, usar uma solução tampão de acetonitrila e sulfato de amônio como a fase móvel em eluição de gradiente; registrar o espectrograma de UV separado através de detecção de UV, e coletar os picos alvo dos componentes de levoisovalerilespiramicina I, II ou III:
coluna cromatográfica: coluna cromatográfica preparativa ODS;
fase móvel: acetonitrila (A), solução de acetato de amônio 100mM (B);
condição de gradiente: adotar o gradiente linear para 0 ~60 minutos, A é 25% -65%; e 61 -90 minutos, A é 65% -90%;
vazão: 260 mL/min;
volume de injeção: 10 mL;
concentração da amostragem: 0,5 g/mL; medição do comprimento de onda: 231 nm; meio de coleta: coleta via desencadeador de UV;
coletar a amostra de levoisovalerilespiramicina I de acordo com o tempo de retenção de 44,759 minutos de levoisovalerilespiramicina I; ou coletar a amostra de isovalerilespiramicina II de acordo com o tempo de retenção de 43,34 minutos de isovalerilespiramicina II; ou coletar a amostra de isovalerilespiramicina II de acordo com o tempo de retenção de 43,34 minutos de isovalerilespiramicina II; ou coletar a amostra de levoisovalerilespiramicina III de acordo com o tempo de retenção de 48,009 de levoisovalerilespiramicina III; então eliminar a acetonitrila através de rotoevaporação, extrair com 1 quantidade de tempo de acetato de etila, e eliminar o acetato de etila no extrato através da rotoevaporação para obter a amostra de pasta; redissolver a amostra obtida com éter de petróleo, e eliminar o éter de petróleo através de rotoevaporação para obter o pó sólido branco de levoisovalerilespiramicina I, II ou III.
12. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 11, em que quando a isovalerilespiramicina I é um composto de cristal de levoisovalerilespiramicina I, o composto de cristal é obtido através do seguinte processo de recristalização: dissolver o pó sólido branco de levoisovaleriles5/6 piramicina I no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, e então adicionar água pura com agitação, depois do que, reduzir a temperatura de 5°C ~15°C com agitação contínua, para obter o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina I, dentro os quais a razão em volume do metanol absoluto para o álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto é 1:0,1 -10:0,5 - preferivelmente, 1:2 -8:0,8 -1;
quando a isovalerilespiramicina II é um composto de cristal de levoisovalerilespiramicina II, o composto de cristal é obtido através do seguinte processo de recristalização: dissolver o pó sólido branco de levoisovalerilespiramicina II no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, então adicionar água pura com agitação, depois do que, reduzir a temperatura para 5°C - 15°C com agitação contínua, para obter o composto de cristal da levoisovalerilespiramicina II, dentre os quais a razão em volume de metanol para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto é de 1:01 -10:0,5 -1, preferivelmente, 1:2 -8:0,8 - 1;
quando a isovalerilespiramicina III é um composto de cristal de levoisovalerilespiramicina III, o composto de cristal é obtido através do seguinte processo de recristalização: dissolver o pó sólido branco de levoisovalerilespiramicina III no solvente misto de metanol absoluto, álcool etílico absoluto e acetona anidra, então adicionar água pura com agitação, depois do que, reduzir a temperatura para 5°C ~15°C com agitação contínua, para obter o composto de cristal do levoisovalerilespiramicina III, dentro os quais a razão em volume de metanol para álcool etílico absoluto para acetona anidra no solvente misto é de 1:0,1 -10:0,5 - 1, preferivelmente, 1:2 -8:0,8 -1.
13. Aplicação da dita levocarrimicina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou a dita composição farmacêutica de levocarrimicina como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 8 para fabricar um medicamento para o tratamento e prevenção de doenças infecciosas.
14. Aplicação, de acordo com a reivindicação 13, em que as ditas doenças infecciosas são as doenças causadas por infecção com bactéria Gram-positiva, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, C-
6/6 hlamydia trachomatis, estreptococos piogênico, Micrococcus catarrhalis, gonocos, bacilos influenza, Legionella ou anaeróbica.
15. Aplicação da dita levocarrimicina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou a dita composição farmacêutica de levocarrimicina como definida em qualquer uma das reivindicações 5-8, na fabricação de um medicamento antibacteriano, em que as dita bactérias incluem Streptococcus pneumoniae, estreptococos do Grupo A, estreptococos piogênico, enterococos, Staphylococcus aureus, S. epidermids, Catarrhal coccus, gonococos, bacilos da influenza, Escherichia coli, Escherichia coli enterotoxigênica, Escherichia coli enteropatogênica, Escherichia coli enteroinvasiva, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, bacilo Proteus vulgaris, bacilo tifoide, acinetobactéria, citrobactéria, Serratia marcescens, S.Sonnei, Sh.flexneri, Tritirachium album; legionella como Legionella pneumophila, Legionella gormanii, Legionella bozemanii, Legionella dumoffii, Legionella jordanis, e Legionella micdadei; anaeróbicas como Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Bacteroides bacteroides, Bacteroides prevotella, Prevotella asaccharolyticus, Prevotella oralis, Fusobacteriumnu cleatum, Fusobacterium russll, bifidobacteria, lactobacilos, peptoestreptococos, Propionibacterium acnes, Clostridium perfringens, e fungos como levedura.
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