CN106566796B - 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系 - Google Patents

阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系 Download PDF

Info

Publication number
CN106566796B
CN106566796B CN201610962757.8A CN201610962757A CN106566796B CN 106566796 B CN106566796 B CN 106566796B CN 201610962757 A CN201610962757 A CN 201610962757A CN 106566796 B CN106566796 B CN 106566796B
Authority
CN
China
Prior art keywords
acarbose
actinoplanes
spp
mycelium
percent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610962757.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106566796A (zh
Inventor
白林泉
赵芹芹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201610962757.8A priority Critical patent/CN106566796B/zh
Publication of CN106566796A publication Critical patent/CN106566796A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106566796B publication Critical patent/CN106566796B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/03—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/365—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinoplanes (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系，是利用菌丝体接合转移的方式，将
Figure DDA0001144902130000011
衍生质粒和pIJ101衍生的复制型质粒导入阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.中，实现基因的表达和敲除。本发明建立并系统优化了阿卡波糖生产菌株Actinoplanes spp.的遗传操作体系，开发了适用于该类菌株的遗传操作工具，并成功应用于精确的基因组编辑，以提高阿卡波糖产量，为实现理性设计改造阿卡波糖生产菌株奠定了基础。采用本发明的方法，加强表达阿卡波糖生物合成基因簇(acb cluster)，可使阿卡波糖发酵终产量提高35％。

Description

阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系
技术领域
本发明属于生物技术，具体涉及一种阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系。
背景技术
阿卡波糖（acarbose）是一种C7环多醇类的假性四糖，可与α-葡萄糖苷酶发生竞争性结合作用，降低小肠壁细胞中的α-糖苷酶对双糖、寡糖和多糖的水解作用，以减少对葡萄糖和果糖的产生、吸收和利用，从而达到降低Ⅱ型糖尿病病人餐后血糖的目的。由于其具有良好的药代动力学性质和低毒性，而成为理想的Ⅱ型糖尿病治疗药物，其销售份额已超过传统的磺酰脲类和双胍类等降糖药物。
目前工业上主要采用Actinoplanes spp.发酵生产阿卡波糖，负责其生物合成的基因簇（acb cluster）由22个结构基因组成，编码与其生物合成和转运及α-葡糖苷代谢相关的蛋白。在此基础上，借助分子生物学和基因工程手段，再辅以体外酶学分析、同位素标记喂养和质谱技术，解析了部分阿卡波糖的生物合成途径，主要包括：C7环多醇和4-氨基-4，6-二脱氧葡萄糖两个模块的合成和组装，及与麦芽糖分子的组装。
国内外针对Actinoplanes spp.发酵生产acarbose进行了大量的研究工作，前期主要集中于生物合成途径的解析、高产菌株的诱变选育及发酵工艺控制与优化、分离提取工艺的研究与优化等；近年来，随着高通量测序技术的发展，对Actinoplanes spp.的基因组、转录组、蛋白质组进行测定与分析。由于缺乏有效的遗传操作体系，而使得在阿卡波糖生物合成及其调控机制、高产菌株的理性设计与改造等方面的研究受到限制。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高效的阿卡波糖生产菌Actinoplanes sp.遗传操作体系及相关的遗传操作工具；目的之二是提供一种提高阿卡波糖产量的方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：一种阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系，是利用菌丝体接合转移的方式，将ØC31衍生质粒和pIJ101衍生的复制型质粒导入阿卡波糖生产菌株Actinoplanes spp.中，实现基因的表达和敲除，具体步骤如下：
A.将构建的重组质粒转化至ET12567(pUZ8002)，挑取正确的菌株，经8 h培养后，转接至新鲜的LB培养基中继续培养4-5 h，至OD600nm为1；
B.将Actinoplanes spp.菌丝体划线于平板培养基上，30℃培养3-4天，接种至菌丝体液体培养基，培养36 h后，转接至TSB培养基培养8-12 h；
C. 将菌丝体和含有重组质粒的ET12567 (pUZ8002) 按照菌体数量为1：30比例混合均匀，涂布于SFM平板上，置于30 ℃培养箱中培养32 h，每块平板分别以2 mg阿泊拉霉素和甲氧苄啶覆盖，继续培养6-7天，获得接合子。
通过优化菌丝体培养过程，覆盖时间，菌丝体用量，供体与受体细胞的配比，Mg2+的用量，建立可大幅度提高接合转移的效率的菌丝体接合转移体系。
将pIJ101衍生的复制型质粒pJTU1278的硫链丝菌素筛选标记替换为阿泊拉霉素抗性标记，同时插入反向筛选标记CodA(sm)，获得复制型质粒pLQ752，用于Actinoplanesspp.的基因敲除、替换和插入。
从阿卡波糖生产菌株Actinoplanesspp.的基因组文库中筛选到包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒，从pSET152中扩增attP-int-oriT-aac(3)IV元件，通过PCR-targeting的方法插入Fosmid质粒，获得重组质粒pLQ666，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanes spp.中，实现阿卡波糖生物合成基因簇的加强表达。
阿卡波糖生物合成基因簇的筛选方法是，抽提Actinoplanes sp.基因组，随机打断，构建基因组文库，经筛选获得包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的fosmid质粒。
通过PCR扩增获得用于acb cluster敲除的上下游同源臂，插入至复制型质粒pLQ752中，获得重组质粒pLQ757，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanesspp.中，筛选获得acbcluster 缺失的突变株。
利用复制型质粒pLQ752，通过同源双交换的方式，敲除编码阿卡波糖生物合成的基因簇，构建了用于C-7环醇类药物合成的微生物细胞工厂。
将突变株划线于平板培养基，置于30 ℃培养箱培养3-4天，用接种环挑取适当菌丝体，接种于种子培养基中，置于30 ℃ 220 rpm摇床中培养30-36 h，按照15 %的接种量接种至发酵培养基，置于30 ℃ 220 rpm摇床中发酵7天，分别在发酵第3天补加2 %的麦芽糖和葡萄糖。
所述种子培养基的质量体积比配方为葡萄糖 1 %、麦芽糖 1.5 %、甘油1 %、热榨豆饼粉 4 %、淀粉 1 %、CaCO3 0.2 %， pH调至7.2，115 ℃高压蒸汽灭菌15 min，所述发酵培养基的质量体积比配方为麦芽糖 5 %、葡萄糖 3 %、热榨豆饼粉1 %、FeCl3 0.05 %、K2HPO4 0.1 %、谷氨酸 0.3 %、CaCO3 0.25 %，pH调至7.2，115 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
本发明的具体的实施步骤如下：
第一步，建立及优化菌丝体接合转移的体系
首先，考察Actinoplanes spp.对常用抗生素敏感性，以便在构建遗传操作体系时选择合适的筛选标记。第二，对菌丝体的培养条件及培养时间进行优化，选择对数生长中期，生长细腻的菌丝体进行结合转移。第三，考察不同培养基对接合转移的影响。最后，优化接合转移过程的参数，如覆盖时间，菌丝体用量，供体与受体细胞的配比，培养基中添加的Mg2+浓度等。
第二步，加强表达阿卡波糖生物合成基因簇
首先，从Actinoplanes spp.的基因组文库中筛选包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒，插入attP-int-oriT-aac(3)IV等接合转移和整合必需的元件，然后通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanes spp.中，实现阿卡波糖生物合成基因簇的加强表达。
第三步，构建复制型质粒pLQ752用于基因的敲除
将复制型载体pJTU1278中的硫链丝菌素抗性基因tsr及其启动子替换成阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV及其启动子，同时插入反向筛选标记CodA(sm)，最终构建成用于Actinoplanes spp.高效基因敲除的复制型质粒pLQ752。
第四步，acbcluster 缺失突变株的构建
通过PCR扩增获得用于acb cluster敲除的上下游同源臂，插入至复制型质粒pLQ752中，获得重组质粒pLQ757，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanesspp.中，筛选获得acbcluster 缺失的突变株。
抗生素敏感性分析的方法是：将实验室保存的三株阿卡波糖生产菌Actinoplanessp. SE50、SE50/110、HDC活化后，取新鲜菌丝划线于含有不同抗生素的平板上， 30℃培养3-5 d，观察菌体的生长情况。
菌丝体培养条件的优化方法是：甘油保存的菌丝划线至STY培养基，培养48 h后，挑取一环至SM培养基，培养约36 h，以10 %的接种量转接至TSB培养基中，每隔4 h取一次样品，测定菌体干重。
接合转移过程参数优化的方法是：（1）覆盖时间和菌丝体用量：选择不同菌丝细胞的用量为106、105、104、103 (CFU)，分别培养8-36 h后，取2 mg阿泊拉霉素和1mg 甲氧苄啶加入至1 mL无菌ddH2O中，倒入SFM平板中，铺展均匀并晾干，在30℃培养箱中继续培养5-8 d，对接合子进行计数。（2）供体与受体细胞的配比：受体细胞数目为3.2×103 (CFU)，调整供体细胞数目分别为103-107 (CFU)使受体与供体细胞的比例分别为3:1、1:3、1:30、1:150、1:300、1:1500、1:3000，对接合子进行计数。（3）Mg2+浓度：在SFM培养基中添加不同浓度的Mg2 +，使其终浓度分别为0、2、5、10、20、30 mM，分别对接合子进行计数。
获取阿卡波糖生物合成基因簇的方法是：抽提Actinoplanes sp.的基因组gDNA，用黄枪头吹吸，随机打断gDNA，经末端补平，5’磷酸化后，用低熔点琼脂糖回收长度为40 kb的片段，并与Copycontrol pCC1FOS vector连接包埋，转染至EPI300-TIR plating cells，采用位于acb cluster中间和两端的基因（acbM、acbZ、acbD）作为筛选标记，筛选获得含有完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒31F6。
Fosmid质粒的改造的方法是：将来自于pSET152上的attP-int-oriT-aac(3)IV元件，通过PCR targeting的方式整合至fosmid质粒31F6中，获得pLQ666。
加倍表达阿卡波糖基因簇的方法是：将pLQ666转化入E. coli ET12567(pUZ8002)中，通过菌丝体结合转移的方式导入Actinoplanes spp.，对重组菌株进行验证，发酵后取上清检测阿卡波糖产量。
复制型质粒pLQ752的构建方法是：（1）将硫链丝菌素抗性筛选标记替换：通过PCR扩增，获得来源于pSET152质粒的阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV及其启动子片段，两端含有AflII和NheI的酶切位点，同时扩增pJTU1278中包含oriT元件在内的986 bp的片段，两段含NheI和AflII的酶切位点，分别酶切后插入用NdeI和NheI酶切的pJTU1278，获得重组质粒pLQ-750。（2）插入反向筛选标记CodA(sm): 从pWHU2573中扩增codA(sm)基因，两端含有AflII酶切位点，插入AflII酶切后的pLQ750，获得重组质粒pLQ752。
阿卡波糖生物合成基因簇缺失的方法是：通过PCR扩增获得用于acb cluster敲除的上下游同源臂T-1、T-2，连接至复制型载体pLQ752中，获得重组质粒pLQ757，转化入ET12567 (pUZ8002)，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanes spp.中，筛选获得的突变株。
阿卡波糖菌株发酵和检测方法是：将突变株划线于平板固体培养基，置于30 ℃培养箱培养3-4 d，用接种环挑取适当菌丝体，接种于种子培养基中，置于30 ℃ 220 rpm摇床中培养30-36 h，按照15 %的接种量接种至发酵培养基，置于30 ℃ 220 rpm摇床中发酵7天，在发酵第3天补加2 %的麦芽糖和葡萄糖。取第7天的发酵上清液，进行适当倍数稀释后，用HPLC进行检测。
基因表达突变株的验证方法是：挑取接合子划线于含阿泊拉霉素和甲氧苄啶的平板固体培养基上，培养3-4天后，接种于液体菌丝体培养基中，培养36 h，取少量菌体抽提基因组，PCR扩增质粒携带的aac(3)IV基因，结合PCR产物酶切，进行验证。
基因缺失突变株的筛选和验证方法是：挑取接合子划线于含阿泊拉霉素和甲氧苄啶的平板固体培养基上，培养3-4 d后，接种于液体菌丝体培养基中，培养36 h，按照10 %的接种量接种至新鲜的SM培养基中，继续培养48 h，取菌丝体稀释十倍后，用孢子过滤器过滤，滤液稀释104-105后，涂布于含50 mg/L的5-氟胞嘧啶的STY平板培养基中，培养4-5天，挑取单菌落，培养后抽提基因组，PCR验证。
Actinoplanes spp.常用培养基包括：接合转移培养基（SFM）: 全脂黄豆饼粉 2%、甘露醇 2%、琼脂 2 % pH 7.2； STY平板培养基：蔗糖3 %、 tryptone 0.5 %、 yeastextract 0.5 %、 casin hydrolysate 0.1 %、 K2HPO4∙3H2O 0.1 %、 KCl 0.05 %、 FeSO40.005 %、琼脂 2 % 自然pH； SM培养基：葡萄糖 1.5 %、 K2HPO4∙3H2O 0.1 %、甘油 1 %、maltose extract 1 %、 tryptone 0.5 %、 yeast extract 0.5 % 自然pH。
本发明建立并系统优化了阿卡波糖生产菌株Actinoplanes spp.的遗传操作体系，开发了适用于该类菌株的遗传操作工具，并成功应用于精确的基因组编辑，以提高阿卡波糖产量，为实现理性设计改造阿卡波糖生产菌株奠定了基础。
附图说明
图1是菌丝体在TSB培养基的生长过程；
图2A是 pLQ666质粒携带完整的阿卡波糖生物合成基因簇和attP-int-oriT-aac (3)IV元件；图2B是出发菌株SE50/110和突变株QQ-1的阿卡波糖产量。
图3是复制型质粒pLQ-752的构建流程；
图4为出发菌株SE50/110及突变株QQ-3和QQ-4的阿卡波糖产量。
具体实施方法
以下实施例将结合附图和附表对本发明进行进一步说明，但这些实施例并不意味着对本发明任何限制。
实施例1 菌丝体接合转移体系的建立与优化
A.抗生素敏感性分析
将实验室保存的三株阿卡波糖生产菌Actinoplanes sp. SE50、SE50/110、HDC活化后，取新鲜菌丝划线于含有不同抗生素的平板上， 30℃培养3-5 d，观察菌体的生长情况。结果如附表1所示。Actinoplanes spp.对硫链丝菌素（Thio）、壮观霉素（Spec）和甲氧苄啶（TMP）不敏感，对阿泊拉霉素（Apr）、卡那霉素（Kan）、氯霉素（Cml）、链霉素（Str）和萘丁酮酸敏感。
表1 Actinoplanes sp.对常用抗生素敏感性分析
Figure 96783DEST_PATH_IMAGE002
注明：“+”表示敏感；“-”表示不敏感；
B．菌丝体的培养
甘油保存的菌丝划线至活化培养基，培养48 h后，挑取一环至SM培养基，培养约36h，以10%的接种量转接至TSB培养基中，每隔4 h取一次样品，测定菌体干重。结果如图1所示, 选择对数生长中期8-12 h的菌丝体用于接合转移。
C. 覆盖时间和菌丝体数量的优化
受体与供体细胞的用量及其在固体培养基中共同培养的时间是接合转移过程中最重要的因素。选择不同菌丝细胞的用量为106、105、104、103 (CFU)，分别培养8-36 h后，利用pSET152质粒携带的Apr抗性筛选标记和供体细胞E.coli敏感而Actinoplanesspp.不敏感的TMP（表1），按照终浓度分别为2 mg/mL和1mg/mL加入至1mL无菌ddH2O中，倒入已经培养好的固体平板中，铺展均匀并晾干，在30℃培养箱中继续培养5-8 d，对接合子进行计数。结果如表2所示，覆盖时间为32 h，菌丝体用量为103-104 CFU。
表2 覆盖前培养时间和供体细胞用量对Actinoplanesspp.接合转移效率的影响
Figure 732032DEST_PATH_IMAGE004
D．供体与受体细胞配比的优化
供体细胞Actinoplanes spp.与受体细胞E. coli的比例也是影响接合转移效率的重要因素，所以本文在前期优化条件的基础上，考察不同供体与受体细胞比例对接合转移效率的影响，结果如表3所示，受体细胞数目为3.2×103 (CFU)，调整供体细胞数目分别为103-107 (CFU)使受体与供体细胞的比例分别为3:1、1:3、1:30、1:150、1:300、1:1500、1:3000，对接合子进行计数。结果如表3所示，供体与受体细胞的配比为1：30时最优。
表3供体与受体细胞的比例对接合转移效率的影响
Figure 246190DEST_PATH_IMAGE006
E．Mg2+浓度的优化
研究表明，在接合转移培养基中添加适量的Mg2+可大幅度提高接合转移的效率。但在SFM中添加Mg2+，造成豆饼粉中的部分蛋白沉淀，对菌体的生长也产生一定的影响。本研究主要考察接合转移固体培养基中添加不同浓度的Mg2+，对供体细胞的生长和接合转移效率的影响。在SFM培养基中添加不同浓度的Mg2+，使其终浓度分别为0、2、5、10、20、30 mM，分别对供体细胞和接合子进行计数。结果如表4所示，20 mM Mg2+最佳。
表4 不同Mg2+浓度对接合转移效率的影响
Figure 375820DEST_PATH_IMAGE008
实施例2. 阿卡波糖生物合成基因簇的加强表达
A. 含有完整acb cluster的fosmid质粒的构建与筛选：抽提Actinoplanes sp.的基因组gDNA，用黄枪头吹吸，随机打断gDNA，经末端补平，5’磷酸化后，用低熔点琼脂糖回收长度为40 kb的片段，并与Copycontrol pCC1FOS vector连接包埋，转染至EPI300-TIRplating cells，采用位于acb cluster中间和两端的基因（acbM、acbZ、acbD）作为筛选标记，筛选获得含有完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒31F6。将来自于pSET152上的attP-int-oriT-aac(3)IV元件，通过PCR targeting的方式整合至fosmid质粒31F6中，获得pLQ666，转化入E. coli ET12567 (pUZ8002)中。
B. E.coli ET12567::pLQ666与Actinoplanespp.的接合转移
（1）菌丝体培养：甘油管保存的菌丝体划线于STY培养基，在30℃培养箱中培养3-4天，挑取一环菌丝体接种于SM培养基，在30 ℃ 220 rpm摇床上培养约36 h，按10 %的接种量接种TSB培养基中，培养8-10 h。
（2）E.coli ET12567::pLQ666培养：E.coli ET12567::pLQ666以1 %的接种量接种至LB培养基中，在37 ℃ 220 rpm摇床上培养约12-16 h，以5 %的接种量转接至新鲜LB培养基中，培养约4-5 h至OD600nm为1.0。
(3) 接合转移。收集菌丝体和E. coli后，用LB各洗涤2遍，用适当体积LB重悬菌体，按照菌丝体和E. coli数量为1:30的比例混合，涂布于含有SFM平板，置于30 ℃培养箱中培养约24 h。取阿泊拉霉素和甲氧苄啶各2 mg于1 mL无菌水中混合均匀，覆盖到平板上，使溶液均匀铺满整个平板，吹干后，置于30 ℃培养箱中培养约5-7天。
(4) 接合子验证
a. 接合子纯化与培养
随机挑取接合子，划线于含阿泊拉霉素和甲氧苄啶的平板固体培养基上，在30 ℃培养箱中培养2 天，挑取适量菌丝，接种于菌丝体液体培养基中培养约36 h，用于基因组抽取。
b. 基因组抽提
取少量菌丝体，以SET buffer洗涤2遍后，用500 uL SET buffer重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为5 mg/mL (23600 U/mg)，在37℃水浴中孵育45 min，加入SDS至其终浓度为1%，颠倒混匀后加入RNase至终浓度为10 ug/mL，37℃水浴中孵育约10 min，加入蛋白酶K至终浓度为0.2 mg/mL，37℃水浴中孵育约30 min，加入200 uL 5 M NaCl，颠倒混匀并冷却至室温，加入500 uL酚氯仿(苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1)，充分颠倒混匀，12000 rpm离心10min，取上层水相，加入等体积预冷异丙醇，颠倒混匀，将DNA用枪头挑出，用70%的乙醇洗涤两遍，等乙醇挥发后，加入适量水溶解DNA，可用于PCR。
c. PCR验证
以验证引物apr-F、apr-R为引物（表5）扩增aac(3)IV内部717 bp的片段。
表5 aac(3)IV的验证引物及其序列
Primer名称 序列(5'to3')
apr-F GCTCATCGGTCAGCTTCTCA
apr-R TCGCATTCTTCGCATCCC
d. 酶切验证
用XhoⅠ对PCR扩增产物进行酶切，理论上可获得长约193 bp与524 bp的片段，结果如图1所示。
B. 突变株QQ-1的发酵及acarbose检测
（1）发酵流程。甘油管保存的菌丝体划线于平板固体培养基，在30 ℃培养箱中培养2 d，挑取一环菌丝体接种于摇瓶种子培养基，在30 ℃ 220 rpm摇床上培养约36 h，按15%接种量接种至发酵培养基，30 ℃ 220 rpm摇床上培养7天，在发酵第1天补加1.5 %的麦芽糖，第3，5天补加1.5 %的麦芽糖和1 %的葡萄糖。
（2）发酵样品处理。取发酵后产物2 mL，离心后取上清，菌丝体用0.25 M HCl洗涤1遍后，置于烘箱中烘干至恒重。上清以ddH2O稀释4倍，取其500 uL，加入等体积氯仿，震荡10min后，12000 rpm离心10 min，取上清过滤，用于HPLC分析。
（3）发酵参数检测。
流动相：磷酸盐(0.6 g/L KH2PO4 & 0.305 g/L Na2HPO4): 乙腈=35:65
柱温：35 ℃
流速：1 mL/min
检测波长：210 nm
进样体积：20 μL
(4) 发酵结果分析。经过7天发酵，突变株（QQ-1）和出发菌株（SE50/110）的acarbose的产量如图2B所示，acarbose的产量较对照菌株提高了35 %，从2.35 g/L提高至3.18 g/L
实施例3. 复制型质粒pLQ-752的构建
A. 将硫链丝菌素抗性筛选标记替换
以apr-1278-F/R为引物，以pSET152为模板，通过PCR扩增，获得阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV及其启动子片段，两端含有AflII和NheI的酶切位点，同时以OriT-F/R为引物，以pJTU1278为模板，扩增其中包含oriT元件在内的986 bp的片段，两段含NheI和AflII的酶切位点，分别酶切后插入用NdeI和NheI酶切的pJTU1278，获得重组质粒pLQ750。
B．插入反向筛选标记CodA(sm)
以codA-F/R为引物，从pWHU2573中扩增codA(sm)基因，两端含有AflII酶切位点，插入AflII酶切后的pLQ750，获得重组质粒pLQ752。引物序列如表6所示，构建流程如图3所示。
表6 构建pLQ-752所需的引物
Primers Sequences from (5' to 3') Restriction sites
apr-1278-F GGAATTC<u>CATATG</u> GTCTGACGCTCAGTGGAACG <i>Nde</i>I
apr-1278-R CCGA<u>CTTAAG</u>TCAGCCAATCGACTGGCGAG <i>Afl</i>II
oriT-F GA<u>CTTAAG</u>CTCGATTCGTCAGTGATGATC <i>Afl</i>II
oriT-R GA<u>GCTAGC</u>TTCAGACGTGTCTAGCTAGAG <i>Nhe</i>I
codA-F GACTTAAGCTAGTGCATGCTCAGCGCTTG <i>Afl</i>II
codA-R GACTTAAGATACCCGGGGATCCTCTAGTC <i>Afl</i>II
实施例4. 阿卡波糖生物合成基因簇的敲除与回补
分别以acb-1/acb-2、acb-3/acb-4为引物，以Actinoplanes spp.基因组为模板，通过PCR扩增获得用于acb cluster敲除的上下游同源臂T-1 (2.59 kb)、T-2 (2.56 kb)，连接至复制型载体pLQ752中，获得重组质粒pLQ757，转化入ET12567 (pUZ8002)。
如实施例2中详述的接合转移方法，将重组质粒通过菌丝体接合转移的方法导入Actinoplanes spp.。挑取接合子划线于含阿泊拉霉素和甲氧苄啶的平板固体培养基上，培养3-4天后，接种于液体菌丝体培养基中，培养36 h，按照10%的接种量接种至新鲜的SM培养基中，继续培养48 h，取菌丝体稀释十倍后，用孢子过滤器过滤，滤液稀释104-105后，涂布于含50 mg/L的5-氟胞嘧啶的STY平板培养基中，培养4-5天，挑取单菌落，培养后抽提基因组，以引物acb-I-F 和acb-I-R验证。对筛选获得的突变株进行发酵，结果显示突变株QQ-3均无阿卡波糖产生（图4）。
将pLQ666导入acb cluster缺失突变株QQ-3中，筛选获得的突变株QQ-4，阿卡波糖产量恢复，如图4所示。
<110> 上海交通大学
<120> 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系
<160> 8
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> apr-F
<400>1
GCTCATCGGT　CAGCTTCTCA　　20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> apr-R
<400>2
TCGCATTCTT　CGCATCCC　　18
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> apr-1278-F
<400>3
GGAATTCCAT　ATG GTCTGAC　GCTCAGTGGA　ACG　33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> apr-1278-R
<400>4
CCGACTTAAG　TCAGCCAATC　GACTGGCGAG　30
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> oriT-F
<400>5
GACTTAAGCT　CGATTCGTCA　GTGATGATC　29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> oriT-R
<400>6
GAGCTAGCTT　CAGACGTGTC　TAGCTAGAG　29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> codA-F
<400>7
GACTTAAGCT　AGTGCATGCT　CAGCGCTTG　29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> codA-R
<400>8
GACTTAAGAT　ACCCGGGGAT　CCTCTAGTC　29。

Claims (5)

1.一种阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作方法，其特征在于，具体步骤如下：
A.将重组质粒pLQ666转化至ET12567(pUZ8002)，挑取正确的菌株，经8 h培养后，转接至新鲜的LB培养基中继续培养4-5 h，至OD600nm为1；
B.将Actinoplanes spp.菌丝体划线于平板培养基上，30℃培养3-4天，接种至菌丝体液体培养基，培养36 h后，转接至TSB培养基培养8-12 h；
C. 将菌丝体和含有重组质粒的ET12567 (pUZ8002) 按照菌体数量为1：30比例混合均匀，涂布于SFM平板上，置于30 ℃培养箱中培养32 h，每块平板分别以2 mg阿泊拉霉素和甲氧苄啶覆盖，继续培养6-7天，获得接合子；
从阿卡波糖生产菌株Actinoplanesspp.的基因组文库中筛选到包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒，从pSET152中扩增attP-int-oriT-aac(3)IV元件，通过PCR-targeting的方法插入Fosmid质粒，获得重组质粒pLQ666，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanes spp.中，实现阿卡波糖生物合成基因簇的加强表达；
获取阿卡波糖生物合成基因簇的方法是：抽提Actinoplanes spp.的基因组gDNA，用黄枪头吹吸，随机打断gDNA，经末端补平，5’磷酸化后，用低熔点琼脂糖回收长度为40 kb的片段，并与Copycontrol pCC1FOS vector连接包埋，转染至EPI300-TIR plating cells，采用位于acb cluster中间和两端的基因acbM、acbZ、acbD作为筛选标记，筛选获得含有完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒31F6；
Fosmid质粒的改造的方法是：将来自于pSET152上的attP-int-oriT-aac(3)IV元件，通过PCR targeting的方式整合至fosmid质粒31F6中，获得重组质粒pLQ666；
加倍表达阿卡波糖基因簇的方法是：将重组质粒pLQ666转化入E. coli ET12567(pUZ8002)中，通过菌丝体结合转移的方式导入Actinoplanes spp.，对重组菌株进行验证，发酵后取上清检测阿卡波糖产量。
2.根据权利要求1所述的阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作方法，其特征在于：所述菌丝体接合转移的方式是，通过优化菌丝体培养过程，覆盖时间，菌丝体用量，供体与受体细胞的配比，Mg2+的用量，建立可大幅度提高接合转移的效率的菌丝体接合转移体系。
3.根据权利要求1所述的阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作方法，其特征在于：阿卡波糖生物合成基因簇的筛选方法是，抽提Actinoplanes spp.基因组，随机打断，构建基因组文库，经筛选获得包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的fosmid质粒。
4.根据权利要求1所述的阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作方法，其特征在于：将突变株划线于平板培养基，置于30 ℃培养箱培养3-4天，用接种环挑取适当菌丝体，接种于种子培养基中，置于30 ℃ 220 rpm摇床中培养30-36 h，按照15 %的接种量接种至发酵培养基，置于30 ℃ 220 rpm摇床中发酵7天，分别在发酵第3天补加2 %的麦芽糖和葡萄糖。
5. 根据权利要求4所述的阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作方法，其特征在于：所述种子培养基的质量体积比配方为葡萄糖 1 %、麦芽糖 1.5 %、甘油1 %、热榨豆饼粉 4 %、淀粉 1 %、CaCO3 0.2 %， pH调至7.2，115 ℃ 高压蒸汽灭菌15 min，所述发酵培养基的质量体积比配方为麦芽糖 5 %、葡萄糖 3 %、热榨豆饼粉1 %、FeCl3 0.05 %、K2HPO4 0.1 %、谷氨酸 0.3 %、CaCO3 0.25 %，pH调至7.2，115 ℃ 高压蒸汽灭菌15 min。
CN201610962757.8A 2016-10-28 2016-10-28 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系 Active CN106566796B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610962757.8A CN106566796B (zh) 2016-10-28 2016-10-28 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610962757.8A CN106566796B (zh) 2016-10-28 2016-10-28 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106566796A CN106566796A (zh) 2017-04-19
CN106566796B true CN106566796B (zh) 2020-11-10

Family

ID=58535840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610962757.8A Active CN106566796B (zh) 2016-10-28 2016-10-28 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106566796B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112592878B (zh) * 2020-12-25 2022-08-26 上海交通大学 增强正调控蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1144271A (zh) * 1995-03-02 1997-03-05 拜尔公司 游动放线菌阿卡布糖生物合成基因及其分离方法和应用
CN1249001A (zh) * 1997-02-28 2000-03-29 拜尔公司 来自游动放线菌SE50/110的Acarboseacb基因簇
CN103305544A (zh) * 2013-07-05 2013-09-18 浙江海正药业股份有限公司 阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1144271A (zh) * 1995-03-02 1997-03-05 拜尔公司 游动放线菌阿卡布糖生物合成基因及其分离方法和应用
CN1249001A (zh) * 1997-02-28 2000-03-29 拜尔公司 来自游动放线菌SE50/110的Acarboseacb基因簇
CN103305544A (zh) * 2013-07-05 2013-09-18 浙江海正药业股份有限公司 阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Acarbose-metabolism in Actinoplanes sp. SE50/110;Wuppertal;《PhD，Bergische Universitaet》;20021231;全文 *
ACCESSION NO. Y18523，Actinoplanes sp. SE50/110 complete acarbose (acb) gene cluster, strain SE50/110;Stratmann，A. et al;《GenBank》;20160726;FEATURES，ORINGIN *
Cytosine Deaminase as a Negative Selection Marker for Gene Disruption and Replacement in the Genus Streptomyces and Other Actinobacteria;Marie-Pierre Dubeau et al;《Applied and Enviromental Microbiology》;20081219;第75卷(第4期);第1211-1214页 *
Highly efficient editing of the actinorhodin polyketide chain length factor gene in Streptomyces coelicolor M145 using CRISPR/Cas9-CodA(sm) combined system;Zeng H et al;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20150829;第99卷(第24期);第10575-10585页 *
Tetiana Gren et al.enetic engineering in Actinoplanes sp. SE50/110 −development of an intergeneric conjugation system for the introduction of actinophage-based integrative vectors.《Journal of Biotechnology》.2016,第232卷第79页摘要，第80-87页 方法、结果与讨论部分. *
游动放线菌 8-22 中 treY 基因敲除对于降低阿卡波糖C组分的作用;余贞 等;《微生物学通报》;20150720;第42卷(第7期);第1301-1306页 摘要，材料与方法，结果与分析，讨论 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106566796A (zh) 2017-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110218244B (zh) 化合物ilamycin F及其应用
CN112111439A (zh) 高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法
CN110343709B (zh) 一种北极拟诺卡氏菌套索肽基因簇及其克隆与表达方法
CN106566796B (zh) 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系
CN112029701B (zh) 一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用
CN109161559A (zh) 一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用
CN111117942B (zh) 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用
CN106906238B (zh) 一种链霉菌抗生素生物合成基因簇多拷贝扩增方法及应用
CN102660488B (zh) 一种促进美达霉素生物合成的基因工程菌及其应用
CN113462628B (zh) 一株产血红素的基因工程菌及其构建方法和应用
CN112409372B (zh) 玉红霉素类似物、制备方法及其应用
CN109136253A (zh) 一种通过糖多孢红霉菌sace_5754基因途径提高红霉素产量的方法
CN104911196A (zh) 三欣卡辛的生物合成基因簇及其应用
CN104427870A (zh) Uk-2生物合成基因和使用其提高uk-2生产率的方法
CN109468253B (zh) 一种高产雷帕霉素的吸水链霉菌
CN112725257A (zh) Gmra1,2,3化合物及其生物合成与应用
CN107541481B (zh) 一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用
CN113980982B (zh) 增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法
CN114150006B (zh) 一种可提高米尔贝霉素产量的基因簇、重组菌及其制备方法与应用
CN113717914B (zh) 高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用
CN103849591B (zh) 一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用
CN115125179B (zh) 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用
CN110408643B (zh) 一种提高自溶链霉菌洋橄榄叶素及其衍生物产量的方法
WO2022017523A1 (zh) 生产脱环氧埃坡霉素b的重组菌及其用途
CN108265069B (zh) 一种去甲基金霉素生物合成基因簇及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant