CN101054553A - 异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建 - Google Patents

异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建 Download PDF

Info

Publication number
CN101054553A
CN101054553A CN 200710090507 CN200710090507A CN101054553A CN 101054553 A CN101054553 A CN 101054553A CN 200710090507 CN200710090507 CN 200710090507 CN 200710090507 A CN200710090507 A CN 200710090507A CN 101054553 A CN101054553 A CN 101054553A
Authority
CN
China
Prior art keywords
spiramycin
strain
bitsoft
acyl transferase
transferase gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200710090507
Other languages
English (en)
Inventor
武临专
王以光
马春燕
赫卫清
周红霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Original Assignee
Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS filed Critical Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority to CN 200710090507 priority Critical patent/CN101054553A/zh
Publication of CN101054553A publication Critical patent/CN101054553A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程技术在改造抗生素组分中的应用，具体来讲，是对必特螺旋霉素产生菌中参与产生组分II和III相关的3－O－酰基转移酶基因实施阻断和破坏，通过同源基因双交换获得产生4″位异戊酰螺旋霉素I为主组份的基因工程菌，该菌株的获得十分有利于今后生产工艺的简化、生产成本的降低和质量标准的制定与控制。

Description

异戊酰螺旋霉素I基因工程菌株的构建
技术领域：
本发明涉及基因工程技术在改造抗生素组分中的应用。
背景技术：
异戊酰螺旋霉素I是本研究室利用基因工程技术构建的必特螺旋霉素(原名为生技霉素)产生菌所产生的一个组分[“生技霉素的制造方法”，专利号：ZL97104440.6]、[“必特螺旋霉素高产菌株的获得”，专利号：ZL 02148771.5]。必特螺旋霉素目前即将完成第III期临床实验。实验结果表明，在治疗呼吸道感染等疾病方面，显示了较好的临床疗效和安全性。
除异戊酰螺旋霉素I组分外，必特螺旋霉素成品中还包含异戊酰II和III组分，同时还含有少量4”丁酰基、丙酰基、乙酰基的衍生物及少量的螺旋霉素I、II、III(总含量应不超过5％)。目前现行的必特螺旋霉素成品质量标准中，规定其含有9个组分，4”酰化螺旋霉素总含量为80％，其中异戊酰螺旋霉素(I、II、III)3个组分的总含量为65％。而在必特螺旋霉素发酵液中还存在较大比例的螺旋霉素I、II、III，尤其II和III组分相对较多。必特螺旋霉素发酵液中的螺旋霉素主要依赖化学提取工艺将其清除。因此，抗生素发酵产品的多组分问题，给药品质量标准的制定以及发酵工艺和提取过程监控，经常带来很大的困难和挑战。所以，在不影响生物学活性的前提下，获得单一组分生产菌种，已成为抗生素研究和生产面临的重要课题。
必特螺旋霉素是以螺旋霉素为母核，利用基因工程技术在其4”位-羟基进行异戊酰基化所产生的。而螺旋霉素产生菌通常产生SPI、II、III三个组分，即内酯环3位分别为羟基(SP I)、乙酰基(SP II)和丙酰基(SP III)，结构式如图A所示。SP I、SP II、SP III三个组分的生物学活性基本一致。螺旋霉素产生菌产生SPI、II、III三个组分的生化机理，是由3-O-酰基转移酶催化内酯环3-O-羟基所致。本研究室曾在获得螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因序列(专利申请号200610087230.1，SEQ ID No.1)基础上，通过基因阻断技术，获得了主要产生螺旋霉素组分I的菌种。但是，仅仅产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的菌种，迄今尚未见到相关报道。
Figure A20071009050700041
                          螺旋霉素结构
本发明的目的在于，借鉴上述成果，在必特螺旋霉素产生菌中通过破坏编码3-O-酰基转移酶基因，以获得产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。
发明内容：
根据已经获得的3-O-酰基转移酶基因及其两翼序列，在3-O-酰基转移酶基因序列中可以破坏该基因的任意区段设计1个引物，并插入4个任意设计的酶切位点，经PCR获得两个1.0kb左右的同源臂，酶切后将两个同源臂互连，另外两侧与能转入必特螺旋霉素产生菌的载体相连接，以必特螺旋霉素产生菌(ZL02148771.5，菌种保藏号：CGMCC No.0304)总DNA为模板，经PCR分别扩增两个与3-O-酰基转移酶基因同源片段，并以相应酶切位点插入具有选择性标记的链霉菌/大肠杆菌穿羧质粒载体，也可在两个同源基因中插入和使用质粒不同的选择性标记片段，构建重组质粒。将所构建的重组质粒转入必特螺旋霉素基因工程菌，以质粒上携带的选择性标记筛选转化子，根据转化子展现的选择性标记差异和PCR验证，获取因同源基因双交换而使3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌，称之为BT3-O-ATΔ变株。该基因工程菌在一定条件下，经发酵培养和产物的初步化学提取以及HPLC检测其发酵产物，证明本发明提供了产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。
发明效果：
本发明利用基因工程技术将原必特螺旋霉素基因工程菌中的3-O酰基转移酶基因实施破坏，获得了只产生异戊酰螺旋霉素组分I的菌种。该菌种的获得，，使得必特螺旋霉素类抗生素发酵液中的多组分状况获得明显单一化，这将有助于简化生产过程发酵工艺的调控，实现提取过程的优化，提高收率，降低能耗和生产成本，为推进必特螺旋霉素类抗生素的产业化创造良好条件。
附图说明：
图1.用于3-O-酰基转移酶基因破坏的重组质粒pKCL1-4的构建及同源双交换
其中：Apramycin(阿普霉素抗性标记)；
      GTG和TGA表示3-O-酰基转移酶基因阅读框的起始和终止密码子；
      a，b，c，d为PCR反应所设计的引物。
图2.染色体基因组PCR产物电泳(确证3-O-酰基转移酶基因的破坏)
其中：1.基因工程菌BT3-O-ATΔ变株；
      2.必特螺旋霉素产生菌原株；
      3.DNA分子量标记III。
图3.基因工程菌BT3-O-ATΔ变株发酵产物HPLC的检测
其中：A.必特螺旋霉素提取品(对照)；
      B.必特螺旋霉素产生菌原株；
      C.基因工程菌BT3-O-ATΔ变株。
      I-异戊酰螺旋霉素I；
      II-异戊酰螺旋霉素II；
      III-异戊酰螺旋霉素III；
      SI-螺旋霉素I；
      SII-螺旋霉素II；
      SIII-螺旋霉素III；
      纵坐标-HPLC分析中紫外吸收百分比(abs)；
      横坐标-分钟(min)。
实施方案：
以下实施例仅为帮助本领域技术人员进一步理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>重组载体pKCL1-4的构建
根据本研究室已经获得的3-O-酰基转移酶基因及其两翼序列[NCBIDQ642742]设计两对引物，并插入相应的酶切位点(引物在染色体上的相对位置如图1所示)：
L1上游引物(a)GCG AAGCTTTGCCCTGGCAATTGCAGTGTCAG    HindIII
  下游引物(b)GCG TCTAGAGCCGAACGTGACGATGTGCAGCG    XbaI
L2上游引物(c)GTC TCTAGACAGTGGTCCTTCGCCTTCTATCT    XbaI
  下游引物(d)GAC GGATCCTCGTCGCGCAGCAGGTCGTTGAG    BamHI
进行常规PCR扩增，获得与3-O-酰基转移酶基因两个部分同源的片段(左臂L1，1.0kb；右臂L2，1.0kb)。L1两端携带HindIII和XbaI酶切位点，L2两端携带XbaI和BamHI位点。将L1、L2片段和温敏型链霉菌/大肠杆菌穿梭质粒pKC1139(携带阿普霉素-Apramycin，Am抗性标记)以相应的酶切位点进行连接，获得重组载体pKCL1-4(构建过程见图1)。
<实施例2>必特螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌株构建
必特螺旋霉素产生菌在斜面培养基[王以光等，生物工程学报，1992年8(1)：1-14]上28℃培养7-10天，按照文献[D.A.Hopwood等Geneticmanipulation of Streptomyces，A Laboratory Manual，Norwich；JohnInnesFoundation UK，1985]描述的方法制备原生质体，将pKCL1-4通过原生质体转化方法，导入必特螺旋霉素产生菌中，以Am抗性作为选择性标记获得转化子；经无抗性平板在37℃条件下培养传代、单菌落分离，获得了Am敏感菌株(称为BT3-O-ATΔ变株)。
提取变株和原株基因组DNA为模板，以引物a和d配对，进行PCR扩增和产物的电泳鉴定。由于必特螺旋霉素原株中的3-O-酰基转移酶基因组与载体携带的L1和L2片段发生了同源双交换，使BT3-O-ATΔ变株中3-O-酰基转移酶基因在阅读框架内删除了612bp的序列，因此，BT3-O-ATΔ变株PCR产物约为2.0kb，比原株(约2.6kb)小0.6kb(结果见图2)，表明必特螺旋霉素原株中3-O-酰基转移酶基因的部分序列已被删除和破坏。所获得的变株即为必特螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌株。
<实施例3>必特螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因破坏的基因工程菌株发酵产物的HPLC检测
BT3-O-ATΔ变株的发酵培养及产物初步提取按照文献[王以光等，生物工程学报，1992年8(1)：1-14]进行。发酵液初步提取液挥发干后，以少量甲醇溶解，采用岛津LC-10ATvp液相色谱议，二级管阵列检测器，色谱柱为KromasilC184.5*150mm，流动相为甲醇/1％磷酸二氢钠溶液(53/47)，流速为1mL/min。以必特螺旋霉素纯品为对照，以必特螺旋霉素主要组分的保留时间为标准[姜威等中国抗生素杂志.2002，27(7)：387-391]，取5ul发酵液，经初步提取的样品进行HPLC检测。发酵主要产物所占比例的HPLC定量分析结果见图4和表1。
表1  BT3-O-ATΔ变株发酵主要产物的HPLC检测
 组分   保留时间(min)   峰面积比％
  原株   BT3-O-ATΔ变株
 螺旋霉素I   7.389   测不出   32.39
 螺旋霉素II   8.563～8.77   21.36   测不出
 螺旋霉素III   13.865～14.059   18.79   测不出
 异戊酰螺旋霉素I   41.022～42.259   3.29   23.47
 异戊酰螺旋霉素II   47.019～47.911   15.07   测不出
 异戊酰螺旋霉素III   78.9～82.464   5.41   测不出
HPLC分析结果表明，原株发酵产生异戊酰螺旋霉素I为3.29％，螺旋霉素II和III所占总组分比例约为40.15％；本发明获得的BT3-O-ATΔ变株不产生螺旋霉素II、III和异戊酰螺旋霉素II、III。BT3-O-ATΔ变株所产生的异戊酰螺旋霉素I占总组分的比例约为23.47％；螺旋霉素I占总组分的比例为32.39％。这一结果充分证明，必特螺旋霉素原株中3-O-酰基转移酶基因已经完全破坏。本发明获得了4”位酰化螺旋霉素中以产生异戊酰螺旋霉素I为主组份的基因工程菌。

Claims (2)

1、异戊酰螺旋霉素I基因工程菌株的构建，其特征是在必特螺旋霉素产生菌中通过破坏编码3-O-酰基转移酶基因，以获得产生异戊酰螺旋霉素I为主组分的基因工程菌。
2、如权利要求1所述的构建方法，其特征是以3-O-酰基转移酶基因序列为模板，在3-O-酰基转移酶基因序列中可以破坏该基因的任意区段设计4个引物，并插入4个任意设计的酶切位点，经PCR获得两个1.0kb左右的同源臂，酶切后将两个同源臂互连，另外两侧与能转入必特螺旋霉素产生菌的载体相连接，获得重组载体，并转入必特螺旋霉素产生菌，以载体上的选择性标记挑取转化子，通过筛选抗性标记和PCR验证，获得3-O-酰基转移酶基因被破坏的变株，经发酵及对产物提取后HPLC分析，证明所获变株为主要产生异戊酰螺旋霉素组分I的菌种。
CN 200710090507 2007-04-09 2007-04-09 异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建 Pending CN101054553A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200710090507 CN101054553A (zh) 2007-04-09 2007-04-09 异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200710090507 CN101054553A (zh) 2007-04-09 2007-04-09 异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101054553A true CN101054553A (zh) 2007-10-17

Family

ID=38794610

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200710090507 Pending CN101054553A (zh) 2007-04-09 2007-04-09 异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101054553A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914482A (zh) * 2010-07-23 2010-12-15 中国医学科学院医药生物技术研究所 一株异戊酰螺旋霉素i组分高含量、高产量基因工程菌
JP2013528166A (ja) * 2010-05-25 2013-07-08 センヤン トンリァン グループ カンパニー，リミテッド レボイソバレリルスピラマイシンｉ、ｉｉ又はｉｉｉとその製剤、調製方法及び応用
JP2013528167A (ja) * 2010-05-25 2013-07-08 センヤン トンリァン グループ カンパニー，リミテッド レボロキタマイシン、その薬物組成物、調製方法及び応用
CN107868789A (zh) * 2015-12-31 2018-04-03 沈阳福洋医药科技有限公司 可利霉素生物合成基因簇
CN111349595A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 沈阳福洋医药科技有限公司 一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法
WO2021183725A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Asclea Corp. Use of isovalerylspiramycins as anti-cancer agents to inhibit metastasis

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013528166A (ja) * 2010-05-25 2013-07-08 センヤン トンリァン グループ カンパニー，リミテッド レボイソバレリルスピラマイシンｉ、ｉｉ又はｉｉｉとその製剤、調製方法及び応用
JP2013528167A (ja) * 2010-05-25 2013-07-08 センヤン トンリァン グループ カンパニー，リミテッド レボロキタマイシン、その薬物組成物、調製方法及び応用
CN101914482A (zh) * 2010-07-23 2010-12-15 中国医学科学院医药生物技术研究所 一株异戊酰螺旋霉素i组分高含量、高产量基因工程菌
WO2012009963A1 (zh) * 2010-07-23 2012-01-26 中国医学科学院医药生物技术研究所 用于生产异戊酰螺旋霉素i的基因工程菌wsj-ia
US8759032B2 (en) 2010-07-23 2014-06-24 Shen Yang Tonglian Group Co., Ltd. Genetically engineered strain WSJ-IA for producing isovaleryl spiramycin I
KR101542243B1 (ko) 2010-07-23 2015-08-05 쉔양 통리엔 그룹 컴패니, 리미티드 이소발레릴 스피라마이신 ｉ을 생산하는 유전학적으로 공학처리된 균주 ｗｓｊ­ｉａ
CN107868789A (zh) * 2015-12-31 2018-04-03 沈阳福洋医药科技有限公司 可利霉素生物合成基因簇
CN107868789B (zh) * 2015-12-31 2020-11-17 沈阳福洋医药科技有限公司 可利霉素生物合成基因簇
CN111349595A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 沈阳福洋医药科技有限公司 一种螺旋霉素产生菌、可利霉素产生菌、构建方法、应用及提高产物产量的方法
WO2021183725A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Asclea Corp. Use of isovalerylspiramycins as anti-cancer agents to inhibit metastasis
US11351185B2 (en) 2020-03-11 2022-06-07 Asclea Corporation Use of isovalerylspiramycins as anti-cancer agents to inhibit metastasis

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101054553A (zh) 异戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的构建
CN106191077B (zh) 一种米尔贝霉素正调控基因milR及其过表达基因工程菌、制备方法和应用
CN103740734B (zh) 厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株
CN109486848B (zh) 一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用
JP2019500903A (ja) カリマイシン（Ｃａｒｒｉｍｙｃｉｎ）生合成遺伝子クラスタ
Gu et al. Effects of chromosomal integration of the Vitreoscilla Hemoglobin Gene (vgb) and S-Adenosylmethionine synthetase gene (metK) on ε-Poly-l-Lysine synthesis in Streptomyces albulus NK660
CN1687403A (zh) 产伊维菌素的工程菌及其构建方法与应用
WO2010127645A2 (en) The method of biotechnological preparation of lincomycin derivatives and its using
WO2019223433A1 (zh) 一种非达霉素基因工程菌及构建方法和应用
CN111849846A (zh) 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用
Wang et al. Strain construction for enhanced production of spinosad via intergeneric protoplast fusion
CN110832066B (zh) 一种伊维菌素B1b产生菌及其应用
CN109136253A (zh) 一种通过糖多孢红霉菌sace_5754基因途径提高红霉素产量的方法
CN112608953B (zh) 茴香霉素的制备方法、茴香霉素的检测方法及抑菌应用
CN100393867C (zh) 格尔德霉素基因工程高产菌株的构建
CN113717892A (zh) 一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株及其应用
CN106566796B (zh) 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系
CN108456689B (zh) 提高安丝菌素p-3生物合成产量的方法
WO2022017523A1 (zh) 生产脱环氧埃坡霉素b的重组菌及其用途
CN112430608B (zh) 一种构建奥利万星前体高产工程菌的方法及应用
CN113355339B (zh) 一种大型基因簇的无痕定点改造方法及其应用
Stevanovic et al. Streptomyces sp. BV410: Interspecies cross‐talk for staurosporine production
CN109321612B (zh) 一种发酵生产巴弗洛霉素a1的方法
CN106222191A (zh) 敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法
CN106434406B (zh) 一种产生疏螺旋体素的放线菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication